Name: Rekombinant Protein Yemler Kullanarak Phage Ekran ve Affinity seçimi için Protokol (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-02-16T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 36 s
Description: Öğrenin immobilize yem molekülleriyle protein etkileşimlerini keşfetmek için faj görüntüleme ve afinite seçimi protokolünü. Bu yöntem, yüksek afiniteli etkileşimleri verimli şekilde tanımlamayı sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Hatch, McIntire-Stennis (AD421 CRIS), USDA Tohum Grant (2011-04375), ve ABD&#39;ye Sir Frederick McMaster Araştırma Bursu; Bu proje kısmen bir NSF IOS (0849230) tarafından finanse edildi.

<ol><li>Georgieva, Y., Konthur, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+and+screening+of+M13+phage+display+cDNA+libraries%5BTitle%5D)+AND+%22Molecules%22%5BJournal%5D)">Design and screening of M13 phage display cDNA libraries.</a> Molecules. 16, 1667-1681 (2011).</li>
<li>Beghetto, E., Gargano, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lambda-display%3A+a+powerful+tool+for+antigen+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Molecules%22%5BJournal%5D)">Lambda-display: a powerful tool for antigen discovery.</a> Molecules. 16, 3089-3105 (2011).</li>
<li>Li, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ORF+phage+display+to+identify+cellular+proteins+with+different+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">ORF phage display to identify cellular proteins with different functions.</a> Methods. 58, 2-9 (2012).</li>
<li>Willats, W. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phage+display%3A+practicalities+and+prospects%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Phage display: practicalities and prospects.</a> Plant Mol. Biol. 50, 837-854 (2002).</li>
<li>Konthur, Z., Crameri, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+applications+of+phage+display+in+proteomic+analyses%5BTitle%5D)+AND+%22Targets%22%5BJournal%5D)">High-throughput applications of phage display in proteomic analyses.</a> Targets. 2, 261-270 (2003).</li>
<li>Chen, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Substrates+of+the+Arabidopsis+thaliana+protein+isoaspartyl+methyltransferase+1+identified+using+phage+display+and+biopanning%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Substrates of the Arabidopsis thaliana protein isoaspartyl methyltransferase 1 identified using phage display and biopanning.</a> J. Biol. Chem. 285, 37281-37292 (2010).</li>
<li>Jung, S., Honegger, A., Pluckthun, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selection+for+improved+protein+stability+by+phage+display%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Selection for improved protein stability by phage display.</a> J. Mol. Biol. 294, 163-180 (1999).</li>
<li>Battaglia, M., Olvera-Carrillo, Y., Garciarrubio, A., Campos, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+enigmatic+LEA+proteins+and+other+hydrophilins%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">The enigmatic LEA proteins and other hydrophilins.</a> Plant Physiol. 148, 6-24 (2008).</li>
<li>Egli, D. B., Bruening, W. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Source-sink+relationships%2C+seed+sucrose+levels+and+seed+growth+rates+in+soybean%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+Botany%22%5BJournal%5D)">Source-sink relationships, seed sucrose levels and seed growth rates in soybean.</a> Ann. Botany. 88, 235-242 (2001).</li>
<li>Badotti, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Switching+the+mode+of+sucrose+utilization+by+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Microb.+Cell+Fact%22%5BJournal%5D)">Switching the mode of sucrose utilization by Saccharomyces cerevisiae.</a> Microb. Cell Fact. 7, 4 (2008).</li>
<li>Kushwaha, R., Lloyd, T. D., Schafermeyer, K. R., Kumar, S., Downie, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+Late+Embryogenesis+Abundant+%28LEA%29+Protein+Putative+Interactors+Using+Phage+Display%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Mol.+Sci%22%5BJournal%5D)">Identification of Late Embryogenesis Abundant (LEA) Protein Putative Interactors Using Phage Display.</a> Int. J. Mol. Sci. 13, 6582-6603 (2012).</li>
<li>Sorensen, H. P., Mortensen, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Soluble+expression+of+recombinant+proteins+in+the+cytoplasm+of+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Microb.+Cell+Fact%22%5BJournal%5D)">Soluble expression of recombinant proteins in the cytoplasm of Escherichia coli.</a> Microb. Cell Fact. 4, 2859 (2005).</li>
<li>Gasser, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+folding+and+conformational+stress+in+microbial+cells+producing+recombinant+proteins%3A+a+host+comparative+overview%5BTitle%5D)+AND+%22Microb.+Cell+Fact%22%5BJournal%5D)">Protein folding and conformational stress in microbial cells producing recombinant proteins: a host comparative overview.</a> Microb. Cell Fact. 7, 11 (2008).</li>
<li>Daly, R., Hearn, M. T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+heterologous+proteins+in+Pichia+pastoris%3A+a+useful+experimental+tool+in+protein+engineering+and+production%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Recognit%22%5BJournal%5D)">Expression of heterologous proteins in Pichia pastoris: a useful experimental tool in protein engineering and production.</a> J. Mol. Recognit. 18, 119-138 (1002).</li>
<li>Davis, T. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+recombinant+protein+production+of+eight+insect+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22In+Vitro+Cell+Dev.+Biol.+Anim%22%5BJournal%5D)">Comparative recombinant protein production of eight insect cell lines.</a> In Vitro Cell Dev. Biol. Anim. 29, 388-390 (1993).</li>
<li>Kost, T. A., Condreay, J. P., Jarvis, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Baculovirus+as+versatile+vectors+for+protein+expression+in+insect+and+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Baculovirus as versatile vectors for protein expression in insect and mammalian cells.</a> Nat. Biotechnol. 23, 567-575 (2005).</li>
<li>Popescu, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+binding+of+calmodulin-related+proteins+to+their+targets+revealed+through+high-density+Arabidopsis+protein+microarrays%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Differential binding of calmodulin-related proteins to their targets revealed through high-density Arabidopsis protein microarrays.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 4730-4735 (2007).</li>
<li>Popescu, S. C., Snyder, M., Dinesh-Kumar, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arabidopsis+protein+microarrays+for+the+high-throughput+identification+of+protein-protein+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Signal+Behav%22%5BJournal%5D)">Arabidopsis protein microarrays for the high-throughput identification of protein-protein interactions.</a> Plant Signal Behav. 2, 416-420 (2007).</li>
<li>Al-Fageeh, M. B., Marchant, R. J., Carden, M. J., Smales, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cold-shock+response+in+cultured+mammalian+cells%3A+Harnessing+the+response+for+the+improvement+of+recombinant+protein+production%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol.+Bioeng%22%5BJournal%5D)">The cold-shock response in cultured mammalian cells: Harnessing the response for the improvement of recombinant protein production.</a> Biotechnol. Bioeng. 93, 829-835 (2006).</li>
<li>Wurm, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+recombinant+protein+therapeutics+in+cultivated+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Production of recombinant protein therapeutics in cultivated mammalian cells.</a> Nat. Biotechnol. 22, 1393-1398 (2004).</li>
</ol>

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

Üç çoğaltılmış kuyularda deneyi çalıştırarak, yem bağlanma aynı proteinin, bağımsız bir şekilde edinilen faj aynı klon elde edilmiş olan CDS bölgenin nükleotid dizisi içinde (yani, hiç bir fark ancak bu olması bile ayırt edilebilir ) bağımsız kuyulardan alınan. Aksi takdirde, yem bağlanmasının, aynı proteini kodlayan faj arasında ayırt etmek için tek yoldur bunlar bağımsız bir şekilde, söz konusu nükleotid dizinin bir bölümünde farklı bölgeleri ters transkribe ise. Seçilen faj afini...

Neden bunun yerine diğer moleküllerle protein etkileşimleri keşfetmek ve araştırmak için kullanılabilir sayısız diğer tekniklerin faj ekran ve afinite seçimi kullanmak? Faj görüntüleme dahil olmak üzere şu protein-ligand etkileşimleri 1-3 saptanmasında diğer yöntemlere göre bazı benzersiz avantajlar iddia edemez: Yem moleküllerin çok geniş repertuarı Önde gelen nedeni yakınlık seçimi 4 yem olarak etki edebilme yeteneğine sahip moleküllerin çeşitliliği bulunmaktadır. Faj gösterimi, bir polimer / molekül, elde edilebilir bir desteğe bağlı olabilir Esasen, bu faj gösterilen proteinlerle yakınlık için taranmalıdır diğer proteinler, nükleotitler, karbonhidratlar vb 5 etkileşim protein fragmanlarının izole edilmesi için bir çok güçlü bir araçtır. R koşullar için kullanılan, ayrıca, yem molekülü, 6, hareketsiz olduğunda biyolojik aktivitesini muhafaza olup olmadığını belirlemek için erişilebiliretkinliğini ortadan kaldırmak / çıkarmak önce yakınlık seçimi için yem dönüşüm sonrası değişikliğe tanıtmak için, 6 ya da etkili bulunmaktadır. Yabancı faktörlere faj direnç Faj ekranı kullanarak ikinci bir sebebi, bazı yemler onların etkileşim proteinlerini yakalamak için çevresel stres (ısı, yüksek osmolite konsantrasyonları, belirli kofaktörler, vb.) Gerektirebilir mümkün olduğunu, ya da faj görüntülenen proteinler şekilde değiştirilmesi gerekebilir afinite seçimi öncesinde. Çalışılmaktadır birincil faktör yem ve protein değil, bu test organizması için ölümcül ise etkileşim meydana sağlar veya durum arasındaki etkileşimdir. O (T7 canlılığı için yayınlanan termik maksimum ~ 60 ° C 7 eg) sağlam ve kalıcı hem de sert deneysel koşullara dayanabilir, çünkü T7 faj tür çalışmalarda özellikle uygundur. Değiştiren faj bir örnek olarak gösterilen proonarım enzimi protein yüzeyler için Arabidopsis thaliana tohum proteomesini incelerken proteinlerden, protein Isoaspartyl Metil Transferaz (PIMT), bu çalışmalarda kullanılan virüs girmesini teşvik etmek, önce her bir yakınlık seçimi için yuvarlak, bir hafta boyunca &quot;yaşlı&quot; olmuştu isoaspartate of (IsoAsp) tanımak ve onarım / tür anormallikleri metabolize organizmalarda mümkün değildir duyarlı proteinlerin 6 artıkları. Metabolik olarak atıl Ayrıca, faj genellikle metabolik zehirler ve, en azından, metabolik açıdan aktif bir test organizmalar üzerinde pleitropik etkilere neden olur küçük moleküller müdahale dayanıklıdır. Sıkılık yıkama sonrasında, zehir zehir bakteri ya da daha sonraki faj replikasyon için zararsız bir aralığa seyreltilir böylece bakterilerin büyük bir hacmi enfeksiyonu için kabul edilmeden önce çıkarılır. PIMT onarım protein hedeflerini araştırırkenenzim, S-adenosil Metionin (AdoMet) enzimi inaktive ve yararlı bir negatif kontrol olarak sağlamak temin etmek üzere S-adenosil homosistein (AdoHcy) dayanarak iken bir hedef protein yakalama izin vermek için mikro titre plaka oyuklu hareketsizleştirilmiş enzimin aktive etmek için kullanıldı virüs olumsuz AdoMet veya AdoHcy 6 ya etkisinde değil ki bilgi. Ayrıca, bu laboratuarda araştırılmıştır bazı Geç Embriyo bol (LEA) protein ailesine ait üyeleri noktasında, soya fasulyesi tohumlannda 200 mM kadar yüksek konsantrasyonlar elde etmek için böyle 8 sakroz gibi katkı maddelerinin varlığında, kendi şeklini değiştirmek bilinmektedir fizyolojik olgunluk 9. Virüs bağımsız olarak uygun bir test organizmasının 10 için geçerli değil belirli LEA istemci-protein etkileşimleri için muhtemelen gerekli olan, her afinite seçimi yuvarlak, 200 mM sükroz ilave etkilendiği tahmin edilmez. Bu laboratuvar açığa çıkarılması odaklanmıştırg protein-protein dehidrasyon 11 ya da tohum 6 batırılmış sonra IsoAsp oluşumuna yatkındır saklı proteomun bileşenlerinin onarımı sırasında depolanmış proteom koruma mekanizması altında yatan olgun, susuz ya da çimlenme tohumlarda etkileşimleri. Bu nedenle, üretim ve arıtma aktif halde yem olarak gerekli olan yeniden birleştirici proteinlerin, ve immobilize edilir önce ve sonra genellikle zordur, çalışmalarımız için bir köşe olmasına rağmen bunlar, çok kalmasını sağlamaktır. Her bir rekombinant protein üretim senaryo farklı olduğu, ancak, yeniden birleştirici protein üretimi için optimize koşullar burada ele alınmayacaktır. Kullanıcılar (bir enzim ise mikrotiter plaka kuyularda bir enzim tahlili yapmak gibi) hareketsiz protein hala işlevsel olup olmadığını belirlemek için, mümkün olan her yerde, denemek için teşvik edilmektedir. Bu herhangi keşfetti etkileşimleri olduğunu, yem nedenle biyolojik olarak aktif olduğunu ve bazı güven sağlayacakbiyolojik ilgisi var biraz daha olasıdır.

<table><tbody><tr><td>Tripton</td><td>Becton Dickinson Co.</td><td></td><td></td>211705</tr><tr><td>Maya Özü</td><td>Becton Dickinson</td><td>212750</td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>Becton Dickinson</td><td>214010</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum Klorür</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP358-10</td><td></td></tr><tr><td>Agaroz</td><td>Araştırma Ürünleri Uluslararası</td><td>A20090</td><td></td></tr><tr><td>Bloke Reaktif</td><td>EMD Chemicals Inc.</td><td>69064</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP337-100</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum Hidroksit</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP359-212</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum Dodesil Sülfat</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP166-500</td><td></td></tr><tr><td>Tris Baz</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP152-5</td><td></td></tr><tr><td>Kloroform</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1145-1</td><td></td></tr><tr><td>Escherichia coli BLT5403</td><td>EMD Kimyasallar A.Ş.</td><td>BLT5403</td><td>Genotip: F- ompT hsdSB (rB - mB -) gal dcm pAR5403 (AmpR)</td></tr><tr><td>Ampisilin, Sodyum Tuzu</td><td>Araştırma Ürünleri Uluslararası</td><td>A40040</td><td></td></tr><tr><td>Etidyum bromür</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP102-1</td><td></td></tr><tr><td>Sığır Serum Albümini (BSA)</td> <td>Sigma-Aldrich Corp.</td><td>A-9647</td><td></td></tr><tr><td>Penta-HIS birincil antikoru</td><td>Qiagen Inc.</td><td>34660</td><td></td></tr><tr><td>Keçi anti-fare alkalin fosfataz konjugatı</td><td>Sigma-Aldrich Corp.</td><td>A-5153</td><td></td></tr><tr><td>para-Nitrofenilfosfat</td><td>Sigma-Aldrich Corp.</td><td>N-7653</td><td></td></tr><tr><td>T7-UP astar</td><td>EMD Kimyasallar A.Ş.</td><td></td><td>5'-GGAGCTGTCGTATTCCAGTC-3'T7-AŞAĞI</td></tr> <tr><td>astar</td><td>EMD Kimyasallar A.Ş.</td><td></td><td>5'-AACCCCTCAAGACCCGTTTA-3'Qiaquick</td></tr> <tr><td>PCR Arıtma kiti</td><td>Qiagen Inc.</td><td>28104</td><td></td></tr><tr><td>Qiaquick Jel Ekstraksiyon kiti </td><td>Qiagen Inc.</td><td>28706</td><td></td></tr><tr><td>Büyük Boya Sonlandırıcı v3.1 Döngü Sıralama Kiti</td><td>Invitrogen Life Technologies</td><td>4336917</td><td></td></tr><tr><td>Isıtma Bloğu</td><td>Pierce Chemical Co. (Thermo Fisher Scientific Co.)</td><td>18780</td><td></td></tr><tr><td>96 kuyulu Hücre Kültürü Plakaları</td><td>Corning</td><td>Costar 3590</td><td></td></tr><tr><td>Isotemp İnkübatör Fırını</td><td>Fisher Scientific</td><td>516D</td><td></td></tr><tr><td>Pasteur Pipetleri, 5 & # 190; Fisher</td><td>Scientific</td><td>13-678-20A</td><td></td></tr><tr><td>ChromaView Transilluminator</td><td>UVP Inc.</td><td>TS-15</td><td></td></tr><tr><td>UV Kalkanı</td><td>Oberon</td><td>071AF</td><td></td></tr><tr><td>Eldiven, Nitril</td><td>Fisher Scientific</td><td>19-170-010C</td><td></td></tr><tr><td>Steril 1.5 ml tüpler</td><td>USA Scientific Inc</td><td>1615-5500</td><td></td></tr><tr><td>10 ml Borosilikat Pipetler</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-678-25E</td><td></td></tr><tr><td>Borosilikat kültür tüpleri</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-961-27</td><td></td></tr><tr><td>Uniskan I, ELISA plaka okuyucu</td><td>Labsystem ve Flow Laboratuvarları, Helsinki, Finlandiya</td><td>Tip 362</td><td></td></tr></tbody></table>

rekombinant protein yemler kullanarak phage ekran ve affinity seçimi için protokol

A Protocol for Phage Display and Affinity Selection Using Recombinant Protein Baits

Hareketsiz yem moleküllerine yönde klonlanmış bir cDNA kütüphanesi ile kodlanan çeşitli protein kısımlarını sunmak için bir iskele olarak yeniden birleştirici faj kullanılarak etkileşimleri keşfetmek için etkili bir araçtır. Bu teknik, büyük ölçüde, protein-protein etkileşimleri keşfetmek için kullanılmıştır ama meydan için yem molekül proteinleri ile sınırlı olmak zorunda değildir. Burada sunulan protokol yemler mütevazı bir dizi aynı protein sunum bağımsız klonların belirlenmesini maksimize etmek için tekrardan ekranlı izin vermek için optimize edilmiştir. Bu tespit etkileşen proteinlerin yem molekülün yasal Uygulayıcılar olduğu daha büyük bir güven izin verir. Her afinite seçimden sonra faj titresi İzleme yuvarlak yakınlık seçme negatif kontrollerin etkinliği yanı sıra nasıl ilerlediğini bilgi sağlar. Bir faj titering ve nasıl anlamına gelir ve ne bu süreç verimli olarak ilerleme sağlamak için önceden hazırlamakMümkün olduğunda, sunulmuştur. Bağımsız plak izolasyonu aşağıdaki alınan amplikonların Özellikler afinite seçimi ilerlemiştir ne kadar iyi belirlemek için kullanılabileceğini vurgulanır. Sorun yanlış pozitif veya en aza indirmek için ısrarla fajının geri atlamak için çekim teknikleri açıklanmıştır. Viral bulaşma nöbetini azaltılması araçlar tartışılmıştır.

(Metabolik yem zehirlenmesi) Faj gösterimli proteinleri ile etkileşim için yem kapasitesini olumsuz yönde mümkün olan bu tekniği için güçlü bir negatif kontrol sağlamaktadır. Bu, yem, iyi mikrotiter plakaya bağlandığı zaman, kendi işlevini korur olmadığını belirlemek de tavsiye edilir. Bu kontrollerin Hem nonpoisoned yem tarafından kurtarıldı etkileşim, faj görüntülenen proteinler meşru olduğunu güveni artacaktır. Her bir kuyudan üç triplicates örnekleme afinite seçiminde bir rol oynar zaman...

Faj gösterimi, bir ilgi hareketsiz molekülü ile etkileşen proteinleri ya da protein parçaları yakalamak için güçlü bir tekniktir. Oluşturmak için faj cDNA kütüphanesi türüne ve ekranın bir karar yapıldıktan sonra, burada açıklanan protokol interactors tanımlanmasına yol açan verimli benzeşim seçimine izin verir.

Rekombinant Protein Yemler Kullanarak Phage Ekran ve Affinity seçimi için Protokol

Using  recombinant phage as a scaffold to present various protein portions encoded by  a directionally cloned cDNA library to immobilized bait molecules ...

Bu prosedürün genel amacı, immobilize edilmiş yem molekülleri ile protein etkileşimlerini keşfetmektir. Bu işlem, öncelikle yem molekülünün elde edilmesi ve immobilize edilmesiyle gerçekleştirilir. İkinci adım ise, taranacak olan faj kütüphanesinin, bağlanmayı teşvik eden koşullar altında yem molekülü ile etkileşime sokulmasıdır.Ardından, bağlanmayan fajlar sıkı yıkama ile uzaklaştırılır. Bağlanmış olan fajlar ise geri kazanılmadan önce bakterileri enfekte etmek için kullanılır. Son adım, afinite seçiliminin bir sonraki iterasyonu için bağlanmış fajların amplifiye edilmesidir.Nihayetinde, faj titresi platoya ulaştığında, deneysel bağlanma koşulları altında immobilize edilmiş laggin proteine hangi proteinlerin en yüksek afiniteye sahip olduğunu göstermek için tekil plaklar seçilir ve dizilenir. Bu süreç, protein-protein etkileşimlerindeki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu prosedür, metin protokolünde açıklandığı üzere, saflaştırılmış rekombinant proteinin mikrotitrasyon plaklarının tabanına yerleştirilmesiyle başlar.Bir sonraki adım, metin protokolünde açıklandığı şekilde önceden büyütülmüş tek bir koloni ile, 250 mL'lik bir erlenmeyer flask içindeki 100 µg/mL amp

a-protocol-for-phage-display-affinity-selection-using-recombinant

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

AVEXIS hücresel tanıma süreçlerinde roman dışı reseptör-ligand çiftleri için sistematik ekran için geliştirilmiş bir yüksek verimlilik protein etkileşim testtir. Bu özellikle diğer yüksek verimlilik yaklaşımları kullanarak tespit etmek zordur geçici protein etkileşimleri tespit etmek için tasarlanmıştır.

Düşük afiniteli Ekstrasellüler Reseptör-ligand Etkileşimlerinin Ölçeklenebilir Algılama için Avidite tabanlı Ekstrasellüler Etkileşim Gösterimi (AVEXIS)

Bu videoda, hedef proteine yüksek afiniteye sahip proteinleri ifade eden önceden tasarlanmış fajları izole etmek için faj görüntüleme tekniğini gösteriyoruz.

Bir Hedef Proteine Yüksek Afiniteye Sahip Proteinleri Seçmek için Faj Ekranını Kullanma

Bir yöntem olup, aynı anda antijenlere karşı yüz Faj gösterimli birleştirici sentetik antikor kütüphanelerinden, ölçeklenebilir, yüksek verimli seçimleri yürütmek için görsel eşliğinde tarif edilmektedir. Bu paralel yaklaşımı kullanarak, standart bağışıklık tahlillerinde işlevsel çeşitli antijenler için yüksek bir çekim ve özelliğe gösteren antikor fragmanları izole ettik.

Faj-görüntülenen Sentetik Antikor Kütüphaneler itibaren Ölçeklenebilir Yüksek Verim Seçimi

Biopanning bakteriyel görüntü kitaplıkları peptid benzeşme reaktifler, antikorlar için güçlü bir alternatif keşfi için kanıtlanmış bir tekniktir. Yarı Otomatik sıralama yöntemini burada yanlış pozitif oluşumunu azaltmak için biopanning aerodinamik. Burada düşünce süreci ve adayların değerlendirilmesi ve aşağı akım analizi en aza indirerek uygulanan teknikler gösterilmektedir.

Peptid benzeşme reaktif keşif ve elde edilen yalıtır analizi için bakteriyel ekran kütüphanelerin yarı otomatik Biopanning

Açıklanan protokollere izin ver inşaat, karakterizasyonu ve DNA, herhangi bir kaynaktan yapılan bir "domainome" kitaplığının (karşı seçim hedef) seçimi. Bu farklı teknolojileri bir araya getiren bir araştırma boru hattı tarafından sağlanır: faj ekran, katlama muhabir ve sonraki nesil sıralama veri analizi için bir web aracı ile.

Interactome-Seq: Domainome kitaplığı inşaat, doğrulama ve seçim fajının görüntü ve sonraki nesil sıralama için bir protokol

Bu iletişim kuralı özel çeşitliliği ile sentetik antikor fajının görüntülenen Kütüphane inşaatı için detaylı bir yordam açıklanır. Sentetik antikorlar temel araştırma geniş uygulamalardan hastalığı teşhis ve tedavi için var.

Sentetik fajının inşaatı Fab Kütüphane özel çeşitliliği ile görüntülenir.

Burada e. coli biotin-protein ligase BirA'nın belirli bir hedef peptidbiyominiyapan yeni varyantları için seçme yöntemi salıyoruz. Protokol, hedef peptidin bakteriyel olarak görüntülenmesi için bir plazmid yapımını, BirA kütüphanesinin neslinin, BirA varyantlarının seçilmesi ve karakterizasyonunun yapılmasını açıklar.

Roman Biyotinilasyon Enzimlerinin Seçimi için Bakteriyel Peptit Gösterimi

Herhangi bir küçük molekül ligand için istenilen yakınlık ve özgüllük ile kimyasal kaynaklı protein dimerizasyon sistemleri oluşturma birçok biyolojik algılama ve harekete uygulama olacaktır. Burada, faj la görüntülenen tek etki alanı antikor kütüphanesinin adım adım seçimi yoluyla kimyasal olarak indüklenen dimerizasyon sistemlerinin de novo mühendisliği için etkili, genelleştirilebilir bir yöntemi tanımlıyoruz.

Bir Kombinatoryal Tek Etki Alanı Antikor Kütüphanesi adım wise Faj Seçimi ile Son Derece Spesifik Kimyasal Kaynaklı Protein Dimerization Sistemleri Oluşturma

Bu çalışma, ilaç-peptit etkileşimlerini tanımlamak için bir strateji sunmayı amaçlamaktadır. Strateji, bir kuvars-kristal mikro denge (QCM) biyosensörüne dayanan ilaç tanıyan kısa peptitlerin biyopannasyonunu ve ardından ilaç tanıma ve ilaç bağlayıcı bölgelerin proteinler üzerinde ek açıklama için elde edilen bilgileri nicel olarak değerlendirmek için biyoinformatik analizini içerir.

İlaç-protein Etkileşimlerinin Küresel Doğrulanması için Biyosensör Tabanlı Yüksek Verimli Biyopanning ve Biyoinformatik Analiz Stratejisi

Bu makalede, alkalen fosfataz konjuge ScFv D11 antikoru kullanılarak immünofloresan yoluyla dokulardaki izolevuglandinlerin ölçümü için ayrıntılı bir metodoloji sunulmaktadır. Hem farelerde hem de insanlarda hipertansiyon modelleri, doku örneklerinde izolevuglandin ölçümü ile ilişkili adım adım prosedürleri ve temel ilkeleri açıklamak için kullanılır.

D11 scFv-alkalen fosfataz füzyon proteini ve immünofloresan kullanılarak dokulardaki izolevuglandinlerin doğrudan tespiti

Her yerde, disrrengülasyonu çok sayıda insan hastalığına karışmış kritik bir protein post-translational modifikasyondur. Bu protokol, faj ekranının, her yerde bulunmanın özgüllüğünü, verimliliğini ve kalıplarını kontrol eden E3 ligaslarının aktivitesini bağlayabilen ve modüle edebilen yeni ubiquitin varyantlarını izole etmek için nasıl kullanılabileceğini açıklar.

E3 Ligases için Ubiquitin Varyant Modülatörleri Geliştirmek için Faj Ekran Kullanma

Öğrenin immobilize yem molekülleriyle protein etkileşimlerini keşfetmek için faj görüntüleme ve afinite seçimi protokolünü. Bu yöntem, yüksek afiniteli etkileşimleri verimli şekilde tanımlamayı sağlar.

Rekombinant Protein Yemler Kullanarak Phage Ekran ve Affinity seçimi için Protokol

Daha fazla video keşfet