Rekombinant Protein Yemler Kullanarak Phage Ekran ve Affinity seçimi için Protokol

Bu prosedürün genel amacı, hareketsizleştirilmiş yem molekülleri ile protein etkileşimlerini keşfetmektir. Bu, önce yemin alınması ve hareketsiz hale getirilmesiyle gerçekleştirilir. İkinci adım, bağlanmayı teşvik eden koşullar altında yemlere taranacak faj kütüphanesini tanıtmaktır.

Daha sonra, bağlanmamış faj sıkı yıkama ile uzaklaştırılır. Bağlı fajlar, geri kazanılmadan önce bakterileri enfekte etmek için kullanılır. Son adım, afinite seçiminin bir sonraki yinelemesi için bağlı fajı yükseltmektir.

Nihayetinde, faj titresi platoları olduğunda, deneysel bağlanma koşulları altında hangi proteinlerin hareketsizleştirilmiş gecikme için en yüksek afiniteye sahip olduğunu göstermek için tekli plaklar seçilir ve sıralanır. Bu süreç, protein protein etkileşimlerindeki temel soruları yanıtlamaya yardımcı olabilir. Bu prosedür, saflaştırılmış rekombinant proteinin metin protokolünde tarif edildiği gibi mikrotitre plakalarının dibine yerleştirilmesiyle başlar.

Bir sonraki adım, 50 mililitre Luria burani ortamını mililitre başına 100 mikrogram ampisilin ile 250 mililitrelik bir erlenmeyer şişesinde daha önce metin protokolünde açıklandığı gibi büyütülmüş tek bir koloni ile aşılamak, 37 santigrat derece, 200 RPM'de yatay bir çalkalayıcıda inkübe etmek ve 600 nanometrede 0.5 ila 0.6 arasında bir optik yoğunluk elde edilene kadar hücre yoğunluğunu izlemek için bir spektrofotometre kullanmaktır. Daha sonra hücreleri 50 mililitrelik bir Falcon tüpüne veya benzerine dökün ve kullanım hücreleri genellikle birinci gün yaklaşık bir hafta boyunca canlı kalana kadar dört santigrat derecede tutun. İkinci günün sabahı metin protokolünde açıklandığı gibi yakınlık seçimi için hazırlanın.

Dokuz otoklav boş, 250 mililitrelik erlenmeyer şişesini bir inkübat çalkalayıcının kelepçelerine yerleştirin, faj ile enfekte BLT 5 4 0 3 hücrelerinin gece boyunca kültürlerinden birinden 500 mililitre lal burani ile 500 mikrolitre aşılayın, şişeyi inkübatöre yerleştirdikten sonra bir gece önce başlatıldı, spektrofotometreyi açın ve 600 nanometrede absorbansı okuyacak şekilde ayarlayın. Bu arada, mikrotitre plakasını dört santigrat dereceden çıkarın ve plastik filmi çıkarın. Bir X tris tamponlu salin veya TBS pH 7.5'in kuyusu başına 200 mikrolitre ile 10 kez yıkayarak ve yıkamalar arasında plakayı kağıt havluya baş aşağı vurarak bağlanmamış proteini plakadan çıkarın.

TBS'de bir saat boyunca% 5'lik oyuk başına 200 mikrolitre bloke edici reaktif ile bloke edin. Plaka streç filmle sarılmışken, blokaj solüsyonunu 200 mikrolitre bir X-T-B-S-T ile 10 kez yıkayın ve plakayı dört kat kağıda baş aşağı vurun. Yıkamalar arasında havlu.

Buradan, faj çapraz kontaminasyonunu önlemek için filtre bariyer uçlarını kullanın. Faj kütüphanesinin 100 mikrolitresini proteinlerle pipetleyin. Plakayı streç filmle tekrar kapatın ve oda sıcaklığında bir saat inkübe edin.

Bir saatin sonunda, streç filmi plakadan çıkarın ve fajı biyolojik olarak tehlikeli atığa sallayarak hemen yıkayın. Ardından, her birine hızlı bir şekilde 200 mikrolitre bir X-T-B-S-T eklemek için çoklu pipetleyici kullanın. Bir dakika boyunca bir zamanlayıcı ayarlayın.

Bir dakika sonra, tamponu biyolojik olarak tehlikeli atığa sallayın, tabağı kağıt havlunun üzerine baş aşağı vurun ve tekrar tezgahın üzerine koyun. 10. yıkamadan sonra yıkama adımlarını 10 kez tekrarlayın. Dört santigrat derecede 50 mililitrelik şahin tüpünden 200 mikrolitre BLT 5 4 0 3 hücresi alın ve son yıkamanın çıkarıldığı dokuz kuyunun her birinin dibine aktarın.

Plakaları streç filmle sarın ve 20 dakika sonunda bakterileri enfekte etmek için yemlere yapışmış herhangi bir faj elde etmek için 20 dakika boyunca 37 santigrat derece bekletin. Plakaları açın. Daha sonra, 25 santigrat derece replikasyonda BSA'dan 10 mikrolitre bakteriyi çıkarın ve 990 mikrolitre orta işaretli olana aktarın.

Bu işlemi o kuyu için iki kez daha tekrarlayın, bu kuyudan bir ila 100 dilu fajın üç üçlüsü ile sonuçlanır, bu BSA replikasyonudur, biri üç kez örneklenir. Bu seyreltme, ortalama titreyi tahmin etmek için kullanılacaktır, artı veya eksi, ortalamanın standart hatası, BSA'nın bu replikasyonu için, zehirli yem proteininin üç replikasyon kuyusu için BSA'nın ikinci ve üçüncü replikasyonu için de aynısını yapın ve yem proteini için bu 27 EOR tüpünü bir kenara koyun. Şişedeki bakteriler 0.6 ila 1.0 optik yoğunlukta ise, eğrelti otu şişesinden 50 mililitre hücreyi 9 250 mililitrelik erlenmeyer şişelerinin her birine boşaltın.

BSA replikasyonunda kalan 170 mikrolitre faj enfekte BLT 5 4 0 3 bakterisini bir kuyu alın ve BSA temsilcisi olarak işaretlenmiş 50 mililitre hücreye ekleyin. Bir. Şişeleri 37 santigrat derece inkübatörde sallamadan önce bunu dokuz kuyucuğun tümü için yapın. Bu arada, ilk 27 seyreltmeden 100 mikrolitre bakteri ile Einor tüpünden LB alarak ve bunu einor tüpündeki 900 mikrolitre LB'ye ekleyerek seyreltme yapın.

10 ila eksi üçüncü seyreltme için dört, einor tüp dördünden bakteri içeren 100 mikrolitre LB almadan ve bunu eph tüpündeki 900 mikrolitre LB'ye eklemeden önce filtre bariyer ucunu yenisiyle atın. 10 ila eksi dördüncü seyreltme için yedi, tüm proteinlerin ve tedavilerin tüm replikasyonlarının tüm üçlüleri için seyreltmeye devam edin. Hücreler yattıktan sonra toplam 135 tüp olmalıdır.

Beş molar sodyum klorür stoğundan beş mililitre ekleyerek ve numuneyi dört santigrat derecede 10 dakika boyunca 8.000 kez G'de etiketli bir santrifüj şişesi santrifüjüne aktararak kültürü 0.5 molar sodyum klorüre getirin. Daha sonra virüsü içeren süpernatanı temiz, steril 50 mililitrelik bir şahin tüpüne boşaltın. Falcon tüpündeki boşaltılmış süpernata birkaç damla kloroform ekleyin.

Süpernatant, üçüncü gündeki bir sonraki afinite seçimi turu için dört santigrat derecede saklanabilir, önceden hazırlanmış numaralı bo silikat test tüplerinin her birine dört santigrat dereceden 250 mikrolitre VLT 5 4 0 3 hücresi pipetleyin. Daha sonra, einor tüpündeki seyreltmeden 100 mikrolitreyi, frez silikat test tüpündeki 250 mikrolitre hücreye pipetleyin. Bir. Pipetin ilk beş inçini alevin üzerinde kısa bir süre ısıtın ve erimiş üst arosun içine daldırın.

Üç mililitre yukarı çekin ve hücrelerin ve fajın üstündeki test tüpüne hızlı bir şekilde teslim edin. Diğer elinizle tüpü tutarken parmağınızla hafifçe vurarak karıştırın ve ardından içindekileri tabağa dökün. Plakayı eğin ve tüm plaka üst agros tarafından kaplanana kadar kabarcıkları ve kuru noktaları kovalamak için test tüpünü kullanın.

Soğuması için bankta dik olarak bir kenara koyun. Boros silikat tüpünü atın. Filtre bariyer ucunu çıkarın ve yenisini alın ve tüm seyreltme kaplanana kadar devam edin.

Hazırlanan plakaları inkübatörden tükendiklerinde, ancak bir seferde altıdan fazla olmayacak şekilde veya soğuduklarında ve üst agroslar çok hızlı bir şekilde katılaştıkça alın, plakalar üzerinde oluşan plağı inceleyin ve birleşimci lizis olanları atın. Kalan seri seyreltmelerden hangilerinin doğru bir Cali sağlamak için yeterince az plak ürettiğini belirleyin Bu plakalardan plak sayısını kaydedin ve afinite seçiminin sonundaki metin protokolünde açıklandığı gibi titreyi hesaplamaya devam edin. Dördüncü turda, steril bir sarı pipet ucu kullanarak 18 ayrı iyi tanımlanmış plak kolonisi seçin.

Ucun içini bir einor tüpünde tris hidroklorür pH 8.5 ile ıslatın. Daha sonra, ucu iyi izole edilmiş bir plaktan doğrudan aşağıdaki plastik Petri kabına iterek ve çekirdeği aspire ederek bu plakları başlık plakalarından çekirdekleyin, girdaplamadan önce çekirdeği uygun tüpte 100 mikrolitre tris hidroklorür pH 8.5'e boşaltın. Kısaca, bu hacimden 20 mikrolitreyi 65 santigrat derecede 10 dakika ısıtın ve burada gösterilen metin protokolünde açıklandığı gibi PCR ve sıralama ile devam edin, birkaç kez örnekleme yoluyla tipik titre sonuçlarıdır, nihai tahmini çeteleler pipetleme hatalarına karşı hassas değildir ve gerçek titrenin ve bunun etrafındaki varyasyonun daha doğru bir tahminidir.

Afinite seçim turlarının sayısı arttıkça, tercihen zehirlenmemiş yem için faj titresi artırılarak iyi ila iyi tahmin elde edilir. Ayrıca tekniğin işe yaradığına dair güven sağlar. Afinite seçimlerinin sayısı arttıkça, zehirlenmemiş yem kuyularında artan oranda faj içeren ekin tutulması, ileri afinite seçimi turlarından sonra da faydalıdır.

İlk tura göre eklenen bağımsız olarak geri kazanılmış fajların sayısındaki bir artış ve bu amplikonların birkaç aynı büyüklükteki bant üzerine yerleşmesi, bu prosedürü takiben afinite seçiminde belirli klonların seçildiğinin iyi bir göstergesidir. Faj gösterimi tarafından keşfedilen etkileşimleri doğrulamak için kolaylık iki hibrit gibi diğer yöntemler de gerçekleştirilebilir.