Rekombinant Protein Yemler Kullanarak Phage Ekran ve Affinity seçimi için Protokol

Bu prosedürün genel amacı, immobilize edilmiş yem molekülleri ile protein etkileşimlerini keşfetmektir. Bu işlem, öncelikle yem molekülünün elde edilmesi ve immobilize edilmesiyle gerçekleştirilir. İkinci adım ise, taranacak olan faj kütüphanesinin, bağlanmayı teşvik eden koşullar altında yem molekülü ile etkileşime sokulmasıdır.

Ardından, bağlanmayan fajlar sıkı yıkama ile uzaklaştırılır. Bağlanmış olan fajlar ise geri kazanılmadan önce bakterileri enfekte etmek için kullanılır. Son adım, afinite seçiliminin bir sonraki iterasyonu için bağlanmış fajların amplifiye edilmesidir.

Nihayetinde, faj titresi platoya ulaştığında, deneysel bağlanma koşulları altında immobilize edilmiş laggin proteine hangi proteinlerin en yüksek afiniteye sahip olduğunu göstermek için tekil plaklar seçilir ve dizilenir. Bu süreç, protein-protein etkileşimlerindeki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu prosedür, metin protokolünde açıklandığı üzere, saflaştırılmış rekombinant proteinin mikrotitrasyon plaklarının tabanına yerleştirilmesiyle başlar.

Bir sonraki adım, metin protokolünde açıklandığı şekilde önceden büyütülmüş tek bir koloni ile, 250 mL'lik bir erlenmeyer flask içindeki 100 µg/mL ampicillin içeren 50 mL Luria burani besiyerini inoküle etmektir; 37 °C'de, 200 RPM hızında yatay bir çalkalayıcıda inkübe edin ve 600 nm'de 0,5 ila 0,6 optik yoğunluk elde edilene kadar hücre yoğunluğunu izlemek için bir spektrofotometre kullanın. Ardından hücreleri 50 mL'lik bir Falcon tüpüne veya benzeri bir kaba aktarın ve kullanıma kadar 4 °C'de muhafaza edin; hücreler genellikle yaklaşık bir hafta boyunca canlı kalacaktır. Birinci günün sonunda, ikinci günün sabahında metin protokolünde açıklandığı şekilde afinite seçimi için hazırlık yapın.

Dokuz adet otoklavlanmış boş, 250 mililitre erlenmeyer balonunu bir inkübatörlü çalkalayıcının kelepçelerine yerleştirin; 500 mililitre lal burani'yi, bir önceki gece başlatılmış fago enfekte BLT 5 4 0 3 hücrelerinin gece boyu süren kültürlerinden birinden alınan 500 mikrolitre ile inoküle edin. Balonu inkübatöre yerleştirdikten sonra spektrofotometreyi açın ve absorbansı 600 nanometrede okuyacak şekilde ayarlayın. Bu sırada, mikrotiter plağını 4 derece Celsius'tan çıkarın ve plastik filmi üzerinden alın. Plaktaki bağlanmamış proteinleri, kuyuk başına 200 mikrolitre 1 X tris tamponlu salin (TBS) pH 7.5 ile 10 kez yıkayarak ve yıkamalar arasında plağı bir kağıt havlu üzerine ters çevirip vurarak uzaklaştırın.

Kuyu başına 200 µL TBS içindeki %5'lik bloklama reaktifi ile bir saat boyunca bloklayın. Plaka streç filmle sarılıyken, bloklama solüsyonunu 200 µL 1X TBST ile 10 kez yıkayın ve plakayı dört kat kağıt havlu üzerine ters çevirerek hafifçe vurun. Yıkamalar arasında kurulayın.

Bundan sonra, faj çapraz kontaminasyonunu önlemek için filtreli pipet uçları kullanın. Proteinlerin üzerine 100 µL faj kütüphanesi pipetleyin. Plakayı streç filmle tekrar kapatın ve oda sıcaklığında bir saat boyunca inkübe edin.

Bir saatin sonunda, plastredeki streç filmi çıkarın ve faji biyotehlikeli atık kutusuna boşaltıp sallayarak plakayı hemen yıkayın. Ardından, çok kanallı bir pipet kullanarak her kuyucuğa hızlıca 200 µL 1X TBS-T ekleyin. Bir dakikalık bir zamanlayıcı ayarlayın.

Bir dakika sonra, tampon çözeltiyi biyotehlikeli atık kabına boşaltın, plakayı ters çevirerek bir kağıt havlu üzerine hafifçe vurun ve tekrar tezgaha yerleştirin. Yıkama adımlarını 10 kez tekrarlayın; 10. yıkamadan sonra, 4 °C'deki 50 ml'lik falcon tüpünden 200 µL BLT 5 4 0 3 hücresi alın ve bunları, son yıkamanın boşaltıldığı dokuz kuyucuğun her birinin tabanına aktarın.

Plakaları streç filmle sarın ve yem hücrelerine hâlâ tutunmuş olan fajların 20 dakikanın sonunda bakterileri enfekte etmesini sağlamak için 37 °C'de 20 dakika bekletin. Plakaların sarımını açın. Ardından, 25 °C'deki BSA replikasyon bir kuyusundan 10 µL bakteri alın ve bir olarak işaretlenmiş 990 µL besiyerine aktarın.

Bu işlemi aynı kuyucuk için iki kez daha tekrarlayarak, o kuyucuktan alınan fagojenin 1 ila 100 dilüsyonundan oluşan üç triplikat elde edin; bu, üç kez örneklenen BSA replikasyonu bir'dir. Bu dilüsyonlar, söz konusu BSA replikasyonunun ortalama titresi artı veya eksi ortalama standart hatasını tahmin etmek için kullanılacaktır. Aynı işlemi BSA'nın ikinci ve üçüncü replikasyonları ile zehirli yem proteininin üç replike kuyucuğu ve yem proteini seti için de yapın; bu 27 EOR tüpünü bir kenara ayırın. Flasktaki bakteriler 0,6 ile 1,0 optik yoğunluktaysa, fern flasktan 50 milliliters hücreyi 9 adet 250 milliliter erlenmeyer flaskın her birine boşaltın.

BSA replikasyon bir kuyusunda kalan 170 µL faj enfekte BLT 5 4 0 3 bakterisini alın ve bunu BSA rep.One olarak işaretlenmiş 50 mL hücreye ekleyin. Erlenmayerleri 37 °C'lik inkübatörde çalkalamadan önce bu işlemi dokuz kuyunun tamamı için yapın. Bu sırada, einor tüp birdeki bakterili LB'den 100 µL alıp einor tüpteki 900 µL LB'ye ekleyerek başlangıçtaki 27 dilüsyondan seyreltmeler gerçekleştirin.

10⁻³ dilüsyonu için, dördüncü tüpten 100 µL bakterili LB alıp bunu epiprovetteki 900 µL LB'ye eklemeden önce filtre uçlu pipet ucunu atıp yenisini takın. 10⁻⁴ dilüsyonu için dördüncü tüpü kullanın; tüm proteinler ve uygulamaların tüm replikasyonlarının tüm triplikeleri için dilüsyon işlemine devam edin. Hücreler liz olduğunda toplamda 135 tüp olmalıdır.

Beş molar sodyum klorür stok çözeltisinden beş mililitre ekleyerek kültürü 0.5 molar sodyum klorür konsantrasyonuna getirin ve örneği etiketli bir santrifüj şişesine aktararak 4 °C'de 10 dakika boyunca 8,000 ×g'de santrifüjleyin. Ardından, virüs içeren süpernatantı temiz, steril bir 50 mililitrelik Falcon tüpüne dekante edin. Falcon tüpündeki dekante edilmiş süpernatanta birkaç damla kloroform ekleyin.

Süpernatan, üçüncü gündeki bir sonraki afinite seçimi için dört derece Celsius'ta saklanabilir; dört derece Celsius'taki VLT 5 4 0 3 hücrelerinden 250 mikrolitreyi, önceden hazırlanmış numaralı borosilikat test tüplerinin her birine pipetleyin. Ardından, bir numaralı tüpteki dilüsyondan 100 mikrolitreyi, bir numaralı borosilikat test tüpündeki 250 mikrolitre hücrenin içine pipetleyin. Pipetin ilk beş inçini alev üzerinde kısa süre ısıtın ve erimiş top aros'un içine daldırın.

Üç mililitre çekin ve hücrelerin ve fajların üzerindeki deney tüpüne hızla aktarın. Tüpü bir elle tutarken diğer elinizle parmağınızla hafifçe vurarak karıştırın ve ardından içeriği plağa dökün. Plağı eğerek, tüm plak üst agar ile kaplanana kadar hava kabarcıklarını ve kuru bölgeleri deney tüpü yardımıyla giderin.

Soğuması için tezgah üzerinde dik konumda bekletin. Borosilikat tüpü atın. Filtre bariyerli ucu çıkarıp yenisini alın ve tüm dilüsyonlar plakalandırılana kadar işleme devam edin.

Hazırlanan plakları, tükendikçe inkübatörden çıkarın; ancak aynı anda altı plakla sınırlı kalın, aksi takdirde plaklar soğur ve üst agar tabakası çok hızlı katılaşır; plaklarda oluşan plakları inceleyin ve konfluen lizis gösterenleri atın. Kalan seri dilüsyonlardan hangilerinin, doğru bir sayım yapmaya olanak tanıyacak kadar az plak ürettiğini belirleyin. Bu plakalardaki plak sayısını kaydedin ve afinite seçiminin sonundaki metin protokolünde açıklandığı şekilde titrasyon hesabına geçin. Dördüncü aşamada, steril bir sarı pipet ucu kullanarak iyi tanımlanmış 18 adet bireysel plak kolonisi seçin.

Bir eppendorf tüpü içindeki pH 8,5 tris hidroklorür ile ucun iç kısmını ıslatın. Ardından, ucu iyi izole edilmiş bir plağın içinden doğrudan altındaki plastik Petri kabına doğru iterek ve çekirdeği aspire ederek titrasyon plakalarındaki bu plaklardan örnekler alın; çekirdeği vortekslemeden önce uygun tüpteki 100 µL pH 8,5 tris hidroklorür içine boşaltın. Kısaca, bu hacimden 20 µL'yi 65 °C'de 10 dakika boyunca ısıtın ve burada gösterilen metin protokolünde açıklandığı gibi PCR ve sekanslama işlemlerine geçin; birkaç kez örnekleme yapılarak elde edilen tipik titrasyon sonuçları gösterilmiştir, nihai tahmini sayımlar pipetleme hatalarına karşı daha az hassastır ve gerçek titrasyonun ve bunun etrafındaki varyasyonun daha doğru bir tahminini sağlar.

Kuyu bazlı tahminler, afinite seçimi turlarının sayısı arttıkça, tercihen zehirsiz yem için faj titresinin arttığını göstermektedir. Bu durum aynı zamanda tekniğin çalıştığına dair güven vermektedir. Afinite seçimi turlarının sayısı arttıkça, zehirsiz yem kuyularında insert içeren fajların giderek artan bir yüzdesinin tutulması, ileri afinite seçimi turlarından sonra da umut vericidir.

İlk tura kıyasla insert içeren bağımsız olarak geri kazanılan fage sayısındaki artış ve bu amplikonların birkaç özdeş boyutlu bantta toplanması, bu afinite seleksiyonu prosedürünü takiben belirli klonların seçildiğinin iyi bir göstergesidir. Fage display ile keşfedilen etkileşimleri doğrulamak için mayalar iki hibrit (yeast two-hybrid) gibi diğer yöntemler uygulanabilir.