İlaç-protein Etkileşimlerinin Küresel Doğrulanması için Biyosensör Tabanlı Yüksek Verimli Biyopanning ve Biyoinformatik Analiz Stratejisi

Küçük moleküllü protein etkileşimlerinin tanımlanması, ilaçların araştırılması ve geliştirilmesinin yanı sıra virüs DTC'lerinin altında yatan patolojik mekanizmaları anlamamızı teşvik etmek için de gereklidir. Bu yöntem, ilaç tanıyan peptitlerin yüksek verimli biyopanlanmasını ve ilgilenilen küçük moleküllü ilaçlar için proteinler üzerindeki ilaç bağlanma bölgelerinin küresel olarak doğrulanmasını kolaylaştırır. Bir QCM sensör çipi hazırlamak için, 27 megahertz'lik bir QCM aparatının osilatörüne bir seramik sensör çipi takın ve küçük molekül immobilizasyonundan önce hava fazındaki içsel frekansı kaydedin.

Kayıttan sonra, çipi ayırın ve sensör çipinin altın elektrodu üzerinde kendi kendine monte edilmiş bir mono tabaka oluşturmak için% 70 etanol içinde bir milimolar küçük molekül türev çözeltisinden 20 mikrolitrelik bir damla dikkatlice ekleyin. Çipi nemli doku ile kaplı bir Petri kabına yerleştirin, elektrot yüzeyini ultra saf suyla nazikçe yıkamadan önce oda sıcaklığında bir saat boyunca ışıktan koruyun. Çipi yumuşak bir hava uygulamasıyla kurutun ve çipi QCM aparatına yükleyin.

Bir saat sonra, hareketsiz hale getirilen küçük molekülün miktarını ölçmek için hava fazındaki frekanstaki azalmayı kaydedin. T7 Faj Kitaplığı Biyopanlama için, dakikada 1000 devire ayarlanmış QCM biyosensörünün üzerine özel bir manyetik karıştırıcıya sahip bir küvet yerleştirin ve küvete sekiz mililitre reaksiyon tamponu ekleyin Tampon karıştırılırken QCM sensör çipini osilatöre takın Çipi tampona daldırmak ve QCM frekansını izlemeye başlamak için osilatörün kolunu basılı tutun. Sensör gramı, frekans kayması dakikada yaklaşık üç Hertz'e dengelendiğinde, küvete sekiz mikrolitre T7 faj kütüphanesi enjekte edin ve sensör üzerindeki enjeksiyon noktasını işaretleyin.

Altın elektrot yüzeyinde hareketsiz hale getirilen küçük moleküle bağlanan T7 fajlarının neden olduğu frekans düşüşünü izleyin. 10 dakika sonra, QCM frekans monitörünü durdurun ve sensör çipini partiden çıkarmak için osilatörü hızlı bir şekilde kaldırın, sensör çipini osilatörden ayırın ve tamponu çipten çıkarın. Kurutulmuş sensör çipini nemli bir Petri kabına yerleştirin ve altın elektrot üzerine 20 mikrolitrelik bir damla log faz E-coli konak hücresi ekleyin.

Çanağı, 37 santigrat derecede ve dakikada 1000 ila 1500 devirde 30 dakika boyunca 96 kuyulu bir mikroplaka karıştırıcı üzerine inkübe edin, bağlı T7 yedi fajın geri kazanımını artırmak için ışıktan korunun. İnkübasyonun sonunda, 20 mikrolitre E-coli süspansiyonunu 200 mikrolitre LB ortamına aktarın. Genel prosedüre göre, ortamda faj plak izolasyonunu ve her bir faj kapsidinde görüntülenen ilacı tanıyan peptit dizilerini tanıyan DNA dizilimini gerçekleştirin.

Sensör çipinin bakımından sonra, elektrot yüzeyini temizlemek için% 1 sodyum dodesil sülfat çözeltisine batırılmış pamuklu çubuk kullanın, altın yüzeyi ultra saf suyla yıkayın ve elektrodu hava ile kurulayın. Daha sonra elektrot yüzeyine beş mikrolitre taze hazırlanmış Parana solüsyonu ile beş dakika muamele edin, ardından ultra saf suyla yıkayın ve iki kez havayla kurutun. RELIC kullanarak biyoinformatik analiz yapmak için, Windows işletim sistemine sahip bir PC'de bağımsız RELIC programını açın ve her metin dosyasında hızlı A formatındaki ilacın seçilen 15 mer peptit veya tekli veya çoklu proteinlerin amino asit dizilerini kullanın.

Gerekli metin dosyalarını AA-div, info, motif, match, hetero align, fast A con veya fast A scan klasörüne yerleştirin. FTN 95'in kişisel sürümünü açmak için bağımsız klasördeki her yürütülebilir dosyaya tıklayın ve her programı çalıştırmak ve elde edilen metin formatı dosyasını elde etmek için komut satırına uygun dosya adını ve uzantısını girin. Elde edilen sonuç metin biçimi dosyaları burada gösterilir.

Ardından, yaklaşık 62'lik bir darbe kullanılarak hesaplanan bir bilgi içeriği grafiği veya kümülatif benzerlik puanları oluşturmak için ortaya çıkan metin dosyasını bir elektronik tabloya aktarın. Bu strateji kullanılarak, altı küçük moleküllü ilaç için hedef proteinler üzerindeki tekli ve çoklu küçük molekül bağlanma bölgeleri başarıyla tanımlanmıştır. Örneğin, klinik olarak onaylanmış ilacı tanıyan 29 peptit, kendi kendine monte edilmiş bir tek tabaka olarak hareketsiz hale getirildi, QCM biyosensör tabanlı bir döngü biyopanlama ile tanımlandı 29 peptit ve asetilkolinesterazın müteakip ikili olarak hizalanması, Irinotecan bağlanma bölgesini oluşturanlarla tutarlı olan spesifik amino asit kalıntıları için maksimum puanlar verdi.

Aynı peptit alt kümesi, Karboksilesterazdaki katalitik üçlünün yakınında da başarılı bir şekilde tanımlandı, bu da bu amino asitlerin de-esterifikasyon sırasında Irinotekan tanınması için bir iskele oluşturduğunu gösterdi. QCM sensör çipi altın elektrot yüzeyini kaplayan anti-grip ilacı Oseltamivir'i tanıyan 27 peptit, nöraminidazdaki oseltamivir bağlanma bölgesini başarıyla tespit etti. Bu bağlanma bölgesi, oseltamivir ile kenetlenirken potansiyel olarak dinamik harekete uğrayan yapılandırılmamış peptit halkalarından oluşur.

İlaçlar, bölgeler, kimyasallar, rekombinant bakteriyofajlar ve bakteriler biyolojik cenaze arabalarıdır ve kültür kazanım protokolüne göre ele alınmalıdır. Güvenlik için her zaman eldiven, gözlük ve laboratuvar önlüğü giymeyi unutmayın. Bu prosedürü takiben, çeşitli ilaçlar için hedef proteinler, ilgilenilen ilaçların moleküler mekanizmalarını ve potansiyel terapötik etkinliğini anlamak için insanlarda, patolojik virüslerde ve hatta bitkilerde küresel olarak doğrulanabilir.