Name: Faj-görüntülenen Sentetik Antikor Kütüphaneler itibaren Ölçeklenebilir Yüksek Verim Seçimi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-01-17T15:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 55 s
Description: Keşfedin, faj-görüntülenen kütüphanelerden yüksek afiniteli Fab antikor fragmanlarını ölçeklenebilir yüksek verim yöntemiyle izole etme tekniğini. Bu yöntem, yüzlerce antijene karşı paralel seçim yaparak immünoloji ve antikor mühendisliği araştırmalarını hızlandırır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Biz NIH Ortak Fonu kabul etmek istiyorum - Protein Yakalama Reaktifler Programı Rekombinant Antikor Ağ antikor seçimi ve karakterizasyonu boru hattı ve robotik seçim platformunun finansman alımı için Yenilik Kanada Vakfı gelişimini finansmanı için.

<ol><li>Winter, G., Milstein, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Man-made+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Man-made antibodies.</a> Nature. 349, 293-299 (1991).</li>
<li>Miersch, S., Sidhu, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthetic+antibodies%3A+concepts%2C+potential+and+practical+considerations%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Synthetic antibodies: concepts, potential and practical considerations.</a> Methods. 57, 486-498 (2012).</li>
<li>Schofield, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+phage+display+to+high+throughput+antibody+generation+and+characterization%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">Application of phage display to high throughput antibody generation and characterization.</a> Genome Biol. 8, R254(2007).</li>
<li>Hust, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+human+scFv+antibody+generation+pipeline+for+proteome+research%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">A human scFv antibody generation pipeline for proteome research.</a> J. Biotechnol. 152, 159-170 (2011).</li>
<li>Colwill, K., Graslund, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+roadmap+to+generate+renewable+protein+binders+to+the+human+proteome%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">A roadmap to generate renewable protein binders to the human proteome.</a> Nat. Methods. 8, 551-558 (2011).</li>
<li>Mersmann, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Towards+proteome+scale+antibody+selections+using+phage+display%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Towards proteome scale antibody selections using phage display.</a> Nat. Biotechnol. 27, 118-128 (2010).</li>
<li>Pershad, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generating+a+panel+of+highly+specific+antibodies+to+20+human+SH2+domains+by+phage+display%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Eng.+Des.+Sel%22%5BJournal%5D)">Generating a panel of highly specific antibodies to 20 human SH2 domains by phage display.</a> Protein Eng. Des. Sel. 23, 279-288 (2010).</li>
<li>Turunen, L., Takkinen, K., Soderlund, H., Pulli, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+panning+and+screening+procedure+on+microplates+for+antibody+generation+from+phage+display+libraries%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomol.+Screen%22%5BJournal%5D)">Automated panning and screening procedure on microplates for antibody generation from phage display libraries.</a> J Biomol. Screen. 14, 282-293 (2009).</li>
<li>Hughes, R. A., Miklos, A. E., Ellington, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+synthesis%3A+methods+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Gene synthesis: methods and applications.</a> Methods Enzymol. 498, 277-309 (2011).</li>
<li>Boersma, Y. L., Pluckthun, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DARPins+and+other+repeat+protein+scaffolds%3A+advances+in+engineering+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">DARPins and other repeat protein scaffolds: advances in engineering and applications.</a> 22, 849-857 (2011).</li>
<li>Terpe, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overview+of+tag+protein+fusions%3A+from+molecular+and+biochemical+fundamentals+to+commercial+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Microbiol.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Overview of tag protein fusions: from molecular and biochemical fundamentals to commercial systems.</a> Appl. Microbiol. Biotechnol. 60, 523-533 (2003).</li>
<li>Lichty, J. J., Malecki, J. L., Agnew, H. D., Michelson-Horowitz, D. J., Tan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+affinity+tags+for+protein+purification%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Expr.+Purif%22%5BJournal%5D)">Comparison of affinity tags for protein purification.</a> Protein Expr. Purif. 41, 98-105 (2005).</li>
<li>Fellouse, F. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+generation+of+synthetic+antibodies+from+highly+functional+minimalist+phage-displayed+libraries%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">High-throughput generation of synthetic antibodies from highly functional minimalist phage-displayed libraries.</a> J. Mol. Biol. 373, 924-940 (2007).</li>
<li>Paduch, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generating+conformation-specific+synthetic+antibodies+to+trap+proteins+in+selected+functional+states%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Generating conformation-specific synthetic antibodies to trap proteins in selected functional states.</a> Methods. 60, 3-14 (2013).</li>
<li>Studier, F. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+production+by+auto-induction+in+high+density+shaking+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Expr.+Purif%22%5BJournal%5D)">Protein production by auto-induction in high density shaking cultures.</a> Protein Expr. Purif. 41, 207-234 (2005).</li>
<li>Huang, H., Sidhu, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studying+binding+specificities+of+peptide+recognition+modules+by+high-throughput+phage+display+selections%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Studying binding specificities of peptide recognition modules by high-throughput phage display selections.</a> Methods Mol. Biol. 781, 87-97 (2011).</li>
<li>McLaughlin, M. E., Sidhu, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+and+analysis+of+peptide-recognition+domain+specificities+by+phage+display+and+deep+Sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Engineering and analysis of peptide-recognition domain specificities by phage display and deep Sequencing.</a> Methods Enzymol. 523, 327-349 (2013).</li>
<li>Bradford, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+and+sensitive+method+for+the+quantitation+of+microgram+quantities+of+protein+utilizing+the+principle+of+protein-dye+binding%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding.</a> Anal. Biochem. 72, 248-254 (1976).</li>
<li>den Engelsman, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strategies+for+the+assessment+of+protein+aggregates+in+pharmaceutical+biotech+product+development%5BTitle%5D)+AND+%22Pharm.+Res%22%5BJournal%5D)">Strategies for the assessment of protein aggregates in pharmaceutical biotech product development.</a> Pharm. Res. 28, 920-933 (2011).</li>
<li>Lavinder, J. J., Hari, S. B., Sullivan, B. J., Magliery, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+thermal+scanning%3A+a+general%2C+rapid+dye-binding+thermal+shift+screen+for+protein+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">High-throughput thermal scanning: a general, rapid dye-binding thermal shift screen for protein engineering.</a> J. Am. Chem. Soc. 131, 3794-3795 (2009).</li>
<li>Fellouse, F. A., Sidhu, S. S. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aFellouse%2C+FA+%22Making+antibodies+in+bacteria.+in+Making+and+Using+Antibodies%3A+A+Practical+Handbook%22">Making antibodies in bacteria. in Making and Using Antibodies: A Practical Handbook</a>. Howard, G. C., MR, K. aser , CRC Press. Boca Raton, Florida. 151-172 (2013).</li>
<li>Acton, T. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+protein+samples+for+NMR+structure%2C+function%2C+and+small-molecule+screening+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Preparation of protein samples for NMR structure, function, and small-molecule screening studies.</a> Methods in Enzymology. 483, 23-47 (2011).</li>
<li>Mahon, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+interrogation+of+a+minimalist+synthetic+CDR-H3+library+and+its+ability+to+generate+antibodies+with+therapeutic+potential%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Comprehensive interrogation of a minimalist synthetic CDR-H3 library and its ability to generate antibodies with therapeutic potential.</a> J. Mol. Biol. 425, 1712-1730 (2013).</li>
<li>Persson, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CDR-H3+diversity+is+not+required+for+antigen+recognition+by+synthetic+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">CDR-H3 diversity is not required for antigen recognition by synthetic antibodies.</a> J. Mol. Biol. 425, 803-811 (2013).</li>
<li>Bradbury, A. R., Sidhu, S., Dubel, S., McCafferty, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beyond+natural+antibodies%3A+the+power+of+in+vitro+display+technologies%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Beyond natural antibodies: the power of in vitro display technologies.</a> Nat. Biotechnol. 29, 245-254 (2011).</li>
</ol>

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

In vitro antikor seçimleri yapılırken, seçim başarısı iki temel belirleyicileri üzerine seçilmesi için) iyi katlanmış antijenik hedefler izolasyon 1 ve 2) yüksek fonksiyonel çeşitlilik antikor kütüphanesinin fırsat. Bir çok durumda, iyi bir şekilde katlanmış, tam-boy proteinin yeterli miktarda bulunması sınırlayıcı olabilir. Bu sınırlamayı aşmak için bir yaklaşım, uygun bir afinite etiketine sahip bir bakteriyel ekspresyon vektörü içine sokulması için biyoinformatik analizi 22 tanımlanır ve ...

Post-genomik yaş başlaması ile karakterize ve proteinleri modüle kaliteli bağlayıcı reaktif durumu, yeni araştırma ve tedavi yollar açmak için esastır. Antikorlar, temel araştırma ve teşhis araçları ve potansiyel terapötik olarak hem akademik hem de endüstriyel araştırmacılara önemli olmaya devam etmektedir. Değil şaşırtıcı, özel antikorlar üretmek için geleneksel hibridoma teknolojileri güvenmek çoğu sözleşme antikor geliştirme firmaları, etkileyici bir büyüme olmuştur. Bununla birlikte, faj-görüntülenen antikor kütüphaneleri kullanılarak in vitro seçimi geleneksel teknolojiler sınırlamalar 1, 2 yüz benzersiz avantajlar ve başarı sunabilir güçlü bir alternatif teknoloji haline geliyor. Araştırma araçları, üretmek için iki temel sorunlar olarak yüksek kaliteli antikorlar için önemli talep ışığında yenilenebilir antikorlar 1) Seçim çıktı ve 2) antijen av vardırailability. Grupların bir dizi şimdi verim ve antikor tanımlama oranını artırmaya yönelik in vitro seçim boru hatları tarif var. Bu açıklamalar detay tam uzunlukta ya üzerine seçerek dahil canlı yaklaşımların çeşitli kullanarak, 3,4 hedefler, veya yapısal etki 5,6,7 ilgili ya boncuk-tabanlı 6,8 veya 3,4 antijen immobilizasyon düzenleri tabanlı plaka. Buna ek olarak, gen sentezi teknolojileri 9 artan kabul maliyet etkin ve potansiyel olarak saflaştırılmış, tam uzunlukta antijenin yeterli miktarlarda elde etmede güçlükle hafifletmek, özellikle izole edilmiş alanlarının sistematik antijen üretimi yaptı. Tandem iki teknolojiyi kullanarak, kendi kendine yeten ve ölçeklenebilir antijen üretimi ve antikor seçimi boru hattı dile antijen alanların büyük kümeleri için antikorların paralel izolasyonunu sağlamak ve cha için reaktiflerin gelişimi kolaylaştırmak olacağını icat edildiyapısal ve işlevsel olarak ilgili proteinlerin bütün sınıfları racterizing. Bu amaçla, eksprese antijen etki gen sentezi, antijenler ve ölçeklenebilir faj gösterimli antikor seçimleri yüksek verimlilik bakteriyel ifade silico tanımlanmasında çiftler geliştirilmiştir entegre bir boru hattı doğru. Bu boru hattı (lisans veya malzeme transferi anlaşması ile giderek mevcut antikor kütüphaneleri dahil) en yaşam bilimleri laboratuvarlarının mevcut sadece temel altyapı gerektirir, ama aynı zamanda bir endüstriyel ölçekte kullanım için otomasyona müsait. Bu protokol kullanılarak, afinite-etiketli antijen etki yüzlerce üretmek mümkündür ve rutin olarak bu antijenlerin çoğu son derece spesifik antikor fragmanları izole eder. Faj ekran teknolojisi Fab, scFv ve özerk Fv etki ve a içeren rekombinant afinite reaktif biçimleri çok çeşitli gösterdi uyumluluk göstermiştirküçük &#39;alternatif çerçeveler&#39; (tasarlanmış ankirin tekrar proteinleri (DARPINS), fibronektin (Fn), lipokalin etki ve daha 10) artan dizi. Bu yöntemler, kütüphanelerin diğer tiplerine adapte edilebilir kabul edilir, ancak Tartışma, antikorun ve antijenin Fab fragmanlarının izolasyonu için bu örnekteki sınırlıdır. Bu teknolojiyi kullanarak, küçük düşük nanomolar afinite ile Fab&#39;ler, tam boy bir protein bağlama ve bağışıklık gibi bağışıklık tahlillerinde işlevsel olan birçok RNA bağlayıcı proteinler ve diğer başarılı seçilmiştir transkripsiyon faktör etki, SH2 etki alanları, de dahil olmak üzere protein alanlarının etiketli , immunopresipitasyon ve immunohistokimyasal. Önemlisi, rekombinant bağlayıcı klonlar tamamen yenilenebilir ve ifadeden yeniden üretilebilir ve böylece titiz klon doğrulama gider haklı, bakteriyel üretim sunan artan tutarlılık, tekrarlanabilirlik ve maliyet-etkililik yoluyla oluşturur. Bu prot olarakocol ve eşlik eden video, immobilize edilmiş antijen sahaları kullanılarak faj görüntülemeli kütüphanelerinden antikor seçimi için temel yöntem gösterilmektedir. Diğer etiketler 11,12,13 ve seçim formatları da başarılı bir şekilde kullanılmıştır 13,14,2 rağmen, bu özel bir yöntem olup, mikro plakalar içinde pasif adsorpsiyonla da immobilize edilmiş GST-etiketli protein etki kullanmaktadır. Belirlenmesi ve doğrulama için özel zenginleştirilmiş klonal antikorlar izole yönelik seçim parametreleri paralel izleme seçimleri kurulumu ve yürütülmesi için kritik hususlar ayrıntılı olarak açıklanmıştır.

<table><tbody><tr><td>MALZEMELER</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>New Brunswick Innova44 istiflenebilir inkübatör çalkalayıcı</td><td>Eppendorf</td><td>M1282-0004</td><td></td></tr><tr><td>Liquidator 96 kanallı manuel tezgah üstü pipetleme sistemi</td><td>Anachem Ltd</td><td>LIQ-96-200</td><td></td></tr><tr><td>Mikroplaka çalkalayıcı</td><td>VWR</td><td>12620-926</td><td></td></tr><tr><td>ThermoScientific Sorvall ST-40 tezgah üstü santrifüj</td><td>Termo Ürün</td><td></td><td></td>75004525</tr><tr><td>ELx405 Select Derin Kuyu Mikroplaka Yıkayıcı</td><td>Biotek</td><td>ELX405USD</td><td></td></tr><tr><td>Özel Yüksek Verimli Otomatik Faj Seçim Robotu</td><td>S & P Robotics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Plastik konik Falcon tüpü: 50 ml</td><td>VWR</td><td>21008-178</td><td></td></tr><tr><td>Plastik konik Falcon tüpü: 15 ml</td><td>VWR</td><td>89039-668</td><td></td></tr><tr><td>Axygen 1.7 ml mikrosantrifüj tüpleri</td><td>Corning</td><td>MCT-175-LC</td><td></td></tr><tr><td>96 kuyulu/384 kuyulu Maxisorp plakası</td><td>Sigma</td><td>M9410-1CS</td><td></td></tr><tr><td>Corning 96 kuyulu V-dipli derin kuyu bloğu</td><td>Corning</td><td>3960</td><td></td></tr><tr><td>Axygen Mini tüp 96 kuyulu steril mikroplaka mavi kutu</td><td>Corning</td><td>AXY-MTS-06-CRS</td> Nefes alabilen yapışkan plaka sızdırmazlık filmi VWR 60941-084 REAKTİFLER <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Şirket Adı</td><td></td><td>Katalog Numarası</td><td></td></tr><tr><td>polietilen glikol</td><td>Bioshop</td><td>PEG800.1</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>maya özü</td><td>Bioshop</td><td>YEX401.1</td><td></td></tr><tr><td>biyo-tripton</td><td>Bioshop</td><td>TRP402.1</td><td></td></tr><tr><td>NZ amin</td><td>Sigma</td><td>C7290</td><td></td></tr><tr><td>glikoz</td><td>Sigma</td><td>G8270-1KG</td><td></td></tr><tr><td>laktoz</td><td>Bioshop</td><td>LAC234</td><td></td></tr><tr><td>gliserol</td><td>Bioshop</td><td>GLY001.500</td><td></td></tr><tr><td>karbenisilin ve nbsp;</td><td>Bioshop</td><td>CAR544.10</td><td></td></tr><tr><td>kanamisin</td><td>Bioshop</td><td>KAN201.25</td><td></td></tr><tr><td>tetrasiklin ve nbsp;</td><td>Biyoshop</td><td>TET701.25</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Biyodükkan</td><td>TWN510.500</td><td></td></tr><tr><td>monobazik potasyum fosfat</td><td>Biyoshop</td><td>PPM302.1</td><td></td></tr><tr><td>dibazik sodyum fosfat</td><td>Anachemia</td><td>84486-440</td><td></td></tr><tr><td>sodyum klorür</td><td>Bioshop</td><td>SOD001.10</td><td></td></tr><tr><td>potasyum klorür</td><td>Bioshop</td><td>POC308.1</td><td></td></tr><tr><td>kalsiyum klorür</td><td>Bioshop</td><td>CCL302.500</td><td></td></tr><tr><td>magnezyum sülfat</td><td>EMD</td><td>MX0070-1</td><td></td></tr><tr><td>magnezyum klorür</td><td>Bioshop</td><td>MAG510.500</td><td></td></tr><tr><td>NH4Cl</td><td>Amresco</td><td>0621-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Na2SO4</td><td>Bioshop</td><td>SOS513.500</td><td></td></tr><tr><td>agar</td><td>Bioshop</td><td>AGR001.500</td><td></td></tr><tr><td>SybrSafe DNA jel lekesi</td><td>Invitrogen</td><td>S33102</td><td></td></tr><tr><td>fosforik asit</td><td>Acros Organics</td><td>201140010</td><td></td></tr><tr><td>lizozim</td><td>Bioshop</td><td>LYS702.25</td><td></td></tr><tr><td>benzonaz</td><td>Novagen</td><td>71205</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td></td><td>Bioshop</td><td>TRX506.500</td></tr><tr><td>proteaz inhibitörü kokteyli tabletler</td><td>Roche</td><td>11 836 170 001</td><td></td></tr><tr><td>Ni-NTA reçinesi&nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>1018240</td><td></td></tr><tr><td>1.000x yardımcı faj (M13K07) stoğu (ml başına 1013 faj)</td><td>NEB</td><td>N0315S</td><td></td></tr><tr><td>HRP konjuge M13-spesifik antikor (anti-M13-HRP).</td><td>GE Healthcare</td><td>27-9241-01</td><td></td></tr><tr><td>TMB substratı: eşit hacimlerde TMB ve H2</sub<>Osub>2 peroksidaz substratı&nbsp; karıştırın;</td><td>KPL</td><td>50-76-00</td><td></td></tr><tr><td>dNTP'ler</td><td>Biyotemel</td><td>DD0056</td><td></td></tr><tr><td>Taq polimeraz</td><td>Genscript</td><td>E00007</td><td></td></tr><tr><td>Eksonükleaz</td><td>GE Sağlık&nbsp;</td><td>EZ0073X-EZ</td><td></td></tr><tr><td>Karides alkalin fosfataz</td><td>GE Healthcare</td><td>E70092Z-EZ</td><td></td></tr></tbody></table>

faj-görüntülenen sentetik antikor kütüphaneler itibaren Ölçeklenebilir yüksek verim seçimi

Scalable High Throughput Selection From  Phage-displayed Synthetic Antibody Libraries

hem temel hem de klinik araştırma uygulamaları ihtiyaçlarını karşılamak antikorlar için talep yüksek olduğu ve dramatik gelecekte artacak. Ancak, geleneksel monoklonal teknolojileri bu göreve kadar yalnız olmadıklarını açıktır. Bu proteom tüm erişilebilir elemanlarına yüksek kalite ve yenilenebilir afinite reaktifler için talebi karşılamak için alternatif yöntemlerin geliştirilmesine yol açmıştır. Bu amaç doğrultusunda, faj-görüntülenen sentetik antikor kütüphanelerinden seçimleri yürütmek için yüksek kapasiteli yöntemleri farklı antijenleri içeren uygulamalar için geliştirilmiştir ve hızlı verim ve başarı için optimize edilmiş. Burada, bir protokol video gösterimi ile bir kılavuzu 96 kanal sıvı tutucu veya otomatik robot sistemi kullanarak hedefleri yüzlerce karşı yüksek çeşitlilik kütüphanelerinden Fab faj klonlarının paralel seçimi göstermektedir ayrıntılı olarak tarif edilmiştir. Bu protokol kullanılarak, tek bir kullanıcı antijenlerin yüzlerce oluşturmak,Paralel onlara antikorları seçmek ve 6-8 hafta içinde antikor bağlanmasını doğrulamak. Vurgulanan şunlardır: i) uygulanabilir bir antijen biçimi, ii) ön seçim antijen karakterizasyonu, iii) kritik özel ve yüksek afinite klonlarının seçimi etkileyen adımlar, ve iv) izleme seçim etkinliği ve erken evre antikor klon karakterizasyonu yolları. Bu yaklaşım ile, tek geçişli membran reseptörleri salgılanmış protein hormonları, ve çoklu alan hücre içi proteinler de dahil olmak üzere pek çok hedef sınıflarına sentetik antikor fragmanları (Fab&#39;lar) elde edilmiştir. Bu fragmanlar, tam uzunluktaki antikorlar dönüştürülür ve yüksek bir çekim ve özelliğe arzettiği doğrulanmıştır. Dahası, Western blotting, ELISA, hücresel bağışıklık, immüno-çökeltme ve ilgili deneyler de dahil olmak üzere, standart bağışıklık tahlilleri, çeşitli işlevsel olduğu gösterilmiştir. Bu metodoloji antikor keşif hızlandırmak ve sonuçta amaç o hayata yakın bize getirecekf proteomu yenilenebilir, yüksek kaliteli antikorlar üreten.

Burada tarif edilen protokol paralel Birleşimsel faj gösterimli Fab kütüphanelerinden structurally- ve işlevsel olarak bağlı antijen alanlarının ikisinin de çeşitli antikor fragmanlarının izole edilmesi için kullanılmıştır. Antijen durumu ile ilgili sorunlar antikor seçiminde 23 için uygun olan eksprese antijen etki silico tanımlanmasında göre, pek çok durumda, atlatılabilir. Aynı laboratuar içinde antikor seçimi için (Şekil 1) bir antijen ifade bağlanması ile, seçime Kritik antijen parametre...

Bir yöntem olup, aynı anda antijenlere karşı yüz Faj gösterimli birleştirici sentetik antikor kütüphanelerinden, ölçeklenebilir, yüksek verimli seçimleri yürütmek için görsel eşliğinde tarif edilmektedir. Bu paralel yaklaşımı kullanarak, standart bağışıklık tahlillerinde işlevsel çeşitli antijenler için yüksek bir çekim ve özelliğe gösteren antikor fragmanları izole ettik.

Faj-görüntülenen Sentetik Antikor Kütüphaneler itibaren Ölçeklenebilir Yüksek Verim Seçimi

The demand for antibodies that fulfill the needs of both basic and clinical research applications is high and will dramatically increase in the future. ...

Bu ölçeklenebilir prosedürün genel amacı, yüzlerce antijenik hedef domaine karşı paralel seçime olanak tanıyan yüksek verimli bir yaklaşım kullanarak, fago ekranlı bir kütüphaneden spesifik ve yüksek afiniteli fab fago klonlarını izole etmektir. Bu işlem, öncelikle saflaştırılmış antijenik domainlerin mikro kuyucuklu plakalara immobilize edilmesiyle gerçekleştirilir. Sonraki adımlar; ardışık seçim turlarında, mikroplakaya immobilize edilmiş antijene spesifik olarak bağlanan fab fago klonlarının maruz bırakılması, yakalanması, serbest bırakılması ve amplifiye edilmesidir.Bu süreç boyunca, seçimin etkinliği her adımda havuzlama yöntemleri kullanılarak izlenir. Son adım, izole edilen fab klonlarının özgünlüğünün, afinitesinin ve/veya aktivitesinin değerlendirilmesidir. Nihayetinde, çok sayıda antijene karşı özgün ve yüksek afiniteli fab fragmanları paralel olarak izole edilir; bu da yapısal veya fonksiyonel olarak ilişkili protein sınıflarının analizinde yararlı olan antikorların üretilmesine olanak tanır.Bu yöntemin önemi, hem akademik hem de endüstriyel laboratuvarlarda geleneksel antikor geliştirme teknolojilerinin kısıtlamalarının aşılmasına yardımcı olabilecek ve sürecini hızland

scalable-high-throughput-selection-from-phage-displayed-synthetic

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Bu videoda, hedef proteine yüksek afiniteye sahip proteinleri ifade eden önceden tasarlanmış fajları izole etmek için faj görüntüleme tekniğini gösteriyoruz.

Bir Hedef Proteine Yüksek Afiniteye Sahip Proteinleri Seçmek için Faj Ekranını Kullanma

Faj gösterimi, bir ilgi hareketsiz molekülü ile etkileşen proteinleri ya da protein parçaları yakalamak için güçlü bir tekniktir. Oluşturmak için faj cDNA kütüphanesi türüne ve ekranın bir karar yapıldıktan sonra, burada açıklanan protokol interactors tanımlanmasına yol açan verimli benzeşim seçimine izin verir.

Rekombinant Protein Yemler Kullanarak Phage Ekran ve Affinity seçimi için Protokol

Açıklanan protokollere izin ver inşaat, karakterizasyonu ve DNA, herhangi bir kaynaktan yapılan bir "domainome" kitaplığının (karşı seçim hedef) seçimi. Bu farklı teknolojileri bir araya getiren bir araştırma boru hattı tarafından sağlanır: faj ekran, katlama muhabir ve sonraki nesil sıralama veri analizi için bir web aracı ile.

Interactome-Seq: Domainome kitaplığı inşaat, doğrulama ve seçim fajının görüntü ve sonraki nesil sıralama için bir protokol

Bu iletişim kuralı özel çeşitliliği ile sentetik antikor fajının görüntülenen Kütüphane inşaatı için detaylı bir yordam açıklanır. Sentetik antikorlar temel araştırma geniş uygulamalardan hastalığı teşhis ve tedavi için var.

Sentetik fajının inşaatı Fab Kütüphane özel çeşitliliği ile görüntülenir.

Herhangi bir küçük molekül ligand için istenilen yakınlık ve özgüllük ile kimyasal kaynaklı protein dimerizasyon sistemleri oluşturma birçok biyolojik algılama ve harekete uygulama olacaktır. Burada, faj la görüntülenen tek etki alanı antikor kütüphanesinin adım adım seçimi yoluyla kimyasal olarak indüklenen dimerizasyon sistemlerinin de novo mühendisliği için etkili, genelleştirilebilir bir yöntemi tanımlıyoruz.

Bir Kombinatoryal Tek Etki Alanı Antikor Kütüphanesi adım wise Faj Seçimi ile Son Derece Spesifik Kimyasal Kaynaklı Protein Dimerization Sistemleri Oluşturma

Bu çalışma, ilaç-peptit etkileşimlerini tanımlamak için bir strateji sunmayı amaçlamaktadır. Strateji, bir kuvars-kristal mikro denge (QCM) biyosensörüne dayanan ilaç tanıyan kısa peptitlerin biyopannasyonunu ve ardından ilaç tanıma ve ilaç bağlayıcı bölgelerin proteinler üzerinde ek açıklama için elde edilen bilgileri nicel olarak değerlendirmek için biyoinformatik analizini içerir.

İlaç-protein Etkileşimlerinin Küresel Doğrulanması için Biyosensör Tabanlı Yüksek Verimli Biyopanning ve Biyoinformatik Analiz Stratejisi

Her yerde, disrrengülasyonu çok sayıda insan hastalığına karışmış kritik bir protein post-translational modifikasyondur. Bu protokol, faj ekranının, her yerde bulunmanın özgüllüğünü, verimliliğini ve kalıplarını kontrol eden E3 ligaslarının aktivitesini bağlayabilen ve modüle edebilen yeni ubiquitin varyantlarını izole etmek için nasıl kullanılabileceğini açıklar.

E3 Ligases için Ubiquitin Varyant Modülatörleri Geliştirmek için Faj Ekran Kullanma

Bu protokol, ilgilenilen bir antijene bağlanan protein varyantlarını zenginleştirmek için maya yüzeyi teşhir seçimi kampanyalarının yürütülmesi için temel adımları açıklar.

Maya Yüzey Ekranı ile Protein Mühendisliği

Bu yöntem, yüksek hassasiyet enfekte olmuş fareler bronkoalveoler lavaj (BAL) sıvısında H1N1 tespiti için Kızılötesi boya temelli görüntüleme sisteminin kullanımı açıklanmaktadır. Bu metodoloji, bir 96 veya plaka 384-iyi, test malzemesi &lt;10 ul hacmi gerektirir ve birden fazla patojenlerin eşzamanlı tarama için bir potansiyele sahiptir.

Gribi için yüksek verimlilik Tespit Yöntemi

Kök-ur nematodları ile ekran bitkiler için iki farklı yöntem tarif edilmiştir. Açıklanan yaklaşımlar ıslah programlarında bu bitkilerin kullanımı kolaylaştıran bir zarar vermeden nematodlar ile yüksek verimlilik ekranlar yer alıyor.

Kök-ur Nematod ile Yüksek ve Düşük Throughput Ekranlar Meloidogyne spp.</em

Keşfedin, faj-görüntülenen kütüphanelerden yüksek afiniteli Fab antikor fragmanlarını ölçeklenebilir yüksek verim yöntemiyle izole etme tekniğini. Bu yöntem, yüzlerce antijene karşı paralel seçim yaparak immünoloji ve antikor mühendisliği araştırmalarını hızlandırır.

Faj-görüntülenen Sentetik Antikor Kütüphaneler itibaren Ölçeklenebilir Yüksek Verim Seçimi

Daha fazla video keşfet