Faj-görüntülenen Sentetik Antikor Kütüphaneler itibaren Ölçeklenebilir Yüksek Verim Seçimi

Bu ölçeklenebilir prosedürün genel amacı, yüzlerce antijenik hedef alana karşı paralel seçim sağlayan yüksek verimli bir yaklaşım kullanarak belirli ve yüksek afiniteli fab faj klonlarını faj görüntülenen bir kitaplıktan izole etmektir. Bu, önce saflaştırılmış antijenik alanların mikro kuyucuk plakalarında hareketsiz hale getirilmesiyle gerçekleştirilir. Sonraki adımlar, ardışık seçim turlarında mikroplaka immobilize antijene spesifik olarak bağlanan fab faj klonlarını açığa çıkarmak, yakalamak, serbest bırakmak ve çoğaltmaktır.

Bu işlem sırasında, seçimin etkinliği her adımda havuzlanmış yöntemler kullanılarak izlenir. Son adım, izole edilmiş fab klonlarının özgüllüğünü, afinitesini ve/veya aktivitesini değerlendirmektir. Sonuç olarak, çok sayıda antijene karşı spesifik yüksek afiniteli fab fragmanları paralel olarak izole edilir, bu da yapısal veya fonksiyonel olarak ilişkili proteinlerin tüm sınıflarının analizinde yararlı olan antikorların üretilmesini sağlar.

Bu yöntemin önemi, akademik veya endüstriyel bir laboratuvarda sınırlamaların üstesinden gelmeye ve geleneksel antikor geliştirme teknolojilerinin hızını artırmaya yardımcı olabilecek bir alternatif sunmasıdır. Bu tekniğin hibridoma gibi geleneksel antikor geliştirme tekniklerine göre en büyük avantajı, hayvanların kullanılmasını gerektirmemesidir. Toksik ve immünojenik olmayan proteinler dahil olmak üzere hemen hemen her protein için kullanılabilir.

Göreceğimiz gibi, kolayca paralelleştirilir ve sonuçta, altı ila sekiz hafta gibi kısa bir sürede belirli antijenlere özgü yüksek afiniteli bir antikor ve fonksiyonel ve standart immünolojik testleri kodlayan yenilenebilir rekombinant DNA verir. Biyotıp araştırmalarında antikorların önemi göz önüne alındığında, hem büyüklük hem de mevcut kaynaklar açısından değişen laboratuvarlara erişilebilirliği korurken, antijen üretimini ve antikor seçimini ve tanımlamasını yüksek verimli bir yaklaşıma uyarlama ve ölçeklendirme fırsatı gördük. Faj seçimi gününün sabahında, T bir faj dirençli e coli hücresinden oluşan tek bir koloni seçin.

Mililitre başına 50 mikrogramda tetrasiklin içeren iki yt ortamının bir mililitresine ekleyin. Koloninin 2,5 santimetrelik bir orbital çalkalayıcıda 200 RPM'de sallayarak kuluçkaya yatmasına izin verin. Kültürün büyümesi görsel olarak belirgin hale geldiğinde, hücreleri tetrasiklin ile takviye edilmiş gerekli hacimdeki ortama aktarın.

Seçim kuyusu başına 100 mikrolitre veya 96 başına yaklaşık 10 mililitre için yeterli olması gerekir. Kuyu plakası, kültürün alikotlarını hem karbon penisilin hem de kanin takviyeli ortama genişletir. Bu kültürler, amplifikasyon için kullanılacak hücrelerde ön enfeksiyona karşı koruma sağlar.

Kültürün optik absorbansı 595 nanometrede 0,4 ila 0,8'e ulaştığında. Beş ila yedi saat sonra, hücreler antijen plakalarına uygulanmaya hazırdır. Bu protokolün kütüphanenin istenen kapsamını sağlaması için, yeterli sayıda replike antijen plakası ve spesifik olmayan kontrol protein plakaları hazırlayın.

Görüntülenen hesaplama detaylarını kullanarak metin protokolünde verilmiştir. Hedef ve spesifik olmayan kontrol proteinlerinin gece boyunca immobilizasyonundan sonra, protein çözeltisini plakadan çıkarın. 200 mikrolitre bloke edici tampon ekleyin ve çalkalayarak bir saat boyunca bloke edin ve hücreler büyürken faj kütüphanesini eklemeden önce plakayı dört kez yıkayın.

Faj seçimi gününde, 100 mikrolitre faj kütüphanesini negatif negatif seçim plakalarına aktararak spesifik olmayan veya etikete özgü bağlayıcı faj görüntülenen FAB klonlarını kütüphaneden önceden temizleriz. Fazla miktarda çözünür afinite etiketi ekleyerek etiket bağlama fajını çıkarın. Bunu yapmak için, her birine 10 mikromolar nihai çözünür GST konsantrasyonu ekleyin.

Daha sonra plakaları oda sıcaklığında bir çalkalayıcı üzerinde bir ila iki saat inkübe edin. Hedef protein plakasını plakadan aspire eden protein çözeltisini hazırlamak için, 200 mikrolitre bloke edici tampon ekleyin ve faj kütüphanesini eklemeden önce çalkalayarak bir saat boyunca bloke edin ve dört kez yıkayın. Kuluçka işleminden sonra, faj snatını plakalardan toplayın.

96 kanallı bir sıvı işleyici kullanarak, faj supinatı antijen kaplı plakalara aktarın. Daha sonra plakaları oda sıcaklığında bir çalkalayıcı üzerinde bir ila iki saat inkübe edin. İnkübasyondan sonra, PT tamponu kullanarak kuyucukları sekiz ila 15 kez yıkayarak bağlanmamış fajı çıkarın.

Bu manuel olarak veya otomatik bir plaka yıkayıcı ile yapılabilir. Daha sonra hücreleri eklemeden hemen önce, hücreler ve antijen plakaları hazır olduğunda tüm fazla yıkama tamponunu çıkarın. Her bir oyuğa 100 mikrolitre büyüyen hücre ekleyerek fajı yükseltin ve plakaların yarım saat boyunca 37 santigrat derecede inkübe etmesine izin verin.

İlk birkaç seçim turunun önemli bir zenginleştirme üretmesi beklenmemektedir, ancak çıktı faj titrelerinin nicelleştirilmesi, başarılı seçimler için gereken minimum faj konsantrasyonlarının yanılsamasını sağlayabilir. Bunu yapmak için, hücrelerin antibiyotik takviyeli agar plakaları üzerinde seri seyreltmelerini hazırlayarak ve kaplayarak faj çıktısını sıkılaştırmak için yardımcı faj eklenmeden önce bir dizi hücre çıkarılabilir. Yarım saat inkübe ettikten sonra, mililitre başına 10 milyar koloni oluşturan birim konsantrasyon için her bir oyuğa M 13 K oh yedi yardımcı faj ekleyin.

Plakaların bu sefer 200 RPM'de çalkalanarak 45 dakika daha inkübe kalmasına izin verin. Daha sonra, hücreleri, oyuk başına 1.2 mililitre takviye edilmiş iki YT ortamı içeren bir V tabanına sahip 96 kuyu derinliğinde bir kuyu bloğuna aktarın. Derin kuyu plakalarının gece boyunca 37 santigrat derecede inkübe etmesine izin verin ve ertesi gün 200 RPM'de çalkalayın.

Plakaları 4.000 GS'de dört santigrat derecede 15 dakika döndürerek bakterileri peletleyin. Daha sonra, her bir kopya plakasından, faj içeren eşit hacimlerde süpernatanı bir mini tüpe aktarın. 96 kuyulu mikroplaka mavi kutu, havuzlanmış fajlara sonraki seçim turları için girdi olarak kullanılmak üzere, 10 XPBT'lik bir 10. hacim ekleyin ve nötralize etmek için karıştırın.

Şimdi, kütüphaneden seçim işlemini tekrarlayın. Ön temizleme ve antijen faj inkübasyonu, önceki seçim turundan amplifiye edilmiş faj kullanılarak üç ila dört kez. Bunu, daha önce kütüphane ön temizleme ve antijen faj inkübasyonunda tarif edildiği gibi mililitre başına iki mikrogram antijen veya kontrol proteini ile kodlanmış Eliza Micro kuyu plakaları tarafından spesifik olmayan kontrol proteinlerinin bağlanmasına kıyasla hedef bağlanma zenginleştirmesi gözlenene kadar yapın, daha sonra bloke edilir ve daha önce olduğu gibi bloke edilmiş ve yıkanmış antijen ve kontrol proteini kaplı plakalara yıkayın, kuyucuklara 100 mikrolitre seyreltilmiş faj supt uygulayın ve plakaların çalkalanarak inkübe edilmesine izin verin. Oda sıcaklığında 15 dakika İnkübasyondan sonra, plakaları PT tamponu ile sekiz kez yıkayın.

Daha sonra yıkamaları takiben, antijene bağlı fajlara antikor bağlanmasına izin vermek için her bir kuyucuğa yarım saat inkübe etmek için PBT'de bir ila 5.000 lution'da 100 mikrolitre anti M 13 HRP antikoru ekleyin. Daha sonra plakaları PT tamponu ile altı kez ve iki kez daha düz PBS ile yıkayın, hazırlayın, karıştırın ve her bir kuyucuğa 100 mikrolitre bire bir TMB substratı uygulayın. Bunun beş ila 15 dakika reaksiyona girmesine izin verin ve önemli renk değişikliği olduğunda reaksiyonları durdurun.

100 mikrolitre bir molar fosforik asit ekleyerek reaksiyonları durdurun. Şimdi 450 nanometredeki kuyucuklardaki absorbansı okuyun ve hedef bağlanma sinyallerini zenginleştirmeyi takiben kontrol proteinlerinin bağlanma sinyalleriyle karşılaştırın. Bireysel klonlar izole edilebilir ve faj dizileme, serbest fab'a bağlı fajın DNA dönüşümü ve protokolün metin bölümünde açıklandığı gibi klonal FabuLisa kullanılarak hedefe doğrudan bağlanmanın değerlendirilmesi ile karakterize edilebilir.

Daha yüksek verimin gerekli olduğu laboratuvarlar için bu metodoloji ölçeklendirilebilir ve otomatikleştirilebilir. Bu amaç göz önünde bulundurularak, engelleme, faj, bağlama ve elucian ve daha fazlası dahil olmak üzere prosedürün tüm yönlerini otomatikleştirerek seçim kapasitesini genişletebilen özelleştirilmiş robotlar geliştirilmiştir. Antikor seçimlerinde kullanılmak üzere antijen elde etmeye yönelik bir yaklaşım, izole edilmiş protein alanlarının ekspresyonu için yapılar elde etmek için sentetik gen teknolojilerinin kullanılmasıdır.

Çoğu durumda, bu, seçim için yeterli miktarlarda yeterince saf saflaştırılmış antijenin yüksek verimli ekspresyonunu ve izolasyonunu sağlar. Seçim sürecinin ardışık turları sırasında, kaçan faj konsantrasyonları ve spesifik olarak antijene bağlanan fajın zenginleşmesi, daha önce gösterildiği gibi faj titrasyonu ile izlendi veya faj havuzları ile izlendi. Bir ELA tahlilinde, ikiden büyük bir bağlanma oranı genellikle spesifik bağlanma klonlarının varlığını gösterir.

Tersine, daha düşük bir oran, seçim hatasının nedenini belirlemeye yardımcı olabilir. Bir kolometrik amino tahlili kullanılarak klon bağlanmasının karakterize edilmesi, bağlayıcı fab faj veya fab'ın bağlayıcı negatif kontrol proteinine kıyasla hareketsizleştirilmiş antijene karşılaştırılmasını sağlar, böylece robotik sıvı işleme üniteleri ile seçimleri ölçeklendirirken ve otomatikleştirirken bir özgüllük ölçüsü verir. Emici kromoforların kullanılması, akışkanlardaki belirli kanalların ne zaman tıkandığını veya sızdırmazlıklarını kaybettiğini tespit etmeye yardımcı olabilir, bu da kısmi hacim iletimine neden olur ve yıkama prosedürlerinin optimizasyonu sırasında sorun gidermeye yardımcı olur, bilinen bağlama klonlarının kullanılması, yıkamalar sırasında arka plan bağlaması çıkarılırken hedef bağlamanın korunmasını sağlar.

Ek olarak, etkili dekontaminasyon protokolleri, ardışık seçim turlarından veya farklı seçim prosedürlerinden çapraz kontaminasyonun olmamasını sağlar ve metin protokolünde ek sorun giderme parametrelerinin gözden geçirilmesi önerilir. Bu tekniğin endüstriyel uygulama için ölçeklendirilmesiyle, araştırmacıların, maksimum proteom kapsamı elde etmek amacıyla yüksek afiniteli yenilenebilir antikorların seçimini ve tanımlanmasını hızlandırarak yapısal veya işlevsel olarak ilişkili protein sınıflarının tamamını keşfetmelerini sağlamayı umuyoruz.