Düşük afiniteli Ekstrasellüler Reseptör-ligand Etkileşimlerinin Ölçeklenebilir Algılama için Avidite tabanlı Ekstrasellüler Etkileşim Gösterimi (AVEXIS)

Bu prosedürün genel amacı, hücresel tanıma süreçlerinde yer alan yeni hücre dışı protein etkileşimlerini, özellikle zara gömülü reseptör proteinlerini keşfetmektir. AveXis yaklaşımı, bu protein etkileşimleri sınıfını simgeleyen çok zayıf etkileşim afinitelerini ve zar proteinlerinin biyokimyasal olarak manipüle edilmesinin zor olduğu gerçeğini atlatmak için tasarlanmıştır. Bu, ilk olarak hücre yüzeyi reseptörlerinin hücre dışı bölgelerinin bir rekombinant protein kütüphanesinin derlenmesiyle gerçekleştirilir.

Bu, reseptörlerin ekto alan bölgelerini hem monomerik biyotinillenmiş yemler hem de pentamer enzimi olarak övgü etiketli olarak çözünür fragmanlar olarak üretmek için ekspresyon plazmitlerinin tasarlanmasıyla elde edilir. İkinci adım, proteinlerin etkileşim taramasına hazır hale getirilmesi için eksprese edilmesi ve normalize edilmesidir. Tüm proteinler, diss, sülfür, bağlar ve glikozilasyon gibi translasyon sonrası modifikasyonların eklenmesini sağlamak için memeli hücrelerinde üretilir.

Protokoldeki çok önemli bir adım, kütüphane içindeki yem ve av proteinlerinin tümünün eşik seviyelere normalize edilmesini sağlamaktır. Ardından heyecan verici kısım geliyor, yeni etkileşimler için tarama. Bates, bir mikrot plakanın ayrı kuyucuklarına dizilir ve daha sonra övgü kullanılarak etkileşimler için incelenir.

Daha sonra bir yıkama adımı gerçekleştirilir. Son adım, yem proteinlerinin dizileri üzerinde yakalanan herhangi bir övgüyü tespit etmek için enzim için substratı eklemektir. Sonuç olarak, bir VEX taramasının sonuçları, hangi hücre sörfçü reseptörlerinin bağlanma ortakları oluşturabildiğini ve bu nedenle hücreler arasındaki tanıma ve iletişim süreçlerinde yer alabileceğini gösterebilir.

Maya iki hibrit veya biyokimyasal saflaştırma gibi popüler bir protein ekstraksiyon yönteminin bu tekniğinin ana avantajı, hücre dışı protein protein etkileşimlerini tespit etmek için özel olarak tasarlanmış olmasıdır. Özellikle membrana bağlı reseptör proteinleri arasındaki yeni etkileşimleri keşfetmek için uygundur. Bu etkileşimlerin diğer teknikler kullanılarak tespit edilmesi zordur, çünkü zar proteinlerinin manipüle edilmesi biyokimyasal olarak zordur ve tipik olarak karşı reseptör etkileşimleri son derece zayıftır.

Bu yöntem, hücrelerin birbirlerini nasıl tanıdıkları ve birbirleriyle nasıl iletişim kurdukları ile ilgili temel soruları yanıtlamaya yardımcı olabilir. Moleküler düzeyde, yumurta ve sperm yüzeyinde görüntülenen hangi reseptör proteinlerinin birbiriyle birleştiği veya hangi reseptör ligand etkileşimlerinin miyosit füzyonu veya nöral krest oluşumu gibi hücresel davranışlardan sorumlu olduğu gibi temel biyolojik süreçlerle ilgili soruları yanıtlamak için kullanılabilir. Bu yaklaşımla ilgili temel zorluk, etkileşimleri taramak için yem ve dua protein kütüphanelerini derlemektir.

Yem ve av proteinlerinin tahlil için gerekli eşik seviyeleri içinde normalize edildiğinden emin olmak da çok önemlidir. Bu, yanlış negatif ve yanlış pozitif frekansı azaltır. Bu yöntem fikri ilk olarak doktoram sırasında CD 200 hücre yüzey proteini için bir bağlanma ortağı belirlemeye çalışırken aklıma geldi.

Esasen, şu soruyu soruyordum, bu özel hücre yüzeyi reseptörü için bağlanma modeli nedir? Bugün bile mi? Bu, o zamanlar cevaplanması teknik olarak zor bir soru olmaya devam ediyor, ancak insan genomu tamamlanmak üzereydi ve artık genomdaki tüm hücre yüzeyi reseptörlerinin tam bir listesine sahip olduğumuz için, artık teknik olarak etkileşime girebilen bu reseptör proteinleri seti içinde sorabileceğimizi fark ettim.

Bu, cevaplaması çok daha kolay bir soru ve AveXis, bunu cevaplamak için geliştirdiğimiz yöntemdi. Yem ve ön ekspresyon vektörlerinden oluşan bir kütüphane oluşturulduktan sonra, bunları HEC 2 9 3 E hücrelerine dönüştürmeye hazırlanın, hücreleri transfeksiyondan bir gün önce mililitrede 250.000 hücre yoğunluğunda 50 mililitre serbest stil 2 9 3 ortamında tohumlayarak başlayın verimli biyotin elasyonu sağlamak için. Yem proteinleri üretmek için kullanılan besiyerini doldurun, av proteinlerini değil, tüm plakalar hazırlanmış olarak d biotin ile takviye edin, hücreleri standart koşullarda gece boyunca inkübe edin.

Biyotin düşük çözünürlüğe ve doğru çözeltiye sahip olduğundan, ek biyotini tartmayı ve ardından ortama eklemeyi ve ertesi gün kuvvetlice çalkalamayı tercih ediyoruz. Biyotinile yem cot transfect üretmek için uygun bir transfeksiyon reaktifi kullanarak 25 mikrogram yem veya av plazmidi ile 50 mililitre kültürlenmiş hücreyi transfekte edin. Yem, bir hasat başına ELI proteini biyotin ligazın salgılanan bir formunu kodlayan plazmitlerle 10'a bir oranında inşa edilir.

Kültürler, transfeksiyondan beş gün sonra, önce hücreleri 20 dakika boyunca 3000 kez yerçekiminde santrifüjleme ile soluklayarak ve ikinci olarak S süpernatantını 0.22 mikronluk bir filtreden süzerek geçirir. AveXis'in en önemli özelliklerinden biri, rekombinant proteinlerin salgılanması nedeniyle, eşik aktiviteler dahilinde seyreltilebilir veya konsantre edilebilirler. Rekombinant proteinlerin dört büyüklük sırasına kadar değişken ekspresyona sahip olduğunu bulduk, bu nedenle normalizasyon adımı, tarama adımları sırasında yanlış pozitiflerin oluşumunu azaltır.

Yemin normalleşmesine başlamak için, konjuge olmayan de biotin, diyaliz yoluyla ortamdan uzaklaştırılmalıdır, çünkü bağlanma bölgelerinde strept'e bağlanmak için biyotinile yem proteini için rekabet edeceğinden, yemi bir diyaliz tüpünde sabitleyerek başlar. Rekombinant proteinlerin etkili bir şekilde diyaliz edilmesini sağlamak için, diyaliz tüpüne fazla yüzey alanı sağlamanın önemli olduğunu bulduk. Tipik olarak, diyalize edilen hacim için gerçekte gerekenden iki ila üç kat daha fazla boru sağlıyoruz.

24 saatlik bir süre boyunca, diyaliz gerçekleştirildikten sonra yemi PBS gibi uygun bir tampona karşı yoğun bir şekilde diyaliz edin. Bir ELIZA, BSA içeren PBST ile strep kodlu bir mikrot plakanın kuyularını 15 dakika boyunca bloke ederek başlar. Bu arada, temiz bir plaka üzerinde, PBST'deki yem proteinlerinin %2 BSA ile dört adet bir ila üç seyreltme serisi yapın.

15 dakikalık inkübasyondan sonra, seyreltmeyi strep TTR kodlu plakaya aktarın ve plakayı bir saat sonra bir saatlik oda sıcaklığında inkübe edin, kuyuları yıkayın ve daha sonra her birine mililitre OX 68 başına 100 mikrolitre iki mikrogram ekleyin. Plakayı oda sıcaklığında bir saat daha inkübe edin. İkinci inkübasyondan sonra, başka bir yıkama serisi yapın ve plakayı anti-US alkalin fosfataz ile doldurun.

Plakayı oda sıcaklığının üçüncü bir saati için inkübe edin. Şimdi plakayı PBST'de üç kez yıkayın ve son bir yıkama PBS'si verin. Kalan deterjanı çıkarmak için, bir saat sonra di etanol amin tamponuna mililitre substrat 1 0 4 başına 100 mikrolitre bir miligram ekleyin.

Oda sıcaklığında 4 0 5 nanometre absorbans ölçümünde, Eliza tarafından bir anti CD dört etiketli monoklonal antikor kullanılarak dört farklı diyalize yem supinatından oluşan bir seyreltme serisi tespit edildi. Seyreltilmemiş ekspres yem proteinleri, strep avid ENC kaplı bir plakanın tüm biyotin bağlanma bölgelerini doyurmak için yetersizse, proteini bir Viva spin yoğunlaştırıcı kullanarak konsantre edin. Aksi takdirde, yem proteinini PBST'de% 2 BSA ile seyreltilmiş bir konsantrasyonda kullanın.

Bu, tahlilin biyotin bağlanma bölgesini doyurmak için yeterlidir. Beta laktamaz enzim aktivitesi kullanılarak ön proteinlerin eksprese edildiği nispi seviyeleri ölçün. PBST% 2 BSA tamponunda paraproteinleri içeren supinatın bir seyreltme serisi yaparak başlayın.

Daha sonra, bir plakaya yerleştirilmiş 60 mikrolitre azotlu bir stepin çözeltisine 20 mikrolitre seyreltme ekleyin. Plakayı hemen bir plaka okuyucuya aktarın ve sonraki 20 dakika boyunca santrifüj yoğunlaştırıcılar veya PBST'yi %2 BSA ile seyrelterek dakikada bir kez 4 85 nanometrelik absorbansınızı ölçün. Tahlildeki tüm nitroları yaklaşık yedi dakika içinde hidrolize etmek için numunelerin son konsantrasyonunu ayarlayın, bu da dakikada yaklaşık iki ol nitro devridir.

Strep TAVR ENC kaplı bir plakayı PBST'de yıkayarak ve plakayı bir kağıt havluya vurarak AveXis ekranına başlayın. Daha sonra, her bir oyuğa BSA ile PBST ekleyin ve plakayı 30 dakika inkübe edin. Bu, sahte bir protein bağlanma bölgelerini bloke eder.

Her birinin içinde, plakanın bir lavabo üzerinde akıllı bir hareketle bloke edici çözeltiyi iyice çıkarın ve uygun kuyucuklara 100 mikrolitre normalleştirilmiş biyotinile monomerik yem ekleyin. Plakayı oda sıcaklığında bir saat inkübe edin. Daha sonra yem örneklerini başka bir hareketle plakadan çıkarın ve PBST ile üç kez yıkayın.

Ardından üçüncü yıkamadan sonra hafifçe kurulayın. Şimdi her bir oyuğa 100 mikrolitre normalleştirilmiş pentamer av yapısı ekleyin ve plakayı oda sıcaklığında bir saat inkübe edin. Bir saat sonra, plakayı PBST ile üç kez daha yıkayın ve yalnızca PBS ile son bir yıkama yapın.

Son olarak, her bir oyuğa 60 mikrolitre azot yedi çözeltisi ekleyin ve plakayı oda sıcaklığında iki saat inkübe edin veya tercihen plakaları dört derece SIU'da 16 saat inkübe edin. Ertesi gün, olumlu etkileşimler kırmızıya dönmüş olacak. Görsel bir kayıt için plakanın bir fotoğrafını çekin ve ardından bir plaka okuyucu kullanarak reaksiyonları 4 85 nanometrelik bir absorbansta ölçün.

AveXis tarama reaksiyonunun başlangıcından yaklaşık 10 dakika sonra, hem antikor aracılı av yakalama kontrolünde hem de pozitif kontrol etkileşiminde sarıdan kırmızıya renk değişiklikleri görüldü. Bu renk değişimi, substrattaki nitronun hidrolizini gösterir. Bu zaman ölçeğinde bazı olumlu etkileşimler gözlemlenebilir, ancak çoğunun ortaya çıkması birkaç saat sürdü.

Tipik olarak, yaklaşık %0,4 ila %0,6 pozitiflik bir isabet oranı gözlemlenmiştir. Protein kütüphaneleri hazırlandıktan sonra, bu tekniğin tarama kısmı hızlı bir şekilde yapılabilir. Bir etkileşimi belirledikten sonra bir günde 12 plakaya kadar taramak oldukça mümkündür.

Bir sonraki en önemli adım, öncelikle etkileşimin taze bağımsız protein preparatları kullanılarak tekrarlanabileceğini göstermektir. İkincisi, etkileşimin yem av yöneliminden bağımsız olup olmadığını, yani karşılık verilip verilemeyeceğini her zaman belirleriz. Bu, yem vektör alanlarının av vektörüne klonlanmasını içerir ve bunun tersi de geçerlidir.

Tekrarlanabilen ve karşılık bulabilen etkileşimler yüksek güven olarak kabul edilir ve her zaman olumlu olduğu gösterilmiştir. Yüzey plazma rezonansı gibi diğer teknikleri kullanarak, yeniden tanımladığımız etkileşimleri ek olarak doğrulamak için rezonansta yüzey plazmasını kullanmayı seviyoruz. Daha da önemlisi, bu, saflaştırılmış iki bileşenin doğrudan etkileşime girebileceğine ve ayrıca bağlamanın oturduğunu ve dolayısıyla spesifik olduğunu göstermek için kullanılabileceğine dair bir gösteri sağlar.