Name: Düşük afiniteli Ekstrasellüler Reseptör-ligand Etkileşimlerinin Ölçeklenebilir Algılama için Avidite tabanlı Ekstrasellüler Etkileşim Gösterimi (AVEXIS) (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-03-05T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 30 s
Description: Keşfedin AVEXIS yöntemiyle düşük afiniteli ekstrasellüler reseptör-ligand etkileşimlerini. Bu yüksek verimli tarama tekniği, zayıf protein bağlanmalarını güvenilir şekilde tespit ederek hücresel tanıma süreçlerini aydınlatır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma Wellcome Trust hibe sayısı [077.108] tarafından desteklenmiştir GJW verilir.

1. Bait ve Prey Plazmid ifade Vektörler Kütüphanesi Derleme <ol><li> Hücre yüzey reseptörü ve etkileşimleri açısından taranmalıdır ilgi salgılanan proteinlerin bir listesini derleyin ve uygun bir protein dizisi veritabanından kendi sıraları almak. Bir N-terminal salgılayıcı sinyal peptit içeren Çoğu protein (bu tip I, GPI-bağlantılıdır ve salgılanan proteinlerin dahil) uygundur. Tipik olarak, bir protein familyası (örn. imünoglobulin süperailesine veya eritrosit gibi belirli bir hücre tipinde sınırlı tüm reseptörler) seçilir. </li><li> Protein özelliği tahmin yazılımı kullanılarak sinyal peptid ve transmembran bölge konumunu belirleyerek dışı bölgelerin ölçüde belirler. Biz genellikle SignalP v3.0 5 ve TMHMM v2.0 6 kullanın. </li><li> Her bir reseptör için tüm ectodomain parçasının büyütülmesi tasarım primer seti. Bir olup, bu amaç için uygun olan yem ve av vektörler bir takımdır sahipAddgene (gelen ULLANILABİLEN <a href="http://www.addgene.org/">http://www.addgene.org/~~V</a> ). Bir Notl kısıtlama enzimi sitesi ve optimal bir Kozak sekansı dahil etmek metionin başlangıç ​​etrafında duyu primeri tasarlanması; Bu tam eşleme genin spesifik sekansı (Şek. 2A) ve 25 baz çifti tarafından takip edilir. </li><li> Hemen önceki tahmin transmembran bölgeyi çözünebilir bir rekombinant bir protein olarak tamamını ifade ectodomain şekilde tip I reseptör proteinler kesecek şekilde tasarlanması anti duyum primeridir. Daha sonra, bir C-terminali sıçan Cd4d3 4 proteini etiketi 7 (Şek. 2A) çerçeveye tercüme edilir Bu astar bir Asci sınırlandırma bölgesi içerir. </li><li> Bu primerler kullanılarak tüm genlerden ectodomain parçaları yükseltmek ve yem veya av vektör içine klonlamak. Biz bazen uygun bir memeli ifade vektörüne on klonlama sonrasında önce, biz pTT3 vektör 3,4 bir türevini kullanan ilk mekik vektörleri içine clone yararlı buluyor. Yem ve yırtıcı vektörler contai Hemaşağıdaki gibi n C-terminal protein etiketler (Şek. 2B). <ol><li> Yemler: E.coli Bira enzimi için substrat bir peptid sekansı tarafından takip ve bu nedenle belli bir lisin çökeltisinde üzerine monobiotinylated edilebilir sıçan CD4 (Cd4d3 4) proteinin etki 3 ve 4 içeren bir etiket (Şek. 2B) . Cd4d3 4 etiketi OX68 monoklonal antikoru tarafından fark edildi ve ELISA ile yem proteinlerinin ifadesini ölçmek için kullanılır. Dolayısıyla, monomer cinsi yem proteinler ve monobiotinylated vardır. Biotinylatable peptid saflaştırılması için bir 6-onun etiketi ile değiştirilir Ek yem proteini vektörler kullanılabilir. </li><li> Preys: kurbanlarına da sıçan kıkırdak oligomerik matriks proteini (COMP) ve bir C-terminali β-laktamaz enziminin bir peptid sekansı takiben bir sıçan Cd4d3 4 etiketi içerir. COMP peptid av formları pentamers kez (Şekil 2B) ifade sağlar. </li></ol></li></ol> 2. Prey ve Bait-protein İfade Biz kullanınBizim proteini kütüphaneleri üretmek için HEK293E hücre hattı 4 süspansiyonu kültürü, fakat herhangi bir memeli ekspresyon sistemi kullanılarak, uygun bir yüksek seviyeli ekspresyon sistemi uygun olmalıdır. Ticari olarak kullanılan bir alternatif Serbest sistemidir. Hücreler rutin 37 titreyen platformu (125 rpm) kültüre ° C olarak,% 5% 70 bağıl nemde CO 2. Pozitif ve negatif kontrol proteinler de ifade edilmelidir. Rat Cd4d3 +4 etiketi sadece bir parçası yem ve yırtıcı her ikisi de mevcuttur ve uygun negatif kontroller vardır. Benzer şekilde, bir pozitif kontrol kodlamak yem ve yırtıcı vektörler (Addgene) mevcuttur; biz genellikle sıçan Cd200-Cd200R etkileşimi 8 kullanın. <ol><li> Tohum HEK293E hücreleri 2.5 x 10 5 hücrelik bir yoğunlukta mL -1 az önce transfeksiyon için günde. Üreticinin önerilerini takip Freestyle293 medyada 50 ml hacimde Biz rutin kültür hücreleri. Verimli biyotinilasyon sağlamak için, t ekO hücre kültürü aracı maddesi 100 uM&#39;lik bir son konsantrasyon elde etmek D-biotin ile yem proteinleri üretmek için kullanılır. Av proteinleri ifade etmek için kullanılan Orta ek D-biotin ile takviye edilmesi gerekmez. </li><li> Ertesi gün, transfekte hücreler (örneğin 293fectin), uygun bir reaktif kullanılarak Transfeksiyonlar. 50 ml kültür transferinde yem veya av plazmid yapıları 25 mcg kullanın. Biyotinile yemler üretmek için, eş-transferinde plazmid kodlama yem E.coli protein biotin ligaz (bir salgılanan formu kodlayan bir plazmid ile inşa Addgene temin edilebilir Bira). Plazmid kodlama salgılanmış Bira bir protein 10:01 oranında (2,5 ug) de eş-transfekte yem plazmid. </li><li> İlk filtre 0.22 uM yoluyla süpernatan filtrasyon takiben 20 dakika boyunca 3000 x g&#39;de santrifüj ile pelet hücreleri tarafından Hasat kültürler beş gün post-transfeksiyon. </li></ol> [İpucu: Yem ve yem proteins 4 ° C&#39;de sulandırılmadan ve genel bir kural olarak bir yıl içinde kullanılmalıdır olarak saklanmalıdır. Böyle 50 mcg / ml polimiksin B sülfat veya süpernatantları bakteri bulaşmasını önlemek için 10 mM NaN 3 olarak Bakteriyostatik ekleyin.] 3. Bait ve Prey Örnekleri Normalisation AVEXIS assay of önemli özelliklerinden biri, rekombinant proteinlerin salgılanan çünkü önceden deneyde kullanılan etmek kurulmuştur eşik aktiviteleri içinde seyreltilir veya (normalize) konsantre edilebilir olmasıdır. Büyüklükte 4 kadar siparişler - - ve böylece normalizasyon adımı sırasında önemli ölçüde ekranlarını yanlış sayısını azaltan We rekombinant proteinlerin ifade edildiği az düzeyde geniş bir aralık yayılma olduğunu bulduk. 3.1 Bait normalleşme Not: biyotinile bai ile yarışacak beri D-biotin Konjuge olmamış medya (genellikle diyaliz ile) kaldırılması gerekirbağlanma yerleri streptavidin bağlanmaktan t proteini. <ol><li> Diyaliz tüp, etiket içine yem süpernatantlar aktarın, güvenli klibi ve serbest biotin kaldırmak için böyle PBS gibi uygun bir tampon karşı yoğun diyaliz. </li></ol> [Tip: Bu yeterli diyaliz normal olarak bir 24 saatlik bir süre boyunca 4 değişikliklerle PBS 4.5 L&#39;lik bir hacme karşı 6 x 50 mL yem için süpernatan elde edilir olduğunu bulduk. Yetersiz diyaliz yem normalleşme adımı sırasında düşük dilüsyonlarda proteinlerine bağlanma inhibisyon tarafından görülebilir (Şekil 3A). <ol start="2"><li> Yem proteinleri ifade edildiği azından göreceli seviyelerini belirlemek için bir ELISA gerçekleştirmek. Biyotinile yem protein dilüsyon serisi hazırlayın ve bir streptavidin kaplı mikrotitre tabağa yakalamak. Bir monoklonal antikor (OX68) kullanarak yakalanan yem proteinleri tespit etmek ve ölçmek sıçan Cd4d3 +4 etiketi kullanın. Tüm biot doyurmak için gereken minimum miktarı yem proteinleri konsantre veya seyreltikBir streptavidin kaplı levhanın hem de birleştirici yerlerde. </li><li> Fosfat içeren bir streptavidin kaplı plaka kuyuları bloke saline/0.1% Tween-20 (PBST) /% 2 sığır için albumini (BSA) serum 15 dakika tamponlu. </li><li> Ayrı bir plakası, bir streptavidin kaplı plaka PBST /% 2 BSA ile kuyucuklara transfer yem proteinlerin bir inceltme serilerini göstermektedir (01:03, dört dilüsyonları genellikle yeterlidir) edin. Oda sıcaklığında 1 saat süreyle inkübe edilir. </li><li> PBST 3x yıkayın. 2 ug / mL, oda sıcaklığında 1 saat boyunca fare anti-sıçan Cd4d3 4 IgG (OX68) inkübe 100 ul ekleyin. </li><li> PBST 3x yıkayın. PBST /% 2 BSA ile 1:5,000 seyreltide anti-fare alkalin fosfataz 100 uL ekleyin ve oda sıcaklığında 1 saat inkübe edilir. </li><li> PBST 3x yıkayın ve kalan deterjan kaldırmak için PBS içinde son bir yıkama gerçekleştirin. 1 mg / dietanolamin tamponu (% 10 dietanolamin (v / v), 0.5mM MgCl2, 10 mM NaH3, pH9.8, 4 ışıktan korunan saklandığında, 104 mL Substrat 100 ul ekleme° C). </li><li> Bir saat sonra, 405 nm&#39;de absorbans ölçümü. Temsilci yem normalizasyon sonuçlar Şekil 3A &#39;de gösterilmiştir. </li><li> Bir streptavidin kaplı plakanın her biyotin-bağlama bölgeleri doygun hale getirmek için yeterli olan seviyelerde ifade edilir yem proteinleri, seyreltilmemiş halde kullanıldığı zaman, Vivaspin yoğunlaştırıcılar (Vivascience, 10kDa MWCO) kullanılarak konsantre edilmelidir. Bir rehber olarak, tipik bir yem proteini (~ 80 kDa) ile ~ 5 mikrogram bir 96 plaka doyurmak için yeterli olduğunu tahmin ediyoruz. <ol><li> Yüksek seviyelerde ifade edilen proteinleri yem streptavidin kaplı plakası doygun hale getirmek için yeterli bir konsantrasyona PBST /% 2 BSA ile seyreltilir edilebilir. Yemler aktivitesi bunlar streptavidin kaplı levha bütün biyotin bağlanma yerleri doyurmak sağlamak için seyreltme veya konsantrasyonu sonra rechecked edilmelidir. </li></ol></li></ol> 3.2 Prey normalleşme <ol><li> Β-laktamaz kullanılarak av proteinleri ifade edildiği azından göreceli düzeylerini ölçmekenzim aktivitesi. </li><li> İlk olarak, PBST av protein /% 2 BSA ihtiva eden tampon süpernatan bir seyreltme dizi yapmak. Daha sonra, bir 242 uM (0.125 mg / mL) nitrosefin çözeltisi (Calbiochem), 60 uL için seyreltmeleri 20 uL ekleyebilir. </li><li> Derhal oda sıcaklığında 20 dakika boyunca 485 nm dakikada bir absorbans ölçümü alır, bir mikrotitre plakası okuyucuya aktarma plakası. Temsilci av normalizasyon sonuçlar Şekil 3b&#39;de gösterilmektedir. </li><li> Santrifüj konsantratörü örnekleri kullanılarak Konsantre veya nitrosefin arasında ~ 2 nmol dk -1 cirosunun bir eşik aktivite ulaşmak için bunları PBST /% 2 BSA ile sulandırın. Tüm nitrosefin ~ 7 dakika içinde hidrolize edilir, uygulamada, bu elde edilir. </li></ol> 4. AVEXIS Eleme Usulü <ol><li> PBST bir streptavidin kaplı plaka yıkayın. </li><li> Her bir kuyuya PBST / 2% BSA 100 mcL ekleyin ve her zamanda içinde herhangi bir sahte proteinlerine bağlanma siteleri engellemek için 30 dakika inkübe edin. </li&gt; </ol> [İpucu: yıkama adım sonra herhangi bir kalıntı yıkama tamponu çıkarmak için, plaka tiplenmeden - şiddetle - kağıt havlu üzerine] <ol start="3"><li> Bir lavabo üzerinde plaka akıllı hareketiyle engelleme çözümü çıkartın ve uygun kuyulara 100 uL normalize biyotinile monomerik yem ekleyin ve oda sıcaklığında 1 saat inkübe edin. </li><li> Plaka upturning ve akıllıca bir lavabo üzerine hafifçe vurarak plakadan yem örnekleri çıkarın ve PBST 3 kez yıkayın. </li><li> Normalize pentamerized yırtıcı 100 uL, her sıra için yapı ve 1 saat için oda sıcaklığında inkübe edilir, aşama 4,4 olarak yıkanması ve sadece PBS ile bir son yıkama gerçekleştirmek ekleyin. </li><li> 242 uM nitrosefin çözeltisi (500 uL DMSO içinde nitrosefin 5 mg çözülür, daha plakalara eklemeden önce filtre 0.22 uM ile 40 ml PBS içinde nitrosefin seyreltilmiş ve iyice geçmesi ve sonra karıştırarak), 60 uL ekleyin ve oda sıcaklığında inkübe . Olumlu etkileşimler görülebiliryılından bu yana gözle sarı nitrosefin kırmızı bir renk hidrolize olur. Bir plaka okuyucu kullanarak 485 nm&#39;de absorbans okuyarak ölçmek. Tipik bir plaka ve kantitatif Şek. 4. </li></ol> [Tip: plakaların tüm muhtemel etkileşimler tespit edilir sağlamak için 16 saat süreyle 4 ° C &#39;de yer almalıdır halde Pozitif etkileşimler, genellikle oda sıcaklığında 2 saat içinde gözlenmiştir. Biz de bu çizikler / parmak izi gibi mikrotitre plaka plastik üzerine çöken nitrosefin ve kusurları bazen hiçbir belirgin nitrosefin hidrolizi rağmen 485 nm artefactual yanlış pozitif yol bulduk. Bu görsel kuyularda nitrosefin ciro kayıt plakaların fotoğrafını çekmek için bu nedenle tavsiye edilir.] 5.. Temsilcisi Sonuçlar Bir temsili AVEXIS eleme plakası bir örneği, Şekil 4 &#39;de gösterilmiştir. Bir de nitrosefin substrat hidroliz (kırmızı sarı) dikkat etmem gerekiryaklaşık on dakika içinde pozitif kontrol kuyuları (antikor-aracılı avını yakalama kontrolü ve aynı zamanda pozitif kontrol etkileşim hem de). Ekran içinde bazı etkileşimler de bu zaman dilimi içinde görülür, ama diğerleri daha uzun sürebilir (birkaç saat) görünür. Tipik olarak, yaklaşık% 0.4-0.6 (taranan her 150-250 etkileşim için olumlu bir etkileşim) bir isabet oranı taranan protein kütüphaneleri bağlı olarak tipiktir. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/3881/3881fig1.jpg" /> Şekil 1.. AVEXIS kullanılarak cep tanıma işlemlerine aracılık eden reseptör-ligand etkileşimlerinin belirlenmesi. Şematik membran-gömülü reseptör proteinler arasında yapılan etkileşimleri üzerinden bilgi alışverişi iki etkileşim hücreleri (A ve B) gösterir. AVEXIS özellikle çok zayıf bir etkileşim kuvvetleri ile karakterize edilir yeni reseptör-ligand çiftleri tanımlamak için tasarlanmış bir ölçülebilir proteininin etkileşime tahlil oluşturmaktadır. Böylece RekombinantHer iki hücre hücre yüzey reseptör repertuarının tamamını ectodomain temsil luble protein kütüphaneleri (hücre tipi A) veya monomerik biyotin etiketli yemler (hücre tipi B) pentamerik β-laktamaz etiketli kurbanlarına olarak ya derlenmektedir. Avların pentamerisation bile çok geçici etkileşimler tespit edilebilir, böylece genel bir avidite kazancı etki etmek için ectodomains yerel konsantrasyonunu artırır. Yem kütüphane streptavidin kaplı plakalar üzerine dizilmiş ve sistematik av proteinleri ile etkileşimleri nedeniyle tahkikat edilir. Kısa bir yıkamadan sonra, herhangi bir yakalanan beslenmez av ile ilişkili β-laktamaz aktivitesi kullanılarak tespit edilir. <img alt="Şekil 2" src="/files/ftp_upload/3881/3881fig2.jpg" /> Şekil 2. Yem ve yem yapı tasarımı. (A) Sıçanlarda Cd200 reseptör protein hücre yüzeyi reseptör proteinler tamamını ectodomains tespit edilir ve primerler yem hem yapmak için tasarlanmış bir örnek olarak verilmiştirve yırtıcı ifade yapıları. CDNA ve çevrilmiş protein sekansı N-terminal sinyal peptidi ile sıçan Cd200 bir membran-kapsayan transmembran bölgeyi gösterilmiştir. Bir duyu primeri Cd200 cDNA sekansı için tam bir eşleşme dizisinin 25 bazlar takip eden bir 5 &#39;Notl kısıtlama enzimi sitesi ve optimal Kozak sekansı dahil etmek için tasarlanmıştır. Antisense astar bir Asci sitesi ve hemen yukarı seçilen ectodomain kesme kalıntı bulunan tam eşleşme dizisinin 25. üsleri içerir. Rat Cd4d3 +4 etiketi ile çerçeve içinde ectodomain tutmak için, Asci sitesi Gly-Ala-Pro olarak tercüme edilmelidir. (B) yem ve yırtıcı ifade yapıları şematik gösterimleri. Her Notl ve Asci siteleri ve Cd4d3 +4 etiketi ile çevrili reseptör ectodomains içerir. Yemler, özellikle bir plazmid bir salgılanmış Bira enzimi ile ifade kotransfeksiyonu ile monobiotinylated edilebilir bir C-terminali peptid sekansı içerirler. Kurbanlarına pentamerisation sırası tarafından takip edilmektedirkıkırdak oligomerik matriks proteini (COMP) ve β-laktamaz enzim. <img alt="Şekil 3" src="/files/ftp_upload/3881/3881fig3.jpg" /> Şekil 3. Yem ve yırtıcı proteinlerin Normalisation. Yem normalleşme (A) Temsilcisi örnekler. Dört farklı diyaliz yem süpernatan bir inceltilmiş serileri bir anti-CD4 monoklonal antikoru etiketi kullanılarak ELISA ile tespit edildi. Dört yemler farklı düzeylerde 1&gt; 2&gt; 3&gt; 4 de ifade edilir. Yemler, her sıra içinde biyotin bağlanma yerleri doldurur bir eşik seviyesi normalize edilmesi gerekir. Yüksek-ifade yemler proteini muhafaza etmek için seyreltilmiş olabilir (örneğin yem 1 ~ 1:100 seyreltilmiş olabilir), ve kötü ifade yemler yoğunlaştı. Düşük dilüsyonlarda Azalmış okumalar bazen eksik diyaliz nedeniyle indirekt D-biotin varlığı atfedilebilecek bazı yemler (örneğin yem 2) gözlenir. (B) proteinler avlayan hangi seviyeleri eski vardırpreslenmiş bir β-laktamaz substrat, nitrosefin ile hidroliz hızı kullanarak ölçülür. Gösterilen örnekte, üç kurbanlarına farklı seviyelerde ifade edilir: av 1&gt; 2&gt; 3. Preys (örn. av 1) ~ 7 dakika içinde 14.5 nmol nitrosefin hidroliz tamamlamak için karşılık gelen ~ 2 nmol dak -1, bir aktivite normalize edilmesi gerekir. Bu örnekte, diğer kurbanlarına taramasında kullanımdan önce konsantre edilmelidir. <img alt="Şekil 4" src="/files/ftp_upload/3881/3881fig4.jpg" /> Şekil 4. Temsilcisi AVEXIS tarama sonuçları. (A) temsili bir AVEXIS eleme plakasının bir fotoğraftır. Bir av proteini 41 farklı yemler karşı probed ve olumlu bir etkileşim sıra E2 tespit edilir. Tarama plakalarda kullanılan kontroller şunlardır: Cd200R ile (yem)-Cd200R (av) eşik dilusyondaki kullanılan Kayalıklarında yırtıcı sıçan Cd200: bütün av protein yakalamak için bir biyotinile anti-CD4 antikoru iyi (G6), bir kontrol etkileşim eklendi (H3), 1:10 (H4) ve 1:100 (H5). Negatif kontroller vardı: Bir Cd4d3 +4 yem av protein (H1) taranan ile probed ve Cd200R avını (H2). (B) üç kopya halinde gerçekleştirilmiştir, aynı ekranın absorbans değerleri Kantitasyonu. Veri noktaları ortalama ± SD vardır.

<ol><li>Fagerberg, L., Jonasson, K., von Heijne, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prediction+of+the+human+membrane+proteome%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Prediction of the human membrane proteome.</a> Proteomics. 10, 1141-1141 (2010).</li>
<li>Wright, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signal+initiation+in+biological+systems%3A+the+properties+and+detection+of+transient+extracellular+protein+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+bioSystems%22%5BJournal%5D)">Signal initiation in biological systems: the properties and detection of transient extracellular protein interactions.</a> Molecular bioSystems. 5, 1405-1405 (2009).</li>
<li>Bushell, K. M., Sollner, C., Schuster-Boeckler, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large-scale+screening+for+novel+low-affinity+extracellular+protein+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+research%22%5BJournal%5D)">Large-scale screening for novel low-affinity extracellular protein interactions.</a> Genome research. 18, 622-622 (2008).</li>
<li>Durocher, Y., Perret, S., Kamen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-level+and+high-throughput+recombinant+protein+production+by+transient+transfection+of+suspension-growing+human+293-EBNA1+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+acids+research%22%5BJournal%5D)">High-level and high-throughput recombinant protein production by transient transfection of suspension-growing human 293-EBNA1 cells.</a> Nucleic acids research. 30, e9-e9 (2002).</li>
<li>Bendtsen, J. D., Nielsen, H., von Heijne, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+Prediction+of+Signal+Peptides%3A+SignalP+3.0%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+molecular+biology%22%5BJournal%5D)">Improved Prediction of Signal Peptides: SignalP 3.0.</a> Journal of molecular biology. 340, 783-783 (2004).</li>
<li>Krogh, A., Larsson, B., von Heijne, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Predicting+transmembrane+protein+topology+with+a+hidden+markov+model%3A+application+to+complete+genomes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+molecular+biology%22%5BJournal%5D)">Predicting transmembrane protein topology with a hidden markov model: application to complete genomes.</a> Journal of molecular biology. 305, 567-567 (2001).</li>
<li>Brown, M. H., Barclay, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+immunoglobulin+and+scavenger+receptor+superfamily+domains+as+chimeric+proteins+with+domains+3+and+4+of+CD4+for+ligand+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+engineering%22%5BJournal%5D)">Expression of immunoglobulin and scavenger receptor superfamily domains as chimeric proteins with domains 3 and 4 of CD4 for ligand analysis.</a> Protein engineering. 7, 515-515 (1994).</li>
<li>Wright, G. J., Puklavec, M. J., Willis, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lymphoid%2Fneuronal+cell+surface+OX2+glycoprotein+recognizes+a+novel+receptor+on+macrophages+implicated+in+the+control+of+their+function%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Lymphoid/neuronal cell surface OX2 glycoprotein recognizes a novel receptor on macrophages implicated in the control of their function.</a> Immunity. 13, 233-23 (2000).</li>
<li>Dustin, M. L., Golan, D. E., Zhu, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low+affinity+interaction+of+human+or+rat+T+cell+adhesion+molecule+CD2+with+its+ligand+aligns+adhering+membranes+to+achieve+high+physiological+affinity%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+biological+chemistry%22%5BJournal%5D)">Low affinity interaction of human or rat T cell adhesion molecule CD2 with its ligand aligns adhering membranes to achieve high physiological affinity.</a> The Journal of biological chemistry. 272, (1997).</li>
<li>Wright, G. J., Martin, S., Bushell, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+identification+of+transient+extracellular+protein+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Society+transactions%22%5BJournal%5D)">High-throughput identification of transient extracellular protein interactions.</a> Biochemical Society transactions. 38, (2010).</li>
<li>de Wildt, R. M., Tomlinson, I. M., Ong, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+receptor-ligand+pairs+by+capture+of+long-lived+multivalent+interaction+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Isolation of receptor-ligand pairs by capture of long-lived multivalent interaction complexes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99, (2002).</li>
<li>Jiang, L., Barclay, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+leucocyte+surface+protein+interactions+by+high-throughput+screening+with+multivalent+reagents%5BTitle%5D)+AND+%22Immunology%22%5BJournal%5D)">Identification of leucocyte surface protein interactions by high-throughput screening with multivalent reagents.</a> Immunology. 129, 55-55 (2010).</li>
<li>Urech, D. M., Lichtlen, P., Barberis, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+growth+selection+system+to+detect+extracellular+and+transmembrane+protein+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+biophysica+acta%22%5BJournal%5D)">Cell growth selection system to detect extracellular and transmembrane protein interactions.</a> Biochimica et biophysica acta. 1622, 117-117 (2003).</li>
<li>Voulgaraki, D., Mitnacht-Kraus, R., Letarte, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multivalent+recombinant+proteins+for+probing+functions+of+leucocyte+surface+proteins+such+as+the+CD200+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Immunology%22%5BJournal%5D)">Multivalent recombinant proteins for probing functions of leucocyte surface proteins such as the CD200 receptor.</a> Immunology. 115, 337-337 (2005).</li>
<li>Wojtowicz, W. M., Wu, W., Andre, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+vast+repertoire+of+Dscam+binding+specificities+arises+from+modular+interactions+of+variable+Ig+domains%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A vast repertoire of Dscam binding specificities arises from modular interactions of variable Ig domains.</a> Cell. 130, 1134-1134 (2007).</li>
<li>Martin, S., Sollner, C., Charoensawan, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Construction+of+a+Large+Extracellular+Protein+Interaction+Network+and+Its+Resolution+by+Spatiotemporal+Expression+Profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell.+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Construction of a Large Extracellular Protein Interaction Network and Its Resolution by Spatiotemporal Expression Profiling.</a> Mol. Cell. Proteomics. 9, 2654-2654 (2010).</li>
<li>Crosnier, C., Bustamante, L. Y., Bartholdson, S. J., Bei, A. K., Theron, M., Uchikawa, M., Mboup, S., Ndir, O., Kwiatkowski, D. P., Duraisingh, M. T., Rayner, J. C., Wright, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basigin+is+a+receptor+essential+for+erythrocyte+invasion+by+Plasmodium+falciparum%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Basigin is a receptor essential for erythrocyte invasion by Plasmodium falciparum.</a> Nature. 480, 534-537 (2011).</li>
<li>Sollner, C., Wright, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+cell+surface+interaction+network+of+neural+leucine-rich+repeat+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+biology%22%5BJournal%5D)">A cell surface interaction network of neural leucine-rich repeat receptors.</a> Genome biology. 10, R99-R99 (2009).</li>
</ol>

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

Canlı hücreler in vivo olarak incelenirse, bunların plazma membranları son derece dinamik davranışları sergilerler: onlar ulaşın ve komşularıyla 2 ile iletişim olarak uzanan ve kesintili olarak membran prosesleri. Bu temasların birçok arabuluculuk membran-gömülü reseptör proteinler arasındaki fiziksel etkileşim bu son derece hareketli davranış izin verecek şekilde son derece zayıf olduğu için evrim geçirmiştir. Bu 50 uM olarak zayıf gibi monomerik etkileşimi son derece güçlü 2,10 meydan roman etkileşimleri tespit yapar fizyolojik reseptör yoğunlukları 9 spontan etkileşimleri sürmek için yeterli olabileceği tahmin edilmiştir. Düşük yalancı pozitiflik oranı ile ölçeklenebilir bir şekilde uygulanabilir protein etkileşimleri: Burada anlatılan AVEXIS yöntemi geçici ekstraselüler proteini tespit için hassas bir yöntem sağlar. Diğer yöntemler ölçülebilir, hücre dışı etkileşimler 11-15 algılamak için geliştirilmiştir ikenAVEXIS bir avantaj gibi yem ve av faaliyetleri gibi deneysel parametrelerin düşük yalancı pozitiflik oranı 3 korurken bile (t 1/2 ≤ 0,1 s) etkileşimlerin zayıf algılamak için sayısal edilmiş olmasıdır. Buna ek olarak, akıcı ve sağlam numune hazırlama usul diğer testlere göre çok daha büyük ölçekte uygulanacak bu testte sağladı ve biz son ~ 16,500 potansiyel etkileşimleri üzerinde 16 toplam sistematik bir etkileşim ekranı tarif var. Tahlil, bir çözünür rekombinant protein parçası ifade etmek mümkün olduğu için herhangi bir proteini üzerinde gerçekleştirilebilir. Bu nedenle bu tip I, GPI-bağlantılıdır ve salgılanan proteinler gibi bir N-terminal sinyal peptit içeren protein içerir. Yakın zamanda şimdi bize yemler 17 olarak tip II proteinleri ifade edebilecekleri vektörler bir paketi tasarladık. Deneyi, genellikle bu tür iyon taşıyıcı olarak multipass zar proteinleri için uygun değildirs ya da doğru bir plazma zarı bağlamı dışında katlanmış olması olası değildir beri pompalar. Biz zebrabalıkları 3,16,18, insan, fare ve P. hücre dışı proteinler farklı bir sistem çeşitliliği için bu başvurmuş ve başarıyla ifade ettiler etkileşim ekranlar için falciparum. Bir AVEXIS ekran kurmak için gerekli kaynakları açısından, biz önemli bir darboğaz seçimi, inşaat, ve ifade plazmid dolu sıralama olduğunu bulduk. Yöntemi bu yönü ~ 100 yem ve yırtıcı yapılar yapmak için bir yıl kadar sürebilir, ancak, gen sentezi azalan maliyet, şimdi projenin bu yönü dış kaynak ticari lehine. Büyük bir titreme doku kültürü inkübatör (biz bir INFORS HT Multitron Hücre kullanın) ile birlikte memeli ekspresyon sistemi ifade ve ~ 100 yem ve yırtıcı proteinleri bir ay kadar normalleştirmek için tek bir araştırmacı sağlar. Proteinler üretilen ve s, normalize edilir kezetkileşimleri için creening rahatlıkla günlük işlenen on iki kadar 96-plakaları ile hızlıdır. Bu tür proteinleri çok sayıda üretimi kolaylaştırmak için geliştirilmiş ki yalnızca ısmarlama ekipmanı paralel bir 0.22μm filtre ile beş süpernatanlar kadar geçmesi için kullanılan bir sıkıştırılmış hava tazyikli bir piston. Bu etkileşimlerin bazıları 3 tespit edilebilir ancak literatürde (yanlış negatif) beklenen etkileşimleri göre cevapsız olabilir etkileşimlerin ana sınıfı, homophilic etkileşimleri vardır. Beklenen etkileşimleri tespit edilmez durumlarda, bu daha sonra immobilize yem proteinleri ile daha fazla etkileşim engeller av proteinler (bir av &quot;maskeleme&quot; etkisi) tarafından homophilic etkileşimlerin oluşumundan dolayı olduğuna inanıyorum. Etkileşimler tespit edilir frekansı taranan proteini kütüphanesinin içeriği bağlıdır. Okuyucu için bir rehber,&gt; 30 bir ekran olarak, Zebrabalıkları immünglobülin süper ailesi içinde 000 etkileşimleri 188 pozitif sonuçlandı -% 0.6 3,16,18 bir frekans. Herhangi bir olumlu hit doğrulamak için yapılabilir çok çabuk kontrol etkileşimi yem-av yönelimleri hem de tespit edilebilir olup olmadığını belirlemek için;, aynı etkileşimi bir yem ya olarak bağlayıcı proteinlerin mevcut olup olmadığına bakılmaksızın tespit edilebilir olduğunu ya da bir av. Bu davranış gözlemledik ileri geri çalışma zaman, bağlayıcı sonradan yüzeysel plasmon rezonans kullanılarak saflaştınlmış protein bağlayıcı doğrudan doyabilen göstererek spesifik olarak gösterilmiştir. Bizim yapay yem proteinleri pentamerising tarafından bağlanma isteğini artırmak, çünkü biz nicelik etkileşim gücünü karşılaştırmak için uygun tahlil düşünmüyoruz olduğu vurgulanmalıdır. Biz monomerik proteinler ve yüzey plazmon rezonans kullanmak etkileşimlerin biyofiziksel bağlama parametrelerini elde etmek. Son olarak, bir kez bir etkileşim tespit edilmiştir, hitestin gh throughput doğası, antikorlar veya etkileşimi engellemek küçük moleküller gibi reaktifler için ekrana test uyum nispeten kolay hale getirir.

<table border="1"><tbody><tr><td> Reaktifi Adı </td><td> Şirket </td><td> Cat. Numara </td><td> Yorumlar </td></tr><tr><td> Freestyle medya </td><td> Invitrogen </td><td> 12338018 </td><td></td></tr><tr><td> Nitrosefin </td><td> Calbiochem </td><td> 484400 </td><td></td></tr><tr><td> SA kaplı mikrotitre plakalar </td><td> Nunc </td><td> 734-1284 </td><td></td></tr><tr><td> OX68 antikoru </td><td> AbDSerotec </td><td> MCA1022R </td><td></td></tr><tr><td> Diyaliz boru </td><td> Delmek </td><td> PN68100 </td><td></td></tr><tr><td> Polimiksin B </td><td> Sigma </td><td> P4932 </td><td></td></tr><tr><td> D-biotin </td><td> Sigma </td><td> B4639-5G </td><td></td></tr><tr><td> Yüzey-104 </td><td> Sigma </td><td> 1040-506 </td><td></td></tr><tr><td> Vivaspin-20 santrifüj konsantratörü </td><td> Sartorius </td><td> VS2002 </td><td></td></tr><tr><td> 0,22 um filtreler </td><td> Nalgene </td><td> 190-2520 </td><td></td></tr></tbody></table>

düşük afiniteli ekstrasellüler reseptör-ligand etkileşimlerinin Ölçeklenebilir algılama için avidite tabanlı ekstrasellüler etkileşim gösterimi (avexis)

Avidity-based Extracellular Interaction Screening (AVEXIS) for the Scalable Detection of Low-affinity Extracellular Receptor-Ligand Interactions

Hücre dışı protein: salgılanan veya membran-gergin proteinler arasındaki protein etkileşimleri Çok hücreli organizmalarda hem de hücreler arası iletişimi başlatma ve uyum sağlamak için önemlidir. Proteinler hücre dışı etkileşimlerin insan genlerinin 1 yaklaşık dörtte bir oranında kodlanmış oluşturmak için tahmin edilen, ancak önemi ve bolluğuna rağmen, bu proteinlerin çoğunluğu hiçbir bağlayıcı ortağı belgelenmiştir. Öncelikle, bu onların biyokimyasal inatçılığı nedeniyle: membran-gömülü proteinler kendi doğal yapısındaki çözünebilmesi zordur ve yapısal-posttranslasyonel önemli değişiklikler içerir. Ayrıca, reseptör proteinler arasındaki etkileşimi akrabalıklar genellikle çok sık kullanılan, yüksek verimlilik yöntemleri 2 ile tespit engelleyen son derece düşük etkileşimi güçlü (yarılanma ömrü &lt;1 saniye) ile karakterizedir. Burada, AVEXIS (avidite tabanlı ekstraselüler, bir deneyi tarifdüşük yalancı pozitiflik oranı 3 ile çok zayıf protein etkileşimleri (t 1/2 ≤ 0.1 sn) tespiti sağlayan bu teknik zorlukların üstesinden lar Etkileşimi Ekran). Assay genellikle uygun bir mikrotitre plakası biçiminde etkileşimler (Şekil 1) binlerce sistematik tarama sağlamak için yüksek bir verim biçimde uygulanmaktadır. Bu etkileşimler için taranması için, içinde hücre yüzey reseptörü veya salgılanan proteinlerin ectodomain parçaları içeren çözünür rekombinant protein üretime kütüphaneleri dayanır, bu nedenle, bu yaklaşım tipi için uygun olan I, tip II, GPI-bağlı hücre yüzey reseptörleri ve salgılanmış proteinler değil, iyon kanalları ya da taşıyıcı olarak multipass membran proteinleri için. Rekombinant protein kütüphaneler gibi glycosyla gibi önemli posttranslasyonel değişiklikler sağlamak için, uygun ve yüksek seviyeli memeli ifade sistem 4 kullanılarak üretilmektedirTION ve disülfit bağları eklenir. Taraması için uygun bir streptavidin kaplı bir katı faz üzerinde yakalandı edilebilir bir biyotinile yem, ve bir pentamerised enzim-etiketli (β-laktamaz) av: ifade edilen rekombinant proteinlerin, orta ve iki formda üretilen salgılanmaktadır. Yem ve av proteinleri geleneksel bir ELISA (Şekil 1) &#39;e benzer bunlar arasında doğrudan etkileşimler, tespit etmek için bir ikili şekilde birbirine sunulmaktadır. Av in proteinlerin pentamerisation kıkırdak oligomerik matriks proteini (COMP) bir peptid sekansı ile gerçekleştirilir ve böylece daha çok geçici etkileşimler tespit edilebilir sağlamak için önemli bir avidite kazancı sağlanması ectodomains lokal konsantrasyonunu artırır. Yem ve tarama öncesinde önceden belirlenen seviyelere av hem de faaliyetlerini normalleştiren, biz 0.1 sn monomerik yarı ömrü olan etkileşimleri düşük yanlış pozitif oranları 3 ile tespit edilebilir olduğunu göstermiştir.

AVEXIS hücresel tanıma süreçlerinde roman dışı reseptör-ligand çiftleri için sistematik ekran için geliştirilmiş bir yüksek verimlilik protein etkileşim testtir. Bu özellikle diğer yüksek verimlilik yaklaşımları kullanarak tespit etmek zordur geçici protein etkileşimleri tespit etmek için tasarlanmıştır.

Düşük afiniteli Ekstrasellüler Reseptör-ligand Etkileşimlerinin Ölçeklenebilir Algılama için Avidite tabanlı Ekstrasellüler Etkileşim Gösterimi (AVEXIS)

Sekresyon yoluyla salgılanan veya membrana bağlı proteinler arasındaki hücre dışı protein-protein etkileşimleri, hem hücreler arası iletişimin başlatılması hem de...

Bu prosedürün genel amacı, hücresel tanıma süreçlerinde yer alan, özellikle membrana gömülü reseptör proteinleri dahil olmak üzere yeni hücre dışı protein etkileşimlerini keşfetmektir. AveXis yaklaşımı, bu protein etkileşim sınıfının karakteristik özelliği olan oldukça zayıf etkileşim afinitelerinin ve membran proteinlerinin biyokimyasal olarak manipüle edilmesinin zor olduğu gerçeğinin üstesinden gelmek için tasarlanmıştır. Bu, öncelikle hücre yüzeyi reseptörlerinin hücre dışı bölgelerinden oluşan rekombinant bir protein kütüphanesi derlenerek gerçekleştirilir.Bu, reseptörlerin ekto domain bölgelerini hem monomerik biyotinillenmiş yemler hem de pentamer enzim etiketli avlar olarak çözünür fragmanlar şeklinde üretecek ekspresyon plazmitleri tasarlanarak gerçekleştirilir. İkinci adım, proteinlerin etkileşim taramasına hazır hale getirilmesi için eksprese edilmesi ve normalize edilmesidir. Disülfit bağları ve glikozilasyon gibi post-translasyonel modifikasyonların eklendiğinden emin olmak için tüm proteinler memeli hücrelerde üretilir.Protokoldeki kritik bir adım, kütüphane içindeki yem ve av proteinlerinin tamamının eşik seviyelerinin altına normalize edildiğinden emin olmaktır. Ardından heyecan verici kısım olan yeni etkileşimlerin taranması gelir. Yemler bir mikroplaka içindeki ayrı kuyucuklara dizilir ve ardından avlar kullanılarak etkileşimler için analiz edilir.Ardından bir yıkama adımı gerçekleştirilir. Son adım, yem protein dizilerinde yakalanan herhangi bir avı tespit etmek için enzime uygun substratın eklenmesidir. Nihayetinde, bir VEX taramasının sonuçları, hangi hücre yüzeyi reseptörlerinin bağlanma ortakları oluşturabildiğini ve dolayısıyla hücreler arasındaki tanıma ve iletişim süreçlerinde yer alabileceğini gösterebilir.Bu tekniğin, maya iki hibrid veya biyokimyasal saflaştırmalar gibi popüler protein ekstraksiyon yöntemlerine göre temel avantajı, özellikle hücre dışı protein-protein etkileşimlerini tespit etmek için tasarlanmış olmasıdır. Bu yöntem, özellikle membrana bağlı reseptör proteinler arasındaki yeni etkileşimlerin keşfi için uygundur. Membran proteinlerinin biyokimyasal olarak manipüle edilmesinin zor olması ve tipik karşı reseptör etkileşimlerinin son derece zayıf olması nedeniyle, bu etkileşimlerin diğer teknikler kullanılarak tespit edilmesi güçtür.Bu yöntem, hücrelerin birbirlerini nasıl tanıdığı ve birbirleriyle nasıl iletişim kurduğuna ilişkin temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Moleküler düzeyde; yumurta ve sperm yüzeyinde sergilenen hangi reseptör proteinlerinin birleştiği veya miyosit füzyonu veya nöral krista oluşumu gibi hücresel davranışlardan hangi reseptör ligand etkileşimlerinin sorumlu olduğu gibi temel biyolojik süreçlerle ilgili soruları yanıtlamak için kullanılabilir. Bu yaklaşımdaki temel zorluk, etkileşimlerin taranacağı "bait and pray" (yem ve dua et) protein kütüphanelerini derlemektir.Yem ve av proteinlerinin, analiz için gereken eşik seviyeleri dahilinde normalize edildiğinden emin olmak da oldukça önemlidir. Bu işlem, yanlış negatif ve yanlış pozitif sıklığını azaltır. Bu yöntemle ilgili ilk fikrim, doktora eğitimim sırasında CD 200 hücre yüzey proteini için bir bağlanma ortağı belirlemeye çalışırken ortaya çıktı.Temel olarak, bu özel hücre yüzeyi reseptörünün bağlanma örüntüsünün ne olduğu sorusunu soruyordum. Bugün bile bu, cevaplanması teknik olarak zor bir soru olmaya devam ediyor; ancak o dönemde insan genomu tamamlanmak üzereydi ve genomdaki tüm hücre yüzeyi reseptörlerinin tam bir listesine sahip olduğumuz için, artık bu reseptör proteinleri seti içerisinde hangilerinin teknik olarak etkileşime girebileceğini sorabileceğimizi fark ettim.Bu, yanıtlanması çok daha kolay bir sorudur ve AveXis, bu soruyu yanıtlamak için geliştirdiğimiz yöntemdir. Bir yem ve av ekspresyon vektörleri kütüphanesi oluşturulduktan sonra, bunları HEC 2 9 3 E hücrelerine transfekte etmeye hazırlanın; verimli biotinilasyon sağlamak için transfeksiyondan bir gün önce hücreleri 50 milliliters freestyle 2 9 3 medyumunda, mililitre başına 250, 000 hücre yoğunluğunda ekleyerek işe başlayın. Av proteinlerini değil, yem proteinlerini üretmek için kullanılan medyumu d biotin ile takviye edin; tüm plakalar hazırlandığında, hücreleri standart koşullarda gece boyunca inkübe edin.Biyotin düşük çözünürlüğe sahip olduğu ve çözeltisi hassas olduğu için, ek biyotini tartıp ardından besiyerine eklemeyi ve ertesi gün şiddetli bir şekilde çalkalamayı tercih ederiz. Biyotinize yemler üretmek için, 50 mililitre kültürlenmiş hücreyi uygun bir transfeksiyon reaktifi kullanarak 25 mikrogram yem veya av plazmidi ile transfekte edin. Yem konstrüktünü, hasat başına salgılanan formdaki ELI protein biyotin ligazı kodlayan plazmidlerle 10'a bir oranında kotransfekte edin.Transfeksiyondan beş gün sonraki kültürler, önce hücrelerin 3000 ×g'de 20 dakika santrifüjlenerek çöktürülmesi ve ardından süpernatanın 0,22 µm'lik bir filtreden süzülmesiyle hazırlanır. AveXis'in temel özelliklerinden biri, rekombinant proteinlerin salgılanması sayesinde, bu proteinlerin eşik aktiviteler dahilinde seyreltilebilmesi veya konsantre edilebilmesidir. Rekombinant proteinlerin ekspresyonlarının dört büyüklük derecesine kadar değişkenlik gösterdiğini saptadık; bu nedenle normalizasyon adımı, tarama aşamaları sırasında yalancı pozitiflerin ortaya çıkma olasılığını azaltır.Yemin proteininin normalizasyonuna başlamak için, streptavidin bağlama bölgeleri için biyotinilelemiş yemin proteini ile rekabet edeceği için konjuge olmamış serbest biyotin, diyaliz yoluyla ortamdan uzaklaştırılmalıdır; işleme yem proteinini bir diyaliz tüpüne yerleştirerek başlayın. Rekombinant proteinlerin etkili bir şekilde diyaliz edilmesini sağlamak için, diyaliz tüpünün yeterli yüzey alanına sahip olmasının önemli olduğunu saptadık. Genellikle, diyalize edilen hacim için fiilen gerekenden iki ila üç kat daha fazla tüp kullanırız.Diyaliz işlemi gerçekleştikten sonra, yem proteinini 24 saatlik bir süre boyunca PBS gibi uygun bir tampona karşı kapsamlı bir şekilde diyalize edin. Bir ELISA işlemi, streptavidin kaplı bir mikroplaka kuyucuklarının BSA içeren PBST ile 15 dakika boyunca bloke edilmesiyle başlatılır. Bu sırada, temiz bir plaka üzerinde, yem proteinlerinin %2 BSA içeren PBST içinde dörtlü bir seri 1/3 seyreltmesini hazırlayın.15 dakikalık inkübasyonun ardından, dilüsyonu strep TTR kodlu plakaya aktarın ve plağı oda sıcaklığında bir saat boyunca inkübe edin; bir saat sonra kuyucukları yıkayın ve ardından her bir kuyucuğa 100 µL 2 µg/mL OX 68 ekleyin. Plakayı oda sıcaklığında bir saat daha inkübe edin. İkinci inkübasyonun ardından, bir yıkama serisi daha gerçekleştirin ve plakayı anti-US alkalen fosfataz ile yükleyin.Plakayı oda sıcaklığında üçüncü bir saat boyunca inkübe edin. Şimdi plağı üç kez PBST ile yıkayın ve son olarak PBS ile yıkayın. Kalan deterjanı uzaklaştırmak için bir saat sonra, di etil amin tamponu içerisinde 1 mg/mL substrat 1 0 4'ten 100 µL ekleyin.Oda sıcaklığında 405 nanometrede absorbansı ölçün. Dört farklı diyalize edilmiş yem süpernatantından oluşan bir dilüsyon serisi, anti CD4 etiketli monoklonal antikor kullanılarak ELISA ile tespit edildi. Seyreltilmemiş ekspres yem proteinleri, streptavidin kaplı bir plakanın tüm biotin bağlanma bölgelerini doyurmak için yetersizse, proteini bir Viva spin konsantratör kullanarak konsantre edin. Aksi takdirde, yem proteinini %2 BSA içeren PBST içinde seyreltilmiş konsantrasyonda kullanın.Bu miktar, analizin biotin bağlama bölgesini doyurmak için yeterlidir. Pre-proteinlerin ekspresyon seviyelerini, beta laktamaz enzim aktivitesini kullanarak nicel olarak belirleyin. Paraproteinleri içeren süpernatantın %2BSA içeren PBST tamponu ile bir dilüsyon serisini hazırlayarak başlayın.Ardından, dilüsyonun 20 µL'sini bir plakaya yüklenmiş 60 µL nitro stepin çözeltisine ekleyin. Plakayı derhal bir plaka okuyucuya aktarın ve santrifüj konsantratörleri veya %2 BSA içeren dilüsyon PBST kullanarak sonraki 20 dakika boyunca her dakika bir kez 485 nm'deki absorbansı ölçün. Örneklerin nihai konsantrasyonunu, analizdeki tüm nitroları yaklaşık yedi dakikada hidrolize edecek şekilde ayarlayın; bu da dakika başına yaklaşık iki ol nitro dönüşümüne karşılık gelir.AveXis taramasına, strep TAVR ENC kaplı bir plakayı PBST ile yıkayıp plağı bir kağıt havluya vurarak kurulayarak başlayın. Ardından, her kuyucuğa BSA içeren PBST ekleyin ve plakayı 30 dakika boyunca inkübe edin. Bu işlem, istenmeyen protein bağlanma bölgelerini bloke eder.Her bir kuyucuktaki bloklama solüsyonunu, plakayı lavabonun üzerinde hafifçe sallayarak uzaklaştırın ve uygun kuyucuklara 100 µL normalize edilmiş biyotinillenmiş monomerik yem ekleyin. Plakayı oda sıcaklığında bir saat boyunca inkübe edin. Ardından yem örneklerini plakadan tekrar sallayarak uzaklaştırın ve plakayı PBST ile üç kez yıkayın.Ardından üçüncü yıkamadan sonra hafifçe vurarak kurulayın. Şimdi her kuyucuğa 100 µL normalize edilmiş pentamer av konstrüktü ekleyin ve plakayı oda sıcaklığında bir saat inkübe edin. Bir saat sonra, plakayı üç kez daha PBST ile ve son olarak sadece PBS ile yıkayın.Son olarak, her kuyucuğa 60 µL nitrous seven çözeltisi ekleyin ve plakayı oda sıcaklığında iki saat boyunca veya tercihen 4 °C'de 16 saat boyunca inkübe edin. Ertesi gün, pozitif etkileşimler kırmızıya dönmüş olacaktır. Görsel kayıt için plakanın fotoğrafını çekin ve ardından bir plaka okuyucu kullanarak reaksiyonları 485 nm absorbans değerinde nicelleştirin.AveXis tarama reaksiyonunun başlangıcından yaklaşık 10 dakika sonra, hem antikor aracılı av yakalama kontrolünde hem de pozitif kontrol etkileşiminde sarıdan kırmızıya renk değişimleri gözlemlenmiştir. Bu renk değişimi, substrattaki nitrojenin hidrolizini göstermektedir. Bazı pozitif etkileşimler bu zaman diliminde gözlemlenebilir, ancak çoğu etkileşimin ortaya çıkması birkaç saat sürmüştür.Tipik olarak, yaklaşık %0,4 ile %0,6 arasında bir pozitif hit oranı gözlemlenmiştir. Protein kütüphaneleri hazırlandıktan sonra, bu tekniğin tarama kısmı hızlıca gerçekleştirilebilir. Bir etkileşim tanımlandıktan sonra, günde 12 plakete kadar tarama yapmak oldukça mümkündür.Bir sonraki en önemli adım, öncelikle etkileşimin taze ve bağımsız protein preparatları kullanılarak tekrarlanabildiğinin gösterilmesidir. İkinci olarak, etkileşimin yem-av oryantasyonundan bağımsız olup olmadığını, yani karşılıklı olarak gerçekleşip gerçekleşmediğini her zaman belirleriz. Bu işlem, yem vektörü domenlerinin av vektörüne ve tersine klonlanmasını içerir.Tekrarlanabilen ve karşılıklı olan etkileşimler yüksek güvenilirlikte kabul edilir ve her zaman pozitif olduğu gösterilmiştir. Yeniden tanımladığımız etkileşimleri ek olarak doğrulamak için yüzey plazmon rezonansı gibi diğer teknikleri kullanmayı tercih ederiz. Önemli olan şudur ki bu işlem, saflaştırılmış iki bileşenin doğrudan etkileşime girebileceğini kanıtlar ve ayrıca bağlanmanın doygun olduğunu, dolayısıyla spesifik olduğunu göstermek için de kullanılabilir.

avidity-based-extracellular-interaction-screening-avexis-for-scalable

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Bu video kullanımı ile mikro-desenli yüzeyler, protein-protein etkileşimleri sonraki analizi ile deneyler gösterir. Bu yaklaşım, canlı hücreler protein etkileşimleri tespit etmek imkanı sunar ve kantitatif bilgileri ayıklamak imkanı ile yüksek verimlilik özellikleri bir araya getiriyor.

Mikro desenli Yüzeyler, protein-protein etkileşimleri-vivo Algılama

Bu videoda, boncuk tabanlı bir yakınlık testi olan güçlendirilmiş ışıldayan yakınlık homojen testini gösteriyoruz. Protein etkileşimlerini inhibe eden potansiyel küçük molekülleri taramak için etkileşime girme eğiliminde olan iki protein ile hareketsiz hale getirilmiş, homojen boyutta alıcı ve verici boncuklar kullanır.

Amplifiye Lüminesan Yakınlık Homojen Deneyi: Protein-Protein Etkileşimlerini İnhibe Eden Küçük Molekülleri Taramak için Boncuk Tabanlı Bir Yakınlık Testi

Peptit dizisi taraması, protein-protein etkileşim bölgelerini tanımlamak için yüksek verimli bir testtir. Bu, bir hedef proteinin çoklu etkileşimlerinin haritalanmasına izin verir ve bir proteini hedef alan inhibitörler için bölgeleri belirlemek için bir yöntem olarak hizmet edebilir. Burada peptit dizilerini taramak ve analiz etmek için bir protokol açıklıyoruz.

Peptit Diziler protein-protein etkileşim Siteleri belirlenmesi

Sunulan protokoller, ligand-reseptör etkileşimlerinin hızlı araştırılması için iki enzim bağlı immünosorban testi (ELISA) tabanlı tekniği tanımlar: İlk test, ligand ve reseptör arasındaki ayrışma sabiti tayinini sağlar. İkinci test, ligand-reseptör etkileşimleri için blokaj peptidlerinin hızlı bir şekilde taranmasını sağlar.

Bir ELISA Tabanlı Bağlama ve Rekabet Yöntemi Hızla Ligand-reseptör Etkileşimleri belirleme

Biopanning bakteriyel görüntü kitaplıkları peptid benzeşme reaktifler, antikorlar için güçlü bir alternatif keşfi için kanıtlanmış bir tekniktir. Yarı Otomatik sıralama yöntemini burada yanlış pozitif oluşumunu azaltmak için biopanning aerodinamik. Burada düşünce süreci ve adayların değerlendirilmesi ve aşağı akım analizi en aza indirerek uygulanan teknikler gösterilmektedir.

Peptid benzeşme reaktif keşif ve elde edilen yalıtır analizi için bakteriyel ekran kütüphanelerin yarı otomatik Biopanning

Burada, içinde yüksek üretilen iş ekran ekstraselüler protein microarrays kimliği roman reseptör-ligand etkileşimleri için bir iletişim kuralına mevcut. Ayrıca protein-microbead kompleksleri kullanarak geçici protein-protein etkileşimlerinin algılama geliştirmek için bir yöntem açıklar.

Hücre dışı Protein Mikroarray teknoloji yüksek işlem hacmi düşük benzeşme reseptör-Ligand etkileşimleri algılanması için

Uyuşturucu hedef nişan ölçümleri etkili ilaç geliştirme ve kimyasal sonda doğrulama için merkezi. Burada, uyuşturucu-hedef nişan yüksek içerik görüntüleme hücresel termal kayması tahlil (CETSA) bir Mikroplaka uyumlu uyum içinde kullanarak ölçmek için bir protokol ayrıntılı.

Yüksek içeriği hedef nişan yapisan hücrelerdeki ölçmek için Imaging kullanarak

Bu el yazması, hücre dışı reseptör-ligand etkileşimlerini tanımlamak için genom ölçeğinde hücre tabanlı tarama yaklaşımını açıklamaktadır.

Genom ÖlçeğiCRISPR/Cas9 Genetik Ekranlar Kullanılarak Hücre Yüzey Reseptör Tanımlama

Bu çalışma, ilaç-peptit etkileşimlerini tanımlamak için bir strateji sunmayı amaçlamaktadır. Strateji, bir kuvars-kristal mikro denge (QCM) biyosensörüne dayanan ilaç tanıyan kısa peptitlerin biyopannasyonunu ve ardından ilaç tanıma ve ilaç bağlayıcı bölgelerin proteinler üzerinde ek açıklama için elde edilen bilgileri nicel olarak değerlendirmek için biyoinformatik analizini içerir.

İlaç-protein Etkileşimlerinin Küresel Doğrulanması için Biyosensör Tabanlı Yüksek Verimli Biyopanning ve Biyoinformatik Analiz Stratejisi

Mevcut protokol, HA, S glikoproteini, ilgili hibrid tip glikanlar ve yüksek mannoz oligosakkaritlerine CV-N bağlanmasını incelemek için SPR bağlanma testleri için yeni araçları açıklamaktadır. SPR, bu glikanlara dimerik veya monomerik CV-N'yi bağlamak için KD'yi belirlemek için kullanılır.

Yüzey Plazmon Rezonansı ile Antiviral Ajanların Mühendisliği

Bu makale, hücre dışı vezikül alt kümelerinin karakterizasyonu için artan verime sahip yeni nesil multiparametrik analitik platformlar önermektedir. Yöntem, bir mikroarray biyoçipinde sıkışmış veziküler hedefleri nitelemek için Raman spektroskopisi ile birleştiğinde, atomik kuvvet mikroskobu ile metrolojik ve morfomekanik analizlerle çoklanmış biyosensing yöntemlerinin bir kombinasyonuna dayanmaktadır.

Hücre Dışı Vezikül Alt Kümelerinin Analizi için Çok Katlı Yüzey Plazmon Rezonans Görüntüleme Çipi Üzerinde Multimodal Analitik Platform

Keşfedin AVEXIS yöntemiyle düşük afiniteli ekstrasellüler reseptör-ligand etkileşimlerini. Bu yüksek verimli tarama tekniği, zayıf protein bağlanmalarını güvenilir şekilde tespit ederek hücresel tanıma süreçlerini aydınlatır.

Düşük afiniteli Ekstrasellüler Reseptör-ligand Etkileşimlerinin Ölçeklenebilir Algılama için Avidite tabanlı Ekstrasellüler Etkileşim Gösterimi (AVEXIS) (Video) | JoVE Journal

Düşük afiniteli Ekstrasellüler Reseptör-ligand Etkileşimlerinin Ölçeklenebilir Algılama için Avidite tabanlı Ekstrasellüler Etkileşim Gösterimi (AVEXIS)

Daha fazla video keşfet