Düşük afiniteli Ekstrasellüler Reseptör-ligand Etkileşimlerinin Ölçeklenebilir Algılama için Avidite tabanlı Ekstrasellüler Etkileşim Gösterimi (AVEXIS)

Bu prosedürün genel amacı, hücresel tanıma süreçlerinde, özellikle de membrana gömülü reseptör proteinlerinde rol oynayan yeni hücre dışı protein etkileşimlerini keşfetmektir. AveXis yaklaşımı, bu protein etkileşimleri sınıfının karakteristik özelliği olan çok düşük etkileşim afinitelerinin üstesinden gelmek ve membran proteinlerinin biyokimyasal olarak manipüle edilmesinin zor olduğu gerçeğini aşmak için tasarlanmıştır. Bu, öncelikle hücre yüzeyi reseptörlerinin hücre dışı bölgelerinden oluşan rekombinant bir protein kütüphanesi oluşturularak gerçekleştirilir.

Bu işlem, reseptörlerin ekto domain bölgelerini hem monomerik biyotinillenmiş yemler hem de pentamer enzim etiketli avlar şeklinde çözünür fragmanlar olarak üretecek ekspresyon plazmidleri tasarlanarak gerçekleştirilir. İkinci adım, etkileşim taramasına hazır hale getirilmek üzere proteinlerin ekspresyonunu sağlamak ve bunları normalize etmektir. Disülfit bağları ve glikozilasyon gibi post-translasyonel modifikasyonların eklendiğinden emin olmak için tüm proteinler memeli hücrelerinde üretilir.

Protokoldeki kritik bir adım, kütüphanedeki yem (bait) ve av (prey) proteinlerinin tamamının eşik seviyelerinin altına normalize edildiğinden emin olmaktır. Ardından, yeni etkileşimlerin taranması şeklindeki heyecan verici kısım gelir. Yemler bir mikroplaka üzerindeki ayrı kuyucuklara dizilir ve ardından avlar kullanılarak etkileşimler açısından taranır.

Ardından bir yıkama adımı gerçekleştirilir. Son adım, yem protein dizilerinde yakalanan herhangi bir avı tespit etmek için enzime uygun substratın eklenmesidir. Nihayetinde, bir VEX taramasının sonuçları, hangi hücre yüzeyi reseptörlerinin bağlanma partnerleri oluşturabildiğini ve dolayısıyla hücreler arasındaki tanıma ve iletişim süreçlerinde rol oynayabileceğini gösterebilir.

Bu tekniğin, maya iki hibrit sistemi veya biyokimyasal saflaştırma gibi yaygın protein ekstraksiyon yöntemlerine göre temel avantajı, özellikle hücre dışı protein-protein etkileşimlerini tespit etmek için tasarlanmış olmasıdır. Bu yöntem, özellikle membrana bağlı reseptör proteinleri arasındaki yeni etkileşimlerin keşfedilmesi için uygundur. Membran proteinlerinin biyokimyasal olarak manipüle edilmesinin zor olması ve genellikle karşı reseptör etkileşimlerinin son derece zayıf olması nedeniyle, bu etkileşimlerin diğer teknikler kullanılarak tespit edilmesi güçtür.

Bu yöntem, hücrelerin birbirlerini nasıl tanıdığı ve birbirleriyle nasıl iletişim kurduğuyla ilgili temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Moleküler düzeyde; yumurta ve sperm yüzeyinde hangi reseptör proteinlerinin birbirleriyle etkileşime girdiğini veya miyosit füzyonu veya nöral krest oluşumu gibi hücresel davranışlardan hangi reseptör ligand etkileşimlerinin sorumlu olduğunu belirlemek gibi temel biyolojik süreçlere ilişkin soruları yanıtlamak için kullanılabilir. Bu yaklaşımdaki temel zorluk, etkileşimlerin taranacağı "yem ve dua et" (bait and pray) protein kütüphanelerinin derlenmesidir.

Yem ve av proteinlerinin, analiz için gerekli eşik seviyeleri dahilinde normalize edildiğinden emin olmak da oldukça önemlidir. Bu durum, yanlış negatif ve yanlış pozitif sıklığını azaltır. Bu yöntemle ilgili ilk fikri, doktora eğitimim sırasında CD 200 hücre yüzeyi proteini için bir bağlanma ortağı belirlemeye çalışırken geliştirdim.

Temelde, şu soruyu soruyordum: Bu özel hücre yüzey reseptörünün bağlanma paterni nedir? Bugün bile bu soruya cevap vermek teknik olarak zor olmaya devam etmektedir; ancak, o dönemde insan genomu tamamlanmak üzereydi ve artık genomdaki tüm hücre yüzey reseptörlerinin tam bir listesine sahip olduğumuz için, bu reseptör proteinleri seti içerisinde hangilerinin teknik olarak etkileşime girebileceğini sorabileceğimizi fark ettim.

Bu, cevaplanması çok daha kolay bir sorudur ve AveXis, bunu yanıtlamak için geliştirdiğimiz yöntemdir. Yem ve av ekspresyon vektörlerinden oluşan bir kütüphane kurulduktan sonra, bunları HEC 2 9 3 E hücrelerine transfekte etmeye hazırlanın; hücreleri, etkili biotinilasyon sağlamak için transfeksiyondan bir gün önce, 50 mililitre freestyle 2 9 3 medyumunda, mililitre başına 250.000 hücre yoğunluğunda ekerek başlayın. Av proteinlerini değil, yem proteinlerini üretmek için kullanılan medyumu d-biotin ile takviye edin; tüm plakalar hazırlandığında hücreleri standart koşullarda gece boyunca inkübe edin.

Biotinin çözünürlüğü düşük olduğu ve çözeltinin hassasiyeti nedeniyle, ek biotini tartmayı ve ardından bir sonraki gün medyuma ekleyip kuvvetlice çalkalamayı tercih ediyoruz. Biyotinillenmiş yemleri üretmek için, uygun bir transfeksiyon reaktifi kullanarak 50 mililitre kültürlenmiş hücreyi 25 mikrogram yem veya av plazmidi ile transfekte edin. Yem konstrüktünü, ELI protein biyotin ligazının salgılanan formunu kodlayan plazmidlerle 10:1 oranında birlikte transfekte edin.

Kültürler, önce hücrelerin 3000 ×g'de 20 dakika boyunca santrifüjle çöktürülmesi ve ardından süpernatanın 0,22 µm'lik bir filtreden süzülmesi yoluyla transfeksiyondan beş gün sonra toplanır. AveXis'in temel özelliklerinden biri, rekombinant proteinlerin salgılanıyor olması nedeniyle, bunların eşik aktiviteleri dahilinde seyreltilebilmesi veya konsantre edilebilmesidir. Rekombinant proteinlerin dört kat büyüklüğe kadar değişken ekspresyon gösterdiğini tespit ettik; bu nedenle normalizasyon adımı, tarama aşamaları sırasında yalancı pozitiflerin oluşma olasılığını azaltır.

Yemin proteininin normalizasyonuna başlamak için, streptavidin bağlanma bölgeleri için biyotinli yemin proteini ile rekabete gireceği için, ortamdaki konjuge olmamış serbest biyotin diyaliz yoluyla uzaklaştırılmalıdır; işleme yem proteinini bir diyaliz tüpüne yerleştirerek başlayın. Rekombinant proteinlerin etkili bir şekilde diyaliz edilmesi için, diyaliz tüpüne ihtiyaçtan fazla yüzey alanı sağlamanın önemli olduğunu tespit ettik. Genellikle, diyaliz edilen hacim için gerçekte gerekenden iki ila üç kat daha fazla tüp sağlarız.

Diyaliz işlemi gerçekleştikten sonra, yemi 24 saatlik bir süre boyunca PBS gibi uygun bir tamponla kapsamlı bir şekilde diyalize edin. Bir ELISA işlemine, strep kodlu bir mikroplaka kuyucuklarını BSA içeren PBST ile 15 dakika boyunca bloke ederek başlayın. Bu sırada, temiz bir plaka üzerinde, yem proteinlerinin PBST içinde %2 BSA ile dört seri bir ila üç dilüsyonunu hazırlayın.

15 dakikalık inkübasyonun ardından, dilüsyonu strep TTR kodlu plakaya aktarın ve plakayı oda sıcaklığında bir saat boyunca inkübe edin; bir saat sonra kuyucukları yıkayın ve ardından her bir kuyucuğa 100 µL 2 µg/mL OX 68 ekleyin. Plakayı oda sıcaklığında bir saat daha inkübe edin. İkinci inkübasyondan sonra, başka bir yıkama serisi gerçekleştirin ve plakayı anti-US alkalin fosfataz ile yükleyin.

Plakayı oda sıcaklığında bir saat daha inkübe edin. Ardından plağı üç kez PBST ile yıkayın ve son olarak PBS ile yıkayın. Kalan deterjanı uzaklaştırmak için, bir saat sonra di etanolamin tamponunda çözülmüş 1 mg/mL konsantrasyonunda 100 µL substrate 1 0 4 ekleyin.

Oda sıcaklığında 405 nanometrede absorbansı ölçün. Dört farklı diyalize edilmiş yem süpernatantından oluşan bir dilüsyon serisi, anti-CD4 etiketli monoklonal antikor kullanılarak ELISA ile tespit edildi. Eğer seyreltilmemiş eksprese yem proteinleri, strep-avidin kaplı bir plakanın tüm biotin bağlama bölgelerini doyurmak için yetersizse, proteinleri bir Viva spin konsantratör kullanarak konsantre edin. Aksi takdirde, yem proteinini %2 BSA içeren PBST içinde seyreltilmiş konsantrasyonda kullanın.

Bu miktar, analizin biotin bağlanma bölgesini doyurmak için yeterlidir. Pre-proteinlerin eksprese olduğu göreceli seviyeleri beta laktamaz enzim aktivitesi kullanarak belirleyin. Paraproteinleri içeren süpernatantın %2 BSA içeren PBST tamponunda bir dilüsyon serisi hazırlayarak başlayın.

Ardından, seyreltiden 20 µL miktarını, bir plakaya yüklenmiş 60 µL nitros stepin çözeltisine ekleyin. Plağı derhal bir plaka okuyucuya aktarın ve santrifügal konsantratörler veya %2 BSA içeren PBST ile seyreltme kullanarak sonraki 20 dakika boyunca her dakika bir kez 485 nm'de absorbansı ölçün. Örneklerin nihai konsantrasyonunu, analizdeki tüm nitrosları yaklaşık yedi dakikada hidrolize edecek şekilde, yani dakika başına yaklaşık iki ol nitros döngüsü olacak şekilde ayarlayın.

AveXis taramasına, strep TAVR ENC kaplı bir plakayı PBST ile yıkayarak ve plakayı bir kağıt havluya hafifçe vurarak kurulayarak başlayın. Ardından, her kuyucuğa BSA içeren PBST ekleyin ve plakayı 30 dakika boyunca inkübe edin. Bu işlem, istenmeyen protein bağlanma bölgelerini bloke eder.

Her bir kuyucuktaki bloklama çözeltisini, plakayı lavabonun üzerinde hafifçe sallayarak uzaklaştırın ve uygun kuyucuklara 100 µL normalize edilmiş biotinize monomerik yem ekleyin. Plakayı oda sıcaklığında bir saat boyunca inkübe edin. Ardından, yem örneklerini plakadan tekrar sallayarak uzaklaştırın ve PBST ile üç kez yıkayın.

Ardından üçüncü yıkamadan sonra tampon kağıdıyla kurulayın. Şimdi her kuyucuğa 100 µL normalize edilmiş pentamer prey konstrüktü ekleyin ve plakayı oda sıcaklığında bir saat boyunca inkübe edin. Bir saat sonra, plakayı üç kez daha PBST ile ve son olarak sadece PBS ile yıkayın.

Son olarak, her kuyucuğa 60 µL nitrous seven çözeltisi ekleyin ve plakayı oda sıcaklığında iki saat boyunca veya tercihen 4 °C'de 16 saat boyunca inkübe edin. Ertesi gün, pozitif etkileşimler kırmızıya dönmüş olacaktır. Görsel kayıt için plakanın fotoğrafını çekin ve ardından bir plaka okuyucu kullanarak reaksiyonları 485 nm absorbansında nicelendirin.

AveXis tarama reaksiyonunun başlangıcından yaklaşık 10 dakika sonra, hem antikor aracılı av yakalama kontrolünde hem de pozitif kontrol etkileşiminde sarıdan kırmızıya renk değişimleri gözlemlendi. Bu renk değişimi, substrattaki nitrojenin hidrolizini göstermektedir. Bazı pozitif etkileşimler bu zaman diliminde gözlemlenebilir, ancak çoğunun ortaya çıkması birkaç saat sürdü.

Genellikle, yaklaşık %0,4 ile %0,6 arasında bir pozitif hit oranı gözlemlenmiştir. Protein kütüphaneleri hazırlandıktan sonra, bu tekniğin tarama kısmı hızlı bir şekilde gerçekleştirilebilir. Bir etkileşim belirlendikten sonra, günde 12 plağa kadar tarama yapmak oldukça mümkündür.

Sıradaki en önemli adım, öncelikle etkileşimin taze ve bağımsız protein preparatları kullanılarak tekrarlanabildiğini göstermektir. İkinci olarak, etkileşimin yem-av oryantasyonundan bağımsız olup olmadığını, yani karşılıklı olarak gerçekleşip gerçekleşmediğini her zaman belirleriz. Bu işlem, yem vektörü domenlerinin av vektörüne ve tersi şeklinde klonlanmasını içerir.

Tekrarlanabilen ve karşılıklı olan etkileşimler yüksek güvenilirlikte kabul edilir ve her zaman pozitif olduğu gösterilmiştir. Yeniden tanımladığımız etkileşimleri ek olarak doğrulamak için yüzey plazmon rezonansı gibi diğer teknikleri kullanmayı tercih ediyoruz. Önemli olan şudur ki bu yöntem, saflaştırılmış iki bileşenin doğrudan etkileşime girebildiğinin bir kanıtını sunar ve ayrıca bağlanmanın doygun olduğu, dolayısıyla spesifik olduğunu göstermek için de kullanılabilir.