Biyobozunur polimerik nano partiküllerin kullanılması Tedavi Angiogenezis Programlama Kök Hücreler

Bu prosedürün genel amacı, bir deniz arka uzuv iskemi modeli kullanarak kök hücrelerde terapötik genlerin aşırı ekspresyonu için polimerik nanopartiküllerin kullanımını göstermektir. Bu, önce biyolojik olarak parçalanabilen polimerlerin iki aşamalı bir mikrofon baskı reaksiyonu yoluyla sentezlenmesi, ardından terapötik genleri kodlayan polimerik nanopartiküllerin üretilmesiyle gerçekleştirilir. İkinci adım, insan adipoz kaynaklı kök hücreleri in vitro olarak aşırı eksprese edilmiş vasküler endotelyal büyüme faktörüne dönüştürmektir.

Daha sonra programlanan kök hücreler, NC iki terapötik faktör üretimi için iskemik bir arka uzuvya intramüsküler olarak enjekte edilir. Son adım, biyolüminesans görüntüleme ve lazer doppler görüntüleme kullanarak zaman içinde iskemik ekstremitede hücre sağkalımını ve kan reperfüzyonunu izlemektir. Sonuç olarak, terapötik faktörlerin lokalize ekspresyonunu ve doku rejenerasyonunun etkinliğini göstermek için kantitatif gen ekspresyonu ve histoloji yapılabilir.

Bu tekniğin anjiyogenez için geleneksel yöntemlere göre avantajı, kök hücrelerin ilaç dağıtımı için araç olarak kullanılmasıdır. Bu strateji, kök hücrelerin iskemiye doğru göç etmek için doğal çapa kapasitesini kullanmamıza izin verir ve ayrıca mikroçevresel ipuçlarına dinamik tepkiler verir. Plazma DNA iletimi için kullanılan nanopartiküller yüksek verimli ve biyolojik olarak parçalanabilir, daha düşük sitotoksisite ve daha fazla sayıda hücre içi olarak verilen DNA kopyası sağlar.

Bu teknik, klinik olarak ilgili birçok hücre bazlı terapötiğe uygulanabilir, çünkü genleri otolog hücrelere eklemek için biyolojik olarak parçalanabilen viral olmayan bir vektör kullanır Çeker ocakta çalışır, bütan kadranı DLI'yi tartar ve malzemeyi bir karıştırma çubuğu içeren bir cam inhalasyon şişesine aktarır. Daha sonra, aynı şişeye önceden ısıtılmış beş amino bir pentol ekleyin. Şişeyi hemen bir karıştırma plakasına yerleştirin ve hızı 600 RPM'ye ayarlayın.

Şişeyi 90 santigrat dereceye ayarlanmış bir fırına aktarın ve dört saat sonra karıştırma hızını 1000 RPM'ye yükseltin, hızı 300 RPM'ye düşürün ve 12 ila 16 saat daha karıştırın. Hazır olduğunda, bir karıştırma çubuğu içeren bir cam şişede beş gram C 32'ye 10 mililitre susuz tetra hidro uran ekleyin. Bir karıştırma çubuğu içeren ayrı bir cam şişede tamamen eriyene kadar folyo girdabına sarıldıktan sonra, 10 milimolar tetra etilen glikol diamin ekleyin.

Bu şişeye 40 mililitre THF ekleyin, her iki şişeyi de birleştirmeden önce beş dakika boyunca bir karıştırma plakasına koyun. Elde edilen maddeyi folyo ile örtün ve 24 saat oda sıcaklığında bekletin. Nihai ürün C 32 1 22 olarak adlandırılır.

Daha sonra, 30 mililitre susuz datil eteri beş adet 50 mililitrelik şahin tüpünün her birine aktarın. Susuz dil etere C 32 1 22 eklendikten sonra, beyaz bulanık bir çözelti tüpü girdap oluşturur ve ardından santrifüjler. Ekstrakte edilen polimer, tüpün tabanında toplanacak, üst çözeltiyi atacak ve bu adımları iki kez daha tekrarlayacaktır.

Çıkarıldıktan sonra, açık tüpleri kurutucuya koyun ve gece boyunca vakumlayın, tüplerin ışıktan korunduğundan emin olun. Ertesi gün, nihai kütleyi belirlemek için C 32 1 22 içeren tüpleri tartın. Son olarak, ekstrakte edilen polimeri susuz DMSO'da mililitre başına 100 miligram konsantrasyonda çözün.

Nanopartikül hazırlama için. İlk olarak, plazma DNA'sını ikinci bir tüpte sodyum asetat içinde mililitre başına 120 mikrogramlık bir nihai konsantrasyona seyreltin, C 32 1: 22'yi mililitre başına 3.6 miligramlık bir nihai konsantrasyona seyreltin. Sodyum asetatta, her tüpün içeriğini tek bir 15 mililitrelik Falcon tüpünde birleştirin ve hemen 10 saniye boyunca yüksekte girdap yapın.

Nanopartiküller oluşurken nanopartikül oluşumunun gerçekleşmesi için tüpü oda sıcaklığında 10 dakika bekletin. Ortamı önceden oturmuş bir doku kültürü şişesindeki 7.8 mililitre ile değiştirin. Tamamen takviye edilmiş DMEM.

Nanopartikül çözeltisini doku kültürü şişesine aktarın ve inkübatöre yerleştirmeden önce eşit şekilde yayın. İki saat sonra, nanopartikül içeren ortamı DMEM ile değiştirin. Dört saat sonra, hücreler in vivo enjeksiyon için hazırdır.

Kesilen hücreler hazır olduğunda, her farenin eşit miktarda almasını sağlamak için PBS'de mililitrede altı hücrenin 10'unun 10 katı yoğunlukta hücreleri sayın. Hücre süspansiyonlarını 110 mikrolitre hacminde einor tüplerine ayırın. Daha sonra, daha önce arka bacak iskemisi geçirmiş bir fareyi uyuşturun.

Anesteziyi ayak parmağınızı sıkıştırarak onayladıktan sonra, enjeksiyon bölgesini 27 gauge şırınga ile temizleyin. Hücreleri yeniden askıya alın ve 100 mikrolitre süspansiyon çekin. Hücre süspansiyonunun yarısını adduktor kas bölgesine enjekte edin ve ardından diğer yarısını baldır kas bölgesine enjekte edin.

Enjekte ettikten sonra, sızıntıyı önlemek için şırıngayı en az 15 ila 30 saniye yerinde bırakın. Enjeksiyonlar tamamlandığında, tamamen iyileşene kadar hayvanı sıcak tutun. Biyolüminesans görüntüleme için, anesteziyi bir ayak parmağı tutamıyla onaylayın ve ardından enjeksiyon bölgesini daha önce gösterildiği gibi temizleyin.

Bir insülin şırıngasını 100 mikrolitre Lucifer ile doldurun ve intraperitoneal enjekte edin. Hayvanı ivus Luciferaz görüntüleme odasına yerleştirmeden önce, fareleri bir dakikalık pozlama süresiyle görüntüleyin. Görüntü elde edildiğinde, ilgilenilen bölgeyi işaretleyin.

Bu durumda, hücre enjeksiyon bölgesindeki iskemik uzuv, sinyal zirveye ulaşana ve azalmaya başlayana kadar her üç ila beş dakikada bir lusiferaz sinyalini ölçmeye devam eder. Bu, fareler arasında ve zaman noktaları arasında karşılaştırma yapmak için kullanılan değerdir, tamamlandığında, fareleri hazneden çıkarın ve tamamen iyileşene kadar hayvanı sıcak tutun. Dokular belirli bir zamanda hasat edilir.

Transfeksiyondan sonraki noktalar Ötenazi sonrası, arka uzuvu çevreleyen cildi distal abdominal bölgede ve arka bacak proksimalinde çevresel olarak kesin. Cildi geri çektikten sonra, pelvik ve femur eklemi arasındaki uzuvyu ampute edin. Son olarak, medial adduktör ve gastrok kasları izole edilir.

Daha fazla analiz için, bu görüntüler C 32 1 22'nin sentezini tasvir ediyor. Burada, ACR ile ilişkili sonlandırılmış C 32 AC, DAL uç gruplarına sahip bir monomer ile birincil ortalama uç grubuna sahip bir monomer arasında bir mikrofon baskı reaksiyonu ile oluşturulmuştur. Bu örnekte ve modifiye edilmiş PBAE polimerleri, gelişmiş transfeksiyon verimliliği için ortalama sonlandırılmış monomerler eklenerek oluşturulabilir.

Başarılı bir transfeksiyon, burada görüldüğü gibi yeşil floresan proteininin aşırı ekspresyonu ile belirgindir. Bu biyolüminesans görüntüleme verileri, sıfırıncı gün ve 14. günde bir fareyi göstermektedir. GFP lusiferaz pozitif adipoz türevli kök hücreler arka ekstremite enjekte edildikten sonra, temsili Doppler görüntüleri, sıfırıncı günde aynalanan arka ekstremitenin bir tarafında iskemi indüksiyonunu ve başarılı kan reperfüzyonunu göstermektedir.

VEGF enjeksiyonundan 14 gün sonra yağ kaynaklı kök hücrelerin eksprese edilmesi. R-T-P-C-R, hücre enjeksiyonundan dört gün sonra tedavi edilen grupta kodlanmış terapötik protein olan vgf'nin başarılı bir şekilde yukarı regülasyonunu doğrularken, PBS kontrolünde herhangi bir ekspresyon tespit edilmedi. Doku rejenerasyonunu teşvik etmek için yeni terapötik hedefleri belirlemek için kombine kök hücre ve gen verme yaklaşımını uygulayan diğer yöntemler gerçekleştirilebilir.

Bu videoyu izledikten sonra, viral olmayan gen terapisi için biyolojik olarak parçalanabilen polimerlerin nasıl sentezleneceğini iyi anlamalı ve bu polimerleri iskemi ve vivo tedavisi için kök hücreleri programlamak için kullanmalısınız. Terapötik faktörlerin yerinde aşırı eksprese edilmesi için viral olmayan mühendislik ürünü kök hücrelerin kullanılması, çeşitli dejeneratif hastalıkların tedavisinde geniş ölçüde yararlı olabilir.