Biyobozunur polimerik nano partiküllerin kullanılması Tedavi Angiogenezis Programlama Kök Hücreler

Bu prosedürün genel amacı, denizel arka ekstremite iskemi modelini kullanarak kök hücrelerde terapötik genlerin aşırı ekspresyonu için polimerik nanopartiküllerin kullanımını göstermektir. Bu işlem, öncelikle iki aşamalı bir mikrosüspansiyon reaksiyonu yoluyla biyobozunur polimerlerin sentezlenmesi ve ardından terapötik genleri kodlayan polimerik nanopartiküllerin üretilmesiyle gerçekleştirilir. İkinci adım, vasküler endotelyal büyüme faktörünün aşırı eksprese edilmesi için insan adipoz kaynaklı kök hücrelerinin in vitro olarak transfekte edilmesidir.

Ardından, terapötik faktörlerin üretimi için programlanmış kök hücreler, iskemik bir arka ekstremiteye intramüsküler olarak enjekte edilir. Son adım, biyolüminesans görüntüleme ve lazer doppler görüntüleme kullanarak iskemik ekstremitedeki hücre sağkalımını ve kan reperfüzyonunu zaman içinde izlemektir. Nihayetinde, terapötik faktörlerin lokalize ekspresyonunu ve doku rejenerasyonunun etkinliğini göstermek için kantitatif gen ekspresyonu ve histoloji çalışmaları gerçekleştirilebilir.

Bu tekniğin anjiyogenez için kullanılan geleneksel yöntemlere göre avantajı, ilaç iletimi için araç olarak kök hücrelerin kullanılmasıdır. Bu strateji, kök hücrelerin iskemiye doğru göç etme konusundaki doğal yönelim kapasitesinden yararlanmamıza olanak tanır ve aynı zamanda mikroçevresel ipuçlarına karşı dinamik yanıtlar verilmesini sağlar. Plazmid DNA iletimi için kullanılan nanopartiküller oldukça verimli ve biyobozunurdur; bu da daha düşük sitotoksisite ve hücre içine iletilen daha fazla DNA kopyası sağlar.

Bu teknik, genleri otolog hücrelere yerleştirmek için biyobozunur non-viral bir vektör kullandığından, klinik açıdan ilgili birçok hücre bazlı terapiye uygulanabilir. Çeker ocak içerisinde çalışarak bütan diyal DLI'yi tartın ve materyali içinde manyetik karıştırıcı bulunan cam bir inhalasyon şişesine aktarın. Ardından, önceden ısıtılmış beş amino bir pentolü aynı şişeye ekleyin. Şişeyi hemen bir manyetik karıştırıcı üzerine yerleştirin ve hızı 600 RPM olarak ayarlayın.

Viyali 90 °C'ye ayarlanmış bir fırına aktarın ve dört saat sonra karıştırma hızını 1000 RPM'e çıkarın, ardından hızı 300 RPM'e düşürün ve 12 ila 16 saat daha karıştırın. Hazır olduğunda, karıştırma çubuğu içeren cam bir viyala beş gram C 32'ye 10 ml susuz tetra hidro uran ekleyin. Folyo ile sardıktan sonra, tamamen çözünene kadar yüksek hızda vorteksleyin; karıştırma çubuğu içeren ayrı bir cam viyala 10 mM tetra etilen glikol diamin ekleyin.

Bu flakona 40 milliliters THF ekleyin; her iki flakonu birleştirmeden önce beş dakika boyunca bir manyetik karıştırıcı üzerine yerleştirin. Elde edilen karışımı folyo ile kapatın ve oda sıcaklığında 24 saat boyunca karıştırmaya bırakın. Nihai ürün C 32 1 22 olarak adlandırılır.

Ardından, beş adet 50 mililitrelik falcon tüpünün her birine 30 mililitre susuz dietil eter aktarın. C 32 1 22 susuz dietil etere eklendikten sonra beyaz bulanık bir çözelti oluşur; tüpü vorteksleyin ve ardından santrifüjleyin. Ekstrakt edilen polimer tüpün tabanında toplanacaktır; üstteki çözeltiyi dökün ve bu adımları iki kez daha tekrarlayın.

Ekstraksiyon tamamlandıktan sonra, açık tüpleri desikatöre yerleştirin ve ışıkla temas etmediklerinden emin olarak gece boyunca vakumlayın. Ertesi gün, nihai kütleyi belirlemek için C 32 1 22 içeren tüpleri tartın. Son olarak, ekstraksiyonu yapılmış polimeri, 100 mg/mL konsantrasyonda susuz DMSO içerisinde çözün.

Nanopartikül hazırlama işlemi için. İlk olarak plazma DNA'sını sodyum asetat içinde 120 µg/mL nihai konsantrasyona seyreltin; ikinci bir tüpte C 32 1 22'yi sodyum asetat içinde 3,6 mg/mL nihai konsantrasyona seyreltin. Her iki tüpün içeriğini tek bir 15 mL'lik Falcon tüpünde birleştirin ve hemen yüksek hızda 10 saniye boyunca vorteksleyin.

Nanopartiküllerin oluşması için tüpü oda sıcaklığında 10 dakika bekletin. Daha önceden hazırlanmış bir doku kültürü flaskındaki besiyerini 7,8 mL tam takviyeli DMEM ile değiştirin.

Nanopartikül çözeltisini doku kültürü flaskına aktarın ve inkübatöre yerleştirmeden önce eşit şekilde yayın. İki saat sonra, nanopartikül içeren medyumu DMEM ile değiştirin. Dört saat sonra, hücreler in vivo enjeksiyon için hazır hale gelecektir.

Transfekte edilen hücreler hazır olduğunda, her fareye eşit miktarda hücre verildiğinden emin olmak için hücreleri PBS içerisinde mililitrede 10 × 10⁶ hücre yoğunluğunda sayın ve süspansiyonu hazırlayın. Hücre süspansiyonlarını 110 µL hacminde eppendorf tüplerine ayırın. Ardından, daha önce arka ekstremite iskemisi uygulanmış bir fareyi anestezi altına alın.

Ayak parmağı sıkıştırma yöntemiyle anestezi onaylandıktan sonra, enjeksiyon bölgesini 27 gauge'lik bir şırınga ile temizleyin. Hücreleri yeniden süspande edin ve süspansiyondan 100 µL çekin. Hücre süspansiyonunun yarısını adduktör kas bölgesine, kalan yarısını ise baldır kası bölgesine enjekte edin.

Enjeksiyondan sonra, sızıntıyı önlemek için şırıngayı en az 15 ila 30 saniye boyunca yerinde bırakın. Enjeksiyonlar tamamlandığında, hayvan tamamen iyileşene kadar sıcak tutun. Biyolüminesans görüntüleme için, anesteziyi ayak parmağı sıkıştırma testiyle onaylayın ve ardından enjeksiyon bölgesini daha önce gösterildiği gibi temizleyin.

Bir insülin şırıngasını 100 µL Lucifer ile doldurun ve intraperitonal olarak enjekte edin. Hayvanı ivus Luciferase görüntüleme odasına yerleştirmeden önce, fareleri bir dakikalık pozlama süresiyle görüntüleyin. Görüntü elde edildiğinde, ilgi bölgesini işaretleyin.

Bu durumda, hücre enjeksiyon bölgesindeki iskemik ekstremitede, sinyal zirveye ulaşana ve azalmaya başlayana kadar her üç ila beş dakikada bir luciferase sinyali ölçülmeye devam edilir. Bu değer, fareler arasında ve farklı zaman noktaları boyunca karşılaştırma yapmak için kullanılır; işlem tamamlandığında fareler kameradan çıkarılır ve hayvan tamamen iyileşene kadar sıcak tutulur. Belirlenen zamanlarda dokular hasat edilir.

Transfeksiyondan sonra ötanazi uygulandıktan sonra, arka ekstremiteyi çevreleyen deri, distal abdominal bölgede ve arka ekstremitenin proksimalinde çevresel olarak kesilir. Deri geriye çekildikten sonra, ekstremite pelvik eklem ile femur eklemi arasından ampute edilir. Son olarak, medial adduktor ve gastrosnemius kasları izole edilir.

Daha detaylı analizler için, bu görüntüler C 32 1 22 sentezini tasvir etmektedir. Burada, ACR ile ilişkili sonlandırılmış C 32 AC, DAL uç gruplarına sahip bir monomer ile primer amin uç grubuna sahip bir monomer arasındaki bir mik ekleme reaksiyonu ile oluşturulmuştur. Bu örnekte, artırılmış transfeksiyon verimliliği için amin sonlandırılmış monomerler eklenerek modifiye PBAE polimerleri oluşturulabilir.

Başarılı bir transfeksiyon, burada görüldüğü üzere, yeşil floresan proteinin aşırı ekspresyonu ile belirginleşir. Bu biyolüminesans görüntüleme verileri, sıfırıncı ve 14. gündeki bir fareyi göstermektedir. Arka ekstremiteye GFP lusiferaz pozitif adipoz kaynaklı kök hücrelerin enjekte edilmesinin ardından, temsili Doppler görüntüleri, sıfırıncı günde karşılıklı arka ekstremitelerin bir tarafında iskeminin indüksiyonunu ve ardından başarılı kan reperfüzyonunu kanıtlamaktadır.

VEGF aşırı eksprese eden adipoz kaynaklı kök hücrelerin enjeksiyonundan 14 gün sonrası. R-T-P-C-R, hücre enjeksiyonundan dört gün sonra tedavi edilen grupta kodlanan terapötik protein olan vgf'nin başarılı bir şekilde yukarı regüle edildiğini doğrulamış, PBS kontrol grubunda ise herhangi bir ekspresyon saptanmamıştır. Doku rejenerasyonunu teşvik edecek yeni terapötik hedeflerin belirlenmesi amacıyla, kombine kök hücre ve gen iletim yaklaşımını uygulayan diğer yöntemler de yürütülebilir.

Bu videoyu izledikten sonra, non-viral gen terapisi için biyobozunur polimerlerin nasıl sentezleneceği ve bu polimerlerin iskemi tedavisi için kök hücreleri vivo ortamında programlamak amacıyla nasıl kullanılacağı konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız. Terapötik faktörlerin in situ aşırı ekspresyonu için non-viral yöntemlerle mühendisliği yapılmış kök hücrelerin kullanılması, çok çeşitli dejeneratif hastalıkların tedavisinde geniş çapta faydalı olabilir.