Hazırlık ve İn Vitro Mıknatıslanmış karakterizasyonu Endotel Hücreleri miR-modifiye

Bu prosedürün genel amacı, mikroRNA ile ve paralel hücre manyetizasyonunda hücre modifikasyonunu sağlayan bir teknik tanıtmaktır. Bu yöntem, rejeneratif tıp alanındaki temel zorlukları ele alabilir. Transplantasyondan önce hücrelerin genetik mühendisliği gibi.

MikroRNA ile verimli hücre modifikasyonuna ek olarak, demir oksit ile izin verdiler. Bu, manyetik alan uygulaması ile ilgilenilen tarafta hücre tutulmasını artırmak için kullanılabilir. Hücre tedavisi, kalp hastalıklarının tedavisi, hipohücre retansiyonu ve hücre sağkalımının acilen iyileştirilmesi için çok umut vericidir.

Bu prosedüre, metin protokolünde tarif edildiği gibi transfeksiyon komplekslerinin hazırlanmasında insan umbilikal ven endotel hücre kültürü ile başlayın. Transfeksiyondan 48 saat önce, HUVEC'leri uygun boyutta plastik hücre kültürü kuyusu plakalarına tohumlayın. Büyüme yüzeyinin santimetre karesi başına yaklaşık 13.000 hücre başlangıç hücre yoğunluğu ile.

Ardından, taze miR / polietilenimen / süper paramanyetik demir oksit nanopartikülleri hazırlayın. İlk olarak, hücre büyüme yüzeyinin santimetre karesi başına 2.5 pikomol mikroRNA ve mikrolitre başına 0.125 pikomol mikroRNA'lık bir nihai konsantrasyon elde etmek için yüzde beş glikoz çözeltisini seyreltin. Daha sonra, PEI'yi eşit hacimde yüzde beş glikoz çözeltisi içinde seyreltin.

Seyreltilmiş PEI'yi mikroRNA çözeltisine ekleyin ve elde edilen karışımı 30 saniye boyunca girdaplayın. Daha sonra miR/PEI karışımını oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin. MNP'leri oda sıcaklığında sonikasyon su banyosunda en az 20 dakika sonikleştirin.

Daha sonra uygun miktarda MNP çözeltisini hazır miR / PEI karışımına ekleyin. 30 saniye girdaptan sonra, oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin. Daha sonra hazırlanan miR/PEI/MNP karışımını damla damla doğrudan hücreler üzerindeki kültür ortamına ekleyin.

Bu karışımı, transfeksiyondan altı saat sonra taze kültür ortamı ile değiştirin. Metin protokolünde açıklandığı gibi vektör güvenliğinin analizinden sonra, konfokal ve süper çözünürlüklü yapılandırılmış aydınlatma mikroskobu ile transfeksiyon komplekslerinin hücre içi lokalizasyonunu doğrulayın ve karakterize edin. Bunu yapmak için, HUVEC'leri daha önce olduğu gibi 24 oyuklu kültür plakalarının kuyucuklarına yerleştirilen jelatin kaplı cam kapak fişleri üzerine tohumlayın.

Hücreleri 3 renkli etiketli miR / PEI / MNP ile transfekte edin ve yüzde beş karbondioksit içeren nemlendirilmiş bir atmosferde 37 santigrat derecede 24 saat inkübe edin. Kapak fişlerini önce yüzde iki sığır serum albümini ve fosfat tamponlu salin ile ve ardından sadece PBS ile yıkayın. Hücreleri, yüzde dört paraformaldehit veya PFA'da 37 santigrat derecede 15 dakika inkübe ederek sabitleyin.

PBS ile yıkayın ve ardından standart protokolleri izleyerek çekirdekleri DAPI ile boyayın. Daha sonra fazla boyayı çıkarmak için hücreleri PBS ile üç kez 15 dakika çalkalayıcıda yıkayın. Hazırlanan lamel kağıtlarını uygun montaj ortamı kullanarak mikroskop lamları üzerine yerleştirin ve mikroskopi için kullanmadan önce slaytları en az bir saat kurumaya bırakın.

Metin protokolünde bulunan SIM ayarlarında 63 kez yağa daldırma hedefini kullanarak görüntüler elde edin. Hücre hedefleme ve in vitro simüle edilmiş dinamik koşullar için, önce HUVEC'leri daha önce olduğu gibi 24 oyuklu plakaya aktarın. Onları 24 saat inkübe ettikten sonra hücreleri yıkayın.

Daha sonra PBS'de seyreltilmiş EDTA'ya bir x trip ekleyin ve hücreleri toplamadan önce hücreleri 37 santigrat derecede dört dakika inkübe edin. Toplanan hücreleri 10 dakika boyunca 300 kez G'de santrifüjleyin. Bir kuyudan elde edilen hücre peletini bir mililitre taze kültür ortamı ile karıştırın.

Ve hücreleri 12 oyuklu bir plakanın tek bir kuyucuğuna aktarın. Bant kullanarak küçük bir mıknatısı yerel olarak sabitleyin. Kültür plakasını çalkalayıcıya yerleştirin ve dinamik koşulları simüle etmek için hücre süspansiyonunu 150 RPM'de 12 saat inkübe edin.

Sonra hücreleri yıkayın ve yüzde dört PFA kullanarak sabitleyin. Çekirdekleri DAPI ile boyayın. Ham verileri elde etmek için z-yığını modunda 405 ve 504 genç nanometre uyarma lazerleri ile lazer taramalı konfokal mikroskopi kullanarak hücre ekini kaydedin.

Analiz için görüntüler oluşturmak için maksimum yoğunluk projeksiyon görüntü işlemeyi kullanın. Manyetik olarak yanıt veren ve yanıt vermeyen hücrelerin kantitatif analizi için, önce HUVEC'leri 24 oyuklu bir plakada transfekte edin. Hücreleri daha önce tarif edildiği gibi yıkamadan ve toplamadan önce hücreleri 24 saat inkübe edin.

Her bir oyuktan elde edilen hücre peletini 500 mikrolitre ısıtılmış steril hücre ayırma tamponu ile yeniden süspanse edin. Hücre süspansiyonunu, verilen mıknatıs tarafından sabitlenmiş bir manyetik sıralama sütununa uygulayın. Daha sonra mıknatıs üzerindeki sütunları taze hücre sıralama tamponu ile üç kez yıkayın.

Akışı manyetik olarak tepkisiz fraksiyon olarak toplayın. Sütunları mıknatıstan çıkarın ve bir piston kullanarak sütunu düşündüren taze hücre sıralama tamponunu iterek manyetik olarak duyarlı hücre fraksiyonunu hemen toplayın. Hem Mag hem de Mag + fraksiyonlarını 300 kez G'de 10 dakika santrifüjleyin.

Hücre peletini PBS'de yeniden askıya aldıktan sonra, hücreleri sayın ve bir tripan mavisi dışlama testi ile hücre canlılığını değerlendirin. Göbek kordonlarından izole edilen HUVEC'ler, endotelyal belirteç CD31'in ekspresyonu ve bir bazal membran matrisi üzerinde tüplerin oluşumu ile karakterize edilir. miR/PEI/MNP ile transfekte edilen HUVEC'lerin tümü etiketli miR'yi alır.

Ve hayatta kalmaları, transfeksiyondan 24 saat sonra etkilenmeden kalır. Ek olarak, süper çözünürlüklü mikroskopi, 3 renkli etiketli transfeksiyon komplekslerinin paranükleer lokalizasyonunu gösterir. PEI toksisitesi, miR / PEI transfekte edilmiş hücrelerin azalmış işlevselliği ile doğrulanır.

Daha da önemlisi, MNP hücre özelliklerini geri yükler. miR/PEI/MNP modifiye hücreler, tüp oluşumu açısından tedavi edilmemiş hücrelerden farklı değildir. Ayrıca, bu hücreler, foto-ağartma sonrası floresan geri kazanımı ile ortaya çıktığı gibi hücreler arası boşluk bağlantı iletişimini sürdürür.

miR / PEI / MNP ile modifiye edilmiş hücrelerin bir süspansiyonu, dönen çalkalayıcı üzerine yerleştirilmiş bir kültür plakasının kuyucuklarına tohumlandıktan sonra, hücreler yerel mıknatıs uygulaması alanına göç etme ve bağlanma eğilimindedir. Temsili görüntüler, mıknatıs uygulaması olan alandaki hücre büyümesini gösterir. Mıknatıs uygulaması olmadan.

Ve kültür kuyusunun merkezinde, sıvı akışının hücreleri yoğunlaştırdığı yerde. Bir kez ustalaştıktan sonra, hücre transfeksiyonu iki saat içinde gerçekleştirilebilir. Bu videoyu izledikten sonra, manyetizasyon da dahil olmak üzere endotel hücrelerinin geçici olarak ancak oldukça verimli bir şekilde nasıl değiştirileceği konusunda çok iyi bir izlenime sahip olmalısınız.

Ve ayrıca hücre ürününün terminal olarak nasıl karakterize edileceği. Bu prosedürü denerken, transfeksiyon komplekslerinin hazırlanması, inkübasyon süresi ve transfeksiyondan sonraki yıkama aşaması için bileşenlerin hücre tohumlama miktarları için verilen sayıları takip etmek önemlidir. Bu yaklaşımın, etkilenen diğer organların tedavisi için diğer hücre tiplerine iyi bir şekilde aktarılabileceği konusunda çok iyimseriz.

Bu prosedürü takiben, modifiye edilmiş manyetize hücrelerle in vivo çalışmalar yapılabilir. Hücrelerin demir yüklemesinin, ilgilenilen tarafta kalmalarını sağlamak için verimli olup olmadığı konusunda ek soruları cevaplayabilirler. Ve ayrıca in vivo MRG ile tespit sınırlarını tanımlamak.