Hazırlık ve

Bu prosedürün genel amacı, hücrelerin mikroRNA ile modifikasyonunu ve eş zamanlı olarak hücrelerin mıknatıslanmasını sağlayan bir tekniği tanıtmaktır. Bu yöntem, transplantasyon öncesi hücrelerin genetik mühendisliği gibi rejeneratif tıp alanındaki temel zorlukların çözümüne yönelik olabilir.

MikroRNA ile gerçekleştirilen etkili hücre modifikasyonuna ek olarak, demir oksit ile modifikasyon yapılmasına da olanak sağlanmıştır. Bu yöntem, manyetik alan uygulamasıyla ilgilenilen bölgedeki hücre tutulumunu artırmak için kullanılabilir. Hücre tedavisi, kalp hastalıklarının tedavisi için oldukça gelecek vaat etmektedir; ancak düşük hücre tutulumu ve hücre sağkalımıyla ilgili durumların acilen iyileştirilmesi gerekmektedir.

Bu prosedüre, metin protokolünde açıklandığı üzere transfeksiyon komplekslerinin hazırlanması için insan göbek ven endotel hücre kültürü ile başlayın. Transfeksiyondan 48 saat önce, HUVEC'leri uygun boyuttaki plastik hücre kültürü kuyucuk plakalarına ekin. Başlangıç hücre yoğunluğu, büyüme yüzeyinin santimetrekare başına yaklaşık 13.000 hücre olacak şekilde ayarlanmalıdır.

Ardından, taze miR/polietilenimin/süper paramanyetik demir oksit nanoparçacıkları hazırlayın. İlk olarak, hücre büyüme yüzeyinin santimetrekare başına 2,5 pikomol mikroRNA'yı, microliter başına 0,125 pikomol mikroRNA nihai konsantrasyonunu elde etmek için yüzde beşlik glukoz çözeltisi ile seyreltin. Daha sonra, PEI'yı eşit hacimde yüzde beşlik glukoz çözeltisi ile seyreltin.

Seyreltilmiş PEI'yi mikroRNA çözeltisine ekleyin ve elde edilen karışımı 30 saniye boyunca vorteksleyin. Ardından, miR/PEI karışımını oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin. MNP'leri oda sıcaklığındaki sonikasyon su banyosunda en az 20 dakika boyunca sonikasyona tabi tutun.

Ardından, hazır miR/PEI karışımına uygun miktarda MNP çözeltisi ekleyin. 30 saniye boyunca vorteksledikten sonra, oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin. Son olarak, hazırlanan miR/PEI/MNP karışımını hücrelerin üzerindeki kültür ortamına damla damla doğrudan ekleyin.

Transfeksiyondan altı saat sonra bu karışımı taze kültür ortamı ile değiştirin. Metin protokolünde açıklanan vektör güvenliği analizinin ardından, transfeksiyon komplekslerinin hücre içi lokalizasyonunu konfokal ve süper çözünürlüklü yapılandırılmış aydınlatma mikroskobisi ile doğrulayın ve karakterize edin. Bunun için, HUVEC'leri daha önce olduğu gibi 24 kuyucuklu kültür plakalarının kuyucuklarına yerleştirilmiş jelatin kaplı cam lameller üzerine ekin.

Hücreleri 3 renkli işaretli miR/PEI/MNP ile transfekte edin ve yüzde beş karbondioksit içeren nemlendirilmiş bir atmosferde, 37 °C'de 24 saat boyunca inkübe edin. Lamelleri önce yüzde iki sığır serum albümini ve fosfat tamponlu salin ile, ardından sadece PBS ile yıkayın. Hücreleri yüzde dört paraformaldehit veya PFA içerisinde 37 °C'de 15 dakika inkübe ederek sabitleyin.

PBS ile yıkayın ve ardından standart protokolleri izleyerek çekirdekleri DAPI ile boyayın. Daha sonra, fazla boyayı uzaklaştırmak için hücreleri çalkalayıcı üzerinde 15 dakika boyunca üç kez PBS ile yıkayın. Hazırlanan lamelleri uygun bir montaj medyumu kullanarak mikroskop lamlarına yerleştirin ve mikroskopi için kullanmadan önce lamların en az bir saat boyunca kurumasını bekleyin.

Metin protokolünde yer alan SIM ayarlarını kullanarak 63 kat yağ daldırma objektifi ile görüntüler elde edin. Hücre hedefleme ve in vitro simüle edilmiş dinamik koşullar için, önce HUVEC'leri daha önce yapıldığı gibi 24 kuyucuklu plakaya transfekte edin. 24 saat inkübe ettikten sonra hücreleri yıkayın.

Ardından, PBS içinde seyreltilmiş bir x trips in EDTA ekleyin ve hücreleri toplamadan önce 37 °C'de dört dakika inkübe edin. Toplanan hücreleri 300 ×g'de 10 dakika santrifüjleyin. Bir kuyucuktan elde edilen hücre peletini bir mililitre taze kültür besiyeri ile karıştırın.

Ardından hücreleri 12 kuyucuklu bir plakanın tek bir kuyucuğuna aktarın. Bant kullanarak yerel olarak küçük bir mıknatıs sabitleyin. Dinamik koşulları simüle etmek için kültür plakasını çalkalayıcıya yerleştirin ve hücre süspansiyonunu 150 RPM'de 12 saat boyunca inkübe edin.

Ardından hücreleri yıkayın ve yüzde dört PFA kullanarak sabitleyin. Çekirdekleri DAPI ile boyayın. Ham verileri elde etmek için z-stack modunda, 405 ve 504 nanometre uyarım lazerleri ile lazer taramalı konfokal mikroskopi kullanarak hücre tutunmasını kaydedin.

Analizler için görüntüler oluşturmak amacıyla maksimum yoğunluk projeksiyonu görüntü işleme yöntemini kullanın. Manyetik yanıt veren ve yanıt vermeyen hücrelerin kantitatif analizi için, önce 24 kuyucuklu plaktaki HUVEC'leri transfekte edin. Hücreleri, daha önce açıklandığı şekilde yıkayıp toplamadun önce 24 saat boyunca inkübe edin.

Her bir kuyucuktan elde edilen hücre peletini, 500 µL önceden ısıtılmış steril hücre ayırma tamponu ile yeniden süspanse edin. Hücre süspansiyonunu, sağlanan mıknatısa sabitlenmiş bir manyetik ayırma kolonuna uygulayın. Ardından, mıknatıs üzerindeki kolonları taze hücre ayırma tamponu ile üç kez yıkayın.

Akışta kalan kısmı, manyetik olarak yanıt vermeyen fraksiyon olarak toplayın. Kolonları mıknatıstan çıkarın ve bir piston yardımıyla kolon boyunca taze hücre ayıklama tamponu geçirerek, manyetik olarak yanıt veren hücre fraksiyonunu hemen toplayın. Hem Mag- hem de Mag+ fraksiyonlarını 300 ×g'de 10 dakika boyunca santrifüjleyin.

Hücre peletini PBS içinde yeniden süspand ettikten sonra, hücreleri sayın ve tripsin mavisi dışlama testi ile hücre canlılığını değerlendirin. Göbek kordonundan izole edilen HUVEC'ler, endotelyal belirteç CD31'in ekspresyonu ve bazal membran matrisi üzerinde tüpler oluşturmaları ile karakterize edilirler. miR/PEI/MNP ile transfekte edilen HUVEC'lerin tamamı işaretli miR alır.

Ve transfeksiyondan 24 saat sonra sağkalımları etkilenmeden kalır. Ayrıca, süper-çözünürlüklü mikroskopi, 3 renkli etiketli transfeksiyon komplekslerinin perinükleer lokalizasyonunu göstermektedir. PEI toksisitesi, miR/PEI transfekte edilmiş hücrelerin azalmış fonksiyonelliği ile doğrulanmıştır.

Önemli bir nokta olarak, MNP hücre özelliklerini geri kazandırır. miR/PEI/MNP ile modifiye edilmiş hücreler, tüp oluşumu açısından tedavi edilmemiş hücrelerden farklılık göstermez. Ayrıca, bu hücrelerin hücreler arası gap junctional iletişimi koruduğu, fotobeyazlatma sonrası floresan geri kazanımı (FRAP) ile ortaya çıkarılmıştır.

miR/PEI/MNP modifiyeli hücre süspansiyonu, döner çalkalayıcı üzerine yerleştirilmiş bir kültür plağının kuyucuklarına ekildikten sonra, hücreler yerel mıknatıs uygulamasının yapıldığı alana göç etme ve orada tutunma eğilimi gösterir. Temsili görüntüler, mıknatıs uygulanan bölgedeki hücre büyümesini betimlemektedir. Mıknatıs uygulaması olmadan.

Ve sıvı akışının hücreleri yoğunlaştırdığı kültür kuyusunun merkezinde. Uzmanlaşıldığında, hücre transfeksiyonu iki saat içinde tamamlanabilir. Bu videoyu izledikten sonra, endotel hücrelerin magnetizasyon dahil olmak üzere geçici ancak yüksek verimli bir şekilde nasıl modifiye edileceği konusunda çok iyi bir fikre sahip olmalısınız.

Ayrıca, hücre ürününün nihai karakterizasyonunun nasıl yapılacağı da anlatılacaktır. Bu prosedür uygulanırken; hücre ekim miktarları, transfeksiyon komplekslerinin hazırlanmasında kullanılan bileşen miktarları, inkübasyon süresi ve transfeksiyon sonrası yıkama adımında belirtilen değerlere uyulması önemlidir. Bu yaklaşımın, etkilenen diğer organların tedavisi için diğer hücre tiplerine de kolaylıkla aktarılabileceği konusunda oldukça iyimseriz.

Bu prosedürün ardından, modifiye edilmiş manyetize hücrelerle in vivo çalışmalar gerçekleştirilebilir. Bu çalışmalar, hücrelerin demirle yüklenmesinin, ilgi duyulan bölgede tutunmalarını sağlamak için yeterli olup olmadığına dair ek soruları yanıtlayabilir. Ayrıca, in vivo MRI ile saptama sınırlarını belirlemek için de kullanılabilir.