Name: Bir uygulama için Protokoller Escherichia coli Tabanlı TX-TL Hücre-Özgür İfade Sistemi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-09-16T13:00:00.000+00:00
Duration: 16 min 11 s
Description: Öğrenin, Escherichia coli tabanlı TX-TL hücre-özgü ifade sisteminin nasıl oluşturulacağını ve sentetik biyoloji uygulamaları için protein sentezi koşullarının nasıl optimize edileceğini.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Biz projenin erken aşamalarında yardım için Jongmin Kim, Dan Siegal-Gaskins, Anu Thubagere ve protokol düzene yardım için Enoch Yeung, ve Clare Chen ve Barclay Lee teşekkür ederim. Bu malzeme Yaşam Dökümü programı, sözleşme numarası HR0011-12-C-0065 (DARPA / CMO.ZZS da UCLA / Caltech Tıp Scientist tarafından desteklenen Savunma İleri Araştırma Projeleri Ajansı (DARPA / MTO) tarafından kısmen desteklenen çalışma üzerine kuruludur Eğitim Programı dostluk ve bir DoD, Bilimsel Araştırma, Milli Savunma Bilimi ve Mühendisliği Yüksek Lisans (NDSEG) Bursu, 32 CFR 168A Hava Kuvvetleri Ofisi., bu belgede yer alan görüş ve sonuçlar yazarlara aittir ve temsil olarak yorumlanmaması gerektiğini resmen politikaları, açıkça veya ima, Savunma İleri Araştırma Projeleri Ajansı veya ABD Hükümeti.

<ol><li>Noireaux, V., Bar-Ziv, R., Libchaber, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Principles+of+cell-free+genetic+circuit+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Principles of cell-free genetic circuit assembly.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100, 12672-12677 (2003).</li>
<li>He, M. Y., He, Y. Z., Luo, Q., Wang, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+DNA+to+protein%3A+No+living+cells+required%5BTitle%5D)+AND+%22Process+Biochem%22%5BJournal%5D)">From DNA to protein: No living cells required.</a> Process Biochem. 46, 615-620 (2011).</li>
<li>Forster, A. C., Church, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthetic+biology+projects+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Synthetic biology projects in vitro.</a> Genome Res. 17, 1-6 (1101).</li>
<li>Shin, J., Noireaux, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+cell-free+expression+with+the+endogenous+E.+Coli+RNA+polymerase+and+sigma+factor+70%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+biological+engineering%22%5BJournal%5D)">Efficient cell-free expression with the endogenous E. Coli RNA polymerase and sigma factor 70.</a> Journal of biological engineering. 4, 8(2010).</li>
<li>Shimizu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-free+translation+reconstituted+with+purified+components%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Cell-free translation reconstituted with purified components.</a> Nat Biotechnol. 19, 751-755 (2001).</li>
<li>Shin, J., Noireaux, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+E.+coli+Cell-Free+Expression+Toolbox%3A+Application+to+Synthetic+Gene+Circuits+and+Artificial+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Acs+Synth+Biol%22%5BJournal%5D)">An E. coli Cell-Free Expression Toolbox: Application to Synthetic Gene Circuits and Artificial Cells.</a> Acs Synth Biol. 1, 29-41 (2012).</li>
<li>Shin, J., Noireaux, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Study+of+messenger+RNA+inactivation+and+protein+degradation+in+an+Escherichia+coli+cell-free+expression+system%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+biological+engineering%22%5BJournal%5D)">Study of messenger RNA inactivation and protein degradation in an Escherichia coli cell-free expression system.</a> Journal of biological engineering. 4, 9(2010).</li>
<li>Shin, J., Jardine, P., Noireaux, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+Replication%2C+Synthesis%2C+and+Assembly+of+the+Bacteriophage+T7+in+a+Single+Cell-Free+Reaction%5BTitle%5D)+AND+%22Acs+Synth+Biol%22%5BJournal%5D)">Genome Replication, Synthesis, and Assembly of the Bacteriophage T7 in a Single Cell-Free Reaction.</a> Acs Synth Biol. 1, 408-413 (2012).</li>
<li>Siegal-Gaskins, D., Noireaux, V., Murray, R. M. Biomolecular resource utilization in elementary cell-free gene circuits. Pao, L., Abramovitch, D. American Control Conference, Jun 17-19, Washington, DC, , AACC. 1531-1536 (2013).</li>
<li>Karzbrun, E., Shin, J., Bar-Ziv, R. H., Noireaux, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coarse-grained+dynamics+of+protein+synthesis+in+a+cell-free+system%5BTitle%5D)+AND+%22Physical+review+letters%22%5BJournal%5D)">Coarse-grained dynamics of protein synthesis in a cell-free system.</a> Physical review letters. 106, 048104(2011).</li>
<li>Hoagland, M. B., Stephenson, M. L., Scott, J. F., Hecht, L. I., Zamecnik, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Soluble+Ribonucleic+Acid+Intermediate+in+Protein+Synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Soluble Ribonucleic Acid Intermediate in Protein Synthesis.</a> J Biol Chem. 231, 241-257 (1958).</li>
<li>Wood, W. B., Berg, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+Enzymatically+Synthesized+Ribonucleic+Acid+on+Amino+Acid+Incorporation+by+a+Soluble+Protein-Ribosome+System+from+Escherichia+Coli%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Effect of Enzymatically Synthesized Ribonucleic Acid on Amino Acid Incorporation by a Soluble Protein-Ribosome System from Escherichia Coli.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 48, 94(1962).</li>
<li>Zubay, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In-Vitro+Synthesis+of+Protein+in+Microbial+Systems%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">In-Vitro Synthesis of Protein in Microbial Systems.</a> Annu Rev Genet. 7, 267-287 (1973).</li>
<li>Pratt, J. M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPratt%2C+JM+%22Transcription+and+Translation%3A+A+Practical+Approach%22">Transcription and Translation: A Practical Approach</a>. Hames, B. D., Higgins, S. J. , IRL Press. 179-209 (1984).</li>
<li>Kim, H. C., Kim, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+energizing+cell-free+protein+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+bioscience+and+bioengineering%22%5BJournal%5D)">Methods for energizing cell-free protein synthesis.</a> Journal of bioscience and bioengineering. 108, 1-4 (2009).</li>
<li>Michel-Reydellet, N., Calhoun, K., Swartz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amino+acid+stabilization+for+cell-free+protein+synthesis+by+modification+of+the+Escherichia+coli+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Metabolic+engineering%22%5BJournal%5D)">Amino acid stabilization for cell-free protein synthesis by modification of the Escherichia coli genome.</a> Metabolic engineering. 6, 197-203 (2004).</li>
<li>Liu, D. V., Zawada, J. F., Swartz, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Streamlining+Escherichia+coli+S30+extract+preparation+for+economical+cell-free+protein+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+progress%22%5BJournal%5D)">Streamlining Escherichia coli S30 extract preparation for economical cell-free protein synthesis.</a> Biotechnology progress. 21, 460-465 (2005).</li>
<li>Andrianantoandro, E., Basu, S., Karig, D. K., Weiss, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthetic+biology%3A+new+engineering+rules+for+an+emerging+discipline%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+systems+biology%22%5BJournal%5D)">Synthetic biology: new engineering rules for an emerging discipline.</a> Molecular systems biology. 2, 2006.0028(2006).</li>
<li>Kwok, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Five+hard+truths+for+synthetic+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Five hard truths for synthetic biology.</a> Nature. 463, 288-290 (2010).</li>
<li>Tabor, S., Richardson, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+bacteriophage+T7+RNA+polymerase%2Fpromoter+system+for+controlled+exclusive+expression+of+specific+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">A bacteriophage T7 RNA polymerase/promoter system for controlled exclusive expression of specific genes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 82, 1074-1078 (1985).</li>
<li>Lewicki, B. T., Margus, T., Remme, J., Nierhaus, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coupling+of+rRNA+transcription+and+ribosomal+assembly+in+vivo.+Formation+of+active+ribosomal+subunits+in+Escherichia+coli+requires+transcription+of+rRNA+genes+by+host+RNA+polymerase+which+cannot+be+replaced+by+bacteriophage+T7+RNA+polymerase%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+molecular+biology%22%5BJournal%5D)">Coupling of rRNA transcription and ribosomal assembly in vivo. Formation of active ribosomal subunits in Escherichia coli requires transcription of rRNA genes by host RNA polymerase which cannot be replaced by bacteriophage T7 RNA polymerase.</a> Journal of molecular biology. 231, 581-593 (1993).</li>
<li>Iskakova, M. B., Szaflarski, W., Dreyfus, M., Remme, J., Nierhaus, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Troubleshooting+coupled+in+vitro+transcription-translation+system+derived+from+Escherichia+coli+cells%3A+synthesis+of+high-yield+fully+active+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+acids+research%22%5BJournal%5D)">Troubleshooting coupled in vitro transcription-translation system derived from Escherichia coli cells: synthesis of high-yield fully active proteins.</a> Nucleic acids research. 34, e135(2006).</li>
<li>Kigawa, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+Escherichia+coli+cell+extract+for+highly+productive+cell-free+protein+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+structural+and%22%5BJournal%5D)">Preparation of Escherichia coli cell extract for highly productive cell-free protein expression.</a> Journal of structural and. 5, 63-68 (2004).</li>
<li>Matsuda, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improving+cell-free+protein+synthesis+for+stable-isotope+labeling%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+biomolecular.+NMR%22%5BJournal%5D)">Improving cell-free protein synthesis for stable-isotope labeling.</a> Journal of biomolecular. NMR. 37, 225-229 (2007).</li>
<li>Sitaraman, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+cell-free+protein+synthesis+system%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+biotechnology%22%5BJournal%5D)">A novel cell-free protein synthesis system.</a> Journal of biotechnology. 110, 257-263 (2004).</li>
<li>Becskei, A., Serrano, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+stability+in+gene+networks+by+autoregulation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Engineering stability in gene networks by autoregulation.</a> Nature. 405, 590-593 (2000).</li>
<li>Maeda, H., Fujita, N., Ishihama, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Competition+among+seven+Escherichia+coli+sigma+subunits%3A+relative+binding+affinities+to+the+core+RNA+polymerase%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+acids+research%22%5BJournal%5D)">Competition among seven Escherichia coli sigma subunits: relative binding affinities to the core RNA polymerase.</a> Nucleic acids research. 28, 3497-3503 (2000).</li>
<li>Caschera, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coping+with+complexity%3A+machine+learning+optimization+of+cell-free+protein+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+and+bioengineering%22%5BJournal%5D)">Coping with complexity: machine learning optimization of cell-free protein synthesis.</a> Biotechnology and bioengineering. 108, 2218-2228 (2011).</li>
<li>Hodgman, C. E., Jewett, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-free+synthetic+biology%3A+thinking+outside+the+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Metabolic+engineering%22%5BJournal%5D)">Cell-free synthetic biology: thinking outside the cell.</a> Metabolic engineering. 14, 261-269 (2012).</li>
<li>Elowitz, M. B., Leibler, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+synthetic+oscillatory+network+of+transcriptional+regulators%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A synthetic oscillatory network of transcriptional regulators.</a> Nature. 403, 335-338 (2000).</li>
<li>Tsuruta, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-level+production+of+amorpha-4%2C11-diene%2C+a+precursor+of+the+antimalarial+agent+artemisinin%2C+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Plos+One%22%5BJournal%5D)">High-level production of amorpha-4,11-diene, a precursor of the antimalarial agent artemisinin, in Escherichia coli.</a> Plos One. 4, e4489(2009).</li>
<li>Gardner, T. S., Cantor, C. R., Collins, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Construction+of+a+genetic+toggle+switch+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Construction of a genetic toggle switch in Escherichia coli.</a> Nature. 403, 339-342 (2000).</li>
<li>Jewett, M. C., Forster, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Update+on+designing+and+building+minimal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Current+opinion+in+biotechnology%22%5BJournal%5D)">Update on designing and building minimal cells.</a> Current opinion in biotechnology. 21, 697-703 (2010).</li>
<li>Noireaux, V., Libchaber, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+vesicle+bioreactor+as+a+step+toward+an+artificial+cell+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">A vesicle bioreactor as a step toward an artificial cell assembly.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101, 17669-17674 (2004).</li>
</ol>

Yazarlar, hiçbir rakip mali çıkarlarını olmadığını beyan ederim.

Burada anlatılan endojen Escherichia coli tabanlı TX-TL hücre-özgür ifade sistem veri toplama kurmak daha az sekiz saat sürebilir kolay bir vadede üç tüp tepkidir. Tüm reaktifler oluşturma işlemi beş günlük süre toplam (sadece bir günde önemli emek şartlarına) gerektirir, ancak 3000 reaksiyonlar için ham özü üreten ve tampon verme 10000 reaksiyonları için reaktif (Şekil 1). Ayrıca, ham öz ve tampon verme reaktif bir hazırlama birden fazla kullanım için izin veren, -80 ° C de en az 1 yıl boyunca stabildir. 4, 10 ul reaksiyon başına 0,11 $ (işçilik dahil 0,26 $) olarak, maliyeti karşılaştırılabilir% 98&#39;den daha düşüktür ticari sistemler (Şekil 2). Bazı çözülmemiş sınırlamalar sisteme Bununla birlikte, var. Her bir ham hücre özütü hazırlama nihai verim, kullanıcı, yeterlilik ve çevre koşullarına göre değişebilir, ancak typical verim varyasyon% 5-10 (Şekil 4b) arasındadır. Bunun bir sonucu olarak, her iki uç noktası ifade ve ifade dinamikleri partiden partiye değişkenlik beklenemez. Özü oluşturma tam otomatik kadar özü tam olarak karakterize kadar veya bu varyasyonlar büyük olasılıkla kalacaktır. Hücre içermeyen sentezleme sistemi hassas bir kantitatif deneyler için kullanılan, bu ham hücre ekstresinin aynı toplu tüm deneyler çalıştırmak için tavsiye edilir. Tek bir ham hücre ekstraktı toplu, yaklaşık 3000 reaksiyonlar verimi tipik bir deney sahaları için yeterli olmalıdır. Biz varyasyon ölçeklendirme ve prosedürü otomatik silinebilir şüphelenmesine rağmen, bu tür girişimler önemli bir kaynak yatırımı içerecektir. Uç-nokta temsil seviyelerini belirlemek üzere oldukça kolay olmasına rağmen, ayrıca, daha fazla iş hücre içermeyen bir sistem için esas anlayış dinamikleri yapılması gerekmektedir. Bilindiği gibi iki kaynak competition ve kaynak sınırlaması ifade dinamiklerini etkileyebilir. Örneğin, belirli endojen sigma 70. 9,27 Bununla birlikte, tam dinamik sistem kullanmak için anlaşılması gerekmez artan DNA şablonu nükleotid ya da amino asit tükenmesi edilene benzer bir ekspresyon profili üreten bir doyurulması rejimi neden olabilir. Verim saf artar, optimizasyon makine-öğrenme yaklaşımları ile yapılabilir. Kaynak rekabeti sınırlama ve 28 Sorular deneysel veriler kullanılarak doğrulandı matematiksel modellerle ele alınabilir. Burada sunulan protokolü BL21-Rosetta2 suşu için optimize edilmiş, ancak diğer E. genellenebilir olduğunu coli suşları. Bu tür gen kodlayan boylam proteaz ve nadir tRNAs kodlayan genlerin ilavesinin giderilmesi gibi BL21-Rosetta2 modifikasyonlar, maksimum protein üretimi için izin verir. Biz diğer iki ekstresi suşları ile protokol çalıştılar - sadece BL21 ve BL21 trxA nakavt-and% 50 daha az protein verimi bulundu. Biz diğer suşları kullanırken verimleri benzer azalttığını varsayımında. Örneğin LB ve diğer zengin bakteri kültürü için 2xYT büyüme ortamını değiştirme gibi parametreler, diğer değişiklikler, azalmış protein verimle sonuçlandı. Endojen ve eksojen transkripsiyon-çeviri makine ve regülasyon mekanizmalarını hem kullanan hücre-özgür ifade sistemleri protein ve metaboliti ifade hem de ve sentetik biyoloji geniş uygulamalar var. Yerine T7-regüle devreleri sınırlı olmak, bir karmaşık biyomoleküllerin üretiminde tasavvur edebilir 3,29 yerli E. bir karışımını kullanarak bir kullanıcı tarafından kontrol ortamda coli hızlandırıcılar ve dışsal olarak verilen transkripsiyon ve regülasyon mekanizmaları. Hücre bölünmesi ve metabolizma sınırlama olmaksızın, bu tür repressilator ya da bu üretim artemisinin gibi metabolik mühendislik yollarındaki gibi sentetik devrelerinde değişkenlik azalır ya da daha iyi anlaşılabilir. 30,31 Biz havE genetik anahtarları uygulamak için, yanı sıra sigma faktörü haciz anlamak için bu avantajları kullanılır 9,32 Bu teknoloji aynı zamanda &quot;minimal&quot; veya &quot;yapay&quot; hücrelerin omurgasını oluşturabilir -. küçük, iyi karakterize ve kendine yeterli somutlaşan birimleri özü. 33,34 Sonuçta, biz sentetik biyoloji için bir prototip ortamı olarak bu endojen hücre içermeyen ifade sisteminin derhal kullanımlar tahmin. Temel plazmiti, doğrusal ya da kimyasal olarak sentezlenmiş DNA üzerinde test döngüleri, bunu takiben-- takma &quot;TX-TL biyomoleküler deneyleri,&quot; hücre sentezleme sistemi içermeyen prototipleme mermi geçirebilmektedir sentetik devre sonunda in vivo ifadesi için tahsis edilmiş bir kontrol ortamı sağlar analizi ve hızlı bir modifikasyonu ile. Prototip mermi şu anda geliştirilmekte olan akıllı matematiksel modellerle destekli olabilir. Klonlama ve non-son devreler için vivo manipülasyon kaldırarak, biz engi tahmindisliği döngü süreleri yerine geçerli haftalık standart 1-3 gün azaltılmalıdır.

A correction to Figure 5's legend has been made for the article <a href="http://www.jove.com/video/50762/protocols-for-implementing-an-escherichia-coli-based-tx-tl-cell-free">Protocols for Implementing an Escherichia coli Based TX-TL Cell-Free Expression System for Synthetic Biology</a>. Method 1 and method 2 have been switched.Z
The figure legend was update from:
Figure 5. Effects of DNA solution on expression efficiency. a) Comparison of two different purification methods for processing plasmids. 1 nM of pBEST-OR2-OR1-Pr-UTR1-deGFP-T500 is prepared using only a QiaPrep Spin Miniprep Kit (Purification method 1) or post-processed with a QiaQuick PCR purification kit (Purification method 2).
to
Figure 5. Effects of DNA solution on expression efficiency. a) Comparison of two different purification methods for processing plasmids. 1
nM of pBEST-OR2-OR1-Pr-UTR1-deGFP-T500 is prepared using only a QiaPrep Spin Miniprep Kit (Purification method 2) or post-processed
with a QiaQuick PCR purification kit (Purification method 1).

A correction to Figure 5's legend has been made for the article Protocols for Implementing an Escherichia coli Based TX-TL Cell-Free Expression System for Synthetic Biology. Method 1 and method 2 have been switched.

Erratum: Protocols for Implementing an Escherichia coli Based TX-TL Cell-Free Expression System for Synthetic Biology

Hücre içermeyen ifade teknolojisi T7 bakteriyofaj DNA kullanılarak bağlanmış transkripsiyon-çeviri mekanizmaları kapsayacak şekilde yıl sonra ilerleyen, tamamen öteleme gibi 1950&#39;li yıllarda başladı. 11,12 O zamandan bu yana, sayısız çalışmalar ham hücre ekstresinin oluşturma (veya E optimize etmek için yapılmıştır . coli S30 ekstresi). 13,14 Bu optimizasyonlar ATP yenilenmesi veya zorlanma modifikasyonlar sayesinde hücre serbest protein sentezini uzatan, ve protokol süresini ve maliyetini azaltmak sayılabilir. 15-17 Alternatif hücre-özgür ifade sistemlerin var olduğunu ham petrol yerine kullanılması yeniden bileşenler ifadesi için hücre ekstresi. 5&#39;te ham hücre ekstraktı ve yeniden oluşturma yöntemleri, her ikisi de ticari kullanım için geliştirilmiştir. Sentetik biyoloji ile birlikte, mühendislik biyolojik modülleri ve devreleri test ve ifade etmek, iyi karakterize platformu için artan bir ihtiyaç vardır. 18,19 Bu platform olmalıçok yönlü, iyi karakterize, işlemek için basit ve kullanıcı tarafından sağlanan bileşenleri üzerinde duruldu. Yarım yüzyıl önce geliştirilmiş olmasına rağmen, hücre içermeyen sistemler E. dayalı Bu büyüme ve metabolizmasını karmaşıklığı olmadan hücresel süreçlerin vitro temsil basitleştirilmiş olarak coli özünde, bu gereksinimleri paylaşmaktadır. Ayrıca, E. in vivo çalışmalarında gelen temel bilginin tüm E. coli kolayca uygulanır coli hücre içermeyen sistemler. Hücresiz ekspresyon sistemleri en hücresiz ifade sistemleri hedef bugüne kadar, sentetik biyoloji uygulamaları olabilir, ancak protein ve metabolit verim en üst düzeye çıkartılması olmuştur. Bu T7 promotörler ile tahrik dizilerinin T7 bakteriyofaj transkripsiyonunu kullanılarak gerçekleştirilir. 20 sentezleme etkili ve sağlam olmakla birlikte, bu sistemler bir çok özel bir amaca hizmet eder. Hücre düzenleme yöntemleri sınırlı, hedef DNA şablonları olmalıT7 promotörleri dahil yeniden yapılandırılmış ve bu ribozomal kompleksleri gibi bazı dizileri transkripsiyonu ve monte edilemez. 21,22 Mevcut hücre içermeyen ifade sistemleri endojen düzenleyici mekanizmalar, sentetik biyoloji için gerekli bir çok yönlülük koruyarak yüksek verim koruyamazlar. Bu endojen bir E. geliştirdik Önceki sistemler tarafından gösterilen protein ifade etkinliğini korur, fakat sağlayarak ek yönlülük ekler coli hücre içermeyen ifade sistemi ifade ve (T7 ya da diğer) mekanizmalar iç ve dış iki göre düzenleme. Burada açıklanan protokol, ilk. Kigawa et al göre (2004) Liu et al. (2005), fakat önemli değişiklikler vardır. Bu, verimlilik artışı için Mg ve K-asetat üzerinde Mg-ve K-glutamat kullanır 2-merkaptoetanol kaldırır ve bir boncuk-çırpıcı kullanarak hücreleri lyses. 17,23,24 Boncuk-dayak homojenizasyon üzerinde seçilir,nedeniyle rekabet sistemlerine daha düşük maliyet ve benzer verimler basınç dayalı yöntemler, ya da sonikasyon. 23 3-fosfogliserik asit (3-PGA) bu kreatin fosfat ile karşılaştırıldığında daha üstün protein verimleri verdiği bulunmuştur olarak enerji kaynağı olarak kullanılır ve fosfoenolpiruvat. 4,25 Bizim sistemi ya da lamda-faj operatörleri ile bir sigma70 tabanlı bir promoter ya da başka ticari sistemlerinden verim benzer bir T7 promotörü tahrikli kullanılarak raportör protein 0.75 mg / ml &#39;ye kadar üretebilir. 4,6 beş gün gerekli tüm reaktifleri (Şekil 1) üretimi için gerekmektedir. Ayrıca, benzer ticari, hücre içermeyen sistemlere göre% 98 maliyet tasarrufu sağlar - malzeme maliyetleri işçilik (Şekil 2) dahil $ ile 0.26 arasında yükselir 10 ul reaksiyon başına 0,11 $ vardır.

<table><tbody><tr><td>2xYT</td><td>MP biyomedikal</td><td>3012-032&</td><td>nbsp;</td></tr><tr><td>3-PGA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8877</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>ATP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A8937</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Bacto-agar</td><td>BD Teşhisi</td><td>214010</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Boncuk çırpma tüpleri (polipropilen mikrovialler)</td><td>BioSpec</td><td>522S</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Boncuklar, 0,1 mm çap.</td><td>BioSpec</td><td>11079101</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>BL21 Rosetta 2 E. coli suşu</td><td>Novagen</td><td>71402</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Bradford BSA Protein Test Kiti</td><td>Bio-rad</td><td>500-0201</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>cAMP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9501</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Kloramfenikol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1919</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>CoA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C4282</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>CTP</td><td>USB</td><td>14121</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Küvet, 1.5ml</td><td>Fisher</td><td>14-955-127</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>DTT</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D0632</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Folinik asit</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F7878</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>GTP</td><td>USB</td><td>16800</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H6147</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>K-glutamat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1149</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Mg-glutamat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>49605</td> <td>&</td></tr><tr><td>Mikro Bio-Spin Kromatografi Kolonları</td><td>Bio-Rad</td><td>732-6204</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>NAD</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N6522</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Nunc 384 kuyulu optik alt plakalar</td><td>Termo-Bilimsel</td><td>142761</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Nunc sızdırmazlık bandı</td><td>Thermo-Scientific</td><td>232701</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>PEG-8000</td><td>Promega</td><td>V3011</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Potasyum fosfat dibazik çözelti</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8584</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Potasyum fosfat monobazik çözelti</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8709</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>RTS Amino Asit Örnekleyici</td><td>5 Prime</td><td>2401530</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Slide-A-Lyzer Diyaliz Kasetleri, 10k MWCO (Kit)</td><td>Termo-Scientific</td><td>66382</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Spermidin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>85558</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Tris tabanı</td><td>Fischer</td><td>BP1521</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>tRNA (E. coli'den)</td><td>Roche Applied Science</td><td>MRE600</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>UTP</td><td>USB</td><td>23160</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>1L Santrifüj Şişesi</td><td>Beckman-Coulter</td><td>A98813</td><td>Bu, Avanti J serisine özeldir; kullanımdaki santrifüj için eşdeğer boyut elde edin.</td></tr><tr><td>4L Erlenmeyer Şişesi</td><td>Kimble Chase</td><td>26500-4000</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Avanti J-26XP Santrifüj</td><td>Beckman-Coulter</td><td>393127</td><td>veya 1L kapasiteli santrifüj eşdeğeri.</td></tr><tr><td>Forma 480 Orbital Çalkalayıcı</td><td>Thermo Scientific</td><td>480</td><td>Veya göğüs boyutunda 6x4L çalkalayıcı eşdeğeri.</td></tr><tr><td>JLA-8.1000 Rotor</td><td>Beckman-Coulter</td><td>363688</td><td>Veya santrifüj için 1L özellikli, 5000 x g rotor eşdeğeri.</td></tr><tr><td>Mini Boncuk Çırpıcı-1</td><td>BioSpec</td><td>3110BX</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td colspan="4">Tamamlayıcı Materyal 1. Items. için tarifler
 Kloramfenikol, 34 mg / ml: 0.51 g kloramfenikol hazırlayın ve 15 ml'ye etanol ekleyin. Filtre sterilize eder (0.22 & mu; M), 1 ml'lik tüplere alikot, -20 °C'de saklayın; Daha sonra kullanmak üzere C. 
2xYT+P+Cm agar plakası: 1.24 g 2xYT, 1.6 ml potasyum fosfat dibazik çözelti @ 1 M, 0.88 ml potasyum fosfat monobazik çözelti @ 1 M, 0.6 g agar ve 40 ml'ye kadar su hazırlayın. 50 ° C'ye soğumaya bırakın; C ve 40 &mu ekleyin; l Cm. 25 ml 100x15 mm'lik bir petri kabına koyun ve bir saat soğumaya bırakın. 
2xYT+P ortam: 124 g 2xYT, 160 ml potasyum fosfat dibazik çözelti @ 1 M, 88 ml potasyum fosfat monobazik çözelti @ 1 M hazırlayın ve 4 L'ye kadar su hazırlayın. 2x1.88 L ve 0.24 L'ye Aliquot. Otoklav. 
Tris tabanı, 2 M: 60.57 g Tris tabanı hazırlayın ve 250 ml'ye kadar su verin. Sterilize edin, daha sonra kullanmak üzere RT'de saklayın. 
DTT, 1 M: 2.31 g DTT hazırlayın ve 15 ml'ye kadar sulayın. Filtre sterilize eder (0.22 & mu; M), 1 ml'lik tüplere alikot, -20 °C'de saklayın; Daha sonra kullanmak üzere C. 
 S30A tamponu: 10.88 g Mg-glutamat ve 24.39 g K-glutamat, 2M'de 50 ml Tris, asetik asit (pH 7.7'ye kadar) ve 2 L'ye su hazırlayın. C, kullanmadan önce 4 ml 1 M DTT ekleyin. 
 S30B tamponu: 10.88 g Mg-glutamat ve 24.39 g K-glutamat, 2 M'de Tris (pH 8.2'ye kadar) ve 2 L'ye su hazırlayın. C, kullanmadan önce 2 ml 1 M DTT ekleyin. 
 HEPES: 1.91 g HEPES (MW 238.21), KOH (pH 8'e kadar) hazırlayın ve 4 ml. 'ye kadar su
tRNA: 30 mg tRNA hazırlayın ve 600 & 'ye kadar su
 CoA: 30 mg CoA (MW 767.53) hazırlayın ve 600 & 'ye kadar su
 NAD: 34.83 mg NAD (MW 663.43), 2 M'de Tris (pH 7.5-8'e kadar) ve 300 &mu;l'ye su ekleyin. Çözeltiyi pH 7.5-8'e getirmek için 2 M'de l Tris). 
cAMP: 42.80 mg cAMP (MW 329.22), 2 M'de Tris (pH 8'e kadar) ve 200 &mu;l'ye su ekleyin. Çözeltiyi pH 8'e getirmek için 2 M'de l Tris). 
Folinik Asit (33.9 mM): 20 mg katı folinik asit kalsiyum tuzuna (MW 511.5) 1.15 ml su ekleyin. 
Spermidin: 23.55 &mu hazırlayın; l spermidin (MW 145.25) ve 150 &mu;l'ye kadar su. 37 ° C. 'de kısa bir süre erittikten sonra oda sıcaklığında hazırlayın
3-PGA: 1.03 g 3-PGA (MW 230.02), 2 M'de Tris (pH 7.5'e kadar) ve 3.2 ml'ye su ekleyin. (Çözeltiyi pH 7.5'e getirmek için 2 M'de 1.73 ml Tris ekleyin). 
 Nükleotid Karışımı: 145 mg ATP dipotasyum tuzu dihidrat (MW 619.4), 133 mg GTP disodyum tuzu (MW 567.14), 79.4 mg CTP disodyum tuzu dihidrat (MW 563.16), 82.6 mg UTP trisodyum tuzu dihidrat (MW 586.12)% 15 seyreltmede KOH (pH 7.5'e kadar) ve 1.5 ml'ye su ekleyin. (353 &mu ekleyin; çözeltiyi pH 7.5'e getirmek için% 15 seyreltmede l KOH). 
< Güçlü> Tamamlayıcı Materyal 2. Bradford Tahlil.</güçlü>
<ol>
	<li>Bradford ajanını 4 & dereceden kaldırın; C ve oda sıcaklığına ayarlayın.< / li>
	<li> 50 &mu hazırlayın; l BSA Standardı 1 mg / ml ve 0.1 mg / ml.< / li'de>
	<li> 40 &mu hazırlayın; l Adım 1.47.</Li'den ekstraktın 20x seyreltilmesi>
	<li>800 &mu ekleyin; l. 7 küvete kadar su. </li>
	<li> 0 mg / ml, 1 mg / ml (10 &mu; l 0.1 mg / ml BSA), 2 mg / ml (20 & mu; l 0.1 mg / ml BSA), 4 mg / ml (4 & mu; l 1 mg / ml BSA), 6 mg / ml (6 &mu; l 1 mg / ml BSA).< / li>
	<li> 2 &mu için deneysel küvetler hazırlayın; L örnek ve 4 &mu; l örnek.</li>
	<li>200 &mu ekleyin; Her küvete l Bradford ajanı ve pipetleme ile iyice karıştırın. Oda sıcaklığında en az 10 dakika </li inkübe edin>
	<li> Adım 6.5'teki küvetleri kullanarak OD 595nm'de standart eğri üretin. r2 < ise standart eğriyi reddet 0,95.</li>
	<li> Tep 6.6.< / li'den küvetler kullanarak OD 595nm'deki ekstrakt konsantrasyonunu belirleyin>
</ol>
< Güçlü> Tamamlayıcı Materyal 3. Tampon kalibrasyon elektronik tablosu. 
<a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/50762/TXTL_e(şablon)_calibration_JoVE.xlsx" target="_blank"> Bkz. TXTL_e(şablon)_calibration_JoVE.xlsx</a>. 
< Güçlü> Tamamlayıcı Materyal 4. Hücresiz ifade çalıştırma spreadsheet. 
<a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/50762/TXTL_JoVE.xlsx" target="_blank">Bkz. TXTL _JoVE.xlsx</a>.</td></tr></tbody></table>

bir uygulama için protokoller escherichia coli tabanlı tx-tl hücre-Özgür İfade sistemi

Protocols for Implementing an Escherichia coli Based TX-TL Cell-Free Expression System for Synthetic Biology

Ideal hücresiz ifade sistemleri, teorik olarak, bir in vitro platform kontrol edilir. 1 Bu, kontrollü bir şekilde proteinler ve genetik devreleri ifade hem de sentetik biyoloji için bir prototip bir ortam temin etmek için kullanışlıdır. 2,3 bir in vivo hücre ortamı taklit İkinci amaca ulaşmak için, korumak hücresiz ifade sistemleri, endojen Escherichia coli transkripsiyon için mekanizmalar daha doğru bir T7 RNA polimeraz transkripsiyonuna dayanan daha in vivo hücre dinamiklerini yansıtmak mümkün bulunmaktadır. Biz verimli bir endojen E. hazırlanmasını ve yürütülmesini tarif Benzer ticari sistemler için% 98 maliyet azaltma T7 bazlı sistemleri gibi protein eşdeğer miktarlarda üretmek coli göre transkripsiyon için (TX-TL) hücre içermeyen sentezleme sistemi. 4,5 tampon ve ham hücre ekstresinin hazırlanması vardır Bir yürütülmesi, hem de tarifÜç tüp TX-TL reaksiyonu. Tüm protokol hazırlamak için beş gün sürer ve bir hazırlık 3000&#39;e kadar tek reaksiyonlar için yeterli malzeme verir. Hazırlandıktan sonra, her reaksiyon veri toplama ve analiz için kurulum 8 saat altında sürer. E. düzenleme ve transkripsiyon dışsal Mekanizmaları E. coli, örneğin, lak / tet baskılayıcılar ve T7 RNA polimeraz gibi, takviye edilebilir. mRNA ve DNA yıkımı oranları gibi 6 endojen özellikleri de ayarlanabilir. 7 TX-TL hücresiz sentezleme sistemi için gösterilmiştir geniş ölçek devre montaj, biyolojik olguları keşfetmek, hem T7-ve endojen yararlanıcı altında proteinlerin ifadesi. 6,8 Refakatçi matematiksel modelleri mevcuttur. 9,10 çıkan sistem bir prototip ortamı olarak sentetik biyoloji benzersiz uygulamaları vardır, ya da &quot;TX- TL Biyomoleküler breadboard. &quot;

Biz, TX-TL hücresiz sentezleme sistemi tabanlı bir endojen Escherichia coli hazırlanması için, beş gün protokol sundu. Ham hücre özütü ve tampon - - reaktiflerin yaratmak için örnek bir zaman çizelgesi, Şekil 1 de bulunabilir. Oluşturulduktan sonra, bu bir yıla kadar -80 ° C'de muhafaza edilebilir. Reaktif oluşturulduktan sonra, deney setup ve yürütme az 8 saat içerisinde yapılabilir. Buna ek olarak, TX-TL hücresiz ekspresyon sisteminde ekspresyonu koşulları optimize edilmiştir. Bu tür tampon çözeltiler ya da DNA gibi diğer kullanıcı tarafından sağlanan ilave, daha önce toksisite için kalibre edilmelidir. Örneğin, işleme plazmidlerin değişik yöntemleri nedeniyle tuz içeriği için farklı tanımına neden olur. Ayrıca, reaksiyon verimliliği üzerinde Tris-Cl elüsyon tamponu etkisini (Şekil 5) test edilmiştir. 4.9 adım 4.1 atıfta ham hücre ekstraktı kalibrasyon, bir örnek gösterilmektedirŞekil 4a. Genelde, deneyler ham hücre ekstraktı K-glutamat seviyeleri, ardından Mg-glutamat seviyeleri, en hassas olduğunu göstermektedir. Hücre içermeyen ifade sistemini göstermek için, biz tet tahakküme dayalı bir negatif geri besleme döngüsü. 26. (Şekil 6) inşa ve test edilmiş. Hücre içermeyen sentezleme sisteminde, ve ATC olmadan aynı devre çalıştırma ifade sekiz saat sonra deGFP raportör bir 7-kat uç-nokta ifade değişimi göstermektedir. Bu "Master Mix Terkip." Altında ilave edilebilir gerekirse, bu deney, genel uyarıcıları veya baskılayıcılar gerektirmez, ancak <img alt="Şekil 1" fo:content-width="4.5in" fo:src="/files/ftp_upload/50762/50762fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50762/50762fig1.jpg"> Şekil 1. Ham hücre özü, amino asit çözeltisi, ve enerji çözelti hazırlanması için zaman çizelgesi. Beş günlük bir timelin Protokolün tipik yürütülmesi için e gece boyunca ve gündüz inkubasyon çalışma adımları için optimize edilmiş, yukarıda verilmiştir. <img alt="Şekil 2," fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50762/50762fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50762/50762fig2.jpg"> Şekil 2. Maliyet ve ham hücre ekstreleri rekabet ekspresyon analizi. a) TX-TL hücresiz sentezleme sistemi emek ve malzeme maliyetlerini Dağılımı. Aralık 2012 gibi reaktiflerin maliyetleri, ve saat başına 14 $ işçilik maliyetleri dayalı. B) diğer ticari sistemleri vs TX-TL hücre serbest ifade sistemi maliyetlerinin karşılaştırması. Reaksiyon hacimleri kit başına. C diğer ticari sistemleri vs TX-TL hücre serbest ifade sistemi verim) Karşılaştırma değişebilir ancak maliyetleri, ul başına aşağı kırılmış. Protein ifadesi verim üretici standartlar tarafından belirlenir./ 50762fig2large.jpg "target =" _blank "&gt; büyük rakam görmek için buraya tıklayın. <img alt="Şekil 3," fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50762/50762fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50762/50762fig3.jpg"> Şekil 3,. Bir boncuk-dayak tüp yükleme ve işleme. a) Hücre-boncuk çözeltisi doğru viskozite gösterilmesi. Hücre-boncuk çözüm buz üzerinde harcanan eklendi S30A tampon miktarı, katma boncuk miktarı ve süresi dahil birçok faktöre bağlı bir viskoziteye sahip olacaktır. B) boncuk-yenerek tüp yükleniyor hızlı masaüstü santrifüj önce. Santrifüj yükleme sırasında biriken kabarcıklar kaldırır. C) masaüstü santrifüj sonra yüzey Bubbles. Kabarcıkların boyutu değişir,. Onlar bir pipet d kullanarak attı veya kaldırılabilir) Tamamen dolu boncuk-yenerek tüp kapatma önce. Bir menisküs boncuk yenerek t oluşturulurube ve kapak). e doldurlama Doğru yüklü filtre cihazı, az miktarda kapak ve neden yeterli bulunmuyor. Bu doğru vs yanlış işlenmiş boncuk-yenerek tüp. F) Karşılaştırma tekrar edilebilir. Soldaki tüpü iyi dövmek tüp - bu küçük ve iyi belirlenmiş üst tabaka, ve çok net süpernatant sahiptir. Sağdaki tüp daha büyük, puslu ikinci tabaka ve puslu yüzer göre suboptimaldir. Suboptimaldi Tüpler ek işleme tabi olmamalıdır. <img alt="Şekil 4," fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50762/50762fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50762/50762fig4.jpg"> Şekil 4. Ham ekstrakt preparatların özellikleri. a) ham hücre ekstresi için tipik kalibrasyon araziler. Ham ekstrakt, bu sırayla ilave Mg-glutamat, K-glutamat ve DTT seviyeleri için kalibre edilir. Son nokta fluorescenc gösterilmektedire 8 saat, hem de 12 dakikalık bir hareketli ortalama göre protein üretiminin maksimum hızı sonra. Bu araziler göre, ek Mg-glutamat, kabul edilebilir bir aralığı K-glutamat 60-80 mM, 4 mM ve DTT, 0-3 mM'dir. Her ham özü bu üç değişkenler için bağımsız kalibre edilmesi gerektiğini unutmayın. B) özü hazırlıkları sapmalar. Farklı tarihlerde hazırlanan iki ham ekstrelerinin Endpoint floresan gösterilir; hata çubukları farklı günde, üç bağımsız çalışan 1 standart sapma vardır. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50762/50762fig4large.jpg" target="_blank">büyük rakam görmek için buraya tıklayın</a> . <img alt="Şekil 5," fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50762/50762fig5highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50762/50762fig5.jpg"> Şekil 5,. Ifade verimliliği DNA çözeltisi etkisi. iki farklı saflaştırma a) Karşılaştırmaplazmidleri işleme yöntemleri. PBEST-OR2-OR1-Pr-UTR1-deGFP-T500 1 nM sadece bir QIAprep Spin Miniprep Kiti (saflaştırma, yöntem 1) ya da bir QIAquick PCR saflaştırma kiti ile post-işlem kullanılarak hazırlanır (saflaştırma, yöntem 2). 8 saat, hem de 12 dakikalık bir hareketli ortalama göre protein üretiminin maksimum hızı sonra uç floresan gösterilmiştir. Hata çubukları, farklı günlerde dört bağımsız çalışan 1 standart sapma değerleridir. Elüsyon tamponu b) etkisi (Tris-Cl). Tris-Cl farklı konsantrasyonları pBEST-OR2-OR1-Pr-UTR1-deGFP-T500 1 nM ekspresyonuna göre hücresiz bir sentezleme reaksiyonu karşılaştırılmaktadır. Verilen konsantrasyonlar reaksiyonunda Tris-CI içinde nihai konsantrasyonlar olarak, kullanılan yıkama tamponu 10 mM Tris-Cl. Hata çubukları farklı günlerde üç bağımsız çalışan 1 standart sapma vardır. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50762/50762fig5large.jpg" target="_blank">büyük rakam görmek için buraya tıklayın</a> . Şekil 6,. Negatif geri besleme döngüsü örnek TX-TL çalıştırın. a) Örnek hücresiz yürütme reaksiyonu kurulumu. Vs negatif geri besleme döngüsü "off" devlet, pozitif ve negatif kontroller ile. B) negatif geri besleme döngüsü plazmid haritası. C) Temsilcisi sonuçları "konulu" Testleri. Veriler deney in yansıtan) ve b), negatif kontrol ile sinyalinden çıkartılmaktadır. Genetik devre insert gösterilmiştir. Hata çubukları farklı günlerde üç bağımsız çalışan 1 standart sapma vardır. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50762/50762fig6large.jpg" target="_blank">büyük rakam görmek için buraya tıklayın</a> . <table border="1"><tbody><tr><td> Isim </td><td> Konsantrasyon </td><td> Miktar </td><td> Sterilizasyon </td><td> Notlar </td></tr><tr><td> Kloramfenikol (Cm) </td><td> Etanol içinde 34 mg / ml </td><td> 1 mi </td><td> Filtre sterilize (0.22 uM) </td><td> Daha sonra kullanılmak üzere -20 ° C'de saklanır büyük hacimlerde yapılabilir. </td></tr><tr><td> 2xYT + P + Cm agar </td><td> 31 g / L 2xYT, 40 mM potasyum fosfat dibazik, 22 mM potasyum fosfat monobazik, 34 ug / ml kloramfenikol </td><td> 1 tabak </td><td> Otoklav </td><td></td></tr><tr><td> 2xYT + P medya </td><td> 31 g / L 2xYT, 40 mM potasyum fosfat dibazik, 22 mM potasyum fosfat monobazik </td><td> 4 L </td><td> Otoklav </td><td></td></tr></tbody></table> Tablo 1. Ham hücre ekstresi protokol 1 gün için ayıraçlar. <table border="1"><tbody><tr><td> Isim </td><td> Konsantrasyon </td><td> Miktar </td><td> Sterilizasyon </td><td> Notlar </td></tr><tr><td> Tris baz </td><td> 2 M </td><td> 250 ml </td><td> Filtre sterilize (0.22 uM) ya da otoklav </td><td> Oda sıcaklığında saklanabilir. </td></tr><tr><td> DTT </td><td> 1 M </td><td> 6 mi </td><td> Filtre sterilize (0.22 uM) </td><td> Büyük hacimli olarak yapılmış ve daha sonra kullanılmak üzere -20 ° C'de muhafaza edilebilir. </td></tr><tr><td> S30A tampon </td><td> 14 mM Mg-glutamat, 60 mM K-glutamat, 50 mM Tris, pH 7.7 </td><td> 2 L </td><td> Otoklav </td><td> PH 7.7 ulaşmak için, asetik asit ile titre edilir. Kullanımdan hemen önce 2 mM nihai konsantrasyon için DTT ekleyin. 4 ° C'de saklayın </td></tr><tr><td> S30B tampon </td><td> 14 mM Mg-glutamat, 60 mM K-glutamat, ~ 5 mM Tris, pH 8.2 </td><td> 2 L </td><td> Otoklav </td><td> PH 8.2 ulaşmak için 2M ile titreTris. Kullanımdan hemen önce, 1 mM DTT nihai konsantrasyon için ekleyin. 4 ° C'de saklayın </td></tr></tbody></table> Tablo 2. Ham hücre ekstresi protokol 2 gün için ayıraçlar. <table border="1"><tbody><tr><td></td><td colspan="4"> Şahin </td></tr><tr><td></td><td> 1 </td><td> 2 </td><td> 3 </td><td> 4 </td></tr><tr><td> Boş 50 ml Falcon (g) </td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Pelet 50 ml Falcon (g) </td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Pellet kütlesi (50 mi pelet Falcon - boş 50 ml Falcon) (g) </td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Eklemek için S30A tampon hacmi (pelet kütle * 0.9) (ml) </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Eklemek için boncuk toplam kütlesi (topak kütle * 5.0) (g) </td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table> Tablo 3. Ham Hücre Özü protokolü 3 gün boyunca S30A tampon ve boncuk kitle hesap makinesi,. <table border="1"><tbody><tr><td> Isim </td><td> Konsantrasyon </td><td> Miktar </td><td> Sterilizasyon </td><td> Notlar </td></tr><tr><td> Hepes </td><td> 2 M, pH 8 </td><td> 4 mi </td><td> Hiçbiri </td><td> PH 8 ulaşmak için, KOH ile titre. </td></tr><tr><td> Nükleotid Mix </td><td> 156 mM ATP ve GTP, 94 mM CTP ve UTP, pH 7.5 </td><td> 1.5 mi </td><td> Hiçbiri </td><td> PH 7.5 ulaşmak için, KOH ile titre. </td></tr><tr><td> tRNA </td><td> 50 mg / ml </td><td> 600 ul </td><td> Hiçbiri </td><td></td></tr><tr><td> CoA </td><td> 65 mM </td><td> 600 ul </td><td> Hiçbiri </td><td></td></tr><tr><td> NAD </td><td> 175 mM, pH 7.5-8 </td><td> 300 ul </td><td> Hiçbiri </td><td> PH 7.5-8 ulaşmak için, 2 M de Tris ile titre </td></tr><tr><td> cAMP </td><td> 650 mM, pH 8 </td><td> 200 ul </td><td> Hiçbiri </td><td> PH 8 ulaşmak için, 2 M de Tris ile titre </td></tr><tr><td> Folinik Asit </td><td> 33.9 mM </td><td> 300 ul </td><td> Hiçbiri </td><td> Sadece 300 ul gerekli olmasına rağmen, ilgili ilave bilgiler reçete 1.15 ml içindir. </td></tr><tr><td> Spermidin </td><td> 1 M </td><td> 150 ul </td><td> Hiçbiri </td><td> 4 ° C'de saklayın, ısı 37 ° C erime. </td></tr><tr><td> 3-PGA </td><td> 1.4 M, pH 7.5 </td><td> 3.2 ml </td><td> Hiçbiri </td><td> PH 7.5 ulaşmak için, 2 M de Tris ile titre </td></tr></tbody></table> Tablo 4. Enerji Çözümü protokol hazırlamak için Reaktifler. Ek Malzeme 1. Öğeler için tarifler. Kloramfenikol, 34 mg / ml: 0.51 g kloramfenikol hazırlayın ve 15 ml etanol ekleyin. Filtre sterilize (0.22 uM), 1 ml tüpler, daha sonra kullanılmak üzere -20 ° C'de saklamak için alikosu. 2xYT + P + Cm agar plakası: 1.24 g 2XYT, 1 M 1.6 mi, potasyum fosfat dibazik çözeltisi, 40 ml, 1 M 0,88 ml potasyum fosfat monobazik çözeltisi, 0.6 g agar ve su hazırlayın. Otoklav. 50 ° C'ye soğuması ve 40 ul Cm ekleyin. Tümbölen 25 100 x 15 mm Petri kabı içine ml, ve bir saat boyunca soğumaya bırakın. 2xYT + P medya: 124 g 2xYT, 1 M 160 ml potasyum fosfat dibasic çözümü, 4 L. Aliqu 1 M, ve su @ 88 ml potasyum fosfat monobasik çözüm hazırlayın2 x 1.88 L ve 0.24 L. otoklav içine ot. Tris baz, 2 M: 250 ml olacak şekilde 60.57 g Tris baz ve su hazırlayın. Daha sonra kullanılmak üzere oda sıcaklığında, depolama sterilize edin. DTT, 1 M: 15 ml 2.31 ​​g DTT ve su hazırlayın. Filtre sterilize (0.22 uM), 1 ml tüpler, daha sonra kullanılmak üzere -20 ° C'de saklamak için alikosu. S30A tamponu: 10.88 g Mg-glutamat ve 24,39 g K-glutamat, 2M, (pH 7.7), asetik asit, 50 ml Tris hazırlayın ve su 2 L. Otoklav için, 4 ° C de saklamak, 4 ml 1 M DTT eklemek Kullanmadan önce. S30B tamponu: 10.88 g Mg-glutamat ve 24.39 g K-glutamat, 2 M Tris (pH 8.2) hazırlayın ve su 2 L. Otoklav, 4 ° C'de mağaza, kullanımdan önce 2 ml 1 M DTT ekleyin. HEPES: 1.91 g HEPES (MW 238,21), KOH (pH 8'e) hazırlayın ve su için 4 ml. tRNA: 600 ul 30 tRNA mg ve su hazırlayın. CoA: 600 ul 30 CoA (MW 767,53) mg ve su hazırlayın. NAD: 300 ul (pH 7.5-8 kadar) NAD 34.83 mg (MW 663,43), 2 M Tris ekleyin ve su. (PH 7.5-8 için çözüm getirmek için 2 M de Tris 27 ul ekleyin). cAMP: 200 ul 42,80 cAMP mg (MW 329,22), 2 M (pH 8'e) ile Tris, ve su eklenir. (PH 8 için çözüm getirmek için 2 M de Tris 73 ul ekleyin). Folinik asit (33.9 mM): katı folinik asit kalsiyum tuzunun (MW 511.5) 20 mg, 1.15 mi su eklenir. Spermidin: 150 ul 23.55 spermidin ul (MW 145.25) ve su hazırlayın. 37 ° C'de kısa bir süre sonra, erime oda sıcaklığında hazırlanması 3-PGA: 3.2 ml 1.03 3-PGA (MW 230,02) g, (pH 7.5), 2 M Tris, ve su eklenir. (PH 7.5 çözüm getirmek için 2 M de Tris 1,73 ml ekleyin). Nükleotidlerinide Mix: ATP dipotasyum tuzu dihidrat, 145 mg (MW 619,4), GTP disodyum tuzu 133 mg (MW 567,14), CTP disodyum tuzu dihidrat, 79.4 mg (MW 563,16), UTP trisodyum tuzu dihidrat, 82.6 mg (MW 586,12) ilave , 1.5 ml% 15 seyreltme (pH 7.5), ve su da KOH. (PH 7.5 çözüm getirmek için% 15 seyreltmede KOH 353 ul). Ek Maddesi 2. Bradford Deneyi. <ol><li> 4 ° C ile Bradford maddesi çıkarın ve oda sıcaklığında ayarlayın. </li><li> 1 mg / ml ve 0.1 mg / ml 'de 50 ul BSA standardı hazırlayın. </li><li> Adım 1.47 ekstrenin 40 ul 20x seyreltme hazırlayın. </li><li> 7 küvetler 800 ul su ekleyin. </li><li> 0 mg / ml, 1 mg / ml (10 ul 0.1 mg / ml BSA), 2 mg / ml (20 ul 0.1 mg / ml BSA), 4 mg / ml (4 ul 1 mg / ml BSA) standart küvetler hazırlanması , 6 mg / ml (6 ul 1 mg / ml BSA). </li><li> Örnek 2 ul ve örnek 4 ul deney küvetler için hazırlayın. </li><li> Her küvete Bradford maddenin 200 ul ekleyin ve iyice karıştırın by pipetleme. En az 10 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edin. </li><li> Adım 6.5 küvetler kullanılarak OD 595 nm de standart eğri üretin. Standart eğri reddetmek ise r 2 &lt;0.95. </li><li> Adım 6.6 küvetler kullanılarak OD 595 nm de ekstrakt konsantrasyonu belirleyin. </li></ol> Ek Maddesi 3. Kalibrasyon tablonuzu Tampon. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50762/TXTL_e(template)_calibration_JoVE.xlsx" target="_blank">TXTL_e (şablon) _calibration_JoVE.xlsx bakın</a> . Ek Malzeme 4. Hücre içermeyen ifade elektronik tablo çalıştırın. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50762/TXTL_JoVE.xlsx" target="_blank">TXTL _JoVE.xlsx Bkz</a> .

Bu beş günlük protokolü bütün adımlar, ekipman, ve esaslı etkili endojen Escherichia coli sıfırdan TX-TL hücre serbest ifade sistemi oluşturmak ve çalıştırmak için gerekli ek yazılım özetliyor. Reaktif ile protokol 8 kurulumu için saat veya daha az bir tepki toplamak ve işlem verileri alır.

Bir uygulama için Protokoller Escherichia coli Tabanlı TX-TL Hücre-Özgür İfade Sistemi

Ideal cell-free expression systems can theoretically emulate an in vivo cellular environment in a controlled in vitro platform.1 This is useful for ...

Bu prosedürün genel amacı, transkripsiyon çevirisi veya TX tl olarak adlandırılan e coli tabanlı hücresiz bir ifade sistemi oluşturmaktır. Bu, önce TX TL ham hücre özütü, amino asit çözeltisi ve enerji çözeltisi için üç başlangıç bileşeninin yapılmasıyla gerçekleştirilir. Amino asit çözeltisi ve enerji çözeltisi daha sonra TX TL tamponunu yapmak için birleştirilecektir.İkinci adım, maksimum ekspresyon seviyelerine sahip TX TL reaksiyonları üretmek için optimal magnezyum, potasyum ve DTT konsantrasyonlarını belirlemek için ham hücre ekstraktını kalibre etmektir. Daha sonra, kalibrasyon sonuçları, tampon ham hücre özütü ve DNA'dan yapılmış üç tüplü bir TX TL sistemi yapmak için kullanılır. Son adım, az önce yapılan reaktifleri kullanarak bir TX TL reaksiyonu gerçekleştirmektir.Sonuç olarak, TX TL, sentetik biyoloji devrelerinin yanı sıra geleneksel hücresiz ifade uygulamalarını göstermek için kullanılır. Bu yöntem, in vivo olarak taklit eden in vitro eşit bir ortam sağlayarak sentetik biyoloji alanındaki devrelerin test edilmesine yardımcı olabilir. Bu tekniğin etkileri, tüm prototipleme adımlarını in vivo olarak yürütme ihtiyacını ortadan kaldırarak sentetik biyolojik tasarımın hızını artırmaya doğru uzanır.Bir prosedüre yardımcı olmak, grubumuzdaki bir araştırma görevlisi olan Claire Hayes olacaktır. Lütfen bu videonun, çekim için kritik olan protokolün yalnızca belirli bölümlerinden geçeceğini unutmayın. Protokolün tamamı metin makalesinde mevcuttur.Bu protokolün daha öncesinde, bakteri hücreleri büyütüldü ve peletlendi. Şimdi bakteri hücreleri bir boncuk çırpıcı kullanılarak parçalanacaktır. Hücre süspansiyonu içeren tüm 50 mililitrelik şahin tüplerini buz üzerinde tutun.Bu videonun amaçları doğrultusunda, sadece bir tüp için boncuk boncuklama gösterilecektir. Boncuklar, her biri toplam boncukların üçte biri kullanılarak üç alikot halinde Falcon tüpüne aralıklı olarak eklenmelidir. İlk boncuk alikotunu 30 saniye boyunca tüp girdabına ekleyin ve buzun üzerine yerleştirin.Aynı şekilde, ikinci boncuk alikotunu, girdabı ekleyin ve buzun üzerine yerleştirin. Son alikotu ekledikten ve girdaplamadan sonra, boncukların eşit şekilde dağıldığından emin olun, üçüncü girdaplama adımından sonra kalın bir macun oluşturulmalıdır. Tüpü buzun üzerine yerleştirin.Ucunu kesmek için steril bir makas kullanarak beş mililitre hacimli bir pipet ucu hazırlayın. Üç ila dört milimetrelik bir açıklık oluşturmak için pipeti iki mililitreye çevirin. 20 steril boncuk boncuk tüpünü buzun üzerine yerleştirin.Boncuk hücresi çözeltisinin yüksek viskozitesini doğrulamak için modifiye edilmiş pipeti kullanın. Pipet ucundan zar zor çıkacak kadar viskoz olmalıdır. Fırlatma sırasında, boncuk hücresi çözeltisini Falcon tüpünden çıkarın ve bir boncuk boncuk tüpüne aktarın.Dörtte üçünü doldurmak, mini bir santrifüjde son derece kısa bir süre döndürün. Boncukları yeniden dağıtmadan hava kabarcıklarını çıkarmak için, içbükey bir menisküs oluşturmak için tüpe boncuk hücresi çözeltisi eklemeyi bitirin. Ardından, bir boncuk boncuk tüpü kapağının içine çok küçük bir damla boncuk hücresi çözeltisi ekleyin.Kapağın dış dudağına solüsyon koymamaya dikkat edin. Aksi takdirde, boncuk boncuk borusu yeterince kapanmayacaktır. Kapağı düz bir yüzeye vurun ve kapağın altında hava kabarcığı olmadığını doğrulayın.Boncuk çırpma tüpünü kapatın. Doğru yapılırsa, kapak sıkıca kapatılmalıdır. Hiçbir hava kabarcığı görünmemelidir ve buradan herhangi bir boncuk hücresi çözeltisi taşarsa çok azdır, boncuk boncuklama işlemini verimli bir şekilde gerçekleştirmek için iki kişi gerekir.İlk gösterici kalan boncuk hücresi çözeltisi ile daha fazla boncuk boncuk tüpü doldurmaya devam ederken, doldurulmuş tüpü boncuk boncuklama için bir asistana verin. Doldurulmuş boncuk boncuk tüpünü alın ve buzun üzerine yerleştirin. Bir kez iki doldurulmuş boncuk boncuk tüpü toplandı ve en az bir dakika buz üzerinde kaldı.46 RPM'de 30 saniye boyunca boncuk bir tüp başlatın. Diğer tüpü çırparken 30 saniye boyunca buzun üzerine baş aşağı yerleştirin. Boncuk işleme ve buzlanmayı, doldurulmuş her boncuk boncuk tüpü toplam bir dakika dövülecek şekilde tekrarlayın.Tüm doldurulmuş boncuk boncuk tüpleri işlendikten sonra, 15 mililitrelik bir şahin tüpünden bir filtre aparatı oluşturun. İlk olarak, tüpün altına bakacak şekilde düz bir parça olan yeni bir boncuk boncuk kapağı ekleyin. Ardından, işlenmiş bir boncuk boncuk tüpünün kapağını çıkarın ve tamamen sızdırmaz hale gelene kadar işlenmiş boncuk boncuk tüpünün ucuna bir mikro kromatografi sütununu sıkıca bastırın.Mikro kromatografi kolonunun elusiyen ucunu koparın ve elucian yerleştirin. Boş bir boncuk boncuk tüpüne bitirin. Bu kompleksi 15 mililitrelik şahin tüpüne yerleştirin.Tüm doldurulmuş boncuk çırpma tüpleri için filtre aparatlarını oluşturun ve bunları buz üzerinde tutun. Tam santrifüjleme yapıldığında, filtre aparatları Falcon tüpü, boncuklardan ekstrakt ve peleti ayırmak için dört santigrat derecede beş dakika boyunca 6.000 G'de kapaksız hale getirilir. Santrifüjlemeden sonra, her bir boncuk boncuk tüpünün canlı ekstrakt ürettiğini doğrulayın.Düzgün bir şekilde dövülmüş ekstrakt bulanık olmayacak ve pelet, soldaki tüp tarafından gösterildiği gibi iki farklı katmana sahip olacaktır. Sağdaki örnekte gösterildiği gibi bulanık tüpler atılmalıdır. Süpernatanı bulanık olmayan tüplerden ayrı ayrı 1.75 mililitrelik mikro santrifüj tüplerine aktarın ve mümkün olduğunca az pellet alın.Tüm boncuk boncuk tüpleri işlenene kadar buz üzerinde tutun. Ardından, mikro santrifüj tüplerini aşağı doğru döndürün ve süpernatanı toplayın. 500 mikrolitre pelet içermeyen süpernatanı yeni bir boncuk boncuk tüpüne konsolide ettikten sonra.Tüpleri, kapakları çıkarılmış olarak 220 RPM ve 37 santigrat derecede 80 dakika inkübe edin. Bu, boncuk boncuklama işlemi sırasında salınan endojen eksonükleaz kullanarak kalan nükleik asitleri sindirecektir. Kuluçka tamamlandığında, ekstrakt bulanık görünmelidir.Ekstraktı 1.75 mililitrelik mikro santrifüj tüplerinde, tüp santrifüj başına 1.5 mililitreye kadar, 12.000 G'de dört santigrat derecede 10 dakika boyunca birleştirin. Bir pipet kullanarak, pelet içermeyen süpernatanı, daha küçük verimler için 1,75 mililitrelik bir mikro santrifüj tüpüne veya buz üzerinde daha büyük verimler için 15 mililitrelik bir şahin tüpüne konsolide edin. Tüpü kapatın ve ters çevirerek iyice karıştırın.Protein konsantrasyonunun daha sonra ölçülmesi için buz üzerinde 10 mikrolitre süpernatan tasarruf edin. Üretilen toplam ekstrakt miktarını belirleyin ve iki dakika boyunca S 30 B tamponuna daldırarak gerekli sayıda 10 moleküler ağırlıklı kesme diyaliz kasetini nemlendirin. Kasetleri 2,5 mililitreye kadar ekstrakt ile yükleyin.Her beher, üç saat boyunca dört santigrat derecede karıştırarak iki kasete kadar diyaliz yapabilir. Diyaliz sonrası işlem adımları için yazılı makaleye bakın. Temel bir transkripsiyon translasyon reaksiyonu, ham hücre ekstresi, tampon ve DNA olmak üzere üç bölümden oluşur.Reaksiyonlar hacim olarak değişebilse de, bu protokol 10 mikrolitrelik bir reaksiyon gerçekleştirmek için önceden yazılmış bir şablon kullanır. Burada. Mor renkli öğeler kullanıcı giriş değerlerini gösterir ve mavi renkli öğeler, ana karışım hazırlama bölümünü ve DNA hazırlama bölümünü kullanarak deneyi sili'de tasarlayarak reaksiyona eklenecek ek reaktifleri gösterir. Genel olarak, sabitler ana karışım hazırlama bölümüne, değişkenler ise DNA hazırlama bölümüne konulabilir.Numune buharlaşmasını ve deneysel başlangıç zamanı yanlılığını önlemek için deney başına numuneleri en aza indirin. Bu tabloda örnek bir kurulum gösterilmiştir. Her numune için DNA örnekleri hazırlamak için, belirtilen DNA suyunu ve kullanıcı tarafından sağlanan öğeleri bir mikro santrifüj tüpüne koyun.Oda sıcaklığında, tampon ekstraktı ve küresel kullanıcı tarafından sağlanan herhangi bir öğeden oluşan ana karışımı, buz ve girdaplama üzerinde tutarak hazırlayın. Her bir maddenin eklenmesinden sonra, her bir DNA örneğine uygun miktarda ana karışım ekleyin ve oda sıcaklığında tutun. Bunu reaksiyon başlangıç zamanı olarak kabul edin.Her numuneyi vorteksleyin ve kalan numuneyi düşürmek ve kabarcıkları azaltmak için oda sıcaklığında 30 saniye boyunca 10.000 G'de santrifüjleyin. Reaksiyonu 29 santigrat derecede 384 oyuklu bir plakada çalıştırın. Çalışma süreleri denemeye bağlı olarak değişir, ancak genellikle sekiz saatin altında sürer.Çalışmanın sonunda, veriler bir plaka okuyucudan okunabilir. Bu makale, endojen e coli bazlı transkripsiyon translasyonu veya TXTL hücresiz ekspresyon sisteminin hazırlanması için beş günlük bir protokol sunmaktadır. Bu sistemin ekspresyon koşulları, farklı plazmit işleme yöntemlerinin ve elucian tamponunun etkilerinin test edilmesiyle optimize edildi.TXTL sistemine eklenen belirli değişkenler toksisite için önceden kalibre edilmelidir, örneğin, plazmit işleme yöntemlerinin karşılaştırılmasında saflaştırma yöntemi sadece bir kaya hazırlama spin mini hazırlık kiti kullanırken, saflaştırma yöntemi ikide plazmit aynı mini hazırlık kiti kullanılarak hazırlanır ve daha sonra bir kayık ile işlem sonrası. Hızlı PCR saflaştırma kiti. Bu grafik, sekiz saat sonra son nokta floresansının yanı sıra 12 dakikalık hareketli bir ortalamaya dayalı olarak maksimum protein üretim oranını gösterir Ortalama hata çubukları, farklı günlerde dört bağımsız çalıştırmadan bir standart sapmadır.Gözlenen ifade farkı, tuz içeriğindeki farklılıktan kaynaklanmaktadır. Ancak, elucian tamponu gibi diğer öğeler TXTL üzerinde hiçbir etki göstermeyebilir. Farklı TS klorür konsantrasyonları, bir plazmid ano molarının ekspresyonuna dayanan hücresiz bir ekspresyon reaksiyonunda karşılaştırıldı.Verilen konsantrasyonlar, tris klorürün nihai konsantrasyonlarıdır. Reaksiyonda kullanılan elucian tamponu 10 milimolar tris klorürdür, hata çubukları farklı günlerde üç bağımsız çalışmadan bir standart sapmadır. Bu şekil, ek magnezyum glutamat, potasyum glutamat ve DTT seviyeleri için kalibre edilmiş ham hücre özütü için tipik kalibrasyon grafiklerini göstermektedir.Sekiz saat sonra son nokta floresansı ve 12 dakikalık hareketli ortalamaya dayalı maksimum protein üretim hızı gösterilir. Her ham hücre ekstraktının bu üç değişken için bağımsız olarak kalibre edilmesi gerektiğini unutmayın. Genel olarak sonuçlar, ham hücre ekstraktının magnezyum glutamat seviyelerine en duyarlı olduğunu ve ardından potasyum glutamat seviyelerine en duyarlı olduğunu göstermektedir.Bu grafiklere dayanarak, kabul edilebilir bir ek magnezyum glutamat aralığı dört milimolar, potasyum glutamat 60 ila 80 milimolar ve DTT alt tarafta sıfır ila üç milimolar havalandırmadır. Her bir ham hücre ekstraktı preparatının son verimliliği, kullanıcı yeterliliğine ve çevresel koşullara bağlı olarak değişebilir. Tipik verim değişimi %5 ila %10 arasında olmasına rağmen, farklı tarihlerde hazırlanan iki ham ekstraktın uç nokta floresansı burada gösterilmektedir.Hata çubukları, farklı günlerdeki üç bağımsız çalıştırmadan bir standart sapmadır. Hücresiz ekspresyon sistemini göstermek için, Tet baskısına dayalı bir negatif geri besleme döngüsü oluşturuldu ve test edildi, TC ile ve TC olmadan çalıştırılan aynı devre yedi katlı bir uç nokta ifadesi gösterdi. Sekiz saatlik ifade hata çubuklarından sonra D-E-G-F-P raportörünün değiştirilmesi, farklı günlerde yapılan üç bağımsız çalıştırmadan bir standart sapmadır.Genetik devre iç kısımda gösterilmiştir. Bu son şekil, rekabet eden ham hücre ekstraktlarının maliyet ve ekspresyon analizini göstermektedir. A'daki pasta grafik, Aralık 2012 itibariyle reaktiflerin maliyetlerine ve saat başına 14 işçilik maliyetlerine dayalı olarak TX TL hücresiz ifade sisteminin işçilik ve malzeme maliyetlerini göstermektedir.Panel B, TX hücresiz ifade sistemi maliyetlerini diğer ticari sistemlerle karşılaştırır. Maliyetler mikrolitre başına ayrılır, ancak reaksiyon hacimleri kit başına değişebilir. Bu sistem için malzeme maliyetleri, mikrolitre reaksiyon başına yaklaşık 3 senttir, bu da karşılaştırılabilir ticari hücresiz sistemlere kıyasla %98'lik bir maliyet düşüşüdür.Panel C, TX TL hücresiz ifade sistemi veriminin diğer ticari sistemlerle karşılaştırmasını göstermektedir. Bu sistem, Lambda faj operatörleri ile Sigma 70 tabanlı bir promotör veya bir T yedi tahrikli promotör kullanarak mililitre başına 0.75 miligrama kadar raportör protein üretebilir. Bu karşılaştırmalar, TX TL hücresiz ekspresyon sisteminin, T yedi tabanlı sistemlerin benzer ticari sistemlere muazzam bir maliyet düşüşü eklemesi nedeniyle eşdeğer miktarlarda protein üretebileceğini göstermektedir.Bu tekniğin, sentetik biyolojide mühendislik sürecini basitleştirmenin yolunu açmasını umuyoruz.

protocols-for-implementing-an-escherichia-coli-based-tx-tl-cell-free

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Yeşil floresan proteini füzyon göre, Escherichia coli içinde rekombinant zar proteinlerinin ifadesi için tarama için bir aerodinamik bir yaklaşım sunulmuştur.

Membran proteinlerinin Yeşil floresan proteini temelli Ekspresyon elemesinde<em&gt; Escherichia coli</em

Boş hücre transkripsiyon-çeviri platformları yeni nesil Gen devreleri yürütülmesi ile biyokimyasal sistemleri vitro oluşturmak için tasarlanmış. Bu makalede, nasıl bacteriophages MS2, ΦΧ174 ve T7, gibi bir bütün E. coli boş hücre TXTL sistemini kullanarak kendi genom sentezlenmiş açıklayın.

Bir E. coli -bulaşıcı Bacteriophages sentezi ifade sistem boş hücre tabanlı

Biz bir basit tekniğinde gen uzunluğunda DNA moleküllerinin immobilizasyon için boş hücre gen ifade deneyler biochips üzerinde gerçekleştirmek için kullanılan bir yüzey üzerinde açıklayınız.

Genlerin Multistep Strand deplasman litografi kullanarak işlevsel yüzey immobilizasyon

Bu iletişim kuralı adımları, maliyetleri ve ekipman E. colioluşturmak için gerekli ayrıntıları-hücre özleri dayalı ve 4 gün içinde veya daha az vitro protein sentez reaksiyonları uygulamak. Bu platformun geniş uygulamalar için esnek yapısı kullanabilmeniz için biz uyarlanmış ve en iyi duruma getirilmiş reaksiyon koşulları tartışıyorlar.

Escherichia coli-boş hücre Protein sentezi dayalı: sağlam, esnek ve erişilebilir platform teknolojisi için iletişim kuralları

Bu protokol, RNA ve protein üreten sentetik hücrelerin aşağıdan yukarıya hazırlanması için yöntem, malzeme, ekipman ve adımları açıklamaktadır. Sentetik hücrelerin iç sulu bölmesi bir lipid bilayer içinde kapsüllenmiş S30 bakteriyel lizat içeriyordu (yani, istikrarlı lipozomlar), bir su-in-oil emülsiyon transferi yöntemi kullanarak.

Hücre Serbest Bakteriyel Özler, Lipozomlar ve Emülsiyon Transferi Kullanarak Protein Üreten Sentetik Hücreler Hazırlama

Çalışma, sentetik gen parçalarından protein tarama kampanyaları için klonlama yapmadan veya canlı hücreler kullanmadan büyük (μg-mg) miktarlarda DNA oluşturmak için bir protokol tanımlamaktadır. Minimal şablon enzimmatik olarak sindirilir ve daireselleştirilir ve daha sonra izotermal yuvarlanan daire amplifikasyonu kullanılarak yükseltilir. Hücresiz ifade reaksiyonları, teşvik edilmemiş ürünle gerçekleştirilebilir.

Hücresiz Sistemler Kullanarak Protein Prototipleme için Minimal, Doğrusal Şablonların Amplifikasyonu için Hızlı, Enzymatik Yöntemler

Bu protokol, Escherichia coli'nin tasarlanmış bir suşunu kullanarak ve sadece standart laboratuvar ekipmanı gerektiren hücresiz gen ekspresyözü için bakteriyel lisat üretmek için hızlı ve basit bir yöntemi açıklar.

Bakteri hücresi içermeyen Lysate'in Hızlı, Uygun Fiyatlı ve Karmaşık Olmayan Üretimi

Bu çalışma, Escherichia coli'den (E. coli ) hücre ekstraktının hazırlanmasını ve ardından 24 saatten kısa sürede hücresiz protein sentezi (CFPS) reaksiyonlarını açıklamaktadır. Hücresiz otoindüksiyon (CFAI) protokolünün açıklaması, araştırmacı gözetimini azaltmak ve elde edilen hücre ekstraktı miktarlarını artırmak için yapılan iyileştirmeleri detaylandırmaktadır.

Hücresiz Otomatik İndüksiyon İş Akışını Kullanarak 24 Saat İçinde Hücrelerden Hücresiz Protein Sentezine

Bu protokol, Streptomyces venezuelae hücresiz transkripsiyon-çeviri (TX-TL) sisteminden yüksek rekombinant protein verimini sentezlemek için geliştirilmiş bir yöntemi detaylandırmamaktadır.

Sentetik Biyoloji ve Doğal Ürün Uygulamaları için Yüksek Verimli Streptomices Transkripsiyon-Çeviri Araç Seti

Burada sunulan, Escherichia coli BL21 Rosetta2'nin (ΔrecBCD ve ΔrecB) ekzonükleaz V nakavt suşlarından hücre ekstraktlarının hazırlanması ve tampon kalibrasyonu için bir protokoldür. Bu, lineer DNA şablonlarını kullanarak hücresiz protein sentez sistemlerinde ekspresyon için hızlı, kolay ve doğrudan bir yaklaşımdır.

Lineer DNA Şablonlarını Kullanarak Ekzonükleaz Eksikliği Olan Hücresel Ekstraktlardan Hücresiz Protein Sentezi

Bu protokol, sentetik hücrelerin yapımında kullanılan Hücresiz Protein Sentezi (CFPS) sistemini tanımlar. Farklı mikro bölmelerde temsili sonuçlarla temel aşamaları ana hatlarıyla belirtir. Protokol, sentetik hücre topluluğundaki çeşitli laboratuvarlar için en iyi uygulamaları oluşturmayı ve sentetik hücre gelişiminde ilerlemeyi ilerletmeyi amaçlamaktadır.

Sentetik hücreler oluşturmak için hücresiz protein sentez sistemi

Öğrenin, Escherichia coli tabanlı TX-TL hücre-özgü ifade sisteminin nasıl oluşturulacağını ve sentetik biyoloji uygulamaları için protein sentezi koşullarının nasıl optimize edileceğini.

Bir uygulama için Protokoller Escherichia coli Tabanlı TX-TL Hücre-Özgür İfade Sistemi

Daha fazla video keşfet