Bir uygulama için Protokoller Escherichia coli Tabanlı TX-TL Hücre-Özgür İfade Sistemi

Bu prosedürün genel amacı, transkripsiyon çevirisi veya TX tl olarak adlandırılan e coli tabanlı hücresiz bir ifade sistemi oluşturmaktır. Bu, önce TX TL ham hücre özütü, amino asit çözeltisi ve enerji çözeltisi için üç başlangıç bileşeninin yapılmasıyla gerçekleştirilir. Amino asit çözeltisi ve enerji çözeltisi daha sonra TX TL tamponunu yapmak için birleştirilecektir.

İkinci adım, maksimum ekspresyon seviyelerine sahip TX TL reaksiyonları üretmek için optimal magnezyum, potasyum ve DTT konsantrasyonlarını belirlemek için ham hücre ekstraktını kalibre etmektir. Daha sonra, kalibrasyon sonuçları, tampon ham hücre özütü ve DNA'dan yapılmış üç tüplü bir TX TL sistemi yapmak için kullanılır. Son adım, az önce yapılan reaktifleri kullanarak bir TX TL reaksiyonu gerçekleştirmektir.

Sonuç olarak, TX TL, sentetik biyoloji devrelerinin yanı sıra geleneksel hücresiz ifade uygulamalarını göstermek için kullanılır. Bu yöntem, in vivo olarak taklit eden in vitro eşit bir ortam sağlayarak sentetik biyoloji alanındaki devrelerin test edilmesine yardımcı olabilir. Bu tekniğin etkileri, tüm prototipleme adımlarını in vivo olarak yürütme ihtiyacını ortadan kaldırarak sentetik biyolojik tasarımın hızını artırmaya doğru uzanır.

Bir prosedüre yardımcı olmak, grubumuzdaki bir araştırma görevlisi olan Claire Hayes olacaktır. Lütfen bu videonun, çekim için kritik olan protokolün yalnızca belirli bölümlerinden geçeceğini unutmayın. Protokolün tamamı metin makalesinde mevcuttur.

Bu protokolün daha öncesinde, bakteri hücreleri büyütüldü ve peletlendi. Şimdi bakteri hücreleri bir boncuk çırpıcı kullanılarak parçalanacaktır. Hücre süspansiyonu içeren tüm 50 mililitrelik şahin tüplerini buz üzerinde tutun.

Bu videonun amaçları doğrultusunda, sadece bir tüp için boncuk boncuklama gösterilecektir. Boncuklar, her biri toplam boncukların üçte biri kullanılarak üç alikot halinde Falcon tüpüne aralıklı olarak eklenmelidir. İlk boncuk alikotunu 30 saniye boyunca tüp girdabına ekleyin ve buzun üzerine yerleştirin.

Aynı şekilde, ikinci boncuk alikotunu, girdabı ekleyin ve buzun üzerine yerleştirin. Son alikotu ekledikten ve girdaplamadan sonra, boncukların eşit şekilde dağıldığından emin olun, üçüncü girdaplama adımından sonra kalın bir macun oluşturulmalıdır. Tüpü buzun üzerine yerleştirin.

Ucunu kesmek için steril bir makas kullanarak beş mililitre hacimli bir pipet ucu hazırlayın. Üç ila dört milimetrelik bir açıklık oluşturmak için pipeti iki mililitreye çevirin. 20 steril boncuk boncuk tüpünü buzun üzerine yerleştirin.

Boncuk hücresi çözeltisinin yüksek viskozitesini doğrulamak için modifiye edilmiş pipeti kullanın. Pipet ucundan zar zor çıkacak kadar viskoz olmalıdır. Fırlatma sırasında, boncuk hücresi çözeltisini Falcon tüpünden çıkarın ve bir boncuk boncuk tüpüne aktarın.

Dörtte üçünü doldurmak, mini bir santrifüjde son derece kısa bir süre döndürün. Boncukları yeniden dağıtmadan hava kabarcıklarını çıkarmak için, içbükey bir menisküs oluşturmak için tüpe boncuk hücresi çözeltisi eklemeyi bitirin. Ardından, bir boncuk boncuk tüpü kapağının içine çok küçük bir damla boncuk hücresi çözeltisi ekleyin.

Kapağın dış dudağına solüsyon koymamaya dikkat edin. Aksi takdirde, boncuk boncuk borusu yeterince kapanmayacaktır. Kapağı düz bir yüzeye vurun ve kapağın altında hava kabarcığı olmadığını doğrulayın.

Boncuk çırpma tüpünü kapatın. Doğru yapılırsa, kapak sıkıca kapatılmalıdır. Hiçbir hava kabarcığı görünmemelidir ve buradan herhangi bir boncuk hücresi çözeltisi taşarsa çok azdır, boncuk boncuklama işlemini verimli bir şekilde gerçekleştirmek için iki kişi gerekir.

İlk gösterici kalan boncuk hücresi çözeltisi ile daha fazla boncuk boncuk tüpü doldurmaya devam ederken, doldurulmuş tüpü boncuk boncuklama için bir asistana verin. Doldurulmuş boncuk boncuk tüpünü alın ve buzun üzerine yerleştirin. Bir kez iki doldurulmuş boncuk boncuk tüpü toplandı ve en az bir dakika buz üzerinde kaldı.

46 RPM'de 30 saniye boyunca boncuk bir tüp başlatın. Diğer tüpü çırparken 30 saniye boyunca buzun üzerine baş aşağı yerleştirin. Boncuk işleme ve buzlanmayı, doldurulmuş her boncuk boncuk tüpü toplam bir dakika dövülecek şekilde tekrarlayın.

Tüm doldurulmuş boncuk boncuk tüpleri işlendikten sonra, 15 mililitrelik bir şahin tüpünden bir filtre aparatı oluşturun. İlk olarak, tüpün altına bakacak şekilde düz bir parça olan yeni bir boncuk boncuk kapağı ekleyin. Ardından, işlenmiş bir boncuk boncuk tüpünün kapağını çıkarın ve tamamen sızdırmaz hale gelene kadar işlenmiş boncuk boncuk tüpünün ucuna bir mikro kromatografi sütununu sıkıca bastırın.

Mikro kromatografi kolonunun elusiyen ucunu koparın ve elucian yerleştirin. Boş bir boncuk boncuk tüpüne bitirin. Bu kompleksi 15 mililitrelik şahin tüpüne yerleştirin.

Tüm doldurulmuş boncuk çırpma tüpleri için filtre aparatlarını oluşturun ve bunları buz üzerinde tutun. Tam santrifüjleme yapıldığında, filtre aparatları Falcon tüpü, boncuklardan ekstrakt ve peleti ayırmak için dört santigrat derecede beş dakika boyunca 6.000 G'de kapaksız hale getirilir. Santrifüjlemeden sonra, her bir boncuk boncuk tüpünün canlı ekstrakt ürettiğini doğrulayın.

Düzgün bir şekilde dövülmüş ekstrakt bulanık olmayacak ve pelet, soldaki tüp tarafından gösterildiği gibi iki farklı katmana sahip olacaktır. Sağdaki örnekte gösterildiği gibi bulanık tüpler atılmalıdır. Süpernatanı bulanık olmayan tüplerden ayrı ayrı 1.75 mililitrelik mikro santrifüj tüplerine aktarın ve mümkün olduğunca az pellet alın.

Tüm boncuk boncuk tüpleri işlenene kadar buz üzerinde tutun. Ardından, mikro santrifüj tüplerini aşağı doğru döndürün ve süpernatanı toplayın. 500 mikrolitre pelet içermeyen süpernatanı yeni bir boncuk boncuk tüpüne konsolide ettikten sonra.

Tüpleri, kapakları çıkarılmış olarak 220 RPM ve 37 santigrat derecede 80 dakika inkübe edin. Bu, boncuk boncuklama işlemi sırasında salınan endojen eksonükleaz kullanarak kalan nükleik asitleri sindirecektir. Kuluçka tamamlandığında, ekstrakt bulanık görünmelidir.

Ekstraktı 1.75 mililitrelik mikro santrifüj tüplerinde, tüp santrifüj başına 1.5 mililitreye kadar, 12.000 G'de dört santigrat derecede 10 dakika boyunca birleştirin. Bir pipet kullanarak, pelet içermeyen süpernatanı, daha küçük verimler için 1,75 mililitrelik bir mikro santrifüj tüpüne veya buz üzerinde daha büyük verimler için 15 mililitrelik bir şahin tüpüne konsolide edin. Tüpü kapatın ve ters çevirerek iyice karıştırın.

Protein konsantrasyonunun daha sonra ölçülmesi için buz üzerinde 10 mikrolitre süpernatan tasarruf edin. Üretilen toplam ekstrakt miktarını belirleyin ve iki dakika boyunca S 30 B tamponuna daldırarak gerekli sayıda 10 moleküler ağırlıklı kesme diyaliz kasetini nemlendirin. Kasetleri 2,5 mililitreye kadar ekstrakt ile yükleyin.

Her beher, üç saat boyunca dört santigrat derecede karıştırarak iki kasete kadar diyaliz yapabilir. Diyaliz sonrası işlem adımları için yazılı makaleye bakın. Temel bir transkripsiyon translasyon reaksiyonu, ham hücre ekstresi, tampon ve DNA olmak üzere üç bölümden oluşur.

Reaksiyonlar hacim olarak değişebilse de, bu protokol 10 mikrolitrelik bir reaksiyon gerçekleştirmek için önceden yazılmış bir şablon kullanır. Burada. Mor renkli öğeler kullanıcı giriş değerlerini gösterir ve mavi renkli öğeler, ana karışım hazırlama bölümünü ve DNA hazırlama bölümünü kullanarak deneyi sili'de tasarlayarak reaksiyona eklenecek ek reaktifleri gösterir. Genel olarak, sabitler ana karışım hazırlama bölümüne, değişkenler ise DNA hazırlama bölümüne konulabilir.

Numune buharlaşmasını ve deneysel başlangıç zamanı yanlılığını önlemek için deney başına numuneleri en aza indirin. Bu tabloda örnek bir kurulum gösterilmiştir. Her numune için DNA örnekleri hazırlamak için, belirtilen DNA suyunu ve kullanıcı tarafından sağlanan öğeleri bir mikro santrifüj tüpüne koyun.

Oda sıcaklığında, tampon ekstraktı ve küresel kullanıcı tarafından sağlanan herhangi bir öğeden oluşan ana karışımı, buz ve girdaplama üzerinde tutarak hazırlayın. Her bir maddenin eklenmesinden sonra, her bir DNA örneğine uygun miktarda ana karışım ekleyin ve oda sıcaklığında tutun. Bunu reaksiyon başlangıç zamanı olarak kabul edin.

Her numuneyi vorteksleyin ve kalan numuneyi düşürmek ve kabarcıkları azaltmak için oda sıcaklığında 30 saniye boyunca 10.000 G'de santrifüjleyin. Reaksiyonu 29 santigrat derecede 384 oyuklu bir plakada çalıştırın. Çalışma süreleri denemeye bağlı olarak değişir, ancak genellikle sekiz saatin altında sürer.

Çalışmanın sonunda, veriler bir plaka okuyucudan okunabilir. Bu makale, endojen e coli bazlı transkripsiyon translasyonu veya TXTL hücresiz ekspresyon sisteminin hazırlanması için beş günlük bir protokol sunmaktadır. Bu sistemin ekspresyon koşulları, farklı plazmit işleme yöntemlerinin ve elucian tamponunun etkilerinin test edilmesiyle optimize edildi.

TXTL sistemine eklenen belirli değişkenler toksisite için önceden kalibre edilmelidir, örneğin, plazmit işleme yöntemlerinin karşılaştırılmasında saflaştırma yöntemi sadece bir kaya hazırlama spin mini hazırlık kiti kullanırken, saflaştırma yöntemi ikide plazmit aynı mini hazırlık kiti kullanılarak hazırlanır ve daha sonra bir kayık ile işlem sonrası. Hızlı PCR saflaştırma kiti. Bu grafik, sekiz saat sonra son nokta floresansının yanı sıra 12 dakikalık hareketli bir ortalamaya dayalı olarak maksimum protein üretim oranını gösterir Ortalama hata çubukları, farklı günlerde dört bağımsız çalıştırmadan bir standart sapmadır.

Gözlenen ifade farkı, tuz içeriğindeki farklılıktan kaynaklanmaktadır. Ancak, elucian tamponu gibi diğer öğeler TXTL üzerinde hiçbir etki göstermeyebilir. Farklı TS klorür konsantrasyonları, bir plazmid ano molarının ekspresyonuna dayanan hücresiz bir ekspresyon reaksiyonunda karşılaştırıldı.

Verilen konsantrasyonlar, tris klorürün nihai konsantrasyonlarıdır. Reaksiyonda kullanılan elucian tamponu 10 milimolar tris klorürdür, hata çubukları farklı günlerde üç bağımsız çalışmadan bir standart sapmadır. Bu şekil, ek magnezyum glutamat, potasyum glutamat ve DTT seviyeleri için kalibre edilmiş ham hücre özütü için tipik kalibrasyon grafiklerini göstermektedir.

Sekiz saat sonra son nokta floresansı ve 12 dakikalık hareketli ortalamaya dayalı maksimum protein üretim hızı gösterilir. Her ham hücre ekstraktının bu üç değişken için bağımsız olarak kalibre edilmesi gerektiğini unutmayın. Genel olarak sonuçlar, ham hücre ekstraktının magnezyum glutamat seviyelerine en duyarlı olduğunu ve ardından potasyum glutamat seviyelerine en duyarlı olduğunu göstermektedir.

Bu grafiklere dayanarak, kabul edilebilir bir ek magnezyum glutamat aralığı dört milimolar, potasyum glutamat 60 ila 80 milimolar ve DTT alt tarafta sıfır ila üç milimolar havalandırmadır. Her bir ham hücre ekstraktı preparatının son verimliliği, kullanıcı yeterliliğine ve çevresel koşullara bağlı olarak değişebilir. Tipik verim değişimi %5 ila %10 arasında olmasına rağmen, farklı tarihlerde hazırlanan iki ham ekstraktın uç nokta floresansı burada gösterilmektedir.

Hata çubukları, farklı günlerdeki üç bağımsız çalıştırmadan bir standart sapmadır. Hücresiz ekspresyon sistemini göstermek için, Tet baskısına dayalı bir negatif geri besleme döngüsü oluşturuldu ve test edildi, TC ile ve TC olmadan çalıştırılan aynı devre yedi katlı bir uç nokta ifadesi gösterdi. Sekiz saatlik ifade hata çubuklarından sonra D-E-G-F-P raportörünün değiştirilmesi, farklı günlerde yapılan üç bağımsız çalıştırmadan bir standart sapmadır.

Genetik devre iç kısımda gösterilmiştir. Bu son şekil, rekabet eden ham hücre ekstraktlarının maliyet ve ekspresyon analizini göstermektedir. A'daki pasta grafik, Aralık 2012 itibariyle reaktiflerin maliyetlerine ve saat başına 14 işçilik maliyetlerine dayalı olarak TX TL hücresiz ifade sisteminin işçilik ve malzeme maliyetlerini göstermektedir.

Panel B, TX hücresiz ifade sistemi maliyetlerini diğer ticari sistemlerle karşılaştırır. Maliyetler mikrolitre başına ayrılır, ancak reaksiyon hacimleri kit başına değişebilir. Bu sistem için malzeme maliyetleri, mikrolitre reaksiyon başına yaklaşık 3 senttir, bu da karşılaştırılabilir ticari hücresiz sistemlere kıyasla %98'lik bir maliyet düşüşüdür.

Panel C, TX TL hücresiz ifade sistemi veriminin diğer ticari sistemlerle karşılaştırmasını göstermektedir. Bu sistem, Lambda faj operatörleri ile Sigma 70 tabanlı bir promotör veya bir T yedi tahrikli promotör kullanarak mililitre başına 0.75 miligrama kadar raportör protein üretebilir. Bu karşılaştırmalar, TX TL hücresiz ekspresyon sisteminin, T yedi tabanlı sistemlerin benzer ticari sistemlere muazzam bir maliyet düşüşü eklemesi nedeniyle eşdeğer miktarlarda protein üretebileceğini göstermektedir.

Bu tekniğin, sentetik biyolojide mühendislik sürecini basitleştirmenin yolunu açmasını umuyoruz.