Özel Bir Büyük Organ Biyoreaktörü Kullanılarak İnsan Dışı Primat Akciğerinin Hücreden Arındırılması ve Yeniden Hücreselleştirilmesi

Bu prosedürün genel amacı, tüm organ biyolojik matrislerini Reus Maccas'ın akciğerlerinden izole etmek ve bu matrisleri akciğer dokusu mühendisliği uygulamalarını araştırmak için iskele olarak kullanmaktır. Bu, önce tüm Reuss Maca akciğerlerinin deterjanlar, tuzlar ve enzimlerle hücrelerden arındırılmasıyla gerçekleştirilir. İkinci adım, hücreden arındırılmış akciğer iskelelerini hem hava yolunu havalandırabilen hem de pulmoner vaskülatürü sıvı hücre kültürü ortamı ile perfüze edebilen bir biyoreaktöre kurmaktır.

Daha sonra, akciğer iskeleleri, hava yolu yoluyla kök hücreler ve pulmoner vaskülatür yoluyla endotel hücreleri ile oturtulur. Son adım, biyoreaktör tarafından sağlanan ventilasyon ve perfüzyon koşulları altında istenen süre boyunca akciğer iskelesi içindeki hücrelerin kültürlenmesi ve ardından elde edilen hücresel ve doku morfolojisinin analizidir. Sonuç olarak, aselüler Maca akciğer iskelelerinin kök hücreler ve endotel hücreleri ile yeniden izasyonu, doğal akciğer dokularının anatomik ve histolojik özelliklerini taklit eden mühendislik dokusu ile sonuçlanır.

Bu yöntem, akciğer dokusunu tek başına mı yoksa olgun pulmoner epitel ve endotel hücreleriyle birlikte mi rejenere etmek için kök veya progenitör hücrelerin kullanılıp kullanılamayacağı gibi akciğer dokusu Mühendisliği alanlarındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin etkileri, son dönem akciğer hastalıklarının tedavisine doğru uzanır, çünkü aselüler akciğer matrislerinin hasta kaynaklı kök veya progenitör hücrelerle izasyonu, akciğer nakli için mevcut donör akciğer sayısını artırma potansiyeline sahiptir. Ayrıca, hastanın kendi kök hücreleri kullanılarak tasarlanan akciğerler, bağışıklık reddine karşı dirençli olabilir.

Bu yöntem için ilk olarak, Dr. Laura Nicholson'ın Yale Üniversitesi'ndeki laboratuvarının üyeleri tarafından daha önce yayınlanmış bir Joe videosunu izlediğimizde aklımıza geldi. Burada, büyük hayvan Resus Meac modelimizin ihtiyaçlarına uyacak şekilde kemirgenler için prosedürlerinin modifikasyonlarını sunuyoruz. Maca dokuları ile çalışırken bulaşıcı maruziyet olaylarını önlemek için azami özen gösterilmelidir.

İnsan olmayan primat dokularını kullanmadan önce, cerrahi maske, yüz siperi, bir kat cerrahi eldiven, tek kullanımlık önlük ve akciğerler diseksiyon tepsisinde düz dururken ikinci bir cerrahi eldiven tabakası dahil olmak üzere kişisel koruyucu ekipman giyin, pulmoner arteri uygun boyutta bir dikenli dişi yem konektörü kullanarak kanüle edin. Kanülü alkolle sterilize edilmiş bir fermuar ile yerine sabitleyin. Soluk borusunun etrafına plastik bir fermuar geçirin.

Trakeal açıklığa bir dişi yem konektörü yerleştirin ve trakeayı diken etrafında yerinde tutmak için konektörün dikeninin etrafındaki fermuarı sıkın. Mililitre başına 30 birim heparin ve mililitre sodyum nitropres başına beş mikrogram içeren fosfat tamponlu salin veya PBS damlatarak akciğerlerde sıkışan havayı çıkarın. Kısaltılmış SNP, çözeltinin tekrarlanmadan önce doğal geri tepme ile dışarı atılmasına izin verir.

PBS Heparin SNP solüsyonu ile üçüncü hava yolu kurulumundan sonra iki kez daha kurulum. Trakeal yem kanülünü bir yem tapası ile kapatın. Kalbin tepesini kesin ve perfüzyon sırasında pulmoner devrenin drenajını kolaylaştırmak için kalan kanı çıkarmak için her iki kulakçıkı da yırtar etmek için iç ventrikülleri PBS Heparin SNP ile sulayın.

PBS Heparin SNP solüsyonu ile doldurulmuş 60 cc'lik bir şırıngayı pulmoner arter kanülüne takın ve sıvının damar sistemine akmasına izin vermek için pistonu dikkatlice çıkarın. Tapayı trakeal kanülden çıkarın ve hava yolundaki sıvının doğal geri tepme ile dışarı atılmasına izin verin. Pulmoner vaskülatürden mümkün olduğunca fazla kan alınana kadar perfüzyona devam edin.

Prosedürün en zor yönü, akciğer hava yolunun etkili bir şekilde durulanması ve yıkanmasıdır Sıvılarla, hava yolları sıvıları iletmek için tasarlanmadığından, sıvı akışı gazlara göre engellenir, bu adımları gerçekleştirmek için zaman ve hastalar gereklidir, hücre çözme ilerledikçe ve hücresel kalıntılar dışarı atılırken hava yolunda kalan sıvıya rağmen protokole devam etmenizi öneririz, sıvı viskozitesi düşük kalacak ve akciğerler sıvıları birinci gün verimli bir şekilde dışarı atabilecektir. Kalp akciğer bloğunu deiyonize suya batırın, sırasıyla batık trakeal ve arteriyel kanüle bağlı 60 cc şırınga kullanarak akciğeri deiyonize su ile şişirin ve perfüze edin. Deiyonize su ile hava yolunu ve vasküler yıkamaları etkili bir şekilde tekrarlayın.

Beş yıkamadan sonra her biri yaklaşık 0,5 ila bir litrelik toplam beş durulama için dört kez daha, akciğerleri sudan çıkarın ve bloğu Triton solüsyonuna batırın. Akciğerleri Triton solüsyonu ile şişirin ve perfüze edin. Daha önce olduğu gibi, kurulumu ikinci kez tekrarlayın ve batık organları Triton çözeltisinde gece boyunca dört santigrat derecede inkübe edin.

Gece boyunca inkübasyondan sonra, akciğer bloğunu Triton solüsyonundan çıkarın ve harici olarak deiyonize su ile yıkayın. Daha sonra bloğu taze deiyonize suya batırın. Triton solüsyonunu ve hücre kalıntılarını yıkamak için deiyonize suyu trakea ve pulmoner artere beş kez damlatın.

Akciğerleri deiyonize sudan çıkarın ve% 2 Sodyum deoksi kaplama veya SDC çözeltisine batırın. SDC çözeltisi ile aynı şekilde şişirin ve perfüze edin. Akciğerleri üçüncü gün gece boyunca dört santigrat derecede SDC çözeltisine batırın.

Dokuyu tekrar deiyonize su ile harici olarak ve hava yolu ve damar sistemi yoluyla beş kez yıkayın. Daha önce olduğu gibi, dokuyu deiyonize sudan çıkarın ve bir molar sodyum klorür çözeltisine batırın. Daha önce olduğu gibi sodyum klorür çözeltisi ile şişirin ve perfüze edin ve akciğerleri sodyum klorür çözeltisinden beş durulama deiyonize su ile yıkadıktan sonra dokuyu oda sıcaklığında bir saat boyunca sodyum klorür çözeltisine batırın.

Daha önce olduğu gibi, onları taze DNA çözeltisinde yıkayın ve bu çözeltiyi hava yoluna ve damar sistemine aşılayın. Akciğerleri oda sıcaklığında bir saat boyunca DNA çözeltisinde inkübe edin. Daha sonra akciğerleri DNA çözeltisinden çıkarın ve PBS çözeltisi ile harici olarak yıkayın.

Akciğerleri PBS solüsyonuna batırın ve bu solüsyonu hava yolu ve damar sistemi boyunca beş kez yıkayın. Daha önce olduğu gibi, akciğerleri PBS çözeltisinde dördüncü gün dört santigrat derecede gece boyunca kapalı bir kapta saklayın. Akciğerleri taze buz gibi PBS solüsyonunda hava yolu ve damar sistemi boyunca beş kez yıkayın.

Daha sonra, kullanılana kadar dört santigrat derecede steril kapalı bir kapta PBS çözeltisinde saklayın. Biyoreaktör bileşenlerini şemaya göre bir laminer akış başlığı altında birleştirin. Metin protokolünde, biyoreaktörde kullanımdan hemen önce ana odayı bir hücre kültürü inkübatörünün %5 CO2 atmosferine dengelenmiş, trakeal ve vasküler kanül adaptörlerini akciğer kanülüne uygulayın.

Akciğerleri kültür ortamında yıkayarak ve kanül adaptörlerini modifiye kapaktaki uygun bağlantı noktalarına takarak organları ana biyoreaktör odasına yerleştirin. Bağlandıktan sonra kapağı güvenli ve sıkı bir şekilde yapıştırın. Hazne, şırınga portları ve sıvı akışını şırıngaya yönlendirmek için üç durdurma musluklarının yönünü hareket ettiren 18 gauge iğne ile donatılmış 60 CCC'lik bir şırınga kullanılarak borudan hava aspire etme süresi boyunca tekrar açılmayacaktır.

Sıcaklık ve gazı dengelemek için kurulu organlara sahip sızdırmaz bitişik bağlı biyoreaktör odalarını bir doku kültürü inkübatörüne taşıyın. Ana hazneye bağlı bir şırınga pompası kullanarak akciğerleri her iki dakikada bir yaklaşık bir tam nefeste havalandırın ve damar sistemini peristaltik pompa aracılığıyla dakikada yaklaşık 10 mililitre perfüze edin Hava yolu oturması için toplam 30 dakika. Solunum döngüsündeki üç yollu durdurma musluğuna bağlı şırınga portundan hafifçe enjekte ederek akciğerleri hücre süspansiyonu ile şişirin.

Hücrelerin hücreden arındırılmış akciğer matrisine bağlanmasına izin vermek için akciğerleri hava yolu veya vasküler perfüzyon olmadan gece boyunca 37 santigrat derecede, %5 CO2'de statik olarak tutun. Gece boyunca inkübasyondan sonra, standart hava yolu ventilasyon programını ve kültürünü, organları vasküler oturma için üç ila yedi gün boyunca yeniden başlatın. Akış yolunun yönlülüğü, bu iki bölmeyi birbirine bağlayan boruya yerleştirilmiş durdurma musluğu üzerindeki valfi döndürerek ana odadan bir endotel oturma rezervuarına değiştirilebilir, tohumlama tamamlandığında manyetik karıştırma kullanılarak hafifçe karıştırılırken, peristaltik pompa kullanılarak kademeli olarak tohum endotel hücreleri.

Perfüzyonu durdurun ve yaklaşık dört ila altı saat statik olarak inkübe edin. Vasküler perfüzyonu ana hazne ortamı ile dakikada yaklaşık 10 mililitre hızında yeniden başlatın. Hava yolu ventilasyon kültürü periyodu ile eş zamanlı olarak sürekli vasküler perfüzyon ile üç ila yedi gün boyunca kültür.

Hücreden arındırma işlemi boyunca, MCCA akciğerleri, işlemin sonunda yarı saydam bir görünümle sonuçlanan ilerleyici beyazlatma gösterdi. Bununla birlikte, akciğerler brüt anatomik özelliklerini korudu ve büyük ölçüde elastik kaldı ve sıvı ile şişirildikten sonra doğal geri tepme üretebildi. Mikroskobik düzeyde.

Histolojik ultra yapı, decellularizasyondan sonra bozulmadan kaldı. Yani, bronşiyal solunum, bronşiyaller, alveolar keseler. Kan damarları ve kılcal damarlar, düşük güç mikroskobu ile hala oldukça net bir şekilde ayırt edilebiliyordu.

Bununla birlikte, histolojik mikroanatomi, akciğerin kaba anatomisi ve ultra yapısının decellularizasyon ile hafifçe bozulduğunu, ancak dokunun burada görüldüğü gibi sağlam hücrelerden tamamen yoksun olduğunu gösterdi. Hücreden arındırılmış dokularda sadece eser miktarda DNA kaldı. Ayrıca, alkol çökeltme ile konsantre edilen ve %0.8'lik bir AROS jeli içinde görselleştirilen eser DNA, çoğunlukla düşük moleküler ağırlıklı bozunmuş parçalardan oluşuyordu.

Hücresel protein gideriminin etkinliği, hem doğal hem de hücresizleştirilmiş akciğer proteininin western blot analizleri ile değerlendirildi. Beta aktine karşı bir antikor kullanan lizatlar, beta aktin, doğal akciğer lizatlarında kolayca tespit edildi, ancak hücresizleştirilmiş akciğer lizatlarında tespit edilmedi, bu da decellularization'ın hücreleri önemli ölçüde tükettiğini ve maca kemik iliği türevi mezenkimal kök hücreler veya BMC'ler ve biyoreaktör kültürü ile hava yolu tohumlamasından 14 gün sonra hücreyle ilişkili protein materyalini çıkardığını düşündürmektedir. Deselülasyonlu Maca akciğerlerinin parankimi etkili bir şekilde izole edildi.

BMC'ler, berrak ve açık bir alveolar lümeni korurken alveolar septusu kapladı. Büyük hava yollarının soyulmuş matrisi, biyoreaktör kullanılarak BMC'ler tarafından da izole edildi, bir ana gövde bronşunun lümen yüzeyi, 14 günlük kültürden sonra BMC'ler gibi tek bir skuamöz tabaka ile kaplandı. Burada gösterilen biyoreaktörde, damar sisteminin mikrovasküler endotel hücreleri ile tohumlanmasından ve dakikada beş mililitrede endotel kültür ortamı ile sürekli vasküler perfüzyon sağlanmasından beş gün sonra hücreden arındırılmış bir reus akciğer lobu bulunmaktadır.

Histolojik analiz, akciğer parankimindeki küçük damar sistemini kaplayan hücreleri ortaya çıkardı. Bazı durumlarda, hücrelerin lümen boyunca birkaç hücresel projeksiyon yoluyla matrise bağlı olduğu görülürken, damarların diğer kesitleri, endotel yüzeyini net lümenle kaplayan hücreleri gösterdi. Bu prosedürü takiben.

İmmünohistokimya, western blot ve kantitatif gerçek zamanlı PCR gibi diğer yöntemler, tohumlanan kök hücrelerin aselüler akciğer matriksi üzerinde kültürlendikten sonra pulmoner soy hücrelerine mi farklılaştığı yoksa biyoreaktör içindeki olgun epitel ve endotel hücreleri ile mi farklılaştığı gibi ek soruları yanıtlamak için gerçekleştirilebilir. Bu videoyu izledikten sonra, insan olmayan primat akciğerlerinin nasıl hücrelerden arındırılacağını iyi anlamalı ve daha sonra elde edilen aselüler akciğerleri bir biyoreaktör sisteminde kök hücreleri, epitel hücrelerini ve endotel hücrelerini kültürlemek için iskele olarak kullanmalıyız. İnsan olmayan primat dokularıyla çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini ve bu prosedürü gerçekleştirirken her zaman yüz siperi ve çift katmanlı lateks veya nitril eldivenler de dahil olmak üzere tam kişisel koruyucu ekipman giymek gibi önlemler alınması gerektiğini unutmayın.