Name: Özel Bir Büyük Organ Biyoreaktörü Kullanılarak İnsan Dışı Primat Akciğerinin Hücreden Arındırılması ve Yeniden Hücreselleştirilmesi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-12-15T20:00:00.000+00:00
Duration: 16 min 45 s
Description: Öğrenin, Reus Macca akciğerlerinin hücreden arındırılması ve biyoreaktörde kök hücrelerle yeniden hücreselleştirilmesi yöntemini. Bu teknik, rejeneratif tıpta akciğer doku mühendisliği uygulamaları için biyolojik iskeleler oluşturur.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Yazarlar, önceki bir yayından görüntülerin bu raporda kullanılmasına izin verdikleri için Tissue Engineering editörlerine teşekkür etmek isterler.

1. Tüm Organ Makak Akciğeri Hücresizleştirme
<ol>
	<li>Çözeltilerin Hazırlanması
	<ol>
		<li>1-2 L'lik şişelerde 10-15 L deiyonize su (dH2O) otoklavlayın.</li>
		<li>Manyetik bir karıştırıcı üzerinde karıştırırken 1 ml Triton X-100'ü 999 ml dH2O içinde karıştırarak "Triton çözeltisi" (dH2O'da% 0.1 Triton X-100) hazırlayın. Çözeltiyi 0.22 μm'lik bir filtre aparatından süzün. Oda sıcaklığında saklayın.</li>
		<li>Karıştırırken ~ 900 ml dH 2 O'ya yavaşça 20 g sodyum deoksikolat (SDC) ekleyerek "SDC çözeltisi" (dH2O'da% 2 SDC) hazırlayın. SDC çözündükten sonra, çözeltiyi dereceli bir silindire aktarın ve hacmi dH2O ile 1 ml'ye getirin. Çözeltiyi 0.22 μm'lik bir filtre aparatından süzün. Oda sıcaklığında saklayın.</li>
		<li>~900 ml dH2O'ya 58 g NaCl ekleyerek "NaCl çözeltisi" hazırlayın ve tamamen eriyene kadar karıştırın. 1 L'lik son hacme dH2O ekleyin, süzün ve oda sıcaklığında saklayın.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Organ hazırlığı
	<ol>
		<li>Makak dokularıyla çalışırken bulaşıcı maruziyet olaylarını önlemek için azami özen gösterilmelidir. İnsan dışı primat dokularını kullanmadan önce aşağıdaki kişisel koruyucu ekipmanı (KKD) giyin: cerrahi maske, yüz siperi, cerrahi eldivenler, tek kullanımlık önlük ve ikinci bir cerrahi eldiven tabakası.</li>
		<li>Dış kanın pıhtılaşmasını önlemek için 50 U / ml heparin içeren PBS'de hayvan nekropsisinden sağlam kalp-akciğer bloklarını toplayın.</li>
		<li>Akciğerler bir diseksiyon tepsisinde düz dururken, uygun boyutta bir dikenli dişi Luer konektörü kullanarak pulmoner arteri kanüle edin. Kanülü alkolle sterilize edilmiş bir fermuarla yerine sabitleyin.</li>
		<li>Trakeanın etrafına steril bir fermuar geçirin, trakeal açıklığa 0.250 dişi Luer konektörü yerleştirin ve trakeayı diken etrafında yerinde tutmak için konektörün çubuğunun etrafındaki fermuarı sıkın.</li>
		<li>30 U/ml heparin ve 5 μg/ml sodyum nitroprussid (SNP) içeren PBS'yi damlatarak akciğerlerde sıkışan havayı çıkarın. Çözeltinin doğal geri tepme ile dışarı atılmasına izin verin ve damlatmayı iki kez daha tekrarlayın. Üçüncü damlatmadan sonra, çözeltiyi akciğerlerde tutmak için trakeal Luer kanülünü bir Luer tıkaç ile kapatın.</li>
		<li>Kalbin tepesini kesin ve kalan kanı çıkarmak için iç ventrikülleri PBS-heparin-SNP ile sulayın. Perfüzyon sırasında pulmoner devrenin drenajını kolaylaştırmak için her iki atriyumu da yırtın.</li>
		<li>Kalp-akciğer bloğunu dH2O'ya batırın 60 ml'lik bir şırıngayı PBS-heparin-SNP çözeltisi ile doldurun. Forseps kullanarak, arteriyel kanülü batırın, böylece tüm hava kabarcıkları vasküler açıklıktan kaçar. Şırıngayı takın ve pistonu dikkatlice çıkarın ve sıvının damar sistemine akmasına izin verin.</li>
		<li>Tapayı trakeal kanülden çıkarın ve hava yolundaki sıvının doğal geri tepme ile dışarı atılmasına izin verin. Arter üzerinde ~ 15-20 cm H2O basıncını korumak için vasküler kanüle bağlı şırıngaya PBS-heparin-SNP solüsyonu eklemeye devam edin. Pulmoner vaskülatürden mümkün olduğunca fazla kan alınana kadar perfüzyona devam edin.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Hücreden arındırma
	<ol>
		<li>1. Gün: Kalp-akciğer bloğunu dH2O'ya batırın Sırasıyla batık trakeal ve arteriyel kanüllere bağlı 60 ml'lik şırıngalar kullanarak akciğeri dH2O ile şişirin ve perfüze edin. Toplam beş durulama için hava yolu ve vasküler yıkamaları dH2O 4 kat daha fazla tekrarlayın.</li>
		<li>Akciğerleri sudan çıkarın ve bloğu Triton çözeltisine batırın. Akciğerleri daha önce olduğu gibi Triton solüsyonu ile şişirin ve perfüze edin. Damlatmayı ikinci kez tekrarlayın ve batık organları Triton solüsyonunda gece boyunca 4 ° C'de inkübe edin.</li>
		<li>2. GÜN: Gece boyunca inkübasyondan sonra, akciğer bloğunu Triton solüsyonundan çıkarın, harici olarak dH2O ile yıkayın ve ardından bloğu taze dH2O'ya batırın. dH2O, adım 1.3.1'deki gibi 5 kez yıkayın.</li>
		<li>Akciğerleri dH2O'dan çıkarın ve SDC çözeltisine daldırın. SDC çözeltisi ile adım 1.3.2'deki gibi şişirin ve perfüze edin. Gece boyunca 4 ° C'de SDC çözeltisine batırılmış inkübe edin.</li>
		<li>3. GÜN: Dokuyu 1.3.1'deki gibi dH2O ile tekrar yıkayın.</li>
		<li>Dokuyu dH2O'dan çıkarın ve NaCl çözeltisine batırın. NaCl çözeltisi ile adım 1.3.2'deki gibi şişirin ve perfüze edin. NaCl çözeltisine batırılmış olarak oda sıcaklığında 1 saat inkübe edin.</li>
		<li>Akciğerleri NaCl çözeltisinden adım 1.3.1'deki gibi dH2O ile yıkayın.</li>
		<li>Taze "DNaz çözeltisi" hazırlayın (30 μg / ml DNase, 1.3 mM MgS04, dH2O'da 2.0 mM CaCl2) Akciğerleri bu çözeltide yıkayın ve adım 1.3.2'deki gibi hava yoluna ve damar sistemine aşılayın. Akciğerleri DNaz solüsyonunda oda sıcaklığında 1 saat inkübe edin.</li>
		<li>Taze "PBS çözeltisi" hazırlayın (1x PBS + 5x antibiyotik / antimikotik). Akciğerleri DNaz solüsyonundan çıkarın ve PBS solüsyonu ile harici olarak yıkayın. Akciğerleri PBS solüsyonuna batırın ve bu solüsyonla adım 1.3.1'deki gibi beş kez yıkayın.</li>
		<li>Akciğerleri PBS solüsyonunda kapalı bir kapta gece boyunca 4 ° C'de saklayın. Ertesi gün (4. gün), akciğerleri adım 1.3.1'deki gibi taze, buz gibi soğuk PBS solüsyonunda beş kez yıkayın ve kullanıma kadar 4 ° C'de steril, kapalı bir kapta PBS solüsyonunda saklayın.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Büyük Organlı Biyoreaktör
<ol>
	<li>Montaj ve Doku Montajı
	<ol>
		<li>Solunum halkası ve vasküler döngü yapılarının yanı sıra trakeal ve vasküler kanül adaptörlerini önceden monte edin (Şekil 1). Steril paketlenmiş hava filtreleri ve şırınga portları hariç, tüm biyoreaktör bileşenlerini otoklavlayın.</li>
		<li>Biyoreaktör bileşenlerini Şekil 2'deki şemaya göre bir laminer akış başlığı altında birleştirin. Ana hazneyi, biyoreaktörde kullanmadan hemen önce bir hücre kültürü inkübatörünün %5 CO2 atmosferine dengelenmiş, kültür ortamı ile doldurun.</li>
		<li>Trakeal ve vasküler kanül adaptörlerini akciğer kanüllerine uygulayın ve akciğerleri kültür ortamında yıkayarak ve kanül adaptörlerini modifiye kapaktaki uygun portlara takarak organları ana biyoreaktör odasına yerleştirin. Bağlandıktan sonra kapağı güvenli ve sıkı bir şekilde yapıştırın; Hücreselleştirme süresi boyunca oda tekrar açılmayacaktır.</li>
		<li>Trakeal rezervuarı yaklaşık yarıya kadar kültür ortamı ile doldurun ve modifiye edilmiş kapağı takın.</li>
		<li>Steril 0.22 μm şırınga filtreleri, Luer tapaları ve şırınga portlarını belirtildiği gibi tüm bölmelere uygulayın.</li>
		<li>Trakea rezervuarını solunum döngüsü aparatı aracılığıyla ana hazneye bağlayın. Solunum döngüsü hortumunu belirtildiği gibi takın.</li>
		<li>Şırınga portlarını ve 18 G iğne ile donatılmış 60 ml'lik bir şırıngayı kullanarak borudan hava aspire edin; sıvı akışını şırıngaya yönlendirmek için 3 muslukların yönünü hareket ettirin.</li>
		<li>Sıcaklık ve gazı dengelemek için kurulu organlara sahip sızdırmaz, bitişik olarak bağlı biyoreaktör odalarını bir doku kültürü inkübatörüne taşıyın. Akciğerleri ana hazneye bağlı bir şırınga pompası kullanarak her 2 dakikada bir ~ 1 tam "nefes" ile havalandırın ve damar sistemini peristaltik pompa aracılığıyla yaklaşık 10 ml / dk'da toplam ~ 30 dakika boyunca perfüze edin.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Hava yolu tohumlama
	<ol>
		<li>İstenilen hücre yoğunluğunda hava yoluna ekilecek hücrelerin süspansiyonlarını hazırlayın (hacim organ boyutuna bağlı olacaktır).</li>
		<li>Solunum döngüsündeki üç vanaya bağlı şırınga portundan nazikçe enjekte ederek akciğerleri hücre süspansiyonu ile şişirin.</li>
		<li>Hücrelerin hücresizleştirilmiş akciğer matrisine bağlanmasına izin vermek için akciğerleri hava yolu veya vasküler perfüzyon olmadan gece boyunca 37 ° C'de,% 5 CO2'de statik olarak tutun.</li>
		<li>Gece boyunca inkübasyondan sonra, standart hava yolu ventilasyon programını yeniden başlatın ve organları 3-7 gün (veya istenen başka bir süre) boyunca kültürleyin.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Vasküler tohumlama
	<ol>
		<li>Hava yolu hücre tohumlaması için endotel hücre kültürlerinin süspansiyonlarını yukarıdaki gibi hazırlayın.</li>
		<li>Hücre süspansiyonunu, küçük bir manyetik karıştırma çubuğu içeren endotelyal tohumlama rezervuarına aktarın.</li>
		<li>Bu iki bölmeyi birbirine bağlayan boruya yerleştirilmiş musluk üzerindeki valfi döndürerek ana odadan endotelyal tohumlama rezervuarına akış yolunun yönünü değiştirin ve peristaltik pompa kullanarak hafifçe karıştırırken endotel hücrelerini kademeli olarak tohumlayın.</li>
		<li>Tohumlama tamamlandığında (ör. endotel tohumlama rezervuarında endotel hücre süspansiyonunun hacmi tükenir), perfüzyonu durdurun ve ~ 4-6 saat statik olarak inkübe edin. Vasküler perfüzyonu ana oda ortamı ile ~ 10 ml / dak hızında (veya izlenirse istenen basınçta) yeniden başlatın.</li>
		<li>Sürekli vasküler perfüzyon ile 3-7 gün kültür.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Sorun Giderme ve Alternatif Yaklaşımlar
<ol>
	<li>Trakeal kanülasyon: Trakea çok küçükse Luer kanülünü yerinde tutmak için fermuar yerine dikişler kullanılabilir. Dişi Luer bağlantısında 1/4, çok çeşitli trakea çapları için yeterli bir kanül görevi görür.</li>
	<li>Pulmoner arter perfüzyonu ile kanın alınması: Dokular kadavra hayvanlardan toplandığından, mikrotrombüsler yaygındır ve pulmoner kapiller yatağın bazı bölgelerinin artık kandan tamamen temizlenmesini önler. Bununla birlikte, hücreden arındırma sırasında, bu küçük damarlar geçirgen hale gelir ve hücre dışı bırakma reaktifleri bu pıhtıları verimli bir şekilde parçalar ve bozar. Mümkün olduğu kadar çok kanı temizlemek için hücre öncesi perfüzyon perfüzyonu yapılmalıdır, ancak parankimden tüm kan izlerini çıkarmak gerekli değildir.</li>
	<li>Sıvıların akciğerlerden atılması: Makak akciğerleri, sıvılarla şişirildiğinde bile ex vivo güçlü doğal geri tepmeyi korur. Bununla birlikte, hücreden arındırma sırasında, hücreler parçalanır ve damlatılan sıvıların viskozitesini artıran ve böylece dışarı atılmalarını zorlaştıran materyalleri (DNA dahil) serbest bırakır. Damlatılmış sıvıya daldırılmışken 4 ° C'de gece boyunca inkübasyon, akciğerlerin viskoz sıvıyı tamamen dışarı atmasına izin vermek için genellikle yeterlidir. Alternatif olarak, mümkün olduğu kadar fazla sıvının akciğerlerden atılmasına izin verin ve ardından sonraki çözeltilerin damlatılmasına devam edin; Deterjanların ve deiyonize su yıkamalarının eklenmesi genellikle viskoz sıvıların uzaklaştırılmasını kolaylaştırır ve hücre gidermenin verimli bir şekilde ilerlemesini sağlar.</li>
	<li>Deterjan çözeltilerine antibiyotik ilavesi: Antibiyotikler ve antimikotikler, deterjan çözeltilerinin yanı sıra deiyonize su yıkama çözeltilerine de eklenebilir; Bununla birlikte, penisilin / streptomisin, sodyum deoksikolat varlığında çökelir ve bu çökeltiler, hücre giderme ve yıkama işlemlerine müdahale edebilir. Ayrıca, bu konsantrasyonlarda kullanılan deterjanlar mikropları parçalayabildiği ve öldürebildiği için hücreden arındırma sırasında antibiyotik/antimikotiklerin varlığı gerekli değildir. Hücreden arındırmadan sonra, çoğu kontaminasyonu önlemek için PBS solüsyonu (5x penisilin / streptomisin / amfoterisin B içeren) ile durulama ve depolama yeterlidir.</li>
	<li>Biyoreaktör borusundan havanın çıkarılması: Hava, üç musluklardaki iğne portlarına yerleştirilen bir iğne ile bir şırınga kullanılarak biyoreaktör borusundan verimli bir şekilde aspire edilir. Alternatif olarak, aynı şekilde bağlanmış bir şırınga kullanılarak organları takmadan önce 1x PBS veya kültür ortamı borudan yıkanabilir.</li>
	<li>Reselülizasyon sırasında ve sonrasında akciğerlerin ventilasyonu ve perfüzyonu: Bu raporda listelenen akış hızları ve süreleri, hücre bağlanmasının yanı sıra hava yolu sıvı ventilasyonu ve vasküler perfüzyon için yeterli olsa da, bu değerler kullanıcı tarafından ampirik olarak belirlenmelidir. Kültür süreleri, damlatılan hücrelerin büyüme hızlarına göre de ayarlanabilir.</li>
</ol>

<ol><li>Ott, H. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Perfusion-decellularized+matrix%3A+using+nature%27s+platform+to+engineer+a+bioartificial+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Med%22%5BJournal%5D)">Perfusion-decellularized matrix: using nature's platform to engineer a bioartificial heart.</a> Nat. Med. 14, 213-221 (2008).</li>
<li>Badylak, S. F., Taylor, D., Uygun, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-organ+tissue+engineering%3A+decellularization+and+recellularization+of+three-dimensional+matrix+scaffolds%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Biomed.+Eng%22%5BJournal%5D)">Whole-organ tissue engineering: decellularization and recellularization of three-dimensional matrix scaffolds.</a> Annu. Rev. Biomed. Eng. 13, 27-53 (2011).</li>
<li>Ott, H. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regeneration+and+orthotopic+transplantation+of+a+bioartificial+lung%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Med%22%5BJournal%5D)">Regeneration and orthotopic transplantation of a bioartificial lung.</a> Nat. Med. 16, 927-933 (2010).</li>
<li>Price, A. P., England, K. A., Matson, A. M., Blazar, B. R., Panoskaltsis-Mortari, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+decellularized+lung+bioreactor+system+for+bioengineering+the+lung%3A+the+matrix+reloaded%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng.+Part+A%22%5BJournal%5D)">Development of a decellularized lung bioreactor system for bioengineering the lung: the matrix reloaded.</a> Tissue Eng. Part A. 16, 2581-2591 (2010).</li>
<li>Petersen, T. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue-engineered+lungs+for+in+vivo+implantation%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Tissue-engineered lungs for in vivo implantation.</a> Science. 329, 538-541 (2010).</li>
<li>Song, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+in+vivo+function+of+bioartificial+lungs+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+Thorac.+Surg%22%5BJournal%5D)">Enhanced in vivo function of bioartificial lungs in rats.</a> Ann. Thorac. Surg. 92, 998-1005 (2011).</li>
<li>Seok, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomic+responses+in+mouse+models+poorly+mimic+human+inflammatory+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Genomic responses in mouse models poorly mimic human inflammatory diseases.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. , (2013).</li>
<li>Joag, S. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primate+models+of+AIDS%5BTitle%5D)+AND+%22Microbes+Infect%22%5BJournal%5D)">Primate models of AIDS.</a> Microbes Infect. 2, 223-229 (2000).</li>
<li>Hu, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-human+primate+models+for+AIDS+vaccine+research%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Drug.+Targets+Infect.+Disord%22%5BJournal%5D)">Non-human primate models for AIDS vaccine research.</a> Curr. Drug. Targets Infect. Disord. 5, 193-201 (2005).</li>
<li>Borda, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+and+immunopathologic+alterations+in+rhesus+macaques+affected+with+globoid+cell+leukodystrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Pathol%22%5BJournal%5D)">Clinical and immunopathologic alterations in rhesus macaques affected with globoid cell leukodystrophy.</a> Am. J. Pathol. 172, 98-111 (2008).</li>
<li>Fabbrini, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+response+to+high-carbohydrate+and+low-carbohydrate+meals+in+a+non-human+primate+model%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Endocrinol.+Metab%22%5BJournal%5D)">Metabolic response to high-carbohydrate and low-carbohydrate meals in a non-human primate model.</a> Am. J. Physiol. Endocrinol. Metab. , (2012).</li>
<li>Crapo, P. M., Gilbert, T. W., Badylak, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+overview+of+tissue+and+whole+organ+decellularization+processes%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">An overview of tissue and whole organ decellularization processes.</a> Biomaterials. 32, 3233-3243 (2011).</li>
<li>Calle, E. A., Petersen, T. H., Niklason, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Procedure+for+Lung+Engineering%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Procedure for Lung Engineering.</a> J. Vis. Exp. (49), e2651(2011).</li>
<li>Arold, S. P., Wong, J. Y., Suki, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+of+a+new+stretching+apparatus+and+the+effects+of+cyclic+strain+and+substratum+on+mouse+lung+epithelial-12+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+Biomed.+Eng%22%5BJournal%5D)">Design of a new stretching apparatus and the effects of cyclic strain and substratum on mouse lung epithelial-12 cells.</a> Ann. Biomed. Eng. 35, 1156-1164 (2007).</li>
<li>Huang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+from+embryonic+stem+cells+to+vascular+wall+cells+under+in+vitro+pulsatile+flow+loading%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Artif.+Organs%22%5BJournal%5D)">Differentiation from embryonic stem cells to vascular wall cells under in vitro pulsatile flow loading.</a> J. Artif. Organs. 8, 110-118 (2005).</li>
<li>Izadpanah, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+multipotent+mesenchymal+stem+cells+from+the+bone+marrow+of+rhesus+macaques%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Dev%22%5BJournal%5D)">Characterization of multipotent mesenchymal stem cells from the bone marrow of rhesus macaques.</a> Stem Cells Dev. 14, 440-451 (2005).</li>
<li>Craig, L. E., Nealen, M. L., Strandberg, J. D., Zink, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+replication+of+ovine+lentivirus+in+endothelial+cells+cultured+from+different+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">Differential replication of ovine lentivirus in endothelial cells cultured from different tissues.</a> Virology. 238, 316-326 (1006).</li>
<li>Craig, L. E., Spelman, J. P., Strandberg, J. D., Zink, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+cells+from+diverse+tissues+exhibit+differences+in+growth+and+morphology%5BTitle%5D)+AND+%22Microvasc.+Res%22%5BJournal%5D)">Endothelial cells from diverse tissues exhibit differences in growth and morphology.</a> Microvasc. Res. 55, 65-76 (1998).</li>
<li>Bonvillain, R. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Nonhuman+Primate+Model+of+Lung+Regeneration%3A+Detergent-Mediated+Decellularization+and+Initial+In+Vitro+Recellularization+with+Mesenchymal+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng.+Part+A%22%5BJournal%5D)">A Nonhuman Primate Model of Lung Regeneration: Detergent-Mediated Decellularization and Initial In Vitro Recellularization with Mesenchymal Stem Cells.</a> Tissue Eng. Part A. 18, 2437-2452 (2012).</li>
<li>Badylak, S. F., Taylor, D., Uygun, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-Organ+Tissue+Engineering%3A+Decellularization+and+Recellularization+of+Three-Dimensional+Matrix+Scaffolds%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Biomed.+Eng%22%5BJournal%5D)">Whole-Organ Tissue Engineering: Decellularization and Recellularization of Three-Dimensional Matrix Scaffolds.</a> Annu. Rev. Biomed. Eng. , (2010).</li>
</ol>

Açıklayacak hiçbir şeyimiz yok.

Dokular, fiziksel, kimyasal ve enzimatik ajanlar12,20 kullanan bir dizi yöntemle verimli ve etkili bir şekilde hücresizleştirilebilir. Büyük organlardan 3 boyutlu biyolojik matrisler üretmenin zorlukları arasında büyük hacimlerde hücresizleştirme çözümlerine, pahalı ticari ekipmanlara (yani biyoreaktörlere) ve nihai doku türevli ürünü elde etmek için gereken baş döndürücü miktarda metodolojik bozulmaya duyulan gereksinim yer alır. Yöntemimiz, fiziksel manipülasyonu, reaktif hacmini ve maliyeti en aza ...

Doku ve organların biyomühendisliği, rejeneratif tıp alanına çekici bir katkıdır. Hastalıklı organların işlevselliğinin yerini almak için hastalara nakil için uygun olan "laboratuvarda yetiştirilen" organların oluşturulması, nakil ihtiyaçlarına yönelik mevcut ve gelecekteki talebi karşılamak için oldukça arzu edilir. Doku mühendisliğinin ilkeleri, istenen hücre tiplerinin veya bunların öncüllerinin, gelişimsel veya rejeneratif süreçleri taklit etmek için gerekli uygun büyüme faktörlerini ve kültür koşullarını sağlarken, tasarlanmış dokunun şeklini destekleyen bir iskeleye tohumlanması etrafında toplanır. Doku mühendisliği için sentetik iskeleler kullanılmış olsa da, doğal hücre dışı matris (ECM) bu amaç için organa özgü iskelelerin en iyi kaynağı olabilir. Tüm organın hücreden arındırılması, doğal ECM'nin kimyasal ve yapısal yönlerini olduğu gibi bırakırken hücrelerin uzaklaştırılmasına izin veren bir işlemdir. Elde edilen aselüler matris iskelesi, üzerine rejeneratif hücrelerin tohumlanabileceği ve kültürlenebileceği bir platform olarak kullanılabilir in vitro1,2.
Bu teknolojinin3-6 fizibilitesini incelemek için akciğer hücre giderme ve müteakip yeniden hücreselleştirmenin birkaç kemirgen modeli geliştirilmiştir. Temel kavram kanıtı sunarken, kemirgen modelleri doğrudan insan klinik ihtiyaçlarına çevrilemez. Yakın zamanda yapılan bir çalışma, travmatik yaralanmaya (ve buna bağlı iltihaplanmaya) verilen genomik tepkilerin fareler ve insanlar arasında iyi bir korelasyon göstermediğine dikkat çekti; Bu bulgular, farelerin insanlarda bu tür karmaşık biyokimyasal süreçler için model olarak kullanılmasının geçerliliği ile ilgili soruları gündeme getirmektedir7. İnsan olmayan primat (NHP) modelleri, genomik, anatomik ve fizyolojik seviyelerde insan biyolojisine çok benzeme avantajını sunar ve insan kullanımına daha fazla ekstrapolasyon için daha esnek manipülasyona izin verir. Rhesus makağı, çeşitli klinik öncesi uygulamalarda kullanılmıştır ve doku mühendisliği8-11'i incelemek için mükemmel bir modeldir. Kısa bir süre önce, akciğer ECM12 üzerinde minimum etkiye sahip bir prosedür kullanarak rhesus makak (Macacca mulatta) akciğerlerinin başarılı bir şekilde hücreden arındırılmasını tanımladık. Akciğer hücre giderme, dokunun deterjanlar, tuzlar ve enzimlerden oluşan dört hücre giderme solüsyonu ile deiyonize su ile aralıklı yıkama ile art arda muamele edilmesiyle gerçekleştirilir (dH2O) ve PBS. Bu prosedürü, orijinal olarak Price ve arkadaşları tarafından açıklanan bir protokolü değiştirerek optimize ettik.4 Doğal makak akciğerlerine göre elde edilen aselüler matrislerin bileşenlerini karakterize etmek için çeşitli histolojik ve protein analitik teknikler kullanıldı.
Bu raporda, insan olmayan primat akciğerlerinin hücreden arındırılması ve ortaya çıkan aselüler akciğer iskelelerinin orijinal olarak Calle ve arkadaşları tarafından gösterilen büyük organlı bir biyoreaktörde yeniden hücreselleştirilmesi için ayrıntılı bir protokol gösteriyoruz. JoVE'de 13. Büyük hayvan akciğerleri için boyut, ventilasyon ve perfüzyon gereksinimlerini karşılamak için orijinal protokollerini değiştirerek, teknoloji kemirgen modelinden rhesus makak modeline başarıyla taşındı. Bu raporda sunulan tüm çalışmalar, Tulane Ulusal Primat Araştırma Merkezi'nde yürürlükte olan Kurumsal Biyogüvenlik Komitesi (IBC) politikalarına uygun olarak gerçekleştirilmiştir. Bu tekniğin gösterilmesi önemlidir, çünkü anatomik yapıların tanımlanması ve daha büyük organların fiziksel manipülasyonu bazen protokolün adımlarını görselleştirmeden zordur. Bu yöntemlerle mümkün kılınan çalışmalar, hücreden arındırılmış rhesus makak akciğerlerinde, rhesus mezenkimal soy kök hücreleri ve rhesus mikrovasküler endotel hücreleri ile reselleşmenin değerlendirilebildiği temel preklinik çalışmalar için bir temel oluşturmaktadır. Bu biyoreaktörün bizim versiyonumuz, gelişimsel ortamı simüle eder ve büyük hayvan akciğerlerinde mekanik gerilme ve gerilme kuvvetleri uygular ve pulmoner ve endotel gelişimini kolaylaştırdığı bilinen koşullar altında akciğer yeniden hücreselleşmesinin araştırılmasına izin verir13-15.

<table><tbody><tr><td>Sodyum nitroprussid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>71778-25G</td><td></td></tr><tr><td>Heparin sodyum tuzu</td><td>Fisher</td><td>BP2425</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Fisher</td><td>BP151-100</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum deoksikolat</td><td>Fisher</td><td>BP349-100</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum klorür</td><td>Fisher</td><td>7647-14-5</td><td></td></tr><tr><td>Sığır pankreas DNaz</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>DN25</td><td>Stok hazırlayın, alikot yapın ve dondurun</td></tr><tr><td>Magnezyum sülfat</td><td>Fisher</td><td>10034-99-8</td><td></td></tr><tr><td>Kalsiyum klorür</td><td>Fisher</td><td>C614-500</td><td></td></tr><tr><td>PBS (Ca/Mg yok)</td><td>Gibco, Yaşam Teknolojileri</td><td>10010-031</td><td></td></tr><tr><td>Antibiyotik-Antimikotik</td><td>Gibco Yaşam Teknolojileri</td><td>15240062</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Hücre Kültürü Ortamı</td></tr><tr><td>Alpha MEM</td><td>Gibco Yaşam Teknolojileri</td><td>12561-072</td><td></td></tr><tr><td>Orta 199</td><td>Gibco Yaşam Teknolojileri</td><td>11150067</td><td></td></tr><tr><td>Premium Fetal Sığır Serumu</td><td>Atlanta Biologicals</td><td>S11150</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamin 100x</td><td>Gibco Yaşam Teknolojileri</td><td>25030-081</td><td></td></tr><tr><td>Endotel Hücre Büyüme Takviyesi (EKGS)</td><td>ScienCell</td><td>1052</td><td></td></tr><tr><td>Antibiyotik-Antimikotik</td><td>Gibco Life Technologies</td><td>15240062</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Hücre Tohumlama ve Biyoreaktör Kültürü</td></tr><tr><td>Çek valfleri</td><td>Cole-Parmer</td><td>EW-98553-20</td><td></td></tr><tr><td>Y-konektörler</td><td>Cole-Parmer</td><td>ED-30614-08</td><td></td></tr><tr><td>3 musluklar</td><td>Harvard Aparatı</td><td>721664</td><td></td></tr><tr><td>MasterFlex L/S 14 boru</td><td>Cole-Parmer</td><td>96420-14</td><td></td></tr><tr><td>MasterFlex L/S 16 boru</td><td>Cole-Parmer</td><td>96420-16</td><td></td></tr><tr><td>Erkek kilit Luer 1/8 in</td><td>Cole-Parmer</td><td>EW-45505-04</td><td></td></tr><tr><td>Dişi Luer 1/8 in</td><td>Cole-Parmer</td><td>SI-45502-04</td><td></td></tr><tr><td>Erkek Luer kilit fişi</td><td>Cole-Parmer</td><td>EW-45505-56</td><td></td></tr><tr><td>Enjeksiyon portları</td><td>Medi-Dose EPS</td><td>IV2004</td><td></td></tr><tr><td>Lateks boru</td><td>St. Louis Medical Suppy</td><td>HN10910</td><td></td></tr><tr><td>Hortum kelepçesi</td><td>Cole-Parmer</td><td>EW-06832-02</td><td></td></tr><tr><td>2 L Geniş ağızlı kavanoz</td><td>Fisher</td><td>05-719-276</td><td></td></tr><tr><td>60 ml Şırınga</td><td>Fisher</td><td>NC9035364</td><td></td></tr></tbody></table>

Özel bir büyük organ biyoreaktörü kullanılarak İnsan dışı primat akciğerinin hücreden arındırılması ve yeniden hücreselleştirilmesi

Nonhuman Primate Lung Decellularization and Recellularization Using a Specialized Large-organ Bioreactor

Mevcut ve gelecekteki organ nakli ihtiyaçlarını karşılamak için yeterli sayıda akciğer bulunmamaktadır. Biyoyapay doku rejenerasyonu, klasik organ transplantasyonuna çekici bir alternatiftir. Bu teknoloji, bir organın doğal biyolojik hücre dışı matrisini (ECM), üzerine otolog veya kök/progenitör hücrelerin, orijinal dokunun yenilenmesini kolaylaştıracak şekilde tohumlanabileceği ve kültürlenebileceği bir iskele olarak kullanır. Doğal ECM, hücreden arındırma adı verilen bir süreçle izole edilir. Hücre giderme, ECM'yi olduğu gibi bırakırken hücresel materyalin etkili bir şekilde uzaklaştırılmasını sağlamak için dokuların bir dizi deterjan, tuz ve enzim ile işlenmesiyle gerçekleştirilir. Kemirgen akciğerlerinin decellularizasyonu ve ardından reselüler hale getirilmesi kullanılarak yapılan çalışmalar, in vivo gaz alışverişi yapabilen pulmoner benzeri doku oluşturmada marjinal başarı göstermiştir. Temel kavram kanıtı sunarken, kemirgen modelleri doğrudan insan kullanımına çevrilemez. İnsan olmayan primatlar (NHP), nihai klinik kullanım için biyoyapay organ üretiminin kullanımını araştırmak için daha uygun bir model sunmaktadır.
NHP rhesus makakından elde edilen akciğerlerin tamamen hücreden arındırılmasını sağlamak için protokoller sunulmuştur. Elde edilen aselüler akciğerler, mezenkimal kök hücreler ve endotel hücreleri dahil olmak üzere çeşitli hücrelerle tohumlanabilir. El yazması ayrıca, hücre tohumlu makak akciğerlerinin, negatif basınçlı ventilasyonun yanı sıra vaskülatür yoluyla pulsatil perfüzyon tarafından sağlanan mekanik gerilme ve gerilme koşulları altında kültürlenebildiği bir biyoreaktör sisteminin geliştirilmesini de açıklamaktadır; Bu kuvvetlerin sırasıyla pulmoner ve endotel soyları boyunca farklılaşmayı yönlendirdiği bilinmektedir. Hücresellikten arındırma ve hücre tohumlamanın temsili sonuçları sağlanır.

Aşağıda gösterilen sonuçlar, daha önce açıklandığı üzere16-18 izole edilen ve karakterize edilen rhesus makak kemik iliği kaynaklı mezenkimal kök hücrelerin veya rhesus akciğer kaynaklı mikrovasküler endotel hücrelerinin sırasıyla hava yolu veya vasküler kompartmanlara ekildiği ayrı deneyleri temsil etmektedir.
Deselülarizasyon süreci boyunca, makak akciğerleri süreç sonunda yarı saydam bir görünüme ulaşan progresif bir beyazlaşma sergilemiştir; ancak akciğerler genel anatomik özell...

Tüm organ hücresizleştirme, rejeneratif tıp için kullanılabilecek doğal biyolojik iskeleler üretir. Tüm akciğerlerin hücrelerden arındırıldığı ve daha sonra vasküler dolaşımı ve sıvı ortam ventilasyonunu kolaylaştıran bir biyoreaktörde yetişkin kök hücreler ve endotel hücreleri ile tohumlandığı insan dışı bir primat akciğer rejenerasyonu modelinin tanımı sunulmaktadır.

Özel Bir Büyük Organ Biyoreaktörü Kullanılarak İnsan Dışı Primat Akciğerinin Hücreden Arındırılması ve Yeniden Hücreselleştirilmesi

There are an insufficient number of lungs available to meet current and future organ transplantation needs. Bioartificial tissue regeneration is an ...

Bu prosedürün genel amacı, tüm organ biyolojik matrislerini Reus Maccas'ın akciğerlerinden izole etmek ve bu matrisleri akciğer dokusu mühendisliği uygulamalarını araştırmak için iskele olarak kullanmaktır. Bu, önce tüm Reuss Maca akciğerlerinin deterjanlar, tuzlar ve enzimlerle hücrelerden arındırılmasıyla gerçekleştirilir. İkinci adım, hücreden arındırılmış akciğer iskelelerini hem hava yolunu havalandırabilen hem de pulmoner vaskülatürü sıvı hücre kültürü ortamı ile perfüze edebilen bir biyoreaktöre kurmaktır.Daha sonra, akciğer iskeleleri, hava yolu yoluyla kök hücreler ve pulmoner vaskülatür yoluyla endotel hücreleri ile oturtulur. Son adım, biyoreaktör tarafından sağlanan ventilasyon ve perfüzyon koşulları altında istenen süre boyunca akciğer iskelesi içindeki hücrelerin kültürlenmesi ve ardından elde edilen hücresel ve doku morfolojisinin analizidir. Sonuç olarak, aselüler Maca akciğer iskelelerinin kök hücreler ve endotel hücreleri ile yeniden izasyonu, doğal akciğer dokularının anatomik ve histolojik özelliklerini taklit eden mühendislik dokusu ile sonuçlanır.Bu yöntem, akciğer dokusunu tek başına mı yoksa olgun pulmoner epitel ve endotel hücreleriyle birlikte mi rejenere etmek için kök veya progenitör hücrelerin kullanılıp kullanılamayacağı gibi akciğer dokusu Mühendisliği alanlarındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin etkileri, son dönem akciğer hastalıklarının tedavisine doğru uzanır, çünkü aselüler akciğer matrislerinin hasta kaynaklı kök veya progenitör hücrelerle izasyonu, akciğer nakli için mevcut donör akciğer sayısını artırma potansiyeline sahiptir. Ayrıca, hastanın kendi kök hücreleri kullanılarak tasarlanan akciğerler, bağışıklık reddine karşı dirençli olabilir.Bu yöntem için ilk olarak, Dr. Laura Nicholson'ın Yale Üniversitesi'ndeki laboratuvarının üyeleri tarafından daha önce yayınlanmış bir Joe videosunu izlediğimizde aklımıza geldi. Burada, büyük hayvan Resus Meac modelimizin ihtiyaçlarına uyacak şekilde kemirgenler için prosedürlerinin modifikasyonlarını sunuyoruz. Maca dokuları ile çalışırken bulaşıcı maruziyet olaylarını önlemek için azami özen gösterilmelidir.İnsan olmayan primat dokularını kullanmadan önce, cerrahi maske, yüz siperi, bir kat cerrahi eldiven, tek kullanımlık önlük ve akciğerler diseksiyon tepsisinde düz dururken ikinci bir cerrahi eldiven tabakası dahil olmak üzere kişisel koruyucu ekipman giyin, pulmoner arteri uygun boyutta bir dikenli dişi yem konektörü kullanarak kanüle edin. Kanülü alkolle sterilize edilmiş bir fermuar ile yerine sabitleyin. Soluk borusunun etrafına plastik bir fermuar geçirin.Trakeal açıklığa bir dişi yem konektörü yerleştirin ve trakeayı diken etrafında yerinde tutmak için konektörün dikeninin etrafındaki fermuarı sıkın. Mililitre başına 30 birim heparin ve mililitre sodyum nitropres başına beş mikrogram içeren fosfat tamponlu salin veya PBS damlatarak akciğerlerde sıkışan havayı çıkarın. Kısaltılmış SNP, çözeltinin tekrarlanmadan önce doğal geri tepme ile dışarı atılmasına izin verir.PBS Heparin SNP solüsyonu ile üçüncü hava yolu kurulumundan sonra iki kez daha kurulum. Trakeal yem kanülünü bir yem tapası ile kapatın. Kalbin tepesini kesin ve perfüzyon sırasında pulmoner devrenin drenajını kolaylaştırmak için kalan kanı çıkarmak için her iki kulakçıkı da yırtar etmek için iç ventrikülleri PBS Heparin SNP ile sulayın.PBS Heparin SNP solüsyonu ile doldurulmuş 60 cc'lik bir şırıngayı pulmoner arter kanülüne takın ve sıvının damar sistemine akmasına izin vermek için pistonu dikkatlice çıkarın. Tapayı trakeal kanülden çıkarın ve hava yolundaki sıvının doğal geri tepme ile dışarı atılmasına izin verin. Pulmoner vaskülatürden mümkün olduğunca fazla kan alınana kadar perfüzyona devam edin.Prosedürün en zor yönü, akciğer hava yolunun etkili bir şekilde durulanması ve yıkanmasıdır Sıvılarla, hava yolları sıvıları iletmek için tasarlanmadığından, sıvı akışı gazlara göre engellenir, bu adımları gerçekleştirmek için zaman ve hastalar gereklidir, hücre çözme ilerledikçe ve hücresel kalıntılar dışarı atılırken hava yolunda kalan sıvıya rağmen protokole devam etmenizi öneririz, sıvı viskozitesi düşük kalacak ve akciğerler sıvıları birinci gün verimli bir şekilde dışarı atabilecektir. Kalp akciğer bloğunu deiyonize suya batırın, sırasıyla batık trakeal ve arteriyel kanüle bağlı 60 cc şırınga kullanarak akciğeri deiyonize su ile şişirin ve perfüze edin. Deiyonize su ile hava yolunu ve vasküler yıkamaları etkili bir şekilde tekrarlayın.Beş yıkamadan sonra her biri yaklaşık 0,5 ila bir litrelik toplam beş durulama için dört kez daha, akciğerleri sudan çıkarın ve bloğu Triton solüsyonuna batırın. Akciğerleri Triton solüsyonu ile şişirin ve perfüze edin. Daha önce olduğu gibi, kurulumu ikinci kez tekrarlayın ve batık organları Triton çözeltisinde gece boyunca dört santigrat derecede inkübe edin.Gece boyunca inkübasyondan sonra, akciğer bloğunu Triton solüsyonundan çıkarın ve harici olarak deiyonize su ile yıkayın. Daha sonra bloğu taze deiyonize suya batırın. Triton solüsyonunu ve hücre kalıntılarını yıkamak için deiyonize suyu trakea ve pulmoner artere beş kez damlatın.Akciğerleri deiyonize sudan çıkarın ve% 2 Sodyum deoksi kaplama veya SDC çözeltisine batırın. SDC çözeltisi ile aynı şekilde şişirin ve perfüze edin. Akciğerleri üçüncü gün gece boyunca dört santigrat derecede SDC çözeltisine batırın.Dokuyu tekrar deiyonize su ile harici olarak ve hava yolu ve damar sistemi yoluyla beş kez yıkayın. Daha önce olduğu gibi, dokuyu deiyonize sudan çıkarın ve bir molar sodyum klorür çözeltisine batırın. Daha önce olduğu gibi sodyum klorür çözeltisi ile şişirin ve perfüze edin ve akciğerleri sodyum klorür çözeltisinden beş durulama deiyonize su ile yıkadıktan sonra dokuyu oda sıcaklığında bir saat boyunca sodyum klorür çözeltisine batırın.Daha önce olduğu gibi, onları taze DNA çözeltisinde yıkayın ve bu çözeltiyi hava yoluna ve damar sistemine aşılayın. Akciğerleri oda sıcaklığında bir saat boyunca DNA çözeltisinde inkübe edin. Daha sonra akciğerleri DNA çözeltisinden çıkarın ve PBS çözeltisi ile harici olarak yıkayın.Akciğerleri PBS solüsyonuna batırın ve bu solüsyonu hava yolu ve damar sistemi boyunca beş kez yıkayın. Daha önce olduğu gibi, akciğerleri PBS çözeltisinde dördüncü gün dört santigrat derecede gece boyunca kapalı bir kapta saklayın. Akciğerleri taze buz gibi PBS solüsyonunda hava yolu ve damar sistemi boyunca beş kez yıkayın.Daha sonra, kullanılana kadar dört santigrat derecede steril kapalı bir kapta PBS çözeltisinde saklayın. Biyoreaktör bileşenlerini şemaya göre bir laminer akış başlığı altında birleştirin. Metin protokolünde, biyoreaktörde kullanımdan hemen önce ana odayı bir hücre kültürü inkübatörünün %5 CO2 atmosferine dengelenmiş, trakeal ve vasküler kanül adaptörlerini akciğer kanülüne uygulayın.Akciğerleri kültür ortamında yıkayarak ve kanül adaptörlerini modifiye kapaktaki uygun bağlantı noktalarına takarak organları ana biyoreaktör odasına yerleştirin. Bağlandıktan sonra kapağı güvenli ve sıkı bir şekilde yapıştırın. Hazne, şırınga portları ve sıvı akışını şırıngaya yönlendirmek için üç durdurma musluklarının yönünü hareket ettiren 18 gauge iğne ile donatılmış 60 CCC'lik bir şırınga kullanılarak borudan hava aspire etme süresi boyunca tekrar açılmayacaktır.Sıcaklık ve gazı dengelemek için kurulu organlara sahip sızdırmaz bitişik bağlı biyoreaktör odalarını bir doku kültürü inkübatörüne taşıyın. Ana hazneye bağlı bir şırınga pompası kullanarak akciğerleri her iki dakikada bir yaklaşık bir tam nefeste havalandırın ve damar sistemini peristaltik pompa aracılığıyla dakikada yaklaşık 10 mililitre perfüze edin Hava yolu oturması için toplam 30 dakika. Solunum döngüsündeki üç yollu durdurma musluğuna bağlı şırınga portundan hafifçe enjekte ederek akciğerleri hücre süspansiyonu ile şişirin.Hücrelerin hücreden arındırılmış akciğer matrisine bağlanmasına izin vermek için akciğerleri hava yolu veya vasküler perfüzyon olmadan gece boyunca 37 santigrat derecede, %5 CO2'de statik olarak tutun. Gece boyunca inkübasyondan sonra, standart hava yolu ventilasyon programını ve kültürünü, organları vasküler oturma için üç ila yedi gün boyunca yeniden başlatın. Akış yolunun yönlülüğü, bu iki bölmeyi birbirine bağlayan boruya yerleştirilmiş durdurma musluğu üzerindeki valfi döndürerek ana odadan bir endotel oturma rezervuarına değiştirilebilir, tohumlama tamamlandığında manyetik karıştırma kullanılarak hafifçe karıştırılırken, peristaltik pompa kullanılarak kademeli olarak tohum endotel hücreleri.Perfüzyonu durdurun ve yaklaşık dört ila altı saat statik olarak inkübe edin. Vasküler perfüzyonu ana hazne ortamı ile dakikada yaklaşık 10 mililitre hızında yeniden başlatın. Hava yolu ventilasyon kültürü periyodu ile eş zamanlı olarak sürekli vasküler perfüzyon ile üç ila yedi gün boyunca kültür.Hücreden arındırma işlemi boyunca, MCCA akciğerleri, işlemin sonunda yarı saydam bir görünümle sonuçlanan ilerleyici beyazlatma gösterdi. Bununla birlikte, akciğerler brüt anatomik özelliklerini korudu ve büyük ölçüde elastik kaldı ve sıvı ile şişirildikten sonra doğal geri tepme üretebildi. Mikroskobik düzeyde.Histolojik ultra yapı, decellularizasyondan sonra bozulmadan kaldı. Yani, bronşiyal solunum, bronşiyaller, alveolar keseler. Kan damarları ve kılcal damarlar, düşük güç mikroskobu ile hala oldukça net bir şekilde ayırt edilebiliyordu.Bununla birlikte, histolojik mikroanatomi, akciğerin kaba anatomisi ve ultra yapısının decellularizasyon ile hafifçe bozulduğunu, ancak dokunun burada görüldüğü gibi sağlam hücrelerden tamamen yoksun olduğunu gösterdi. Hücreden arındırılmış dokularda sadece eser miktarda DNA kaldı. Ayrıca, alkol çökeltme ile konsantre edilen ve %0.8'lik bir AROS jeli içinde görselleştirilen eser DNA, çoğunlukla düşük moleküler ağırlıklı bozunmuş parçalardan oluşuyordu.Hücresel protein gideriminin etkinliği, hem doğal hem de hücresizleştirilmiş akciğer proteininin western blot analizleri ile değerlendirildi. Beta aktine karşı bir antikor kullanan lizatlar, beta aktin, doğal akciğer lizatlarında kolayca tespit edildi, ancak hücresizleştirilmiş akciğer lizatlarında tespit edilmedi, bu da decellularization'ın hücreleri önemli ölçüde tükettiğini ve maca kemik iliği türevi mezenkimal kök hücreler veya BMC'ler ve biyoreaktör kültürü ile hava yolu tohumlamasından 14 gün sonra hücreyle ilişkili protein materyalini çıkardığını düşündürmektedir. Deselülasyonlu Maca akciğerlerinin parankimi etkili bir şekilde izole edildi.BMC'ler, berrak ve açık bir alveolar lümeni korurken alveolar septusu kapladı. Büyük hava yollarının soyulmuş matrisi, biyoreaktör kullanılarak BMC'ler tarafından da izole edildi, bir ana gövde bronşunun lümen yüzeyi, 14 günlük kültürden sonra BMC'ler gibi tek bir skuamöz tabaka ile kaplandı. Burada gösterilen biyoreaktörde, damar sisteminin mikrovasküler endotel hücreleri ile tohumlanmasından ve dakikada beş mililitrede endotel kültür ortamı ile sürekli vasküler perfüzyon sağlanmasından beş gün sonra hücreden arındırılmış bir reus akciğer lobu bulunmaktadır.Histolojik analiz, akciğer parankimindeki küçük damar sistemini kaplayan hücreleri ortaya çıkardı. Bazı durumlarda, hücrelerin lümen boyunca birkaç hücresel projeksiyon yoluyla matrise bağlı olduğu görülürken, damarların diğer kesitleri, endotel yüzeyini net lümenle kaplayan hücreleri gösterdi. Bu prosedürü takiben.İmmünohistokimya, western blot ve kantitatif gerçek zamanlı PCR gibi diğer yöntemler, tohumlanan kök hücrelerin aselüler akciğer matriksi üzerinde kültürlendikten sonra pulmoner soy hücrelerine mi farklılaştığı yoksa biyoreaktör içindeki olgun epitel ve endotel hücreleri ile mi farklılaştığı gibi ek soruları yanıtlamak için gerçekleştirilebilir. Bu videoyu izledikten sonra, insan olmayan primat akciğerlerinin nasıl hücrelerden arındırılacağını iyi anlamalı ve daha sonra elde edilen aselüler akciğerleri bir biyoreaktör sisteminde kök hücreleri, epitel hücrelerini ve endotel hücrelerini kültürlemek için iskele olarak kullanmalıyız. İnsan olmayan primat dokularıyla çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini ve bu prosedürü gerçekleştirirken her zaman yüz siperi ve çift katmanlı lateks veya nitril eldivenler de dahil olmak üzere tam kişisel koruyucu ekipman giymek gibi önlemler alınması gerektiğini unutmayın.

nonhuman-primate-lung-decellularization-recellularization-using

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Biyomühendislik

Biz bir decellularized akciğer ekstraselüler matriks ve fonksiyonel akciğer dokusu oluşturmak için kullanılan olabilir romanı biomimetic biyoreaktör geliştirdik. Biyoreaktör matris ve kültür hücreleri ekim, kısa bir süre için in vivo olarak nakledilen zaman etkili gaz değişimi gösteren doku oluşturur.

Akciğer Mühendisliği Prosedürü

Hızla ve tamamen retrograd perfüzyon yoluyla sağlam bir domuz kalbinden hücresel bileşenleri kaldırmak için bir yöntem tarif edilmiştir. Bu yöntem, çoklu klinik uygulamalarda kullanım için potansiyele sahip bir site spesifik kardiyak ekstraselüler matriks iskele verir.

Retrograd Koroner Perfüzyon tarafından Domuz Kalp Decellularization Prosedürü

Decellularized bir sıçan karaciğerinin hücreselleştirilmiş hücre dışı matrisi, bir virüsün veya viral vektörün dağılımını ve transgen ekspresyonunu incelemek için insanlaştırılmış, üç boyutlu bir ex vivo model olarak kullanılabilir.

Insan hepatoselüler karsinoma hücre hattı HepG2 ile üç boyutlu Karaciğer modeli yeniden doldurulur Viral Vektörler Study

Burada, tümör hücreleri ve metastatik lezyonlar dolaşan bir protokol tümör progresyon adımları taklit eder ve birincil tümörün izole etmek için yardımcı olan bir ex vivo akciğer kanseri modeli için mevcut.

Tümör metastazı çalışmaya acellular ve hücresel akciğer modeli

Bu protokol, desellülarize hassas kesilmiş akciğer dilimlerini alveoler epitel tip 2 hücreleri, fibroblastlar ve endotel hücreleri ile yeniden doldurarak tekrarlanabilir, küçük ölçekli mühendislik ürünü akciğer dokuları oluşturmak için bir yöntemi açıklar.

Desellülerize Akciğer Dilimlerinden Hazırlanan Mühendislik Akciğer Dokuları

Protokol, endojen epitelin sıçan trakeasından seçici olarak çıkarılmasına ve lümen yüzeyindeki eksojen hücrelerin homojen dağılımına izin veren, ardından hücre dokusu yapısının uzun süreli in vitro kültürüne izin veren görüntüleme özellikli bir biyoreaktörü tanımlar.

Biyomühendislik hava yolu dokusu üretmek için görüntüleme kılavuzlu biyoreaktör

Burada bölgesel desellülarize akciğer dokusunun izolasyonu için bir protokol sunulmaktadır. Bu protokol, hücre dışı matris ve hücre-matris etkileşimlerindeki karmaşıklıkları incelemek için güçlü bir araç sağlar.

Bölgeye Özgü Desellülarize Akciğer Dokusunun Diseksiyonu ve İzolasyonu

Bu makale, hücreden arındırma ve yeniden hücreselleştirme yöntemleri kullanılarak biyomühendislik ürünü fare akciğerlerinin nasıl oluşturulacağını açıklamaktadır. Ayrıca sonraki ortotopik akciğer naklini de detaylandırır.

Hücreden Arındırılmış Fare Akciğerleri ve Primer İnsan Endotel Hücreleri Kullanılarak Biyomühendislik Ürünü Akciğerin Transplantasyonu

Perfüzyon decellularization organ ekstraselüler matriks kompozisyonu ve mikromimarisini korur tüm karaciğer iskeleleri üretmek için yeni bir tekniktir. Burada, hepatositler ile perfüzyon decellularization ve sonraki repopulation kullanarak tüm organı iskeleleri hazırlama yöntemi açıklanmıştır. Fonksiyonel ve transplante karaciğer greft tekniği kullanılarak oluşturulabilir.

Tüm karaciğerleri Decellularization ve Recellularization

Grubumuz, kardiyovasküler sistem fizyolojik pulsatil gerilmeler implante küçük çaplı vasküler greft yeniden taklit eden bir biyoreaktör kültür sistemi geliştirmiştir.

Pulsatif Biyoreaktör kullanarak Mühendislik Biyolojik Tabanlı Vasküler Greftler

Öğrenin, Reus Macca akciğerlerinin hücreden arındırılması ve biyoreaktörde kök hücrelerle yeniden hücreselleştirilmesi yöntemini. Bu teknik, rejeneratif tıpta akciğer doku mühendisliği uygulamaları için biyolojik iskeleler oluşturur.

Özel Bir Büyük Organ Biyoreaktörü Kullanılarak İnsan Dışı Primat Akciğerinin Hücreden Arındırılması ve Yeniden Hücreselleştirilmesi (Video) | JoVE Journal

Özel Bir Büyük Organ Biyoreaktörü Kullanılarak İnsan Dışı Primat Akciğerinin Hücreden Arındırılması ve Yeniden Hücreselleştirilmesi

Daha fazla video keşfet