Insan hepatoselüler karsinoma hücre hattı HepG2 ile üç boyutlu Karaciğer modeli yeniden doldurulur Viral Vektörler Study

Bu prosedürün genel amacı, virüsleri ve viral vektörleri incelemek için üç boyutlu bir karaciğer modeli geliştirmektir. Bu yöntem, bir fare veya sıçan modelindeki kemirgen hücrelerinden fizyolojileri bakımından farklılık gösteren insan hücreleri ile vaskülarize üç boyutlu bir sistemde biyolojik süreçlerin incelenmesine izin verir. Ek olarak, canlı hayvanlarla yapılan deneylerden kaçındığı ve uzun vadede hayvan bileşenlerinin tamamen yerini alması amaçlandığı için hayvan refahını iyileştirmeye yönelik bir adımdır.

Bu yöntemi gen transferi için viral vektörleri incelemek için geliştirmiş olsak da, bulaşıcı hayati virüslerin çalışmasına ve kanser araştırmaları gibi diğer araştırma alanlarına da uygulanabilir. Prosedürü göstermek, laboratuvarımdan bir teknisyen olan Viola Rohrs olacak. Hayvan refahı adına, bu çalışma için sadece diğer hayvan deneyleri için kurban edilen fazla hayvanlar kullanıldı, yani

karaciğer iskelelerini elde etmek için ek hayvanlara ihtiyaç duyulmadı. Başlamak için önce hepatik hücre hattı Hep G2'yi genişletin. % 10 fetal buzağı serumu ve% 10 gulatmin, penisilin ve streptomisin içeren 30 mililitre ortamda T175 şişelerine 15 milyon hücre tohumlayın. Dört günlük kültürlemeden sonra, hücreleri gevşetmek için kültürleme koşullarında beş dakikalık tripsin çözeltisine maruz kalma kullanın ve ardından bunları hasat edin.

Daha sonra hücreleri üç dakika boyunca 300 Gs'de döndürün. Sonra bunları dört mililitre PBS'de yeniden askıya alın ve bir hücre sayımı elde edin. Her şişe yaklaşık 45 milyon hücre vermelidir.

Bir sıçan karaciğeri ECM'sini yeniden hücreselleştirmek için 600 milyon hücreye ihtiyaç vardır. ECM'yi yeniden hücreselleştirmek için, önce bir karaciğer bolluk odası, bir bolluk sistemi, bir ortam rezervuarı ve bir kabarcık tuzağı içeren biyoreaktör sistemini kurun. Yeniden hücrelendirme prosedürünün iki kritik adımı vardır.

Birincisi, bolluk sisteminde herhangi bir hava kabarcığı sıkışmasını önlemektir. İkincisi, tüm sistemin steril tutulması gerektiğidir. İlk olarak, biyoreaktör sisteminin bu bileşenlerini 121 santigrat derecede 15 dakika sterilize edin.

İkinci olarak, tüpleri ve sterilize edilmiş füzyon odasını ortamla doldurun. Daha sonra hücreden arındırılmış sıçan karaciğeri iskelesini karaciğer bolluk odasına yerleştirin. Bir sonraki adım, kanüllü portal veni füzyon sistemine bağlamak için tüp klipsleri kullanmaktır.

Şimdi biyoreaktör sistemini inkübatöre yerleştirin ve peristaltik bir pompaya bağlayın. Ardından, iskeleyi beş gün boyunca 150 mililitre takviye edilmiş ortam ile dengeleyin. Akışı dakikada 1,25 mililitre olarak ayarlayın.

Beş gün sonra, biyoreaktör sistemini pompadan ayırın ve steril bir davlumbaza aktarın. Karaciğer iskelesini medya devresinden ayırın. Daha sonra 300 milyon Hep G2 hücresi içeren beş mililitre besiyeri olan bir şırınga yükleyin ve hücreleri portal ven yoluyla enjekte ederek hava kabarcıklarının oluşumunu önleyin.

Ardından, pompayı çalıştırmadan hücrelerin ECM'yi bir saat boyunca yeniden doldurmasına izin verin. Bir saat sonra, pompayı dakikada 1,25 mililitre ile başlatın. 10 dakika sonra, basıncı dakikada 2,5 mililitreye yükseltin.

20 dakika daha sonra, pompayı dakikada 3,75 mililitre çalışma hızına ayarlayın. Tam pompa hızında 30 dakika geçirdikten sonra pompayı kapatın, 300 milyon hücre daha ekleyin ve hücrelerin ECM'yi bir saat boyunca doldurmasına izin verin. Bir saat sonra, daha önce olduğu gibi pompa hızında artımlı ayarlamalar yaparak sirkülasyonu kademeli olarak artırın.

Şimdi kültürün karaciğeri iki hafta boyunca yeniden hücrelendirmesine izin verin. Her gün, ortamın 50 mililitresini değiştirin ve kullanılan ortamın bir örneğinden fizyolojik parametreleri ölçün. AAV vektörlerinin üretimi, metin protokolünde özetlenen birçok adımı içeren karmaşık bir prosedürdür.

Videonun bu bölümünde, bazı önemli adımlar gösterilmektedir. İlk olarak, AAV vektörlerini üretin, saflaştırın ve nicelleştirin. AAV vektörlerini silindirli şişelerde kısaca üretin ve iyodiksanol gradyan santrifüjlemesi ile saflaştırın.

PD10 jel filtrasyon kolonları üzerinden filtrasyon yaparak kalan iyodiksanolü çıkarın. Daha sonra standart olarak genomik AAV DNA'yı kullanarak QPCR ile AAV vektör konsantrasyonunu belirleyin. Model başına toplam 27 trilyon AAV vektörüne ihtiyaç vardır.

Şimdi karaciğer modelini dönüştürün. İlk olarak, bir şırıngaya yüklenen beş mililitre PBS'de 27 trilyon vektör elde edin. Fenol kırmızısı mililitre başına 5 mikrogram eklenebilir.

Daha sonra karaciğeri medya devresinden ayırın ve vektörleri sisteme enjekte edin. Enjekte edildikten sonra, sistemi pompalamadan bir saat inkübe edin. Ardından, daha önce açıklandığı gibi akışı kademeli olarak artırın.

Daha sonra, transdüksiyon karaciğer altı gün boyunca inkübe edildiğinden, her gün 50 mililitre ortamı değiştirin. Bir neşter kullanarak, her bir karaciğer lobundan yaklaşık yarım santimetre kalınlığında ve 1,5 ila iki santimetre uzunluğunda örnekler alın. Dilimleri %4 paraformaldehit ve %4 sükroz içinde dört santigrat derecede 90 dakika inkübe edin.

Daha sonra numuneyi yıkama başına bir dakika boyunca PBS ile üç kez yıkayın. Numuneleri gece boyunca dört santigrat derecede %8 sükroz içinde inkübe ederek yıkamaları takip edin. Ertesi gün, numuneleri bir miktar sabitleme ortamı içeren kriyokalıplara yükleyin.

Herhangi bir hava kabarcığı sokmaktan kaçının. Yüklendikten sonra, numuneleri sabitleme ortamı ile tamamen örtün ve eksi 80 santigrat dereceye koyun. Dondurulduktan sonra, bir kriyotom kullanarak numunelerden 10 mikron kriyoseksiyon hazırlayın.

Yeniden hücreselleştirmeyi doğrulamak için numuneleri gerektiği gibi boyayın. Gen ekspresyonu analizi için, dört milimetrelik bir biyopsi zımbası kullanarak örnekler alın. Reselülizasyonu değerlendirmek için kriyoseksiyonlar hematoksilen ve eozin ile boyandı.

Transdüksiyona uğramış iki karaciğer ve reselülasyona uğramış ancak transdüksiyona uğramamış bir kontrol karaciğerinden gelen lobların tümü Hep G2 hücreleri ile yeniden populasyona tabi tutuldu. RNA ekspresyonu ve vektör titresi, her karaciğer modelinden alınan 28 punch biyopsiden ölçüldü. Dönüştürülen iki karaciğer modelinde, hücre başına 55 ve 90 vektör genomu ölçüldü, bu da gen susturmayı indüklemek için yeterli vektördür.

Beklendiği gibi kontrolde hiçbir genom ölçülmedi. EmGFP ekspresyonu RT-PCR ve western blotlama ile analiz edildi. Biyopsilerin çoğunda EmGFP'nin mRNA ekspresyonu ve EmGFP'nin protein ekspresyonu görüldü.

Kriyoseksiyonların immünostandingingi, modelin başarılı bir şekilde yeniden hücreselleştirildiği her yerde EmGFP ekspresyonunun da görülebileceğini gösterdi. Bu, iyi AAV gen ekspresyonunun bir göstergesidir. Daha sonra, insan siklofilin B'nin AAV aracılı yıkımı, kantitatif RT-PCR ile analiz edildi.

İnsan siklofilin B'nin ortalama yıkımı, transdüksiyona uğrayan iki karaciğerin tüm lobları üzerinde% 70 ila 90 arasındaydı. Geliştirilmesinden sonra, bu teknik, araştırmacıların vaskülarize, üç boyutlu organ sistemindeki virüslerin ve viral vektörlerin dağılımını incelemesinin yolunu açtı. Bu tür çalışmalar, gen transferi için mevcut tekniklerin geliştirilmesine ve yeni antiviral stratejilerin geliştirilmesine yardımcı olacaktır.