NF-KB-bağımlı yetişkin nöron Modülasyon ve Analiz Yöntemleri

Bu prosedürün genel amacı, yetişkin beyninde transkripsiyon faktörü NF kappa B'nin işlevini araştırmaktır. Bu, nöronlarda NF kappa B aktivitesini spesifik olarak inhibe eden ilk üreme transgenik fareler tarafından gerçekleştirilir. Prosedürün ikinci adımı, uzamsal desen, ayırma veya ahırlar, labirent kullanarak NF kappa B inhibisyonunun davranışsal sonuçlarını test etmektir.

Üçüncü adım, hayvanların dikkatli bir şekilde çoğaltılması, beyinlerin çıkarılması ve bunların uygun şekilde bölümlere ayrılmasıdır. Son adım, immün boyama ile yosunlu lif projeksiyonlarını görselleştirmek gibi histolojik ve yapısal etkileri analiz etmektir. Sonuç olarak, davranış testini ve ardından histolojiyi kullanmak, dentat girusa bağlı öğrenmedeki değişiklikleri ilişkili dokulardaki yapısal değişikliklerle ilişkilendirebilir.

Bu tekniğin Mars Vazo gibi mevcut yöntemlere göre en büyük avantajı, uzamsal örüntü ayırma bağlarının MA'sı, bu beyin alanındaki nöro dejenerasyon ve rejenerasyonun yanı sıra çocuk bağımlılığı karşıtı öğrenme süreçlerini özel olarak ölçme fırsatı sunmasıdır. Bu yöntem, özel model ayırma olarak öğrenme gibi yetişkin nörojenez alanındaki temel soruları yanıtlamaya yardımcı olabilir. Labirenti göstermek, laboratuvarımdan bir teknisyen olan Angela Kula tarafından yapılacak.

Perfüzyon, bir araştırma görevlisi olan Peter Hyman tarafından sunulacak. Daha sonra beyinlerin kesitlenmesi Ulrich KA teknisyeni tarafından gösterilecektir. Ve son olarak, konfokal tarama mikroskobu, laboratuvarımın doktora öğrencisi Jeanine Muah tarafından sunulacak. Uzamsal örüntü ayrımını gerçekleştirin.

Barnes Maze Uluslararası ve yerel yönergelere göre davranış testi. Bu test için, sadece en az altı aylık erkek farelerin kullanılması önemlidir. Her test serisi için, hayvanlar dört günlük yaşta olmalı ve aynı operatör testten önce tüm testleri yapmalıdır.

Fareler, tatlı yiyeceklerle motive edilmeleri için standart bir diyetle beslenmelidir. Önce testi kurmak için sert plastikten yapılmış 120 santimetre çapında beyaz bir plaka edinin. Ekstra labirent ipuçları farklı malzemelerden yapılabilir ve farklı şekillere sahip olabilir.

Daha da önemlisi, hayvan koşu tekerlekleri tarafından net bir şekilde tanınabilmeleri için yüksek kontrasta sahip olmaları gerekir. Merdivenler ve tüneller iyi ipuçlarıdır. Plakayı orta derecede yoğun olan birkaç neon floresan lambanın altına yerleştirin, böylece fareler ışıktan çıkmak için motive olur.

Oda nem kontrollü ve sabit 22 santigrat derecede olmalıdır. Şimdi video izleme sistemini kurun. Kamerayı plakanın merkezinin 115 santimetre yukarısına yerleştirin.

Ardından, plakaya uyan beyaz renkli bir beze çok renkli ekstra labirent ipuçları ekleyin. Onları, hayvanlar tarafından kolayca görülebilecek şekilde kumaşın ortasına yakın bir yere yerleştirin. Şimdi, deney kurulumundan herhangi bir kokuyu giderebilecek hızlı dezenfektan ile plakayı dikkatlice temizleyin.

Beyaz tabağın üzerine yedi adet aynı sarı yiyecek evini yerleştirin. Konumları, testlere başlamadan bir gün önce kesin olarak işaretlenmeli, her fareyi diske alıştırmalıdır. Yerleşim denemesi için yedi yiyecek evinin her birinin içine dörde bölünmüş bir meyve halkası gibi tatlı yiyecek pelet ödülleri yerleştirin.

Her fareyi plakanın başlangıç noktasına koyun ve keşfetmesi için 10 dakika bekleyin. Bu keşfi fareler arasında kaydedin. Dairesel tabağı ve yemek evlerini hızlı dezenfektan ile temizleyin.

Ayrıca yiyecek ödüllerini de yenileyin. Sonraki yedi ardışık günde, testler için test denemelerini çalıştırın. Bir ev hariç tüm ev, tüm deney için şeffaf bantla kapatılmıştır.

Hep aynı ev. Her ev hala bir ödülle doludur ve test, alışkanlık denemesi gibi yapılır. Sirkadiyen değişimleri önlemek için testleri her hayvan için günün aynı saatinde yapın.

Daha sonra, uygun istatistikleri kullanarak gecikmeyi, kat edilen mesafeyi ve hataları analiz edin. Yazılımlar, hataları yanlış yemek evine yaklaşmak veya uygun kutuyla temas kurmak, ancak ödülü girip alamamak olarak tanımlar. Grupları karşılaştırmak için bon fer post hoc testi ile iki yönlü bir ANOVA kullanın.

Hayvanı interperitoneal vertin enjeksiyonu ile uyuşturduktan sonra, heparin ve propan içeren PBS ile trans olarak dikkatlice perfüze edin. 26 gauge iğne kullanarak sol ventrikülde bir delik açın. Ayrıca kanın dışarı akmasına izin vermek için sağ atriyumda bir kesi yapın ve sekizinci perfüzün dışarı çıkmasına izin verin.

Perfüzyon iğnesini delikteki sol ventriküle düz bir açıyla ve bir ila iki milimetre derinliğe kadar yerleştirin. 1,2 ila 1,4 metre hidrostatik basınç kullanın ve fareyi iki ila dört dakika boyunca perfüze edin. PBS'de %4 paraldehit içeren heparin ve propanı 10 ila 15 dakika takip edin.

Perfüzyon dakikada 15 mililitre olmalıdır. Şimdi beyni inceleyin. Görünür kırmızı kan damarları olmadan soluk beyaz olmalıdır.

Toplanan tüm beyinleri 24 saat boyunca dört santigrat derecede% 4 para formaldehit içinde sabitleyin. Ertesi gün. Cryo, beyinleri PBS'de% 30 sükrozda korur, onları en az 24 saat sonra dört santigrat derecede saklar.

Beyinler kriyo ton aşamasında dondurulur ve 40 mikron kalınlığında yatay bölümler halinde dilimlenir. Kesitler nöro filament M için bir antikor ile boyandıktan sonra, yosunlu lif projeksiyonları, floresan antikor için uygun dalga boyunda bir konfokal lazer tarama mikroskobu kullanılarak görüntülenebilir. Taramayı düşük büyütme oranında başlatın ve hipokampus ve yosunlu lif çıkıntılarına yönlendirin.

Daha sonra daha yüksek büyütmede, I kappa B alfa AA bir transgenin ekspresyonunu araştırmak için analiz için yosunlu liflerin yüksek çözünürlüklü C-kesit taramalarını toplayın. Çift transgenik fare beyinleri izole edildi, kriyo kesit alındı ve GFP konfokal lazer taramasına karşı bir antikor kullanılarak boyandı. Mikroskopi, hipokampal nörojenik bölgede CAMK iki alfa tahrikli I kappa B alfa AA birini eksprese eden en erken hücre tipini belirlemek için CA bir bölgede, CA üç bölgesinde ve DG'de transgenin yüksek ekspresyonunu ortaya çıkardı.

I Kappa BTTA'dan su aygırı Campi'nin kriyo bölümleri. Hayvanlar çift kortin için boyandı ve transgen konfokal analizi, CAMK iki alfa aktivitesi ile transgen ekspresyonunun indüksiyonunu gösteren oklarla işaretlenmiş genç DCX pozitif granül hücrelerinde GFP sinyallerini ortaya çıkardı. i kappa BTTA ve i Kappa B eksi farelerin hipokampusunun koronal bölümleri, yosunlu lif projeksiyonlarını görselleştirmek ve I kappa BTTA farelerinde karmaşık ve veziküler organizasyonu ortaya çıkarmak için nörofilament M için boyandı.

Yosunlu lif çıkıntıları ciddi şekilde bozuldu. Ek olarak, NF kappa B inhibisyonu, dramatik yapısal kusurun potansiyel nedenlerini incelemek için önemli ölçüde azalmış bir speral bıçak kalınlığına ve daha küçük bir DG hacmine yol açtı. Kontrol ve I kappa BTTA farelerinden elde edilen taze sabitlenmemiş hipokampal dilimler, nöronal hücre ölümünün spesifik olarak tespit edilmesini sağlayan floro jade C ile boyandı.

Çift transgenik hayvanlarda, tek transgenik kontrollere kıyasla önemli ölçüde artan sayıda dejenere nörit gözlenmiştir. Ayrıca, I kappa BTTA Farelerinde bölünmüş kaprit üç pozitif hücrede önemli bir artış tespit edildi. Buna karşılık, DCX'e karşı immünohistokimyasal boyama, I kappa BT farelerinin beyinlerinde önemli ölçüde artmış DCX pozitif hücre miktarlarını ortaya çıkardı.

Ayrıca, I kappa B TTA hippo Campi'deki d CX pozitif hücreler sadece alt granüler bölgede düzenlenmemiştir, aynı zamanda dg'nin daha derin bölgelerinde de bulunmuştur. Kontrol hayvanlarındaki D CX pozitif progenitörler ise neredeyse sadece alt granüler bölge içinde lokalize olmuştur. DCX eksprese eden hücrelerin artan miktarını test etmek, daha önceki progenitörlerin olgunlaşmasının bir sonucuydu veya doğrudan DCX pozitif hücrelerin çoğalmasından kaynaklanıyordu.

BRDU, i kappa BTTA ve kontrol farelerinin intraperitoneal olarak enjekte edildi, daha sonra kriyo kesit alındı ve proliferasyon analizi için DCX ve BRDU ile boyandı. BRDU bir kez enjekte edildi ve ardından 24 saat sonra analiz edildi. Farklılaşma analizi için günde üç enjeksiyon yapıldı, ardından tek bir BRDU enjeksiyonundan yedi gün sonra analiz yapıldı.

I kappa, BTTA negatif ve kontrol hayvanları arasında toplam BRDU pozitif hücre sayısında anlamlı bir fark gözlenmemiştir. Buna karşılık, üç seri enjeksiyon yaklaşımı, I capa, BTTA'nın DG'sinde açıkça artmış miktarda B-R-D-U-D-C-X pozitif hücre ortaya çıkardı. DCX eksprese eden hücrelerin farklılaşması veya entegrasyonu bozulan fareler, hücre sayılarını arttırmış olabilir ve çift transgenik farelerin davranışını spesifik olarak test etmek için tip üç hücreler dahil edilmiş olabilir.

DG'ye bağlı bir görevde, S-P-S-B-M kullanıldı. I kappa B kontrol hayvanları, deneyin ilk gününde yiyecek evlerini seri olarak keşfettiler. Yedi günlük eğitimden sonra, hayvanlar açık yemek evini doğrudan bulabildiler.

Buna karşılık, IA BTTA hayvanları, eğitimden sonra bile yemek evlerini seri olarak keşfetmeye devam ediyor. I Kappa BTTA hayvanlarında i Kappa B kontrol hayvanlarına kıyasla kat edilen mesafelerde önemli artışlar ve daha yüksek gecikmeler ve hata oranlarının gözlemlenmesi, bu hayvanların ciddi öğrenme kusurlarına sahip olduğunu göstermektedir. Bir kez kurulduktan sonra, bu teknik, geliştirildikten sonra uygun şekilde yapılırsa, hayvan başına 30 dakika içinde yapılabilir.

Bu teknik, farelerde yetişkin nörogenezi, dejenerasyon veya rejenerasyon gibi daid jiroskoplarına bağımlı görevlerle ilgilenen diğer sinirbilimcilerin yolunu açabilir.