Nörogelişimsel Bozukluklar Fare Modeli Mekansal Öğrenme ardından Hipokampal Nöron Faaliyet immünohistokimyasal Görselleştirme

Aşağıdaki deneyin genel amacı, bir nörogelişimsel bozukluk modeli olarak Grailed iki nakavt farede uzamsal öğrenmeyi takiben hipokampal irk fosforilasyonundaki değişiklikleri tespit etmektir. Bu, ilk olarak Morris su labirentinde hem vahşi tip hem de kase iki nakavt farenin test edilmesiyle elde edilir. İkinci adım olarak, farelerin beyinleri çıkarılır ve vahşi tip ve nakavt farelerden dilimler viome kesim ile hazırlanır.

Daha sonra, vahşi tip ve nakavt farelerden alınan beyin dilimleri immünohistokimya için işlenir ve hipokampustaki fosforilasyon değişikliklerini tespit etmek için kullanılır. Sonuçlar, immünohistokimyasal boyamanın ışık mikroskobu görselleştirmesine dayalı olarak vahşi tip ve kase iki nakavt faresi arasındaki hipokampal RC fosforilasyonundaki farklılıkları göstermektedir. Bu yöntem, Maurice su labirenti gibi hipokampusa bağımlı özel bir öğrenme görevini takiben aktive edilen hipokampal nöronların belirli alt kümelerini tanımlamaya izin verir.

Bu yöntem fikrini ilk olarak, otizm spektrum bozuklukları için bir fare modeli olan ikinci derece nakavt farelerde moleküler açığın altını çizen moleküler boşluğu araştırmaya karar verdiğimizde ekledik. Morris Water Mae gibi uzamsal bir öğrenme görevinde çeşitli ilgi alanlarından fareleri eğitmeye başlamak. Eğitim süresinin sonunda ekteki metin protokolünde açıklandığı gibi eğitim rejimini takip edin, farelere ötenazi yapın ve ardından beyinlerini düzeltin ve çıkarın.

Prosedüre devam etmeye hazır olduğunuzda, beyinciği çıkarmak için bir neşter kullanın. Ardından beynin geri kalanını vibrato'nun tutucu plakasına dik olarak yapıştırın. Beyni dorsal hipokampus boyunca 20 ila 40 mikron kalınlığında seri bölümler halinde kesin.

Her dilimi bir mililitre 0.1 molar PBS ile doldurulmuş 24 oyuklu bir plakanın bir oyuğuna aktarın, her fare için üç ila beş dorsal hipokampal bölümü, her biri için 500 mikrolitre 0.1 molar PBS içeren 24 çok oyuklu bir plakanın kuyucuklarına aktarın. Her bir kuyucukta bulunan bölümleri 500 mikrolitre 0.1 molar PBS ile iyice yıkayın, aksi belirtilmedikçe tüm yıkamaları ve inkübasyonları oda sıcaklığında hafif çalkalama ile gerçekleştirin. Bir davlumbaz altında, endojen peroksidaz aktivitesini söndürmek için bölümleri 0.1 molar PBS'de% 40 metanol,% 1 hidrojen peroksit içinde 20 dakika inkübe edin.

0.1 molar PBS'de üç yıkamadan sonra, bölümler inkübe edilirken beş dakika boyunca 500 mikrolitre% 0.2 Triton X 100 içinde inkübe ederek bölümlere nüfuz edin, tüm deney için yeterli bloke edici tampon hazırlayın. Daha sonra geçirgen çözeltiyi çıkarın ve her birine 100 mikrolitre bloke edici tampon ekleyin. Bölümleri bir saat boyunca inkübe edin.

Daha sonra, bloke edici tamponu çıkarın ve bölümleri fosforile hücre dışı düzenlenmiş kinaz ile kaplayın. Birincil antikor, bloke edici tamponda bir ila 500 oranında seyreltilir. Bölümleri beş dakika boyunca 0.1 molar PBS'de üç kez yıkadıktan sonra ertesi gün hafif çalkalama ile dört santigrat derecede gece boyunca inkübe edin.

Her biri, inkübasyon sırasında oda sıcaklığında bir saat boyunca bloke edici tamponda bir ila 250 oranında seyreltilmiş bir biyotin konjuge ikincil antikor ile bölümleri inkübe eder. Aden ve biotin kompleksinin oluşması için yeterli zaman tanımak için A BC reaktifini kullanmadan en az 30 dakika önce hazırlayın. Bölümleri 0.1 molar PBS ile üç kez daha yıkadıktan sonra A, b, C reaktifini ekleyin ve numune ile 45 dakika inkübe edilmesine izin verin.

PBS'deki bir sonraki üç yıkama seti sırasında, davlumbazdaki DAB çalışma solüsyonunu üreticinin spesifikasyonlarına göre hazırlayın, plakadaki DAB çalışma solüsyonunu ayırın. Daha sonra bölümleri DAB çalışma solüsyonunu içeren kuyucuklara aktarın ve bölümlerin solüsyona maksimum maruz kalmasını sağlamak için plakayı yavaşça döndürün. Yeterli sinyal gelişene kadar DAB reaksiyonunu mikroskopta izleyin.

Yaklaşık iki ila beş dakika içinde, dokuyu 0.1 molar PBS'de yıkayarak reaksiyonu istenen renk yoğunluğunda durdurun. PBS'de üç yıkamadan sonra, bölümleri jelatin kaplı slaytlara monte edin ve oda sıcaklığında en az üç ila dört saat kurutun. Hava kuruduktan sonra, çeker ocakta slaytları aktarın ve bölümleri, her biri iki dakika boyunca entegre etanol çözeltilerini sırayla yerleştirerek kurutun, ardından slaytları beş dakika boyunca %100 ksilen içinde temizleyin.

Slaytları örtün, montaj ortamını kullanarak kaydırın ve kuruması için gece boyunca çeker ocakta bırakın, slaytları bir kamera ve 20 x objektif lens ile donatılmış parlak bir alan mikroskobuna aktarın. Dorsal hipokampus görüntüsünü kaplayan 200 x büyütmede her bölümden birden fazla parlak alan görüntüsü elde edin. Her hayvandan üç ila beş bölüm.

Burada, vahşi tip bir farenin dorsal su aygırı kampi bölgelerinden bölümler ve fosforile için boyanmış bir Grailed iki nakavt faresi gösterilmektedir. Hücre dışı, öğrenmeye bağlı nöronal aktivasyonun güvenilir bir moleküler okumasını düzenledi. Bu farelerin her ikisi de kurban edilmeden önce klasik bir hipokampal bağımlı uzamsal öğrenme görev rejimi olan Morris su labirentine tabi tutulmuştu.

Testin son gününde, Grailed iki nakavt faresi, vahşi tip farelere kıyasla önemli bir uzamsal öğrenme eksikliği gösterdi. Farelerden alınan beyin dilimlerini analiz etmek için, hipokampusun çeşitli bölgeleri boyunca toplam pozitif hücre sayısı sayıldı. CA üç parametre katmanında, yabani tip fareler, nakavt farelere göre alan başına önemli ölçüde daha fazla fosforile RK pozitif hücreye sahipti.

Hili ve granül hücre tabakasında veya GCL'de zıt sonuçlar bulundu. Bu videoyu izledikten sonra, bilişsel eksikliklerle karakterize nörogelişimsel bozuklukların hem genetik hem de farmakolojik fare modellerinin hipokampusundan beyin dilimleri üzerinde fos formülasyonunun nasıl araştırılacağını iyi anlamış olmalısınız. Bu teknik aynı zamanda beynin diğer bölgelerindeki irk kuvveti formülasyon değişikliklerini incelemek ve Maurice Water labirentinden farklı bilişsel davranışsal görevleri takip etmek için de kullanılabilir.

DIA benzin ile çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini ve bu prosedürü gerçekleştirirken her zaman uygun korumaların alınması gibi önlemlerin alınması gerektiğini unutmayın.