Optogenetically Hedeflenen Önbeyin Devreler Lazer tarama photostimulation
27 Aralık 2013
Nöronal popülasyonları in vitro olarak fotostimül etmek için optogenetik bir yaklaşım kullanarak ön beyin devrelerinin fonksiyonel topografyasını ve sinaptik özelliklerini karakterize etmek için bir yöntem açıklıyoruz.
Bu prosedürün genel amacı, in vitro dilim preparatlarında hedeflenen nöronal yolakları foto-stimülasyon yapmak için modern optogenetik teknikleri uygulamaktır. Bu, ilk olarak ilgilenilen nöronal hücre hatlarında kanal çubuğu Dossin'in eksprese edilmesiyle gerçekleştirilir. İşlemin ikinci basamağı ise çalışılacak ilgili beyin yapılarının akut kesit preparatlarının yapılmasıdır.
Bir sonraki adım, kanalın foto stimülasyonuna yanıt olarak dilim hazırlığındaki nöronlardan gelen yanıtları kaydetmek, çubuk Dossin'i lifleri ifade etmektir. Son adım, nöronları ve lifleri ifade eden kanal opsininin dağılımını görüntülemektir. Sonuç olarak, bu yaklaşım, optogenetik olarak hedeflenmiş nöral bileşenlerin lazer taramalı foto stimülasyonunu kullanarak nöral devrelerin fonksiyonel topografyasının ve sinaptik özelliklerinin değerlendirilmesini sağlar.
Bu tekniğin geleneksel elektriksel stimülasyon yöntemlerine göre temel avantajları, belirli nöronal hücre tiplerini spesifik olarak hedefleme ve uyarma ve uzun vadeli projeksiyonlarını in vitro olarak inceleme yeteneğidir. Bu yöntem, karmaşık savaş soketlerinin işlevsel organizasyonu gibi sistem sinirbilimi alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Transfeksiyonu arttırmak için mililitre poli başına dört mikrogram içeren viral çözeltiyi enjekte etmek için bir şırınga ve iğne hazırlayın.
Daha sonra şırınga pompasını kullanarak 200 nanolitre çözelti enjekte edin, iki ila üç hafta sonra, kanal çubuğu Dossin diliminin yeterli ifadesi olacaktır. Hazırlık mümkün olduğunca çabuk yapılmalıdır Enjekte edilen beyni çıkardıktan sonra, temiz bir tıraş bıçağı kullanarak beynin istenen yönde bir bloğunu yapın. Daha sonra, beynin tıkalı yüzeyini anında yapışkan yapıştırıcı kullanarak kesme aşamasına yapıştırın.
Ardından sahneyi dondurucuda soğutulmuş vibram kesme haznesine aktarın ve buz gibi soğuk A CSF'yi kesme haznesine dökün. Beyin bölümlerini bir viome kullanarak dört ila 500 mikron kalınlığında bölümler halinde dilimleyin. Beyin dilimlerini oksijenli bir tutma odasına aktarın ve deneye devam etmeden önce en az bir saat boyunca 30 santigrat derecede inkübe etmelerine izin verin.
Deneye başlamaya hazır olduğunuzda, beyin dilimini elektrofizyolojik kayıt teçhizatının aşamasına aktarın. Standart tam hücre yama kelepçesi tekniklerini kullanarak bir nöron kaydedin. Pipete pozitif basınç uygularken kayıt pipetini nöronun yanına kısa bir süre yerleştirin.
Hücre ile temas sağlandıktan sonra, basıncı serbest bırakın ve giga contayı oluşturmak için emme uygulayın. Ardından, tüm hücre konfigürasyonu için zarı kırmak için kısa bir emme uygulayın ve voltaj veya akım kelepçesi modlarında kayıt alın. Lazer tarayıcıyı gelgit dalgası veya EFA veri toplama yazılımı ile çalıştırın.
Lazerin gücünü kontrol etmek için kullanmadan önce yazılımın foto diyota kalibre edilmesi gerekir. Yoluna değişken bir nötr yoğunluk çarkı yerleştirilir. Tekerleği döndürmek, arka odak düzleminde ölçüm yaparak lazerin gücünü ayarlar.
Güç tipik olarak 25 ile D miliwatt arasında ayarlanır. Deklanşörün darbe parametresi, yazılımdaki stimülasyonun uzunluğunu ve zamanlamasını kontrol eder. Uyarılacak bölgenin bir görüntüsü, video yakalama işlevinden yapılabilir.
Ardından, 80 mikron aralıklı 16'ya 16 ızgara gibi stimülasyon ızgarasını ayarlayın. Ardından, ızgarayı elde edilen görüntünün üzerine yerleştirin ve stimülasyonu başlatmak için yönlendirmeyi optimize etmek için XY koordinatlarını ve ofset derecesini ayarlayın. Harita işlevini etkinleştirin.
Veriler saklanır ve gelgit dalgasında çevrimdışı analiz programı kullanılarak analiz edilebilir veya EFA yazılımındaki harita analiz programı kullanılarak analiz edilebilir. Dilim üzerindeki fizyolojik kayıtlar tamamlandıktan sonra, YFP etiketli kanal opsininin ifade modeli belgelenebilir. İlk olarak, dilimi gece boyunca dört santigrat derecede 0.01 molar PBS'de% 4 PFA'da sabitleyin.
Ertesi gün, gece boyunca kriyo koruması için dilimi %30 sükroz %4 PFA çözeltisine aktarın. Ertesi gün, dilimin 50 mikronluk kesitlerini bir kriyostat üzerinde kesin. Dilimleri PBS'de durulayın ve konfokal mikroskopta solma önleyici bir ortamla görüntülemek için monte edin.
Beyaz ışıkta ilgilenilen bölgeyi bulduktan sonra, 514 nanometre uyarıcı dalga boyu ve 527 nanometre emisyon dalga boyu kullanın. Kanal çubuğu Dobson, EYFP'nin ekspresyonunu yönlendiren YFPA viral yapısını görüntülemek için. Uyarıcı glutamaterjik nöronlar, bir BSY faresinin birincil görsel korteksine enjekte edildi.
Viral ekspresyon, birincil ve ikincil görsel korteksler arasındaki izlerde bulundu ve LGN tam hücre yamasının kortiko talamik liflerinde, yıldızla işaretlenmiş ikincil görsel korteksteki bir nörondan yapılan kayıt e PSC'leri ortaya çıkardı. Kanalın lazer taramalı foto stimülasyonunu takiben, V'nin alt katmanlarında lifleri eksprese eden çubuk Dossin, primer somatosensoriyel korteksin altıncı katmanından iki kortiko talamik projeksiyon. Ventral posterior çekirdek, altıncı tabaka kortiko talamik nöronlarda kanal çubuğu dozunu eksprese etmek için bir CRE LAX yaklaşımı kullanılarak incelendi ve projeksiyonlarında, bir CRE transgenik fareye floklu bir a a V yapısı tarafından transfeksiyon, hedeflenen altıncı tabaka nöronlarında kanal çubuğu dozin ekspresyonu ile sonuçlandı ve lifleri dördüncü tabakaya uzandı.
Kanal çubuğu Dobson, EYFP ekspresyonu, bir VP nöronundan VP fizyolojik kayıtlarını yansıtan liflerde de kaydedildi. Tüm hücre yaması klempinin kullanılması, yıldız tarafından işaretlenen kaydedilen nöronun yakınındaki foto stimülasyonu takiben e PSC'lerin ortaya çıkabileceğini ortaya çıkardı. Çevrimdışı analiz, VP'de foto stimülasyona ortalama yanıt genliğini gösterir, kanal Rodin'i eksprese eden altıncı katman kortiko talamik nöronların 50 mikronluk dilimleri rezeksiyonlu EYFP, altıncı katmandan dördüncü katmana geçen, sonlandırıldıkları ve yoğun bir şekilde çardak oluşturdukları etiketli liflerin ince bir modelini ortaya çıkardı.
Ek olarak, kortiko talamik liflerin beyaz cevhere girdiği ve talamusa doğru geçtiği gözlendi. Bu videoyu izledikten sonra, in vitro dilim preparatlarında hedeflenen nöronal yolakları foto-stimülasyon yapmak için modern optogenetik tekniklerin nasıl uygulanacağını iyi anlamış olmalısınız. Unutmayın, bu prosedürle ilişkili kalibrasyon adımlarını gerçekleştirirken lazerlerle çalışmak son derece tehlikeli olabilir.
Koruyucu gözlük takın.
Genel Bakış
Bu makale, in vitro nöronal popülasyonları fotostimüle etmek için optogenetik kullanarak ön beyin devrelerini karakterize etmek için bir yöntem sunmaktadır. Teknik, nöral devrelerin fonksiyonel topografyası ve sinaptik özelliklerinin değerlendirilmesine olanak tanır.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Bilim Alanı
- Nörobilim
- Optogenetik
- Elektrofizyoloji
Arka Plan
- Optogenetik, nöronal aktivitenin kesin kontrolünü sağlar.
- In vitro dilim preparasyonları beyin devrelerini incelemek için kullanılır.
- Kanalrodopsin, fotostimülasyon için önemli bir araçtır.
- Bu yöntem, nöral devrelerin organizasyonu hakkında bilgiler sağlar.
Çalışmanın Amacı
- Hedeflenen nöronal stimülasyon için optogenetik teknikleri uygulamak.
- Spesifik nöronal yolakların sinaptik özelliklerini araştırmak.
- Beyindeki fonksiyonel organizasyon hakkındaki anlayışı geliştirmek.
Kullanılan Yöntemler
- Nöronal hücre hatlarında kanalrodopsin ekspresyonu.
- Deney için akut beyin dilimlerinin hazırlanması.
- Tam hücre patch clamp teknikleri kullanılarak elektrofizyolojik kayıtlar.
- Spesifik nöronal popülasyonları aktive etmek için lazer taramalı fotostimülasyon.
Ana Sonuçlar
- Kanalrodopsin eksprese eden liflerin başarılı bir şekilde fotostimülasyonu.
- Hedeflenen nöronlarda belgelenen sinaptik tepkiler.
- Nöronal yolakların ve projeksiyonlarının görselleştirilmesi.
- Ön beyin devrelerinin fonksiyonel bağlantısı hakkında bilgiler.
Sonuçlar
- Yöntem, nöral devreleri incelemek için güçlü bir araç sağlar.
- Optogenetik, spesifik nöronal tiplerin hedeflenmesine ve stimülasyonuna olanak tanır.
- Bu yaklaşım, sistem nörobilimindeki kritik sorulara cevap verebilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
Laser-scanning photostimulation of optogenetically targeted forebrain circuits enables precise interrogation of neuronal connectivity and synaptic function in complex brain regions. This approach enhances predictive confidence in early discovery by allowing targeted hypothesis testing of circuit-level mechanisms. The method supports portfolio decisions by clarifying functional organization and de-risking biological targets in neuropsychiatric and neurodegenerative research.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables targeted interrogation of neuronal pathways to clarify circuit-level mechanisms.
- Supports functional target validation by isolating specific cell types and projections.
- Facilitates predictive confidence in mechanistic hypotheses for CNS disorders.
- Provides data to triage targets based on synaptic and connectivity profiles.
Screening & Assay Development
- Prepares validated brain slice systems for downstream electrophysiological assays.
- Standardizes stimulation and recording conditions for reproducible quantitative outputs.
- Enables scalable mapping of synaptic responses across defined neuronal populations.
- Supports reliable evaluation of compound effects on circuit function.
Translational & Preclinical Research
- Aligns functional circuit mapping with disease-relevant brain regions and pathways.
- Provides continuity from discovery through preclinical validation of neural targets.
- De-risks translational advancement by linking synaptic properties to in vivo function.
- Supports biomarker development through quantifiable electrophysiological readouts.
Pipeline & Workflow Integration
This method integrates into the discovery-to-preclinical continuum by enabling hypothesis-driven mapping of neuronal circuits, supporting both target validation and assay development for CNS portfolios.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by enabling selective stimulation and recording from defined neuronal populations.
- Screening: Provides reproducible, quantitative electrophysiological outputs for compound screening in validated slice systems.
- Analytics: Delivers quantitative measurements of synaptic responses and connectivity for comparative analysis.
- Translational Research: Links in vitro circuit function to disease-relevant models and potential biomarkers.
- Enterprise Reuse: Offers a reusable platform for mapping diverse brain circuits and evaluating multiple targets.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in CNS target validation.
- Operational Value: Standardizes optogenetic stimulation and electrophysiological recording for reproducibility and scalability.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions and capital efficiency by clarifying circuit-level mechanisms early.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of CNS targets and pathways for advancement.
Implementation Considerations
- Requires expertise in optogenetics, viral transfection, and electrophysiology.
- Needs specialized instrumentation for laser-scanning, patch clamp, and confocal imaging.
- Demands cross-team standardization of stimulation and analysis protocols.
- Adaptation may be needed for different brain regions or transgenic models.
- Safety protocols for laser use and viral handling are essential.
