Optogenetically Hedeflenen Önbeyin Devreler Lazer tarama photostimulation

Bu prosedürün genel amacı, in vitro dilim preparatlarında hedeflenen nöronal yolakları foto-stimülasyon yapmak için modern optogenetik teknikleri uygulamaktır. Bu, ilk olarak ilgilenilen nöronal hücre hatlarında kanal çubuğu Dossin'in eksprese edilmesiyle gerçekleştirilir. İşlemin ikinci basamağı ise çalışılacak ilgili beyin yapılarının akut kesit preparatlarının yapılmasıdır.

Bir sonraki adım, kanalın foto stimülasyonuna yanıt olarak dilim hazırlığındaki nöronlardan gelen yanıtları kaydetmek, çubuk Dossin'i lifleri ifade etmektir. Son adım, nöronları ve lifleri ifade eden kanal opsininin dağılımını görüntülemektir. Sonuç olarak, bu yaklaşım, optogenetik olarak hedeflenmiş nöral bileşenlerin lazer taramalı foto stimülasyonunu kullanarak nöral devrelerin fonksiyonel topografyasının ve sinaptik özelliklerinin değerlendirilmesini sağlar.

Bu tekniğin geleneksel elektriksel stimülasyon yöntemlerine göre temel avantajları, belirli nöronal hücre tiplerini spesifik olarak hedefleme ve uyarma ve uzun vadeli projeksiyonlarını in vitro olarak inceleme yeteneğidir. Bu yöntem, karmaşık savaş soketlerinin işlevsel organizasyonu gibi sistem sinirbilimi alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Transfeksiyonu arttırmak için mililitre poli başına dört mikrogram içeren viral çözeltiyi enjekte etmek için bir şırınga ve iğne hazırlayın.

Daha sonra şırınga pompasını kullanarak 200 nanolitre çözelti enjekte edin, iki ila üç hafta sonra, kanal çubuğu Dossin diliminin yeterli ifadesi olacaktır. Hazırlık mümkün olduğunca çabuk yapılmalıdır Enjekte edilen beyni çıkardıktan sonra, temiz bir tıraş bıçağı kullanarak beynin istenen yönde bir bloğunu yapın. Daha sonra, beynin tıkalı yüzeyini anında yapışkan yapıştırıcı kullanarak kesme aşamasına yapıştırın.

Ardından sahneyi dondurucuda soğutulmuş vibram kesme haznesine aktarın ve buz gibi soğuk A CSF'yi kesme haznesine dökün. Beyin bölümlerini bir viome kullanarak dört ila 500 mikron kalınlığında bölümler halinde dilimleyin. Beyin dilimlerini oksijenli bir tutma odasına aktarın ve deneye devam etmeden önce en az bir saat boyunca 30 santigrat derecede inkübe etmelerine izin verin.

Deneye başlamaya hazır olduğunuzda, beyin dilimini elektrofizyolojik kayıt teçhizatının aşamasına aktarın. Standart tam hücre yama kelepçesi tekniklerini kullanarak bir nöron kaydedin. Pipete pozitif basınç uygularken kayıt pipetini nöronun yanına kısa bir süre yerleştirin.

Hücre ile temas sağlandıktan sonra, basıncı serbest bırakın ve giga contayı oluşturmak için emme uygulayın. Ardından, tüm hücre konfigürasyonu için zarı kırmak için kısa bir emme uygulayın ve voltaj veya akım kelepçesi modlarında kayıt alın. Lazer tarayıcıyı gelgit dalgası veya EFA veri toplama yazılımı ile çalıştırın.

Lazerin gücünü kontrol etmek için kullanmadan önce yazılımın foto diyota kalibre edilmesi gerekir. Yoluna değişken bir nötr yoğunluk çarkı yerleştirilir. Tekerleği döndürmek, arka odak düzleminde ölçüm yaparak lazerin gücünü ayarlar.

Güç tipik olarak 25 ile D miliwatt arasında ayarlanır. Deklanşörün darbe parametresi, yazılımdaki stimülasyonun uzunluğunu ve zamanlamasını kontrol eder. Uyarılacak bölgenin bir görüntüsü, video yakalama işlevinden yapılabilir.

Ardından, 80 mikron aralıklı 16'ya 16 ızgara gibi stimülasyon ızgarasını ayarlayın. Ardından, ızgarayı elde edilen görüntünün üzerine yerleştirin ve stimülasyonu başlatmak için yönlendirmeyi optimize etmek için XY koordinatlarını ve ofset derecesini ayarlayın. Harita işlevini etkinleştirin.

Veriler saklanır ve gelgit dalgasında çevrimdışı analiz programı kullanılarak analiz edilebilir veya EFA yazılımındaki harita analiz programı kullanılarak analiz edilebilir. Dilim üzerindeki fizyolojik kayıtlar tamamlandıktan sonra, YFP etiketli kanal opsininin ifade modeli belgelenebilir. İlk olarak, dilimi gece boyunca dört santigrat derecede 0.01 molar PBS'de% 4 PFA'da sabitleyin.

Ertesi gün, gece boyunca kriyo koruması için dilimi %30 sükroz %4 PFA çözeltisine aktarın. Ertesi gün, dilimin 50 mikronluk kesitlerini bir kriyostat üzerinde kesin. Dilimleri PBS'de durulayın ve konfokal mikroskopta solma önleyici bir ortamla görüntülemek için monte edin.

Beyaz ışıkta ilgilenilen bölgeyi bulduktan sonra, 514 nanometre uyarıcı dalga boyu ve 527 nanometre emisyon dalga boyu kullanın. Kanal çubuğu Dobson, EYFP'nin ekspresyonunu yönlendiren YFPA viral yapısını görüntülemek için. Uyarıcı glutamaterjik nöronlar, bir BSY faresinin birincil görsel korteksine enjekte edildi.

Viral ekspresyon, birincil ve ikincil görsel korteksler arasındaki izlerde bulundu ve LGN tam hücre yamasının kortiko talamik liflerinde, yıldızla işaretlenmiş ikincil görsel korteksteki bir nörondan yapılan kayıt e PSC'leri ortaya çıkardı. Kanalın lazer taramalı foto stimülasyonunu takiben, V'nin alt katmanlarında lifleri eksprese eden çubuk Dossin, primer somatosensoriyel korteksin altıncı katmanından iki kortiko talamik projeksiyon. Ventral posterior çekirdek, altıncı tabaka kortiko talamik nöronlarda kanal çubuğu dozunu eksprese etmek için bir CRE LAX yaklaşımı kullanılarak incelendi ve projeksiyonlarında, bir CRE transgenik fareye floklu bir a a V yapısı tarafından transfeksiyon, hedeflenen altıncı tabaka nöronlarında kanal çubuğu dozin ekspresyonu ile sonuçlandı ve lifleri dördüncü tabakaya uzandı.

Kanal çubuğu Dobson, EYFP ekspresyonu, bir VP nöronundan VP fizyolojik kayıtlarını yansıtan liflerde de kaydedildi. Tüm hücre yaması klempinin kullanılması, yıldız tarafından işaretlenen kaydedilen nöronun yakınındaki foto stimülasyonu takiben e PSC'lerin ortaya çıkabileceğini ortaya çıkardı. Çevrimdışı analiz, VP'de foto stimülasyona ortalama yanıt genliğini gösterir, kanal Rodin'i eksprese eden altıncı katman kortiko talamik nöronların 50 mikronluk dilimleri rezeksiyonlu EYFP, altıncı katmandan dördüncü katmana geçen, sonlandırıldıkları ve yoğun bir şekilde çardak oluşturdukları etiketli liflerin ince bir modelini ortaya çıkardı.

Ek olarak, kortiko talamik liflerin beyaz cevhere girdiği ve talamusa doğru geçtiği gözlendi. Bu videoyu izledikten sonra, in vitro dilim preparatlarında hedeflenen nöronal yolakları foto-stimülasyon yapmak için modern optogenetik tekniklerin nasıl uygulanacağını iyi anlamış olmalısınız. Unutmayın, bu prosedürle ilişkili kalibrasyon adımlarını gerçekleştirirken lazerlerle çalışmak son derece tehlikeli olabilir.

Koruyucu gözlük takın.