Optogenetically Hedeflenen Önbeyin Devreler Lazer tarama photostimulation

Bu prosedürün genel amacı, in vitro kesit preparasyonlarında hedeflenen nöronal yolları fotostimüle etmek için modern optogenetik teknikleri uygulamaktır. Bu işlem, öncelikle ilgili nöronal hücre hatlarında channel rhodopsin eksprese edilerek gerçekleştirilir. Prosedürün ikinci adımı, incelenecek ilgili beyin yapılarının akut kesit preparasyonlarının hazırlanmasıdır.

Bir sonraki adım, kanal rodopsin eksprese eden liflerin fotostimülasyonuna yanıt olarak, kesit preparasyonundaki nöronlardan gelen yanıtların kaydedilmesidir. Son adım, kanal opsin eksprese eden nöronların ve liflerin dağılımının görüntülenmesidir. Nihayetinde bu yaklaşım, optogenetik olarak hedeflenmiş nöral bileşenlerin lazer taramalı fotostimülasyonu kullanılarak, nöral devrelerin fonksiyonel topografyasının ve sinaptik özelliklerinin değerlendirilmesine olanak tanır.

Bu tekniğin geleneksel elektriksel stimülasyon yöntemlerine göre temel avantajları, belirli nöronal hücre tiplerini spesifik olarak hedefleyip stimüle edebilme ve bunların uzun menzilli projeksiyonlarını in vitro inceleyebilme yeteneğidir. Bu yöntem, kompleks savaş soketlerinin fonksiyonel organizasyonu gibi sistemler nörobilimi alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Transfeksiyonu artırmak için mililitre başına dört mikrogram poly içeren viral çözeltiyi enjekte etmek üzere bir şırınga ve iğne hazırlayın.

Ardından, şırınga pompası kullanarak çözeltinin 200 nanolitresini basınçla enjekte edin; iki ila üç hafta sonra, kanal çubuğu Dossin diliminde yeterli ekspresyon gerçekleşecektir. Hazırlık işlemi mümkün olan en kısa sürede gerçekleştirilmelidir. Enjekte edilen beyin çıkarıldıktan sonra, temiz bir jilet kullanarak beyni istenen yönde bloklayın. Daha sonra, beynin bloklanan yüzeyini hızlı yapıştırıcı kullanarak kesme tablasına sabitleyin.

Ardından platformu, dondurucuda soğutulmuş bir vibram kesme haznesine aktarın ve kesme haznesine buz gibi soğuk A CSF dökün. Bir viome kullanarak beyin kesitlerini 4 ile 500 mikron kalınlığında bölümlere ayırın. Beyin kesitlerini oksijenlendirilmiş bir tutma haznesine aktarın ve deneye devam etmeden önce en az bir saat boyunca 30 °C'de inkübe edilmelerini sağlayın.

Deneye başlamaya hazır olduğunuzda, beyin kesitini elektrofizyolojik kayıt düzeneğinin tablasına aktarın. Standart tüm hücre yama kenetleme (whole cell patch clamp) tekniklerini kullanarak bir nöronu kaydedin. Pipete pozitif basınç uygularken, kayıt pipetini kısaca nöronun yanına konumlandırın.

Hücre ile temas sağlandıktan sonra, basıncı serbest bırakın ve giga sızdırmazlık (giga seal) oluşturmak için vakum uygulayın. Ardından, bütün hücre konfigürasyonu için membranı kırmak amacıyla kısa süreli vakum uygulayın ve voltaj veya akım klemp modlarında kayıtlar alın. Lazer tarayıcıyı tidal wave veya EFAs veri toplama yazılımlarından biriyle çalıştırın.

Lazerin gücünü kontrol etmek için yazılım, kullanımdan önce fotodiyota kalibre edilmelidir. Lazer yoluna değişken bir nötr yoğunluk filtresi tekerleği yerleştirilir. Tekerleğin döndürülmesi, arka odak düzleminde ölçüm yaparak lazerin gücünü ayarlar.

Güç genellikle 25 ile D milliwatt arasında ayarlanır. Deklanşörün darbe parametresi, yazılımdaki stimülasyonun uzunluğunu ve zamanlamasını kontrol eder. Stimüle edilecek bölgenin görüntüsü, video yakalama fonksiyonu ile oluşturulabilir.

Ardından, 80 mikron aralıklı 16'ya 16'lık bir ızgara olacak şekilde stimülasyon ızgarasını ayarlayın. Daha sonra ızgarayı elde edilen görüntünün üzerine yerleştirin ve stimülasyona başlamak için yönlendirmeyi optimize etmek amacıyla XY koordinatlarını ve ofset derecesini ayarlayın. Harita fonksiyonunu etkinleştirin.

Veriler saklanır ve tidal wave'deki çevrimdışı analiz programı kullanılarak veya EFAs yazılımındaki harita analiz programı kullanılarak analiz edilebilir. Dilim üzerindeki fizyolojik kayıtlar tamamlandıktan sonra, YFP etiketli kanal opsinin ekspresyon paterni belgelenebilir. İlk olarak, dilimi dört santigrat derecede, 0.01 molar PBS içindeki %4 PFA ile gece boyunca fikse edin.

Ertesi gün, kesiti gece boyunca kriyokoruma için %30 sükroz %4 PFA çözeltisine aktarın. Takip eden günde, kriyostat üzerinde kesitten 50 mikron kalınlığında bölümler kesin. Kesitleri PBS ile durulayın ve konfokal mikroskopta görüntüleme için anti-fade ortamı ile monte edin.

Beyaz ışık altında ilgi alanı belirlendikten sonra, 514 nanometre eksitasyon dalga boyu ve 527 nanometre emisyon dalga boyu kullanın. Eksitatör glutamaterjik nöronlarda channel rod Dobson ekspresyonunu sağlayan YFPA viral konstrüktunun görüntülenmesi için, EYFP bir BSY faresinin primer görsel korteksine enjekte edilmiştir.

Viral ekspresyon, primer ve sekonder görsel korteksler arasındaki yollarda ve LGN'nin kortiko-talamik liflerinde saptandı; yıldızla işaretlenmiş sekonder görsel korteksteki bir nörondan yapılan tüm hücre yama kenetleme (whole cell patch clamp) kaydı, ePSC'leri ortaya çıkardı. Kanal rodopsin eksprese eden liflerin lazer taramalı foto-stimülasyonunu takiben, V2'nin alt katmanlarında, primer somatosensoriyel korteksin altıncı katmanından gelen kortiko-talamik projeksiyonlar gözlendi. Ventral posterior çekirdek, altıncı katman kortiko-talamik nöronlarında ve projeksiyonlarında kanal rodopsin eksprese etmek için bir CRE-Lox yaklaşımı kullanılarak incelendi; beklendiği üzere, bir CRE transgenik fareye flokslanmış bir AAV konstrüktünün transfeksiyonu, hedeflenen altıncı katman nöronlarında ve bunların dördüncü katmana uzanan liflerinde kanal rodopsin ekspresyonu ile sonuçlandı.

Channelrhodopsin-EYFP ekspresyonu, VP'ye projeksiyon yapan fiberlerde de gözlemlenmiş olup, bir VP nöronundan fizyolojik kayıtlar alınmıştır. Tüm hücre yama kenetleme (whole cell patch clamp) yöntemi kullanıldığında, yıldızla işaretlenen kayıt altındaki nöronun yakınında foto-stimülasyon sonrası ePSC'lerin tetiklenebildiği ortaya çıkmıştır. Çevrimdışı analiz, VP'deki foto-stimülasyona verilen ortalama yanıt genliğini betimlemektedir. Channelrhodopsin-EYFP eksprese eden tabaka altı kortikotalamik nöronların 50 mikronluk yeniden kesilmiş dilimlerinde, tabaka altıdan tabaka dörde uzanan, burada sonlanan ve geniş bir şekilde dallanan ince bir işaretli fiber paterni görülmüştür.

Ek olarak, kortikotalamik liflerin beyaz maddeye girdiği ve talamusa doğru ilerlediği gözlemlenmiştir. Bu videoyu izledikten sonra, in vitro dilim preparasyonlarında hedeflenen nöronal yolakları fotostimüle etmek için modern optogenetik tekniklerin nasıl uygulanacağı konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız. Unutmayın, bu prosedürle ilişkili kalibrasyon adımlarını gerçekleştirirken lazerlerle çalışmak son derece tehlikeli olabilir.

Koruyucu gözlük kullanın.