Lazer Tarama Photostimulation tarafından inhibitör nöronal devreler Haritalama

Bu prosedürün genel amacı, inhibitör nöronal devrelerin lokal fonksiyonel organizasyonunu araştırmaktır. Prosedür, farelerin birincil somatosensoriyel korteksinden canlı beyin dilimlerinin hazırlanmasıyla başlar. Bir sonraki adım, beyin dilimindeki inhibitör hücre tiplerini ifade eden hedeflenen GFP'den görselleştirmek ve kaydetmektir.

Glutamat yoluyla bu lazer taramalı foto stimülasyonun ardından, uyarıcı veya inhibitör olarak küçük pre-sinaptik nöron kümelerini aktive etmek için açılması kullanılır. Post-sinaptik akımlar, inter nöronları eksprese eden GFP'de kaydedilir. Son adım, foto stimülasyon, veri analizinden geçmek ve kaydedilen nöronlara sinaptik girdinin nicel haritalarını oluşturmaktır.

Sonuç olarak, tüm hücre kayıtları ile birleştirilen lazer taramalı foto stimülasyon, yerel inhibitör kortikal devrelerin organizasyonunu ve işlevini belirlemeye izin verebilecek belirli inhibitör nöron tiplerine sinaptik girdilerin ayrıntılı haritalarının oluşturulmasını sağlar. Foto stimülasyona dayalı tekniğe Dr.Larry Katz, Ned Calloway öncülük etti ve daha sonra Dr.Carols Waboda tarafından geliştirildi, benim pi'm, Dr.Xing Z, Salk Enstitüsü Dr.Dr.Calloway ile eğitim aldı ve burada interoral devreleri araştıran birçok çalışmaya öncülük etti. Grubumuz şu anda bu çalışmaları genişletmekte ve devam ettirmekte, interoral devreleri araştırmaktadır.

Bu işleme başlamak için, doğum sonrası iki ila üç hafta içinde dekapitasyon ile transgenik bir fareyi feda edin ve beyni hızlı bir şekilde çıkarın, beyni donmuş ve oksijenli bir kesme çözeltisine yerleştirin. Ardından beyni görsel olarak taramak ve GFP ifadesini kontrol etmek için GFP gözlüklerini kullanın. Daha sonra, birincil somatosensoriyel korteksi bir vibratör ile 400 mikrometre kalınlığında bölümlere ayırın.

%95 O2 ve %5 CO2 ile köpürtülmüş A BOS içeren sakarozdaki dilimleri 32 santigrat derecede 30 dakika ila bir saat boyunca inkübe edin. Bundan sonra, lazeri deneye hazır hale getirmek için dilimleri oda sıcaklığında normal A BOS'a aktarın, lazer soğutma sistemini ve güç kaynağını açın. Ardından, tarama ayna sistemi ve optik modülatör ve elektronik deklanşör ve bir fotodiyot giriş amplifikatörü dahil olmak üzere fotoğraf stimülasyon kontrolü ile ilgili tüm donanımı açın.

Daha sonra çoklu kelepçe 700 B amplifikatör ve mikro manipülatörler gibi elektrofizyolojik ekipmanı açın. Mikroskobun motorlu tablası üzerine monte edilen dilim perfüzyon odasında elektrofizyolojik kayıtlar, fotostimülasyon ve görüntüleme yapılmaktadır. Bundan sonra, görüntüleme kamerasını açın, dilim, görüntüleme sistemi aracılığıyla kızılötesi DIC ve epi floresan optiklerle dik mikroskopta görüntülenecektir.

Ardından monitörde MATLAB tabanlı FS yazılımını ve Q capture kamera yazılımını açın. Deneyi çalıştırmadan önce lazer foto stimülasyon sistemini kontrol edin ve çalışır durumda olduğundan emin olun. Sistem çalışırken lazer tarama modelini gözlemlemek için dört x mikroskop objektifinin altına bir parça kağıt yerleştirin.

Mikro elektrodu dört ila altı mega OM direncine sahip yapmak için, pipet çekicisi ile bir cam elektrot çekin. Daha sonra elektrodu, hücre etiketleme ve morfolojik tanımlama için% 0.1 biyotin içeren dahili bir çözelti ile doldurun. Ardından, A CSF'yi odaya pompalamak için basınçlı perfüzyon sistemini açın.

Haznedeki dilimin 2,0 milimetre üzerinde sabit bir sıvı seviyesi olduğundan emin olun. MNI kafesli glutamat stok çözeltisinin bir alikotu, 0.2 milimolar kafesli glutamat konsantrasyonu için 25 mililitre dolaşımdaki A BOS'a eklenir. Ardından bir beyin dilimini kayıt odasına aktarın.

Dilim kalitesini kontrol etmek ve birincil somatosensoriyel alanı anatomik olarak bulmak için görüntüleme sistemini çalıştırın. Ardından, dilimi özel yapım telli bir platin halka ile sabitleyin ve ankrajı kayıt için tasarlanan beyin bölgesinin üzerine koymamaya dikkat edin. Hücreleri, bir DIC floresan mikroskobu altında GFP ekspresyonunun görselleştirilmesine dayalı olarak 60 x objektifle görselleştirin.

İnhibitör hücre tiplerini tanımlayın ve seçin. Kaydın kızılötesi DIC destekli görsel kontrol altında gerçekleştirileceğini lütfen unutmayın. Elektrodu hedef hücreye indirirken GFP hücre konumunu doğrulamak için video izleme ve DIC ile floresan modları arasında geçiş yapmak gereklidir.

Geleneksel yama sıkıştırma tekniğini kullanarak. İlk olarak, elektroda pozitif basınç uygulayın. Hedeflenen hücre zarı üzerinde fark edilebilir bir çukur oluşturmak için hücre yüzeyine yaklaştırın.

Ardından, bir giga conta oluşturmak için hızlı bir şekilde negatif basınç uygulayın ve video monitöründe mevcut enjeksiyon tepkilerini izlerken hücreyi kırın. İçeri girdikten sonra, çevrimiçi doğrulama için DIC ve floresan modları altında 60 x büyütmede intra nöronu ifade eden kayıtlı GFP'nin görüntülerini alın. Foto stimülasyon verilerini toplamadan önce, her hücrenin temel elektrofizyolojik özelliklerini incelemek için hiperpolarize edici ve depolarize edici akım darbeleri enjekte edin.

Kararlı hale geldikten sonra, genellikle 20 mega ohm'dan daha az olan iyi erişim direnci ile tüm hücre kaydı elde edilir, lazer taramalı foto stimülasyon için mikroskop objektifini 60 x'ten dört x büyütmeye geçirin, dört x büyütmede bir dilim görüntüsü elde edin ve bunu foto stimülasyon bölgelerini yönlendirmek ve kaydetmek için kullanın. Phys'in konfigürasyon anahtarı modülünü etkinleştirerek foto stimülasyon ve veri toplama parametrelerini ayarlayın. Bir saniyelik bir uyaran aralığı ile yaklaşık 20 miliwatt'lık bir milisaniyelik bir lazer darbesi kullanın.

Foto stimülasyon haritalaması için, 10 kilohertz'de örneklenen bir saniyelik veri izlerini alın. Ardından, dört x dilimli görüntüyü phys'in eşleyici modülüne yükleyin. Somanın konumunu tanımlayın ve 16'ya 16'lık bir desenin 80, mikrometreye 80 mikrometre ile foto stimülasyon bölgelerini ayarlayın.

Tüm kortikal katmanları kaplayan hücre konumunun etrafındaki boşluk. Ardından, mevcut kelepçe modunda foto stimülasyona yanıt olarak sivri çıkma konumlarını inceleyerek kaydedilen nöronun uyarma profilini haritalayın. Çevrimiçi görüntüleme özelliklerine sahip kullanıcı dostu yazılımımız, haritalama deneylerini kolaylaştırır.

Bundan sonra, kaydedilen hücreden uyarıcı post-sinaptik akımları tespit ederek yerel uyarıcı devre bağlantılarını haritalayın Farklı konumlarda lazer tarama ile, içe doğru uyarıcı akımları algılamak için hücreyi voltaj kelepçesi modunda eksi 70 milivoltta tutun. Ardından, uyarıcı post-sinaptik akım haritalarını, foto stimülasyon modeli döndürülmüş veya çevrilmiş olarak iki ila üç kez tekrarlayın. Yerel inhibitör devre bağlantılarını haritalamak için, kaydedilen hücreden inhibitör post-sinaptik akımları tespit edin.

Bu durumda hücreyi sıfır milivolta yakın tutun, dışa doğru inhibitör akımları tespit etmek için voltaj kelepçesi modunda negatif 15 milivolt. Tüm fizyolojik tahlilleri tamamladıktan sonra, elektrodu kaydedilen hücreden nazikçe çıkarın. Beyin dilimini hazneden çıkarın, ardından gece boyunca% 4 para formaldehit içinde sabitleyin ve kaydedilen hücreleri biotin'e karşı boyayın.

Bu deneyde, inhibitör nöronları sınıflandırmak için GFP ekspresyonu, içsel elektrofizyoloji ve morfolojik özelliklerin kombinasyonu kullanılmıştır. Gösterilen. Burada, kaydedilen inhibitör nörona yerel kortikal devre bağlantılarının kapsamlı bir şekilde haritalanmasına izin veren lazer taramalı foto stimülasyonu göstermek için örnek ve ham bir veri haritası verilmiştir. Şekil D'de gösterilen ham izlerden türetilen renk kodlu kantitatif girdi haritalarının örnekleri aşağıda verilmiştir.Kaydedilen inter nöronda tespit edilen sinaptik olayların genlikleri renk kodludur ve foto stimülasyon konumlarının üzerine topografik olarak bindirilir.

Hücre gövdesinin konumu, ölçek çubuğundaki kırmızı açık daire ile gösterilir. Sıcak renkler güçlü sinaptik girişleri gösterir ve soğuk renkler hedeflenen hücreye bağlantının zayıf olduğunu veya hiç olmadığını gösterir. Benzer şekilde, şekil E, kaydedilen nörona örneklenen açma konumu başına sinaptik olayların sayısını sunar.

Şekil F, ölçek çubuğunda foto stimülasyon sonrası kaydedilen hücreye ilk tespit edilen sinaptik olayın başlama zamanını göstermektedir. Sıcak renkler kısa girişi, gecikmeyi ve daha soğuk renkler daha uzun sinaptik gecikmeleri gösterir. Böylece, LSPS, belirli inhibitör nöron tiplerine çarpan konum, güç, gecikme ve girdi sayısının ayrıntılı haritalarının oluşturulmasını sağlar.

Bu prosedüre katılarak, sabırlı olmak, temiz deney koşulu yapmak, ancak nesnenin yüksek büyütmesinden düşük modifikasyona geçmek için etkili ve çok dikkatli bir şekilde nöron yapmak önemlidir. Sonra arazi yazılımının son kullanımı çok iyi.