Tasarımcı nükleazlar kullanılması Fare Genom Mühendisliği

Bu prosedürün genel amacı, tasarımcı kuyruk nükleazları veya pençeleri yardımıyla gen eksikliği olan fareleri hızlı bir şekilde üretmektir. Bu, ilk olarak, Talon mRNA'ları oluşturmak için in vitro transkripsiyon için şablon görevi gören spesifik pençe çiftlerini kodlayan DNA yapılarının tasarlanması ve birleştirilmesiyle gerçekleştirilir. Prosedürün bir sonraki adımları, döllenmiş fare sitlerini izole etmek ve daha sonra bunları T ile mikro enjekte etmektir.Son adım, enjekte edilen sitleri cerrahi olarak sahte hamile koruyucu annelere aktarmaktır.

Elde edilen F sıfır dölleri, sıklıkla hedef gen fonksiyonunun kaybına yol açan genomik dizilerin bölgeye özgü delesyonlarını gösterir. Burada sunulan yöntem farelerde gen fonksiyonu hakkında bilgi sağlayabilse de, temel yaklaşım fareler ve balıklar gibi diğer model organizmalara da uyarlanabilir. İlk olarak, sitedeki TAL efektör nükleotid hedefleyici web sitesine erişin.

TN hedefleyici programını seçin ve hedef genin sırasına yapıştırın. Bu protokol için. Ad geninde bulunan P-C-A-G-T yedi TALEN ifade yapısını ve golden gate Talen ve T efektör kitini kullanın.

Talen montaj ayarları için başka yapılar veya montaj kitleri kullanılıyorsa, optimum ara parça uzunluğu ve kuyruk RV'lerinin sayısı için farklı olabilirse, önceden ayarlanmış bir mimari kullan ayarı altında Miller Etal 2011 seçeneğini seçin. Ardından G yedeği sekmesi altında NN'yi seçin. Program, bu listeden oluşturulan potansiyel hedef siteleri içeren bir metin dosyası oluşturur.

Gerekli Talen çiftini veya çiftlerini seçin ve Golden gate montajına devam edin. Bu protokol, C 57 BL altı J ve BDF dahil olmak üzere en yaygın kullanılan laboratuvar faresi suşları ile çalışır ve dört haftalıkken 10 donör dişi bir süper yumurtlama, beş ünite hamile kısrak serum gonadotropinin intraperitoneal enjeksiyonu kullanılarak kullanılır. 48 saat sonra dişilere beş ünite insan koryonik gonadotropin verin, ayrıca insan koryonik gonadotropin enjeksiyonundan hemen sonra intraperitoneal enjeksiyonla çiftleşin, dişiler aynı gün üreme çağındaki erkeklerle bire bir, sahte hamile koruyucu anneleri hazırlayın. Diğer.

Ertesi sabah, dişileri kurban edin ve ucts'yi diseke ederek döllenmiş oositleri geri kazanın. Daha sonra oosit kavramalarını bir mililitre M iki ortam içeren bir organ kültürü kabına bırakın. M iki ortamında sit kavramaları içeren bir tabağa 10 mikrolitre% 0.1 sığır hyaluronidaz çözeltisi ekleyerek tüm kümülüs hücrelerini çıkarın.

Daha sonra, hyaluronidazı çıkarmak için embriyoları iki veya üç M iki ortam değişikliği ile yıkamak için ağız pipetini kullanın. Henüz kümülüs hücrelerinden ayrılmamış embriyolar için hyaluronidaz tedavisine devam edin. İzole edilen embriyolar, mikro enjekte edilene kadar M 16, 37 santigrat derece besiyerinde ve% 5 karbondioksitte saklanabilir.

Her kuyruğun mikrolitresi başına 10 nanogram içeren 100 mikrolitre enjeksiyon çözeltisi hazırlayın. Nükleaz, mRNA, çift ve santrifüj 30 dakika boyunca 30.000 G'de pelete kadar. Enjeksiyon iğnelerini tıkayabilecek herhangi bir parçacık.

Ardından karışımı buz üzerinde tutun. Oositleri öğleden sonra erken saatlerde pronükleer evrelerinde enjekte etmeyi planlayın. Yaklaşık 100 embriyoyu M iki ortamındaki bir mineral yağ tabakasının altına daldırın ve marsy DIC optiği olmayan ters çevrilmiş bir mikroskop üzerinde çalışın.

20 x büyütme altında, farklı pronükleuslara sahip sitleri seçin. Oositlerin sınıflandırılması, boş bir enjeksiyon kılcal yükü kullanılarak yapılabilir, enjeksiyon kılcal damarı, bir ila iki mikrolitre enjeksiyon çözeltisi ile kullanılmadan hemen önce. Ardından mikroenjeksiyon başlığına takın.

Daha sonra seçilen bir siti tutan bir kılcal damar ile aspire edin ve nükleaz mRNA'sının sitoplazmaya sığ bir enjeksiyonunu yapın. Pronükleus ile temastan kaçının. Enjeksiyon hacmi düşük tutulmalıdır.

Sitoplazmik distansiyonun ilk belirtisinde iğneyi geri çekin. Normalde, embriyoların yaklaşık% 80 ila 90'ı hemen hayatta kalmalıdır. Enjekte edilen mRNA miktarını artırmak için, mevcut sitlerin mikroenjeksiyonunu takiben çözeltiyi daha konsantre hale getirin.

Bunları bir ağız pipeti kullanarak M 16 ortamına aktarın. Embriyoları 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksitte bir saat inkübe edin. Daha sonra hayatta kalanları sahte hamile koruyucu annelere aktarın.

Mikroenjeksiyondan bir gün önce, üç ila altı aylık CD'de bir dişi fareyi VA'ların sektörlerine ayrılmış erkeklerle çiftleştirerek yalancı gebeliğe neden olur. Ertesi sabah, embriyo alıcısı olarak kullanmak için şeffaf bir atory plug ile dişileri seçin. Kullanılmayan dişiler üç hafta içinde yalancı hamile durumlarından geri döner ve daha sonra tekrar kullanılabilir.

Anestezi uygulanmış bir koruyucu anne dişisini karnındaki sıcak bir yüzeye yerleştirin. Daha sonra insizyon alanını% 70 etanol püskürterek dezenfekte edin. Islak saçı planlanan kesi bölgesinden uzağa tarayın.

Şimdi periton boşluğunu makasla kesin ve uterus boynuzunu dışsallaştırın. Bunu yapmak için. Yumurtalığa bağlı yağ pedini çekin ve üreme organlarını bir bulldog kelepçesi ile hareketsiz hale getirin.

Ayrıca, ısıtılmış% 0.9 sodyum klorür çözeltisi ile organları nemli tuttuğunuzdan emin olun. Bu noktada, 12 ila 20 canlı embriyoyu sıralayın ve bunları ince bir cam kılcal damara yükleyin. Ağız pipetini kullanarak önce küçük bir hava kabarcığı aspire edin, ardından ince forseps kullanarak embriyoları aspire edin.

UCT'yi amp'in hemen yukarısından nazikçe kavrayın ve 30 gauge bir iğne kullanarak UCT duvarında küçük bir delik oluşturun. Yüklü kılcal damarı deliğe yerleştirin ve hava kabarcığının kılcal damardan yer değiştirdiğini görene kadar embriyoları yavaşça amfiye üfleyin. Ardından kılcal damarı çıkarın.

Üreme organlarını hemen vücut boşluğuna geri yerleştirin ve periton boşluğunu tek bir dikişle kapatın. Daha sonra, bir veya iki dokuz milimetrelik yara klipsi kullanarak cildi kapatın. Hayvanı ev kafesine geri koyun ve anestezi geçene kadar onu denetleyin.

Daha sonra, ameliyat sonrası ilk üç gün boyunca stresi en aza indirmek için dişileri iki ila üç fareden oluşan stabil sosyal gruplara yerleştirin, fare genomundaki tasarımcı nükleazlarla hedeflenen her çekirge için içme suyunda DEF Falcon gibi bir analjezik sağladığınızdan emin olun. PCR tabanlı bir test, istenen mutasyona uğramış bir aleli taşıyan kurucu hayvanları tanımlamak için tasarlanmıştır. İlk örnekte, bir kuyruk nükleaz çiftinin mikroenjeksiyonundan kaynaklanan kurucular.

Fare prion protein geninin kaplama bölgesini hedefleyen, bir PCR ürününün T yedi endonükleaz sindirimi ile analiz edildi. T yedi Endonükleaz sindirim testi, mutasyona uğramış ve vahşi tip alellerden üretilen PCR ürünlerinin DNA zincirleri arasında hetero duplekslerin oluşumuna dayanır. Tek kurucuların hedeflenen genomik bölgesinde Talon kaynaklı mutajenez, tam uzunlukta PCR ürününe ek olarak 250 ve 110 baz eşleştirilmiş uzun sindirim ürünlerinin ortaya çıkmasıyla ortaya çıktı.

Alternatif olarak, PCR ürünleri, tasarımcı nükleaz çiftinin ara bölgesi içinde uygun bir tanısal kısıtlama bölgesi bulunuyorsa, bir kısıtlama sindirimine tabi tutulabilir. İkinci örnekte, ZFN, fare Rosa 26 lokuslarından biri olan giriş içinde bulunan bir XPO bir kısıtlama bölgesini hedefler. Burada sindirilmemiş bantlar mutasyonların varlığını gösterir.

Yıldız işareti, herhangi bir sindirilmiş ürünün olmaması, hedeflenen genin her iki alelinde de mutasyonlar taşıyan bir kurucuyu güçlü bir şekilde düşündürür. Bu sindirilmemiş PCR ürünlerinin klonlanması ve dizilenmesi, kurucu farelerin hedeflenen alelin iki veya daha fazla farklı modifikasyonunu barındırabileceğini ortaya koymaktadır. Yabani tip dizilerin olmaması, hedef genin tam ablasyonunu gösterir.

Bu videoyu izledikten sonra, kuyruk nükleaz tasarımı, kuyruk montajı, nükleaz yapıları ve bunların doğrudan oside mikroenjeksiyon ile mutant fareler oluşturmak için nasıl kullanılacağı hakkında iyi bir anlayışa sahip olmalısınız. Bu yöntem, çinko, parmak çekirdeği veya CAS dokuz crispr gibi diğer tasarımcı nükleaz sınıflarıyla çalışacak şekilde uyarlanabilir. Ayrıca, nükleazın ve uygun gen hedefleme şablonunun eşzamanlı birlikte enjeksiyonu yoluyla homolog rekombinasyon yoluyla genom modifikasyonunu kolaylaştırabilir.