Name: Tasarımcı nükleazlar kullanılması Fare Genom Mühendisliği (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-04-02T15:45:00.000+00:00
Duration: 12 min 4 s
Description: Öğrenin TALEN kullanarak fare genom mühendisliği yöntemini ve gen fonksiyonlarını incelemeyi. Mikroenjeksiyon ve yalancı gebe kabul anneleri ile hızlı gen değişikliği sağlanır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Biz mükemmel teknik yardım için Monika Tarnowska, Cornelia Albrecht, ve Ewa Skoczylas teşekkür etmek istiyorum. Bu çalışma SNF Sinergia hibe CRSI33-125073 PP tarafından finanse edildi.

<ol><li>Capecchi, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+targeting+in+mice%3A+functional+analysis+of+the+mammalian+genome+for+the+twenty-first+century%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Genetics%22%5BJournal%5D)">Gene targeting in mice: functional analysis of the mammalian genome for the twenty-first century.</a> Nat. Rev. Genetics. 6, 507-512 (2005).</li>
<li>Johansson, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Building+a+zoo+of+mice+for+genetic+analyses%3A+a+comprehensive+protocol+for+the+rapid+generation+of+BAC+transgenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">Building a zoo of mice for genetic analyses: a comprehensive protocol for the rapid generation of BAC transgenic mice.</a> Genesis. 48, 264-280 (2010).</li>
<li>Skarnes, W. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+conditional+knockout+resource+for+the+genome-wide+study+of+mouse+gene+function%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A conditional knockout resource for the genome-wide study of mouse gene function.</a> Nature. 474, 337-342 (2011).</li>
<li>Carbery, I. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+genome+modification+in+mice+using+zinc-finger+nucleases%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Targeted genome modification in mice using zinc-finger nucleases.</a> Genetics. 186, 451-459 (2010).</li>
<li>Meyer, M., de Angelis, M. H., Wurst, W., Kuhn, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+targeting+by+homologous+recombination+in+mouse+zygotes+mediated+by+zinc-finger+nucleases%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Gene targeting by homologous recombination in mouse zygotes mediated by zinc-finger nucleases.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 15022-15026 (2010).</li>
<li>Cui, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+integration+in+rat+and+mouse+embryos+with+zinc-finger+nucleases%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Targeted integration in rat and mouse embryos with zinc-finger nucleases.</a> Nat. Biotechnol. 29, 64-67 (2011).</li>
<li>Sung, Y. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Knockout+mice+created+by+TALEN-mediated+gene+targeting%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Knockout mice created by TALEN-mediated gene targeting.</a> Nat. Biotechnol. 31, 23-24 (2013).</li>
<li>Wefers, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+production+of+mouse+disease+models+by+embryo+microinjection+of+TALENs+and+oligodeoxynucleotides%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Direct production of mouse disease models by embryo microinjection of TALENs and oligodeoxynucleotides.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110, 3782-3787 (2013).</li>
<li>Wang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((One-Step+generation+of+mice+carrying+mutations+in+multiple+genes+by+CRISPR%2FCas-mediated+genome+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">One-Step generation of mice carrying mutations in multiple genes by CRISPR/Cas-mediated genome engineering.</a> Cell. 153, 910-918 (2013).</li>
<li>Urnov, F. D., Rebar, E. J., Holmes, M. C., Zhang, H. S., Gregory, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+editing+with+engineered+zinc+finger+nucleases%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Genetics%22%5BJournal%5D)">Genome editing with engineered zinc finger nucleases.</a> Nat. Rev. Genetics. 11, 636-646 (2010).</li>
<li>ZFN, T. A. L. E. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR%2FCas-based+methods+for+genome+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">CRISPR/Cas-based methods for genome engineering.</a> Trends Biotechnol. 31, 397-405 (2013).</li>
<li>Joung, J. K., Sander, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TALENs%3A+a+widely+applicable+technology+for+targeted+genome+editing%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Mol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">TALENs: a widely applicable technology for targeted genome editing.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 14, 49-55 (2013).</li>
<li>Cermak, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+design+and+assembly+of+custom+TALEN+and+other+TAL+effector-based+constructs+for+DNA+targeting%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Efficient design and assembly of custom TALEN and other TAL effector-based constructs for DNA targeting.</a> Nucleic Acids Res. 39, (2011).</li>
<li>Reyon, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FLASH+assembly+of+TALENs+for+high-throughput+genome+editing%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">FLASH assembly of TALENs for high-throughput genome editing.</a> Nat. Biotechnol. 30, 460-465 (2012).</li>
<li>Sanjana, N. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+transcription+activator-like+effector+toolbox+for+genome+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">A transcription activator-like effector toolbox for genome engineering.</a> Nat. Protoc. 7, 171-192 (2012).</li>
<li>Kim, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+library+of+TAL+effector+nucleases+spanning+the+human+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">A library of TAL effector nucleases spanning the human genome.</a> Nat. Biotechnol. 31, 251-258 (2013).</li>
<li>Schmid-Burgk, J. L., Schmidt, T., Kaiser, V., Honing, K., Hornung, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+ligation-independent+cloning+technique+for+high-throughput+assembly+of+transcription+activator-like+effector+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">A ligation-independent cloning technique for high-throughput assembly of transcription activator-like effector genes.</a> Nat. Biotechnol. 31, 76-81 (2013).</li>
<li>Hsu, P. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+targeting+specificity+of+RNA-guided+Cas9+nucleases%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">DNA targeting specificity of RNA-guided Cas9 nucleases.</a> Nat. Biotechnol. 31, 827-832 (2013).</li>
<li>Fu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-frequency+off-target+mutagenesis+induced+by+CRISPR-Cas+nucleases+in+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">High-frequency off-target mutagenesis induced by CRISPR-Cas nucleases in human cells.</a> Nat. Biotechnol. 31, 822-826 (2013).</li>
<li>Hermann, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+OPEN+zinc+finger+nucleases+for+direct+gene+targeting+of+the+ROSA26+locus+in+mouse+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Evaluation of OPEN zinc finger nucleases for direct gene targeting of the ROSA26 locus in mouse embryos.</a> PLoS ONE. 7, (2012).</li>
<li>Meyer, M., Ortiz, O., Hrabe de Angelis, M., Wurst, W., Kuhn, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+disease+mutations+by+gene+targeting+in+one-cell+mouse+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Modeling disease mutations by gene targeting in one-cell mouse embryos.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109, 9354-9359 (2012).</li>
<li>Doyle, E. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TAL+Effector-Nucleotide+Targeter+%28TALE-NT%29+2.0%3A+tools+for+TAL+effector+design+and+target+prediction%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">TAL Effector-Nucleotide Targeter (TALE-NT) 2.0: tools for TAL effector design and target prediction.</a> Nucleic Acids Res. 40, 117-122 (2012).</li>
<li>Miller, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+TALE+nuclease+architecture+for+efficient+genome+editing%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">A TALE nuclease architecture for efficient genome editing.</a> Nat. Biotechnol. 29, 143-148 (2011).</li>
<li>Guo, J., Gaj, T., Barbas, C. F. 3rd <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+evolution+of+an+enhanced+and+highly+efficient+FokI+cleavage+domain+for+zinc+finger+nucleases%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Directed evolution of an enhanced and highly efficient FokI cleavage domain for zinc finger nucleases.</a> J. Mol. Biol. 400, 96-107 (2010).</li>
<li>Doyon, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhancing+zinc-finger-nuclease+activity+with+improved+obligate+heterodimeric+architectures%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Enhancing zinc-finger-nuclease activity with improved obligate heterodimeric architectures.</a> Nat. Methods. 8, 74-79 (2011).</li>
<li>Wefers, B., et al. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWefers%2C+B+%22Current+Protocols+in+Mouse+Biology%22">Current Protocols in Mouse Biology</a>. , John Wiley & Sons, Inc. (2011).</li>
<li>Wefers, B., Wurst, W., Kühn, R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWefers%2C+B+%22Current+Protocols+in+Mouse+Biology%22">Current Protocols in Mouse Biology</a>. , John Wiley & Sons, Inc. (2011).</li>
<li>Haueter, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+vasectomy-overexpression+of+Prm1-EGFP+fusion+protein+in+elongating+spermatids+causes+dominant+male+sterility+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">Genetic vasectomy-overexpression of Prm1-EGFP fusion protein in elongating spermatids causes dominant male sterility in mice.</a> Genesis. 48, 151-160 (2010).</li>
<li>Perez-Pinera, P., Ousterout, D. G., Brown, M. T., Gersbach, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+targeting+to+the+ROSA26+locus+directed+by+engineered+zinc+finger+nucleases%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Gene targeting to the ROSA26 locus directed by engineered zinc finger nucleases.</a> Nucleic Acids Res. 40, 3741-3752 (2012).</li>
<li>Bultmann, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+transcriptional+activation+of+silent+oct4+pluripotency+gene+by+combining+designer+TALEs+and+inhibition+of+epigenetic+modifiers%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Targeted transcriptional activation of silent oct4 pluripotency gene by combining designer TALEs and inhibition of epigenetic modifiers.</a> Nucleic Acids Res. 40, 5368-5377 (2012).</li>
<li>Valton, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overcoming+TALE+DNA+binding+domain+sensitivity+to+cytosine+methylation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Overcoming TALE DNA binding domain sensitivity to cytosine methylation.</a> J. Biol. Chem. 287, 38427-38432 (2012).</li>
<li>Cradick, T. J., Ambrosini, G., Iseli, C., Bucher, P., McCaffrey, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ZFN-Site+searches+genomes+for+zinc+finger+nuclease+target+sites+and+off-target+sites%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Bioinform%22%5BJournal%5D)">ZFN-Site searches genomes for zinc finger nuclease target sites and off-target sites.</a> BMC Bioinform. 12, (2011).</li>
<li>Doyle, E. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TAL+Effector-Nucleotide+Targeter+%28TALE-NT%29+2.0%3A+tools+for+TAL+effector+design+and+target+prediction%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">TAL Effector-Nucleotide Targeter (TALE-NT) 2.0: tools for TAL effector design and target prediction.</a> Nucleic Acids Res. 40, 117-122 (2012).</li>
<li>Byers, S. L., Payson, S. J., Taft, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Performance+of+ten+inbred+mouse+strains+following+assisted+reproductive+technologies+%28ARTs%29%5BTitle%5D)+AND+%22Theriogenology%22%5BJournal%5D)">Performance of ten inbred mouse strains following assisted reproductive technologies (ARTs).</a> Theriogenology. 65, 1716-1726 (2006).</li>
<li>Luo, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Superovulation+strategies+for+6+commonly+used+mouse+strains%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Assoc.+Lab.+Animal+Sci%22%5BJournal%5D)">Superovulation strategies for 6 commonly used mouse strains.</a> J. Am. Assoc. Lab. Animal Sci. 50, 471-478 (2011).</li>
<li>Pease, S., Saunders, T. L. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPease%2C+S+%22International+Society+for+Transgenic+Technologies.+Advanced+protocols+for+animal+transgenesis+%3A+an+ISTT+manual%22">International Society for Transgenic Technologies. Advanced protocols for animal transgenesis : an ISTT manual</a>. , Springer. (2011).</li>
<li>Cong, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplex+genome+engineering+using+CRISPR%2FCas+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems.</a> Science. 339, 819-823 (2013).</li>
<li>Mali, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-Guided+human+genome+engineering+via+Cas9%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">RNA-Guided human genome engineering via Cas9.</a> Science. 339, 823-826 (2013).</li>
</ol>

Yazarlar herhangi bir çıkar çatışması beyan ederim.

Tasarımcı Nükleaza odaklı genom düzenleme yaklaşımları önemli ölçüde kendi genomları 10,12 hedeflenen değişiklikler için uygun türlerin yelpazesini genişletmiştir. Farelerde, gen hedefleme ES hücrelerinin iki yıldır standart bir teknik olmuştur; fare ES hücreleri, bazı son başarılı olmuştur, ancak bununla birlikte, bu, fare dışındaki türlerden ES hücrelerine adapte zor olduğu kanıtlanmıştır. Hatta böyle EUCOMM, KOMP veya ZFN ve TALEN yüksek hassasiyet olabilir ve değişiklikler yelpazenin ilgili esneklik sağlar tarafından NorCOMM 3 genom düzenleme gibi konsorsiyumlar tarafından sunulan &quot;off-the-raf&quot; gen-hedefli fare ES hücre klonlarının durumu ile fare genomuna sokulur. Nükleaz aracılı mutasyonlar taşıyan Kurucu hayvanların her zaman ES hücrelerinin enjeksiyonu blastosist kaynaklanan kimera için durum böyle değildir yüksek germ-hattı yetkili 4-6,20,21, görünmektedir. Bu nedenle, bazı durumlarda des mikroenjeksiyon inigner nükleazlar hedef genom modifikasyonlarla yeni fare hatları önemli ölçüde daha hızlı üretimi ile sonuçlanabilir. ZFN ve yetenekleri yeri püskürtülmesiyle knockout farelerde başarılı bir şekilde üretimi enjekte nükleaz çiftinin aktivitesi üzerinde büyük ölçüde bağlıdır. TALENS organizma bir dizi gen geniş bir hedef yüksek başarı oranına sahip olduğu gösterilmiştir; Bununla birlikte, son çalışmalar TALEN bağlayıcı sitozin metilasyon 30,31 duyarlı olduğunu göstermektedir. Böylece, yeni üretilen nükleaz çiftleri, örneğin TALENS pCAG-T7 vektörlerine klonlanır, örneğin NIH-3T3 veya Nöro gibi bir fare hücre hattı içine geçici olarak transfekte edilebilir bir ölçüde fare embriyo kromatin durumunu taklit-2a. Burada, nükleaz aktivitesi önceden mRNA sentezi ve mikroenjeksiyon bölüm 5&#39;de tarif edildiği gibi T7 endonükleaz analizi ya da PCR ürünü bir sınırlama sindirimi kullanan tahmin edilebilir. Bu bağlamda ilgili genomik bölgenin sıralama tavsiyehücre çizgisi ve mikro-enjeksiyon deneyleri için kullanılan fare suşu ive. Fare zigot, farklı TALEN veya ZFN çiftleri farklı mRNA konsantrasyonlarda en iyi şekilde çalışır ve bu nedenle mikro-enjekte nükleaz mRNA&#39;nın en uygun çalışma konsantrasyonu deneysel olarak tespit edilmesi gerekebilir. Çok yüksek embriyo ölümcül neden olabilir, oysa nükleaz çift bağlı olarak, çok düşük bir konsantrasyonunun bir yarılmaya neden olur. Nukleaz çifti bağlı olarak, 2 ng / ul ve 200 mikrogram / ul gibi yüksek kadar düşük toplam mRNA konsantrasyonları kullanarak başarı oldu. Bu etkiler, hücre kültürü ve embriyo hayatta kalma ve hedef lokusunun modifikasyonu oranı her iki deneysel olarak tespit edilmesi gerekmektedir için optimum konsantrasyon nükleaz deney tahmin etmek güçtür. Yüksek aktif ZFN veya TALEN mikroenjeksiyon embriyo tek hücreli aşamada ötesinde hedef sekansı ayrılması ve bu nedenle mutagenez An karmaşık kalıpları neden olabilirkurucuları d mozaisizm. Biz ve diğerleri 4, tek bir kurucu (Şekil 5C) üç veya daha fazla farklı mutasyona uğramış allelleri gözlemledik. Bu kurucuları yeni bir fare hattı kurulması Böylece, yavrular dikkatle sindirim deneyler, tanımlanmamış bir mutasyon mevcut tek olduğunu kanıtlar sağlarlar uygun mutasyonun varlığı için sıralanmasıyla taranmalıdır. Eleştirilerden biri sık sık ZFN ve TALEN sistemlerine karşı dile getirdiği bu nükleazlar da hedef sitelere benzer genomunda başka bir yerde mevcut dizilerini klivajlayabilen olasılığıdır. Bu gibi hedef dışı etkiler homodimerik Fokl alanı kullanarak erken üretimi reaktifleri ile gözlenmiştir ve heterodimer konstruktları hedef dışı etkiler 25 hafifletmek için dizayn edilmiştir. Olası hedef dışı siteleri silico 32,33 bir dereceye kadar öngörülen ve PCR ve dizileme ile taranabilir. Bariz bir avantaj of yerine hücre çizgileri daha farelerin üretilmesi için ZFNs ve TALENS kullanan tercih edilen bir vahşi tip suşu için çeşitli çaprazlamaların gerçekleştirerek arzu edilen genom modifikasyona bağlanmamış hedef mutasyonları kapalı kaldırma olasılığıdır. Kurucu farelerin çok sayıda, nükleaz hedefli lokusundan üretilir ve siliko hedef dışı tahmin edilen PCR ürünlerinin nesil derin sekanslama analizi için noktalar, PCR ürünlerinin sindirim deneyleri için alternatif bir nicel ve nitel okuma sunabilir. Bu protokol açıklanan yardımla üreme teknikleri gibi C57Bl/6J veya B6D2F1 gibi mikroenjeksiyon deneyleri için kullanılan standart fare suşları için optimize edilmiştir. Bu tür suşlar outbred gibi farklı orijinlerden Fareler, prensip olarak genom düzenleme yaklaşımlar için kullanılabilir ve özel araştırma soru için daha uygun bir genetik arka planı sağlayabilir. Böyle süperovülasyon gibi yardımla üreme tekniklerinin performansı predi olabilirsuşları 34-36 bir dizi cted ama nükleaz mikroenjeksiyon için embriyo yeterli sayıda elde etmek için standart olmayan suşlar için daha fazla optimizasyon gerektirebilir. ZFN ve Yeten yanı sıra, bu tür RNA-güdümlü CRISPR/Cas9 sistemi 9,37,38 gibi yeni tasarımcı nükleazlar şimdi genom düzenleme uygulamaları için getirilmiştir. Mikroenjeksiyon ve burada tarif edilen kurucu hayvan analiz için tüm yöntemler de CRISPR/Cas9 ve genom düzenleme gelecek modları için de geçerlidir.

Fareler transgenik hayvan modelleri oluşturmak için ana kadar en popüler platform tarafından bulunmaktadır. Fare embriyo 1-3 genetik mühendisliği için çok yönlü bir araç son zamanlarda, örneğin çinko parmak nükleazlara (ZFN) gibi tasarımcı nükleazlara göre genom düzenleme yaklaşımlarla 4-6, transkripsiyon aktivatör gibi efektör nükleazlar (TALEN) 7,8 uzatıldı ve kümelenmiş düzenli interspaced kısa palindromık tekrarlar (CRISPR) / CRISPR-ilişkili (Cas) 9 9. ZFN ve her Fokl endonükleaz 10-12 birleştirilir (sırasıyla çinko parmak proteinlerin dizileri ve tekrar-değişken di-tortuları (RVDs),), iki özel olarak tasarlanmış protein bazlı DNA-bağlayıcı etki çiftleri olarak işlev TALEN. Tersine, Cas9-aracılı DNA parçalanmasının özgüllüğü (aynı zamanda, tek bir kimerik RNA molekülü olarak geçecek kılavuz RNA birleştirilebilir crRNA ve tracrRNA) CRISPR RNA transaktive tarafından sağlanan ile bir kompleks içinde hareket 11CRISPR proteini. RVDs tanımlanmış bir dizi ile Talens hızla 13-17 seçmek için montaj stratejileri çok sayıda bireysel deneyciler tarafından inşa edilebilir. CRISPR/Cas9 ancak kılavuz RNA-DNA özgünlüğü hala tam 18,19 çözülmüş değil bağlama, tasarımcı nükleazların daha az emek-yoğun nesil vaat ediyor. Özel ZFNs nesil şimdiye kadar uzman akademik laboratuarları ve bu Sangamo Biyobilimlerdeki ve Sigma CompoZr hizmet olarak ticari tedarikçiler ile sınırlı olmuştur. Genel olarak, tasarımcı nükleazlara ile düzenleme genom sonradan katılan homolog olmayan uç (NHEJ) veya homolog rekombinasyon (HR) DNA onarım makine 10,12 çekmek tanımlanan genomik loci, at çift iplikli sonları (DSB) tanıtmayı amaçlamaktadır. Bir DSB aracılı NHEJ onarım genellikle tamir yerinde yakın eklemeler ve silmeler getirilmesi ile sonuçlanır. Böylece NHEJ onarım cBir genlerin protein kodlama sekansı 4,7,9 içinde bir çerçeve kayma mutasyonu getirerek, bir hedef genin işlevi nakavt için yararlanılabilir. Alternatif olarak, ek veya tanımlanmış genetik bilginin değiştirilmesi tasarımcı nükleazlar ile birlikte bir DNA donör temin edilmesiyle elde edilebilir. Bir DNA donör Böylece HR ile DSB onarım için bir şablon olarak hizmet veren hedef alan ile homoloji bölgeleri ile çevrili araştırmacı tasarlanmış DNA dizileri içerir. Plazmidler 5,6,20 ve tek sarmallı oligonükleotid 8,9,21 Hem verici olarak başarılı bir şekilde kullanılmıştır. NHEJ-nor HR-aracılı genom düzenleme ne genel genetik mimari bozmadan nükleotid sekansında küçük değişikliklere oluşturmak için bu stratejiler özellikle uygun hale getirir, fare embriyo, genomuna bir seçilebilir markerin giriş gerektirir. Bu protokolde genom düzenleme için gerekli tüm prosedürler açıklanmaktadırTalens kullanılarak fare embriyosu. Bunlar TALEN hedef site 22 1) tanımlanmasını içerir, golden gate klonlama 13 tarafından Talens 2) yapım, TALEN mRNA, döllenmiş fare oosit, embriyo transferi için 5) cerrahi girişimler içine TALEN mRNA 4) mikroenjeksiyon 3) in vitro sentez ve 6) kurucusu hayvanlarda TALEN kaynaklı mutagenez analizi. Biz TALEN mRNA mikroenjeksiyon ve NHEJ kaynaklı eklemeler / silmeler için kurucularından tarama odaklanmak. Bu amaçla plazmid olarak ve fare embriyoları mikro enjeksiyon için TALEN mRNA in vitro sentezi transfekte zaman memeli hücrelerinde hem de ifade edilmesine olanak iki fonksiyonlu TALEN yapıları yarattı. Bu yapılar, heterodimerik Foki kaynaşmış bir kesik TALE omurga 23 Memeli hücrelerinde optimum genom düzenleme için 24,25 etki içermektedir. Bu protokol, aynı zamanda, diğer tasarım nükleazlara mikroenjeksiyonu için veya tasarımcı nükleazlara birleşik enjeksiyon için kabul edilebilirve verici yapıları (DNA donör tasarım Wefers et al. 26,27 ile mükemmel bir teknik yayınlarda tarif edilmiştir). Etik Bildirimi Tüm hayvan deneyleri Kanton Zürih Kanton Veteriner Ofisi kurallara ve yönetmeliklere uygun olarak yapıldı.

<table><tbody><tr><td>BsaI</td><td>NEB</td><td>R0535S veya L</td><td></td></tr><tr><td>Esp3I</td><td>Thermo Scientific</td><td>ER0451</td><td></td></tr><tr><td>T4 Ligaz</td><td>NEB</td><td>M0202S veya L</td><td></td></tr><tr><td>Spektinomisin</td><td>Sigma</td><td>S0692-1ML</td><td></td></tr><tr><td>Ampisilin & nbsp;</td><td>Sigma</td><td>A0166</td><td></td></tr><tr><td>X-Gal</td><td>Sigma</td><td>B4252</td><td></td></tr><tr><td>IPTG</td><td>Sigma</td><td>I6758</td><td></td></tr><tr><td>Plazmid Güvenli</td><td>Nükleaz Merkez Bankası</td><td>E3101K</td><td></td></tr><tr><td>QIAprep Spin Miniprep Kiti</td><td>Qiagen</td><td>27106</td><td></td></tr><tr><td>QIAGEN Plazmid Midi Kiti</td><td>Qiagen</td><td>12143</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick PCR Arıtma Kiti</td><td>Qiagen</td><td>28106</td><td></td></tr><tr><td>mMESSAGE mMACHINE T7 Ultra Kit</td><td>Invitrogen</td><td>AM1345</td><td></td></tr><tr><td>NucAway Döndürme Sütunları</td><td>Invitrogen</td><td>AM10070</td><td></td></tr><tr><td>RNaseZAP</td><td>Sigma</td><td>R2020-250ML</td><td></td></tr><tr><td>NorthernMax Formaldyde Yük Boyası</td><td>Invitrogen</td><td>AM8552</td><td></td></tr><tr><td>RNA Milenyum İşaretleyicileri</td><td>Invitrogen</td><td>AM7150</td><td></td></tr><tr><td>10x TBE tampon</td><td>Thermo Scientific</td><td>B52</td><td></td></tr><tr><td>T7 endonükleaz</td><td>NEB</td><td>M0302S veya L</td><td></td></tr><tr><td>pGEM-T EasyVector System I</td><td>Promega</td><td>A3600</td><td></td></tr><tr><td>SYBR Green I Nükleik Asit Jel Leke</td><td>Invitrogen</td><td>S-7563</td><td></td></tr><tr><td>hamile kısrak & # 039; serum gonadotropin (PMSG)</td><td>Sigma</td><td>G4877</td><td></td></tr><tr><td>insan koryonik gonadotropin (hCG)</td><td>Sigma</td><td>CG5</td><td></td></tr><tr><td>M2 embriyo kültürü ortamı</td><td>Sigma</td><td>M7167</td><td></td></tr><tr><td>M16 embriyo kültürü ortamı</td><td>Sigma</td><td>M7292</td><td></td></tr><tr><td>Mineral yağ, embriyo testi yapılmış</td><td>Sigma</td><td>M8410</td><td></td></tr><tr><td>Ketamin</td><td>CentraVet</td><td>Ket 201</td><td></td></tr><tr><td>Xylazine</td><td>Sigma Aldrich</td><td>46995</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Equipment/Tools</td></tr><tr><td>Nomarski DIC optikli ters mikroskop (örneğin Nikon Eclipse TE200)</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mikromanipülatör birimleri (örneğin Narishige, NT88NF)</td><td>Narishige</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Embriyo tutan kılcal damarlar</td><td>Sutter Instruments</td><td>B100-75-10</td><td></td></tr><tr><td>Embriyo enjeksiyon kılcal damarları</td><td>Narishige</td><td>GD-1</td><td></td></tr><tr><td>Kılcal çektirme (örneğin Sutter P97)</td><td>Sutter Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microforge (örneğin Narishige MF-900)</td><td>Narishige</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Walton cilt makası</td><td>FST</td><td>14077-10</td><td></td></tr><tr><td>Cerrahi makas</td><td>FST</td><td>14041-10</td><td></td></tr><tr><td>Cerrahi prob</td><td>FST</td><td>10140-03</td><td></td></tr><tr><td>Refleks yara klipsi sistemi (9 mm)</td><td>FST</td><td>12031-09</td><td></td></tr><tr><td>Refleks yara klipsleri (9 mm)</td><td>FST</td><td>12032-09</td><td></td></tr><tr><td>Dumont ince forseps 5</td><td>FST</td><td>11254-20</td><td></td></tr><tr><td>Moria kavisli forseps</td><td>FST</td><td>11370-31</td><td></td></tr><tr><td>Moria ince forseps</td><td>FST</td><td>11399-80</td><td></td></tr><tr><td>Dietrich bulldog kelepçesi</td><td>FST</td><td>18038-45</td><td></td></tr><tr><td>C57BL / 6J fareler</td><td>Jackson Labs</td><td>suş kodu 000664</td><td></td></tr><tr><td>CD-1 fareler</td><td>Charles River</td><td>suş kodu 000664</td><td></td></tr></tbody></table>

tasarımcı nükleazlar kullanılması fare genom mühendisliği

Mouse Genome Engineering Using Designer Nucleases

Site özel genom değişiklikler (nakavt, knock-in) taşıyan transgenik fareler karmaşık biyolojik sistemleri diseksiyon yanı sıra insan hastalıklarının modelleme ve tedavi stratejileri test etmek için hayati önem taşımaktadır. Böyle çinko parmak nükleazlardır (ZFNs), transkripsiyon aktivatörü gibi efektör nükleazlardır (Talens) ve kümelenmiş düzenli interspaced kısa yineleyen tekrarlar (CRISPR) / için CRISPR-ilişkili (Cas) 9 sistemi yerinde gibi tasarımcı nükleazların kullanımı son gelişmeler Belirli bir genom mühendislik embriyonik kök (ES) hücre teknolojisi güvenmek gerek kalmadan hemen hemen herhangi bir laboratuvar türlerde hızlı hedef genom modifikasyonu gerçekleştirmek için olasılığını açığa çıkarır. Bir genom düzenleme deney tipik olarak tanımlı bir araştırmacı genomik nükleaz aktivitesi yönlendirmek için özel DNA bağlayıcı etki yapımında ardından ilgi konusu bir gen içinde bir tasarımcı nükleaz hedef siteye belirlenmesi ile başlar. Tasarımcı nükleaz plazmidler in vitro olarak &#39;/ Em&gt; döllenmiş fare oosit mikroenjeksiyon için mRNA oluşturmak için transkripsiyonu. Burada, döllenmiş fare oositlerine TALEN mRNA&#39;nın direkt enjeksiyonu ile hedef genom modifikasyonu elde edilmesi için bir protokol sağlar.

Bu memeli hücrelerinde TALENS sentezlenmesini hem de T7 faj promoteri (Şekil 1C) için in vitro mRNA sentezine izin vermek Cermak&#39;ın et al. 13 tarafından yayınlanan Altın GateTALEN düzeneği ile uygun hedef plazmidleri yapılmıştır. Bu plazmidler Fokl homodimerler göre hedef dışı etkileri azaltmak ve Fokl 25,29 heterodimerler ilk nesil ile karşılaştırıldığında bölünme etkinliğini arttırmak için gösterilmiştir heterodimerik Fokl etki (ELD veya KKR mutasyonlar) taşır. Altın kapı montaj reaksiyonlar # 1 ve # 2 genellikle çok verimli ve her beyaz koloni, koloni PCR ile analiz edildiğinde, klonlanmış RVDs (Şekil 1B ve 1D) belirli sayıda için beklenen modelini gösterir. In vitro sentezlenen mRNA Jel analizi (Şekil 2) ile analiz edilir, her bir numune için çok az veya hiç smear ile tek bir bant açığa ayırt edilmelidir. Başarılı poliadenilasyona gösterir örnekleri L1/R1 ve L2/R2, L3/R3 arasında net bir boyut değişim var olmalıdır. Kurucu hayvanların bir enzim kullanılarak, ya T7 endonükleaz sindirimi ve ardından genotipleme PCR (Şekil 3) ya da bir sınırlandırma sindirimi kullanan NHEJ indüklenen mutasyona uğramış aleller için taranabilir nükleaz çiftinin boşluk bölgesi içinde yaran vahşi tip sekans (Şekil 4),. T7 endonükleaz deney bağımsız enjekte nükleaz çiftinin boşluk bölgesi içinde belirli bir genomik sekansın mutasyonu herhangi bir uygulanabilir; Bununla birlikte, bu heterodupleks PCR ürünleri DNA elyaf arasında sadece uyumsuzluklarını bulgulamaktadır. Böylece, kurucu iki aynı mutasyona uğramış allel taşıyan nadir durumlarda, PCR ürünleri herhangi T7 sindirim desen göstermek olmaz. Belirli bir kısıtlama alanı NHEJ tarafından yok edilecek nükleaz boşluk bölgesi içinde yer almaktadır Bu tür bir ayrım her zaman, ancak, mümkünEklemeler / silmeler (Şekil 5) ile indüklenen. Burada, sindirilmemiş bantları mutasyonların varlığını gösterir ve her sindirilmiş ürünlerin yokluğu güçlü (Şekil 4b&#39;de yıldız ile işaretlenmiştir) hedeflenen genin her iki allel içinde mutasyonlar taşıyan bir kurucu göstermektedir. <img alt="Şekil 1" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50930/50930fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50930/50930fig1.jpg" width="600" /> Şekil 1. Pfus vektörlere RVD diziler Heterodimerik pCAG-T7-Hedef vektörlere TALEN RVDs Golden Gate klonlama. A) Meclis. İşte bir örnek birey MASALI diziler, sırasıyla, 15 ve 17 RVDs RVDs oluşan bir TALEN çifti için gösterilmiştir (uzun 21 RVDs daha MASALI diziler için, üç pfus-RVDs meclisleri gösterilmez, gerekli). Oklar pfus spesifik koloni PCR reaksiyonları. B) PCR ürünleri belirtmek için primerlerDoğru pfus meclisleri büyütüldü tipik) bir grup klonlanmış tüm RVDs (10 RVDs örneğin yaklaşık 1.1 kb) ve bir bitiş RVD dizilerin tekrarlayan doğa için daha küçük daha az önemli gruplarından &quot;merdiven&quot;. C&#39;nin kombine uzunluğuna tekabül göstermek son montaj pfus-RVD dizileri sırasıyla FokIELD ve FokIKKR varyantları ile heterodimerik TALEN ekspresyon vektörleri içine, son tekrar (plr) ihtiva eden bir plazmid. (N-ve C açıklamalı) TALEN omurga T7 faj promoteri de sağlar iken CAG (CMV erken güçlendirici element / tavuk beta-aktin) promoteri, transfekte memeli hücrelerinde yüksek düzeyde ekspresyon sağlayan Miller et al. 23 tarafından yayınlanan benzer bir mimari nitro mRNA sentezi (nükleaz STOP kodonu alt vektörün doğrusallaştırılması için SacI kullanım). D) C oklarla gösterilen primerler kullanılarak koloni PCR) doğru monte TALENS tanımlanmasını sağlar. Tam lengt&quot;merdiven etkisi&quot; başarılı montaj sağlam bir göstergesini temsil ederken h PCR ürünleri genellikle daha az belirgindir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50930/50930fig1highres.jpg" target="_blank">resmi büyütmek için buraya tıklayın</a> . <img alt="Şekil 2," fo:content-width="3in" fo:src="/files/ftp_upload/50930/50930fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50930/50930fig2.jpg" width="300" /> Şekil 2. . Agaroz jel elektroforezi kullanılarak in vitro sentezi nukleaz mRNA kalite kontrol ZFN mRNAlarının bir örnek olarak gösterilmiştir (L, ZFN sol, R, sağ ZFN). Numuneler önce poliadenilasyonunun mRNA göstermek L1/R1, mRNA ve L3/R3 poliadenillenmiş örnekleri L2/R2 gösteri saflaştırılmış poliadenile mRNA göstermektedir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50930/50930fig2highres.jpg" target="_blank">resmi büyütmek için buraya tıklayın</a> . <img<html> içerik-genişliği fo = &quot;6in&quot;: src = &quot;/ files/ftp_upload/50930/50930fig3highres.jpg&quot; src = &quot;/ files/ftp_upload/50930/50930fig3.jpg&quot; width = &quot;600&quot; fo alt = &quot;Şekil 3&quot; /&gt; Şekil 3,. Hedef lokusunun nükleaz ile indüklenen mutasyon taşıyan Kurucu hayvanların tanımlanması için kullanılan bir T7 endonükleaz tahlilin örneği. A) TALEN çift fare prion proteini geni (PRNP kodlayıcı bölge içinde bölmek için tasarlanmıştır, TALEN hedef sekansı), istek üzerine temin edilebilir. Bir PCR ürünü, PCR ürünü daha sonra oluşum ve T7 endonükleaz sindirim hetero tabi tutulur, 110 bp yukarı yer alan bir ileri primer (F) ve ters primer (R) TALEN bölünme sitesinin. B alt 250 bp) kullanılarak oluşturulur. ° C) tek kurucu hedeflenen genomik bölge içinde TALEN kaynaklı mutagenez sindirim 250 ürün ve 110 baz ile tam uzunlukta PCR ürününün varlığı ile ortaya çıkar.50930/50930fig3highres.jpg &quot;target =&quot; _blank &quot;&gt; büyük resmi görebilmek için buraya tıklayın. <img alt="Şekil 4," fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50930/50930fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50930/50930fig4.jpg" width="600" /> Şekil 4. Hedef lokusunun nükleaz ile indüklenen mutasyon fare Rosa26 lokusu 29 hedef intron 1 içinde bir Xbal kısıtlama alanı için. ZFN özgü taşıma Kurucu hayvanların belirlenmesi için kullanılan PCR ürünleri restriksiyon dijest örneği. A) Kurucular kullanılarak PCR ile taranmıştır genotiplenmesi ileri primer (F) 500 bp üst baş ve ters primer (R) yarılma sitesi. B alt 250 bp) Xbal ile PCR ürünleri sindirim yıldız işareti ile işaretlenmiştir iki alelik mutasyonlarla fareleri () gösteren sindirim desenler ortaya, mono bulunduğu -alelik mutasyon (sindirilmiş ve sindirilmemiş grupları, örneğin, hayvan 2)potansiyel bi-alel değişiklikler ile farelerin ve wt fareler (tam sindirim, örneğin, hayvan 21). C) Dizi 3 (hayvan 24) farklı eklemeler / silmeler kadar gösterir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50930/50930fig4highres.jpg" target="_blank">resmi büyütmek için buraya tıklayın</a> . <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> Primer Adı </td><td> &#39;Ila 3&#39; sekans 5 </td></tr><tr><td> pCR8_F1 </td><td> ttgatgcctggcagttccct </td></tr><tr><td> pCR8_R1 </td><td> cgaaccgaacaggcttatgt </td></tr><tr><td> TAL_F1 </td><td> ttggcgtcggcaaacagtgg </td></tr><tr><td> TAL_R2 </td><td> ggcgacgaggtggtcgttgg </td></tr><tr><td> TAL_Seq_5-1 </td><td> catcgcgcaatgcactgac </td></tr></tbody></table> Tablo 1. Golden Gate TALEN takımı içinde koloni PCR analizleri ve sekanslama için kullanılan primerlerin dizileriprotokolü. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> Plazmid / Koleksiyon </td><td> Iştirakçi </td><td> Addgene Kimliği </td><td> Yorumlar </td></tr><tr><td> Golden Gate TALEN ve TAL Efektör Kit 2.0 </td><td> Voytas laboratuvar </td><td> 1000000024 </td><td> Golden Gate TALEN montaj için gerekli tüm plazmidler İçeriyor </td></tr><tr><td> pCAG-T7-TALEN -KKR/ELD hedef vektörleri </td><td> Pelczar laboratuvar </td><td> 40131, 40132 </td><td> Eklenti, memeli hücreleri ve in vitro mRNA sentezindeki TALEN ifadesi için plazmidler </td></tr></tbody></table> Tablo 2. Golden Gate TALEN montaj için gerekli olan plasmidler ve plasmid koleksiyon Addgene (elde edilebilir <a href="http://www.addgene.org">www.addgene.org</a> ). <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> ÇevrimiçiKaynak </td><td> Yorumlar </td></tr><tr><td> http://tale-nt.cac.cornell.edu </td><td> Yeten Tasarımı; TALEN hedef dışı tahmini </td></tr><tr><td> http://zifit.partners.org/ZiFiT/ </td><td> Yeten, AÇIK ZFN, CoDA ZFN, CRISPR/Cas9 Tasarımı </td></tr><tr><td> http://www.genome-engineering.org </td><td> Yeten, CRISPR/Cas9 Tasarımı; CRISPR/Cas9 hedef dışı tahmini </td></tr><tr><td> http://baolab.bme.gatech.edu/Research/BioinformaticTools/assembleTALSequences.html </td><td> Yeten Meclisi sıralama sonuçlarının doğrulanması için dizileri </td></tr><tr><td> http://pgfe.umassmed.edu/ZFPmo dularsearchV2.html </td><td> Modüler montaj ZFN tasarımı </td></tr><tr><td> www.genomecenter.ucdavis.edu/s egallab / segallabsoftware </td><td> Modüler montaj ZFN tasarımı </td></tr></tbody></table> Tablo 3. ZFN, Yeten, ve CRISPR/Cas9 tasarımı için online kaynaklar. </strong&gt;

Örneğin çinko parmak nükleazlara (ZFNs) ve transkripsiyon aktivatörü gibi efektör nükleazlara (TALENS) olarak tasarımcı nükleazlar homolog olmayan uç birleştirme (NHEJ) ile homolog yeniden birleştirmeye (HR) yolaklar tetikleyerek fare preimplantasyon embriyoların genomunu değiştirmek için kullanılabilir. Bu gelişmeler kesin genetik değişiklikler farelerde hızlı üretimini sağlar.

Tasarımcı nükleazlar kullanılması Fare Genom Mühendisliği

Transgenic mice carrying site-specific genome modifications (knockout, knock-in) are of vital importance for dissecting complex biological systems as well ...

Bu prosedürün genel amacı, tasarımcı kuyruk nükleazları veya pençeleri yardımıyla gen eksikliği olan fareleri hızlı bir şekilde üretmektir. Bu, ilk olarak, Talon mRNA'ları oluşturmak için in vitro transkripsiyon için şablon görevi gören spesifik pençe çiftlerini kodlayan DNA yapılarının tasarlanması ve birleştirilmesiyle gerçekleştirilir. Prosedürün bir sonraki adımları, döllenmiş fare sitlerini izole etmek ve daha sonra bunları T ile mikro enjekte etmektir.Son adım, enjekte edilen sitleri cerrahi olarak sahte hamile koruyucu annelere aktarmaktır.Elde edilen F sıfır dölleri, sıklıkla hedef gen fonksiyonunun kaybına yol açan genomik dizilerin bölgeye özgü delesyonlarını gösterir. Burada sunulan yöntem farelerde gen fonksiyonu hakkında bilgi sağlayabilse de, temel yaklaşım fareler ve balıklar gibi diğer model organizmalara da uyarlanabilir. İlk olarak, sitedeki TAL efektör nükleotid hedefleyici web sitesine erişin.TN hedefleyici programını seçin ve hedef genin sırasına yapıştırın. Bu protokol için. Ad geninde bulunan P-C-A-G-T yedi TALEN ifade yapısını ve golden gate Talen ve T efektör kitini kullanın.Talen montaj ayarları için başka yapılar veya montaj kitleri kullanılıyorsa, optimum ara parça uzunluğu ve kuyruk RV'lerinin sayısı için farklı olabilirse, önceden ayarlanmış bir mimari kullan ayarı altında Miller Etal 2011 seçeneğini seçin. Ardından G yedeği sekmesi altında NN'yi seçin. Program, bu listeden oluşturulan potansiyel hedef siteleri içeren bir metin dosyası oluşturur.Gerekli Talen çiftini veya çiftlerini seçin ve Golden gate montajına devam edin. Bu protokol, C 57 BL altı J ve BDF dahil olmak üzere en yaygın kullanılan laboratuvar faresi suşları ile çalışır ve dört haftalıkken 10 donör dişi bir süper yumurtlama, beş ünite hamile kısrak serum gonadotropinin intraperitoneal enjeksiyonu kullanılarak kullanılır. 48 saat sonra dişilere beş ünite insan koryonik gonadotropin verin, ayrıca insan koryonik gonadotropin enjeksiyonundan hemen sonra intraperitoneal enjeksiyonla çiftleşin, dişiler aynı gün üreme çağındaki erkeklerle bire bir, sahte hamile koruyucu anneleri hazırlayın. Diğer.Ertesi sabah, dişileri kurban edin ve ucts'yi diseke ederek döllenmiş oositleri geri kazanın. Daha sonra oosit kavramalarını bir mililitre M iki ortam içeren bir organ kültürü kabına bırakın. M iki ortamında sit kavramaları içeren bir tabağa 10 mikrolitre% 0.1 sığır hyaluronidaz çözeltisi ekleyerek tüm kümülüs hücrelerini çıkarın.Daha sonra, hyaluronidazı çıkarmak için embriyoları iki veya üç M iki ortam değişikliği ile yıkamak için ağız pipetini kullanın. Henüz kümülüs hücrelerinden ayrılmamış embriyolar için hyaluronidaz tedavisine devam edin. İzole edilen embriyolar, mikro enjekte edilene kadar M 16, 37 santigrat derece besiyerinde ve% 5 karbondioksitte saklanabilir.Her kuyruğun mikrolitresi başına 10 nanogram içeren 100 mikrolitre enjeksiyon çözeltisi hazırlayın. Nükleaz, mRNA, çift ve santrifüj 30 dakika boyunca 30.000 G'de pelete kadar. Enjeksiyon iğnelerini tıkayabilecek herhangi bir parçacık.Ardından karışımı buz üzerinde tutun. Oositleri öğleden sonra erken saatlerde pronükleer evrelerinde enjekte etmeyi planlayın. Yaklaşık 100 embriyoyu M iki ortamındaki bir mineral yağ tabakasının altına daldırın ve marsy DIC optiği olmayan ters çevrilmiş bir mikroskop üzerinde çalışın.20 x büyütme altında, farklı pronükleuslara sahip sitleri seçin. Oositlerin sınıflandırılması, boş bir enjeksiyon kılcal yükü kullanılarak yapılabilir, enjeksiyon kılcal damarı, bir ila iki mikrolitre enjeksiyon çözeltisi ile kullanılmadan hemen önce. Ardından mikroenjeksiyon başlığına takın.Daha sonra seçilen bir siti tutan bir kılcal damar ile aspire edin ve nükleaz mRNA'sının sitoplazmaya sığ bir enjeksiyonunu yapın. Pronükleus ile temastan kaçının. Enjeksiyon hacmi düşük tutulmalıdır.Sitoplazmik distansiyonun ilk belirtisinde iğneyi geri çekin. Normalde, embriyoların yaklaşık% 80 ila 90'ı hemen hayatta kalmalıdır. Enjekte edilen mRNA miktarını artırmak için, mevcut sitlerin mikroenjeksiyonunu takiben çözeltiyi daha konsantre hale getirin.Bunları bir ağız pipeti kullanarak M 16 ortamına aktarın. Embriyoları 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksitte bir saat inkübe edin. Daha sonra hayatta kalanları sahte hamile koruyucu annelere aktarın.Mikroenjeksiyondan bir gün önce, üç ila altı aylık CD'de bir dişi fareyi VA'ların sektörlerine ayrılmış erkeklerle çiftleştirerek yalancı gebeliğe neden olur. Ertesi sabah, embriyo alıcısı olarak kullanmak için şeffaf bir atory plug ile dişileri seçin. Kullanılmayan dişiler üç hafta içinde yalancı hamile durumlarından geri döner ve daha sonra tekrar kullanılabilir.Anestezi uygulanmış bir koruyucu anne dişisini karnındaki sıcak bir yüzeye yerleştirin. Daha sonra insizyon alanını% 70 etanol püskürterek dezenfekte edin. Islak saçı planlanan kesi bölgesinden uzağa tarayın.Şimdi periton boşluğunu makasla kesin ve uterus boynuzunu dışsallaştırın. Bunu yapmak için. Yumurtalığa bağlı yağ pedini çekin ve üreme organlarını bir bulldog kelepçesi ile hareketsiz hale getirin.Ayrıca, ısıtılmış% 0.9 sodyum klorür çözeltisi ile organları nemli tuttuğunuzdan emin olun. Bu noktada, 12 ila 20 canlı embriyoyu sıralayın ve bunları ince bir cam kılcal damara yükleyin. Ağız pipetini kullanarak önce küçük bir hava kabarcığı aspire edin, ardından ince forseps kullanarak embriyoları aspire edin.UCT'yi amp'in hemen yukarısından nazikçe kavrayın ve 30 gauge bir iğne kullanarak UCT duvarında küçük bir delik oluşturun. Yüklü kılcal damarı deliğe yerleştirin ve hava kabarcığının kılcal damardan yer değiştirdiğini görene kadar embriyoları yavaşça amfiye üfleyin. Ardından kılcal damarı çıkarın.Üreme organlarını hemen vücut boşluğuna geri yerleştirin ve periton boşluğunu tek bir dikişle kapatın. Daha sonra, bir veya iki dokuz milimetrelik yara klipsi kullanarak cildi kapatın. Hayvanı ev kafesine geri koyun ve anestezi geçene kadar onu denetleyin.Daha sonra, ameliyat sonrası ilk üç gün boyunca stresi en aza indirmek için dişileri iki ila üç fareden oluşan stabil sosyal gruplara yerleştirin, fare genomundaki tasarımcı nükleazlarla hedeflenen her çekirge için içme suyunda DEF Falcon gibi bir analjezik sağladığınızdan emin olun. PCR tabanlı bir test, istenen mutasyona uğramış bir aleli taşıyan kurucu hayvanları tanımlamak için tasarlanmıştır. İlk örnekte, bir kuyruk nükleaz çiftinin mikroenjeksiyonundan kaynaklanan kurucular.Fare prion protein geninin kaplama bölgesini hedefleyen, bir PCR ürününün T yedi endonükleaz sindirimi ile analiz edildi. T yedi Endonükleaz sindirim testi, mutasyona uğramış ve vahşi tip alellerden üretilen PCR ürünlerinin DNA zincirleri arasında hetero duplekslerin oluşumuna dayanır. Tek kurucuların hedeflenen genomik bölgesinde Talon kaynaklı mutajenez, tam uzunlukta PCR ürününe ek olarak 250 ve 110 baz eşleştirilmiş uzun sindirim ürünlerinin ortaya çıkmasıyla ortaya çıktı.Alternatif olarak, PCR ürünleri, tasarımcı nükleaz çiftinin ara bölgesi içinde uygun bir tanısal kısıtlama bölgesi bulunuyorsa, bir kısıtlama sindirimine tabi tutulabilir. İkinci örnekte, ZFN, fare Rosa 26 lokuslarından biri olan giriş içinde bulunan bir XPO bir kısıtlama bölgesini hedefler. Burada sindirilmemiş bantlar mutasyonların varlığını gösterir.Yıldız işareti, herhangi bir sindirilmiş ürünün olmaması, hedeflenen genin her iki alelinde de mutasyonlar taşıyan bir kurucuyu güçlü bir şekilde düşündürür. Bu sindirilmemiş PCR ürünlerinin klonlanması ve dizilenmesi, kurucu farelerin hedeflenen alelin iki veya daha fazla farklı modifikasyonunu barındırabileceğini ortaya koymaktadır. Yabani tip dizilerin olmaması, hedef genin tam ablasyonunu gösterir.Bu videoyu izledikten sonra, kuyruk nükleaz tasarımı, kuyruk montajı, nükleaz yapıları ve bunların doğrudan oside mikroenjeksiyon ile mutant fareler oluşturmak için nasıl kullanılacağı hakkında iyi bir anlayışa sahip olmalısınız. Bu yöntem, çinko, parmak çekirdeği veya CAS dokuz crispr gibi diğer tasarımcı nükleaz sınıflarıyla çalışacak şekilde uyarlanabilir. Ayrıca, nükleazın ve uygun gen hedefleme şablonunun eşzamanlı birlikte enjeksiyonu yoluyla homolog rekombinasyon yoluyla genom modifikasyonunu kolaylaştırabilir.

mouse-genome-engineering-using-designer-nucleases

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

CompoZr Özel Çinko-Parmak Nükleaz (ZFN) Hizmet kullanıcı tarafından tanımlanan herhangi bir odağı herhangi bir organizma ya da hücre hattı hassas genom düzenlenmesini sağlar. Bu makale CompoZr Özel ZFN Hizmet tasarım, imalat, onaylanması ve uygulanması için süreci anlatılmaktadır.

CompoZr Özel Çinko Parmak Nükleazlar ile Genom Düzenleme (ZFNs)

CRISPR/Cas9, genlerin ve genetik elementlerin bozulmasını sağlayan sağlam bir sistemdir. Burada, CRISPR / Cas9 kullanarak memeli hücre hatlarında genomik delesyonların verimli bir şekilde oluşturulması için bir protokol açıklıyoruz.

CRISPR / Cas9 üzerinden Memeli Hücre Hatlarında Genomik Delesyonlar Üretimi

İnsan pluripotent kök hücrelerinin (hPSC'ler) genom düzenlemesi hızlı ve verimli bir şekilde yapılabilir. Burada, EGFP'yi eksprese etmek ve antibiyotik direncini ortaya çıkarmak için AAVS1 güvenli liman lokusunun düzenlenmesiyle örneklendiği gibi, hPSC'leri genetik olarak tasarlamak için sağlam bir deneysel prosedür sunulmaktadır.

Genom düzenlenmiş İnsan Pluripotent Kök Hücre Hatları oluşturulması: İzolasyon hedefleyen Gönderen

Fare oositlerinin mikroenjeksiyonu hem klasik transgenezis ( yani, transgenlerin rastgele bütünleşmesi) hem de CRISPR aracılı gen hedeflemesi için yaygın olarak kullanılır. Bu protokol, kalite kontrolü ve genotiplendirme stratejileri üzerinde özel bir vurguyla mikroenjeksiyondaki en son gelişmeleri gözden geçiriyor.

Oositlerin Mikroenjeksiyonu ile Genetiği Değiştirilmiş Farelerin Üretilmesi

CRISPR-Cas bitki ve hayvan karmaşık genleri Mühendisi için güçlü bir teknolojidir. Burada, verimli bir şekilde farklı Cas endonucleases kullanarak insan genomu düzenlemek için bir iletişim kuralı ayrıntılı. Biz ilgili önemli noktalar ve Düzenleme verimliliği optimize etmek için tasarım parametreleri vurgulayın.

Memeli hücre CRISPR-Cas kullanarak satırları genom düzenleme

Burada, tek hücreli embriyoların kriyopreservation için değiştirilmiş bir yöntem yanı sıra genetik olarak değiştirilmiş farelerin verimli nesil için dondurulmuş çözülmüş embriyolar ve elektroporasyon kullanarak çiftler bir protokol sıyoruz.

Genetiği Değiştirilmiş Farelerin Yüksek Verimli Üretimi için Dondurulmuş Çözülmüş Embriyoların Kullanımı

Mevcut protokol, gen kaseti knock-in ve flokslu fareleri verimli bir şekilde üretmek için CRISPR-Cas9 ve donör DNA'sının zigot mikroenjeksiyonunu tanımlamaktadır.

Farelerde gen kaseti knock-in ve flox alelleri oluşturmak için zigot mikroenjeksiyonu

Burada, CRISPR RNP Zygotes Elektroporasyonu (CRISPR-EZ) adı verilen genetiği değiştirilmiş farelerin verimli bir şekilde üretilmesi için tasarlanmış basit bir tekniği açıklıyoruz. Bu yöntem, elektroporasyon yoluyla düzenleme reaktiflerini embriyolara %100'e yaklaşan bir verimlilikle teslim eder. Bu protokol, memeli embriyolarındaki nokta mutasyonları, küçük genomik eklemeler ve delesyonlar için etkilidir.

Zigotların CRISPR Elektroporasyonu ile Farelerin Verimli Genom Düzenlemesi

Oviductal Nükleik Asitler Yoluyla Geliştirilmiş Genom Düzenleme  (I-GONAD) yönteminin etkinliği, donör dişilerden zigot toplanmasını ve yalancı hamile kadınlara aktarılmasını gerektiren geleneksel mikroenjeksiyon ile karşılaştırılabilir. Bu protokol, CRISPR/Cas9 ile indüklenen mutasyonları kromozom 6'daki ROSA26 lokusuna sokarak etkinliğini gösterir.

Nakavt Fare Üretimi için Oviduktal Nükleik Asitler Teslimatına Dayalı In Vivo Elektroporasyon Tekniği ile Geliştirilmiş Genom Düzenleme

Doku Mühendisliği Deneysel Yaklaşımlar

Öğrenin TALEN kullanarak fare genom mühendisliği yöntemini ve gen fonksiyonlarını incelemeyi. Mikroenjeksiyon ve yalancı gebe kabul anneleri ile hızlı gen değişikliği sağlanır.

Tasarımcı nükleazlar kullanılması Fare Genom Mühendisliği

Daha fazla video keşfet