Lenf düğümü Stromal Hücre Menşe Çalışmaları Lenf-yağ Pad Kimeralar Üretimi

Bu prosedürün genel amacı, yağ dokusunun lenf nodu stroma oluşumuna katkısını değerlendirmek için bir lenf nodu yağ yastığı kimerası oluşturmaktır. Bu, ilk olarak yeni doğan farelerden lenf düğümlerinin ve 18.5 günlük fare embriyolarından yağ yastıkçıklarının izole edilmesiyle gerçekleştirilir. Lenf nodu, embriyonik yağ yastıkçığından çıkarılır ve yerine yenidoğan lenf nodu yerleştirilir.

Lenf nodu yağ yastığı kimerası, bir yenidoğan lenf nodunun in vitro olarak bir embriyonik yağ yastığı ile yeniden ilişkilendirilmesi ve ardından kültürlenmesiyle birleştirilir. Chimera daha sonra bir konakçı farenin böbrek kapsülünün altına aşılanır. Nakilden üç hafta sonra böbrek alınır ve kimera geri alınır.

Sonuç olarak, yağ yastığı türevli hücrelerin lenf nodu stromasına katkısı, akım sitometrisi ve immünofloresan mikroskobik analiz ile değerlendirilebilir. Bu nedenle, bu yöntem için ilk fikri, yağ yastıkçığından gelen hücrelerin lenf düğümlerinin oluşumuna katkıda bulunup bulunmadığını değerlendirmenin bir yolunu ararken aklımıza geldi: Yenidoğan kasık lenf düğümlerini izole etmek. Kafayı bölümlere ayırdıktan sonra, hayvanın vücudunu torasik bölgenin üstünden karnın altına kadar açmak için bir makas kullanın.

Karın boşluğundaki tüm iç organları dikkatlice çıkardıktan sonra, vücudu RF 10 ortamı içeren 90 milimetrelik bir Petri kabına yerleştirin. Çanağı steril bir doku kültürü başlığına yerleştirin ve ardından gövdeyi taze RF 10 içeren yeni bir steril 90 milimetrelik Petri kabına aktarın. Daha sonra peritonu kasık bölgesindeki deriden dikkatlice ayırın ve yağ yastığındaki üç kan damarının kesişme noktasında bulunan kasık lenf düğümlerini bulun.

Tüm yağ dokusunun çıkarıldığından emin olarak lenf düğümlerini dikkatlice çıkarın. Daha sonra lenf düğümlerini, kasık yağ yastıkçıklarını 18.5. gün embriyolarından izole etmek için buz üzerinde RF 10 ortamı içeren 50 milimetrelik bir Petri kabına yerleştirin. İç organları az önce gösterildiği gibi çıkardıktan sonra, tüm kan izlerini ortadan kaldırmak için cesetleri steril PBS'de yıkayın.

Temizlenmiş gövdeleri 90 milimetrelik yeni bir Petri kabına aktarın ve ardından peritonu çıkarın, kasık lenf düğümünü lokalize edin ve gösterildiği gibi çıkarın. İzole edilmiş dokuyu atın. Yağ yastığı kimerasının kontaminasyonunu önlemek için tüm lenf düğümünü çıkarmaya özen gösterin.

Daha sonra kasık yağ pedini çıkarın ve buz üzerinde RF 10 ortamı içeren 50 milimetrelik bir Petri kabına yerleştirin. İn vitro organ kültür sistemini kurmak için, önce bir miktar Vulcan'ı sargı altında bir ila 1,5 santimetre karelik parçalar halinde kesin. Daha sonra süngerleri iki saat ve filtreleri damıtılmış suda 20 dakika kaynatın ve bir hücre kültürü davlumbazında birkaç saat kurumaya bırakın.

Malzemeler kuruduktan sonra, iki mililitre ortam içeren 50 milimetrelik Petri kabına birer sünger yerleştirin. Her iki tarafı da ıslatmak için her bir süngeri ortama batırın ve ardından sıvı hava arayüzüne in vitro organ kültürü sistemi başına bir filtre yerleştirin. Daha sonra, bir embriyonik yağ pedini bir yenidoğan lenf nodu ile doğrudan her filtrenin üstüne dikkatlice yeniden ilişkilendirin.

Petri kaplarını, dibinde su ve kapağında delikler bulunan dikdörtgen bir plastik kutuya aktarın. Delikleri açık bırakarak kapağı kutuya bantlayın. Ardından kutuyu 37 derece santigrat derece %5 CO2 hücre kültürü inkübatörüne yerleştirin.

Kutunun iki saat dengelenmesine izin verin ve ardından kapaktaki delikleri bantla kapatın. Transplantasyondan üç ila dört hafta sonra, böbrek kapsülü altına transfer edilmeden önce lenf düğümlerinin yağ yastıkçıklarına yapışmasına izin vermek için dokuları en az iki gün inkübe edin. Her böbrekte her lenf nodu yağ yastığı kimerasını izole edin ve lenf nodlarını inceleyin.

Daha sonra her lenf nodu için, enzimatik sindirime yardımcı olmak için dokuda tek bir kesi yapmak için küçük bir makas kullanın. Daha sonra, her biri 600 mikrolitre sindirim tamponu içeren 1.5 mililitrelik einor tüplerine bir lenf nodu yerleştirin. Tüpleri, çalkalayıcı bir termal blok üzerinde 37 santigrat derecede 30 dakika boyunca inkübe edin, dokunun ayrışmasına yardımcı olmak için her 10 dakikada bir yukarı ve aşağı pipetleyin.

Daha sonra tüplere altı mikrolitre EDTA ekleyin ve ayrışmayı bitirmek için hücre süspansiyonunu birkaç kez tritrate edin. Hücreler daha sonra istenen ilgilenilen antikorlarla boyanabilir ve gelişmiş sarı floresan proteini veya EYFP ekspresyonunu korumak için akış sitometrisi ile analiz edilebilir. Lenf düğümlerini üç ila dört saat boyunca sabitleyin.

Daha sonra her lenf nodu için, küçük bir alüminyum folyo parçası üzerine tek bir damla soğuk OCT bileşiği yerleştirin. Hava kabarcıklarından kaçınarak, her damlanın ortasına dikkatlice bir lenf düğümü yerleştirin ve ardından dokuları dondurmak için folyoyu kuru buzun üzerine yerleştirin. Lenf düğümleri daha sonra kesitlere ayrılabilir, boyanabilir ve floresan mikroskobu ile analiz edilebilir.

P lenf nodunun dikkatli bir şekilde izole edilmesi, EYFP pozitif adipoz türevli hücrelerin döllerinin daha fazla analizine izin verir. Lenf nodunun kriyo kesitleri ve immünofloresan analizi, EYFP pozitif adipoz türevli hücrelerin lenf noduna göç ettiğini ve burada GP 38 pozitif E RTR yedi pozitif lenf nodu stromal hücre ağı akışına katkıda bulunduklarını ortaya koymaktadır Sitometrik analiz, lenf nodu stromal hücrelerinin önemli bir kısmının, CD'nin %30'una katkıda bulunan lokal EYFP pozitif yağ dokusu progenitör hücrelerinden türetildiğini doğrulamaktadır 45 negatif G 38 pozitif CD 31 negatif FIBROBLASTIK fraksiyon ve CD 45 negatifin %10'u GP 38 negatif CD 31 pozitif kan endotel hücre fraksiyonu CD 45'in %80'ine kadar, negatif G 38 pozitif CD 31 negatif fibroblastik fraksiyon, yağ dokusunun lenf nodu stromasının büyümesini sürdürmede oynadığı önemli rolü gösteren yağ dokusu öncü hücrelerinden türetilebilir. Bu nedenle, lenfoid travmasında yer alan farklı moleküllerin rolünü keşfetmek için lenfoid Organogenez alanındaki bir araştırmacı ile bu teknikte ustalaştı.