Lenf düğümü Stromal Hücre Menşe Çalışmaları Lenf-yağ Pad Kimeralar Üretimi

Bu prosedürün genel amacı, adipoz dokunun lenf düğümü stromasının oluşumuna olan katkısını değerlendirmek için bir lenf düğümü yağ yastığı kimerası oluşturmaktır. Bu işlem, öncelikle yeni doğmuş farelerden lenf düğümlerinin ve 18,5 günlük fare embriyolarından yağ yastıklarının izole edilmesiyle gerçekleştirilir. Lenf düğümü embriyonik yağ yastığından çıkarılır ve yerine yeni doğmuş fare lenf düğümü yerleştirilir.

Lenf düğümü yağ pedi kimerası, bir yeni doğmuş lenf düğümü ile bir embriyonik yağ pedinin in vitro ortamda yeniden birleştirilmesi ve ardından kültüre edilmesiyle oluşturulur. Daha sonra kimera, bir konak farenin böbrek kapsülü altına greftlenir. Transplantasyondan üç hafta sonra böbrek hasat edilir ve kimera geri alınır.

Nihayetinde, yağ yastığından türetilen hücrelerin lenf düğümü stromasına olan katkısı, akış sitometrik ve immünofloresan mikroskobik analizlerle değerlendirilebilir. Bu yönteme dair ilk fikrimiz, yağ yastığından gelen hücrelerin lenf düğümlerinin oluşumuna katkıda bulunup bulunmadığını değerlendirmenin bir yolunu ararken ortaya çıktı. Yeni doğmuş inguinal lenf düğümlerini izole etmek için, baş bölgesini kestikten sonra bir makas yardımıyla hayvanın gövdesini göğüs bölgesinin üst kısmından karnın altına kadar açın.

Karın boşluğundaki tüm viseral organlar dikkatlice çıkarıldıktan sonra, gövde RF 10 ortamı içeren 90 milimetrelik bir Petri kabına yerleştirin. Kabı steril bir doku kültürü davlumbazına yerleştirin ve ardından gövdeyi taze RF 10 içeren yeni, steril bir 90 milimetrelik Petri kabına aktarın. Ardından, kasık bölgesindeki peritonyumu deriden dikkatlice ayırın ve yağ yastığındaki üç kan damarının kesişme noktasında bulunan inguinal lenf düğümlerini bulun.

Tüm adipoz dokunun temizlendiğinden emin olarak lenf nodlarını dikkatlice çıkarın. Ardından, 18,5 günlük embriyolardan inguinal yağ yastıklarını izole etmek için lenf nodlarını buz üzerinde RF 10 medyası içeren 50 milimetrelik bir Petri kabına yerleştirin. Az önce gösterildiği gibi viseral organları çıkardıktan sonra, tüm kan kalıntılarını temizlemek için gövdeleri steril PBS ile yıkayın.

Temizlenmiş gövdeleri taze bir 90 milimetrelik Petri kabına aktarın; ardından peritonu ayırın, inguinal lenf nodunu lokalize edin ve az önce gösterildiği gibi çıkarın. İzole edilen dokuyu atın. Yağ yastığı kimerasının kontamine olmasını önlemek için lenf nodunun tamamının çıkarıldığından emin olun.

Ardından inguinal yağ yastığını çıkarın ve buz üzerinde RF 10 medyası içeren 50 milimetrelik bir Petri kabına yerleştirin. In vitro organ kültürü sistemini kurmak için, önce bir miktar Vulcan under wrap'i 1 ila 1,5 santimetrekarelik parçalar halinde kesin. Daha sonra süngerleri iki saat, filtreleri ise 20 dakika boyunca distile suda kaynatın ve bir hücre kültürü davlumbazında birkaç saat boyunca kurumaya bırakın.

Materyaller kuruduktan sonra, her birine iki mililitre besiyeri içeren 50 milimetrelik Petri kabına birer sünger yerleştirin. Her iki tarafı da ıslatmak için her süngeri besiyerine batırın ve ardından, her bir in vitro organ kültürü sistemindeki sıvı-hava arayüzüne birer filtre yerleştirin. Daha sonra, bir embriyonik yağ yastıkçığını bir yeni doğan lenf nodu ile doğrudan her filtrenin üzerine dikkatlice yeniden birleştirin.

Petri kaplarını, tabanında su bulunan ve kapağında delikler olan dikdörtgen plastik bir kutuya aktarın. Delikleri açık bırakarak kapağı kutuya bantlayın. Ardından kutuyu 37 °C, %5 CO2 değerine sahip bir hücre kültürü inkübatörüne yerleştirin.

Kutunun iki saat boyunca dengelenmesini sağlayın ve ardından kapaktaki delikleri bantla kapatın. Nakilden üç ila dört hafta sonra böbrek kapsülü altına transfer edilmeden önce, lenf düğümlerinin yağ pedlerine tutunmasını sağlamak için dokuları en az iki gün inkübe edin. Her böbrekteki her bir lenf düğümü yağ pedi kimerasını izole edin ve lenf düğümlerini diseke ederek çıkarın.

Ardından, enzimatik sindirime yardımcı olmak için her bir lenf noduna küçük bir makasla doku üzerinde tek bir insizyon yapın. Daha sonra, her bir lenf nodunu 600 µL sindirim tamponu içeren ayrı 1,5 mL'lik eppendorf tüplerine yerleştirin. Tüpleri, dokunun ayrışmasına yardımcı olmak için her 10 dakikada bir pipetle yukarı-aşağı çekerek, ajite eden bir termal blok üzerinde 37 °C'de 30 dakika boyunca inkübe edin.

Ardından tüplere altı µL EDTA ekleyin ve disosiasyonu tamamlamak için hücre süspansiyonunu birkaç kez trite edin. Daha sonra, geliştirilmiş sarı floresan protein (EYFP) ekspresyonunu korumak amacıyla hücreler, ilgilenilen antikorlarla boyanabilir ve akış sitometrisi ile analiz edilebilir. Lenf düğümlerini üç ila dört saat boyunca fikse edin.

Ardından her bir lenf nodu için, küçük bir alüminyum folyo parçasına bir damla soğuk OCT bileşiği damlatın. Hava kabarcığı oluşmamasına dikkat ederek, her bir damlanın ortasına bir lenf nodu yerleştirin ve dokuları dondurmak için folyoyu kuru buz üzerine koyun. Lenf nodları daha sonra kesite ayrılabilir, boyanabilir ve floresan mikroskobu ile analiz edilebilir.

Lenf düğümünün dikkatli bir şekilde izole edilmesi, EYFP pozitif adipoz kaynaklı hücrelerin soyunun daha ayrıntılı analiz edilmesine olanak tanır. Lenf düğümünün kriyoseksiyonları ve immünofloresan analizi, EYFP pozitif adipoz kaynaklı hücrelerin lenf düğümüne göç ettiğini ve burada GP 38 pozitif ER-TR7 pozitif lenf düğümü stromal hücre ağına katkıda bulunduğunu ortaya koymaktadır. Akış sitometrik analiz, lenf düğümü stromal hücrelerinin önemli bir kısmının yerel EYFP pozitif adipoz doku progenitör hücrelerinden türediğini doğrulamakta; bu hücreler CD 45 negatif GP 38 pozitif CD 31 negatif fibroblastik fraksiyonun %30'una ve CD 45 negatif GP 38 negatif CD 31 pozitif kan endotel hücresi fraksiyonunun %10'una katkı sağlamaktadır. CD 45 negatif GP 38 pozitif CD 31 negatif fibroblastik fraksiyonun %80'e kadarı adipoz doku öncül hücrelerinden türeyebilmektedir, bu da adipoz dokunun lenf düğümü stromasının büyümesini sürdürmede oynadığı kritik rolü göstermektedir. Bu nedenle, lenfoid stroma gelişiminde rol oynayan farklı molekülleri araştırmak için lenfoid organogenez alanında çalışan bir araştırmacı bu tekniği uzmanlaşarak kullanabilir.