Name: Lenf düğümü Stromal Hücre Menşe Çalışmaları Lenf-yağ Pad Kimeralar Üretimi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-12-16T13:45:00.000+00:00
Duration: 9 min 10 s
Description: Keşfedin lenf düğümü-yağ pad kimerası üretimini; yeni doğan farelerden lenf düğümleri ve embriyonik yağ pedleri izole edilerek böbrek kapsülü altına nakledilir. Bu yöntem lenf düğümü stromal hücre menşeini incelemek için kullanılır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Birmingham Üniversitesi Biyomedikal Hizmetler Birimi personeline hayvan kolonilerimize baktıkları için minnettarız. Bu çalışma, AB FP7 entegre projesi INFLACARE to JC tarafından desteklenmiştir.

Fareler, Birleşik Krallık İçişleri Bakanlığı ve yerel etik kurul düzenlemelerine göre Birmingham Üniversitesi'ndeki Biyomedikal Hizmet Birimi'nde SPF koşulları altında yetiştirildi ve bakımı yapıldı. Bu protokolde açıklanan tüm prosedürler, hem yerel etik kurul hem de İçişleri Bakanlığı tarafından onaylanmış bir Proje Lisansı kapsamındadır.
1. Yenidoğan LN'lerinin İzolasyonu
<ol>
	<li>Yeni doğan fareleri servikal çıkık ile kurban edin.</li>
	<li>Başı bölümlere ayırın ve vücudu torasik bölgenin tepesinden karın bölgesinin altına kadar makasla açın ve tüm iç organları (kalp, akciğerler, karaciğer, bağırsak, böbrek, mesane) karın boşluğundan dikkatlice çıkarın.</li>
	<li>Vücudu RF10 ortamı (% 10 fetal sığır serumu, 100 U / ml penisilin, 100 mg / ml streptomisin ve 2 mM L-glutamin ile desteklenmiş RPMI1640 ortamı) içeren 2 mm'lik bir Petri kabına aktarın. Bu adımdan itibaren dokular steril koşullar altında tutulacak ve bir doku kültürü başlığında ele alınacaktır.</li>
	<li>Vücudu RF10 içeren yeni bir 90 mm Petri kabına aktarın.</li>
	<li>Diseksiyon mikroskobu altında, peritonu kasık bölgesindeki deriden dikkatlice ayırın. Kasık LN, yağ yastıkçığındaki üç kan damarının kesişme noktasında bulunur.</li>
	<li>LN'yi dikkatlice çıkarın. Tüm yağ dokusunun alındığından emin olun. LN'yi RF10 ortamı içeren 50 mm'lik bir Petri kabına aktarın. İşleme devam ederken dokuları buz üzerinde tutun.</li>
</ol>
2. E18.5 Yağ Yastıkçıklarının İzolasyonu
<ol>
	<li>Gebeliğin 18.5. gününde (E18.5) fare embriyoları oluşturmak için, gece boyunca kafes başına bir dişi ve bir erkek fare yerleştirerek zamanlanmış gebelikler ayarlayın. Sabahları fareleri ayırın ve vajinal tıkaç olup olmadığını kontrol edin (gebelik günü E0.5).
	<ol>
		<li>Gebeliğin 18.5. gününde tıkalı dişileri servikal çıkık ile ötenazi yapın.</li>
		<li>Embriyoları çıkarın ve RF10 içeren 90 mm'lik bir Petri Kabına yerleştirin.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Bu aşamadan itibaren dokular, doku kültürü başlığında steril teknik kullanılarak ele alınmalıdır. Diseksiyon mikroskobu altında, başı bölümlere ayırın, embriyoları torasik bölgeden karın bölgesinin dibine kadar makasla açın ve tüm iç organları (kalp, akciğerler, karaciğer, bağırsak, böbrek, mesane) vücut boşluğundan dikkatlice çıkarın.</li>
	<li>Vücudu kalan tüm iç organlardan temizleyin ve diseksiyonu daha zor hale getirebilecek tüm kan izlerini ortadan kaldırmak için PBS'de yıkayın.</li>
	<li>Temiz gövdeleri RF10 içeren 90 mm'lik yeni bir Petri kabına aktarın.</li>
	<li>Peritonu kasık bölgesindeki deriden dikkatlice ayırın. Kasık LN, yağ yastıkçığındaki üç kan damarının kesişme noktasında bulunur.</li>
	<li>LN'yi dikkatlice çıkarın ve atın. Kimeralar için kullanılan yağ yastığının herhangi bir lenfoid stromal hücre tarafından kontamine olmamasını sağlamak için LN'nin tamamen çıkarılması çok önemlidir.</li>
	<li>Kasık yağ pedini çıkarın ve RF10 ortamı içeren 50 mm'lik bir Petri kabına aktarın. İşleme devam ederken dokuları buz üzerinde tutun.</li>
</ol>
3. LN-fat Pad Chimera'nın Üretilmesi
<ol>
	<li>İn vitro organ kültürü sistemini hazırlayın15.
	<ol>
		<li>Sünger ve filtrelerin hazırlanması: Bu önceden yapılabilir ve süngerler ve filtreler kültür davlumbazındaki bir Petri kabında steril olarak saklanabilir.
		<ol>
			<li>Vulkan Underwrap'ı 1-1,5 cm,2 parça halinde kesin</li>
			<li>Süngerleri damıtılmış suda 2 saat kaynatın.</li>
			<li>Süngerleri hücre kültürü davlumbazında birkaç saat kurumaya bırakın.</li>
			<li>Filtreleri 20 dakika kaynatın.</li>
			<li>Filtreleri hücre kültürü davlumbazında birkaç saat kurumaya bırakın.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>% 10 fetal sığır serumu, 10 mM HEPES, 1x MEM Esansiyel Olmayan Amino Asit Çözeltisi, 50 mM 2-Merkaptoetanol, 100 U / ml penisilin, 100 mg / ml streptomisin ve 2 mM L-Glutamin ile tamamlanmış DMEM ortamını hazırlayın.</li>
		<li>50 mm'lik bir Petri kabına 2 ml ortam ekleyin.</li>
		<li>Petri kabının dibine bir sünger yerleştirin. Süngerin her iki tarafını da ortama batırarak ıslatın.</li>
		<li>Süngerin üzerine bir filtre yerleştirin. Filtre, sıvı-hava arayüzüne yerleştirilmiştir.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Diseksiyon mikroskobu altında, bir yenidoğan LN'yi bir embriyonik yağ pedi ile dikkatlice yeniden ilişkilendirin.</li>
	<li>LN yağ pedi kimerasını filtrenin üzerine yerleştirin.</li>
	<li>Petri kabını, nemden emin olmak için kapağında birkaç delik bulunan ve altta su bulunan dikdörtgen bir plastik kutuya aktarın.</li>
	<li>Kutunun kapağını bantla kapatın. Kapaktaki iki deliği açık bırakın.</li>
	<li>Kutuyu% 5 CO2 ile 37 ° C'de bir hücre kültürü inkübatörüne aktarın. Kapaktaki delikleri bantla kapatmadan önce kutunun 2 saat dengelenmesine izin verin.</li>
	<li>LN'nin yağ yastığına yapışmasını ve böbrek kapsülü altına aktarılabilmesini sağlamak için dokuları en az 2 gün inkübe edin.</li>
</ol>
4. LN-yağ pedi kimerasının konakçı farelerin böbrek kapsülü altına transferi
<ol>
	<li>LN-yağ pedi kimeralarını filtreden toplayın ve bunları konakçı farelerin böbrek kapsülünün altına aktarın. Böbrek kapsülü transfer yöntemi daha önce tarif edilmiştir 16.</li>
</ol>
5. Aktarılan LN'lerin İzolasyonu
<ol>
	<li>Böbrek kapsülünün altında 3-4 hafta sonra, LN yağ yastıkçıkları kimeraları hasat edilmeye hazırdır. Onaylanmış kılavuzu kullanarak konakçı farelere ötenazi yapın.</li>
	<li>Böbreği konakçı farelerden çıkarın.</li>
	<li>Diseksiyon mikroskobu altında, LN-yağ pedi kimerasını izole edin ve LN'yi inceleyin.</li>
</ol>
6. Akış-Sitometrik Analiz için Transfer Edilen LN'lerin Enzimatik Sindirimi
<ol>
	<li>Enzimlerin organa nüfuz etmesini sağlamak ve sindirimi kolaylaştırmak için LN'de küçük bir makasla bir kesi yapın.</li>
	<li>600 μl sindirim tamponu (RPMI% 1 FCS, 2.5 mg / ml Kollajenaz D, 100 μg / ml DNaz I) içeren 1.5 ml Eppendorf içine bir LN yerleştirin.</li>
	<li>Çalkalayıcı bir termal blok üzerinde 37 ° C'de 30 dakika inkübe edin. Her 10 dakikada bir dokuların ayrışmasına yardımcı olmak için yukarı ve aşağı pipetleyin.</li>
	<li>Tüpe 6 μl EDTA 0.5 M ekleyin ve dokuların ayrışmasını bitirmek için yukarı ve aşağı pipetleyin.</li>
	<li>490 x g'da 5 dakika santrifüjleyin.</li>
	<li>Hücre peletini, birincil antikorların kombinasyonunu içeren boyama çözeltisinde (PBS,% 0.1 BSA,% 5 sıçan serumu ve% 5 fare serumu) yeniden süspanse edin.</li>
	<li>Buz üzerinde 30 dakika inkübe edin.</li>
	<li>PBS'de iki kez yıkayın</li>
	<li>Gerekirse ikincil antikorlarla 20 dakika inkübe edin.</li>
	<li>PBS'de 2 kez yıkayın.</li>
	<li>Akış sitometresinde analiz edin.</li>
</ol>
7. Aktarılan LN'lerin İmmünofloresan ile Analizi
<ol>
	<li>Dondurma ve kriyoseksiyon işlemi sırasında EYFP koruması için fiksasyon: LN'yi PBS,% 4 PFA ve% 10 sükroz çözeltisine koyun ve 3-4 saat bekletin.</li>
	<li>Küçük bir alüminyum folyo parçası üzerine tek bir küçük damla soğuk OCT bileşiği koyun. Hava kabarcıklarından kaçının. LN'yi damlanın ortasına herhangi bir sıvı olmadan dikkatlice yerleştirin.</li>
	<li>Alüminyum folyoyu kuru buzun üzerine yerleştirerek organı dondurun.</li>
	<li>Bir kriyostat kullanarak ekstra yapışkanlı cam slaytlar üzerine 8-10 μm'lik bölümler kesin. Slaytları -20 °C'de saklamadan önce 2 saat kurumaya bırakın.</li>
	<li>Boyama prosedürleri, kullanılan primer antikorlara göre değişebilir ve aşağıdaki protokolden optimize edilebilir. Bölümleri, birincil antikorların kombinasyonunu içeren boyama çözeltisi (PBS,% 1 BSA) ile boyayın.</li>
	<li>Nemlendirilmiş bir odada oda sıcaklığında 1 saat inkübe edin.</li>
	<li>PBS'de 5 dakika boyunca iki kez yıkayın</li>
	<li>İkincil antikorlarla 1 saat inkübe edin.</li>
	<li>PBS'de 5 dakika boyunca iki kez yıkayın.</li>
	<li>Kızakları DAPI içeren montaj ortamına monte edin.</li>
	<li>Floresan veya konfokal mikroskop kullanarak görüntü yakalayın.</li>
</ol>

<ol><li>Mueller, S. N., Germain, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stromal+cell+contributions+to+the+homeostasis+and+functionality+of+the+immune+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Stromal cell contributions to the homeostasis and functionality of the immune system.</a> Nat. Rev. Immunol. 9, 618-629 (2009).</li>
<li>Roozendaal, R., Mebius, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stromal+cell-immune+cell+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Stromal cell-immune cell interactions.</a> Annu. Rev. Immunol. 29, 23-43 (2011).</li>
<li>Turley, S. J., Fletcher, A. L., Elpek, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+stromal+and+haematopoietic+antigen-presenting+cells+that+reside+in+secondary+lymphoid+organs%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">The stromal and haematopoietic antigen-presenting cells that reside in secondary lymphoid organs.</a> Nat. Rev. Immunol. 10, 813-825 (2010).</li>
<li>Katakai, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organizer-like+reticular+stromal+cell+layer+common+to+adult+secondary+lymphoid+organs%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Organizer-like reticular stromal cell layer common to adult secondary lymphoid organs.</a> J. Immunol. 181, 6189-6200 (2008).</li>
<li>Link, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibroblastic+reticular+cells+in+lymph+nodes+regulate+the+homeostasis+of+naive+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Fibroblastic reticular cells in lymph nodes regulate the homeostasis of naive T cells.</a> Nat. Immunol. 8, 1255-1265 (2007).</li>
<li>Benezech, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ontogeny+of+stromal+organizer+cells+during+lymph+node+development%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Ontogeny of stromal organizer cells during lymph node development.</a> J. Immunol. 184, 4521-4530 (2010).</li>
<li>Cupedo, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Presumptive+lymph+node+organizers+are+differentially+represented+in+developing+mesenteric+and+peripheral+nodes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Presumptive lymph node organizers are differentially represented in developing mesenteric and peripheral nodes.</a> J. Immunol. 173, 2968-2975 (2004).</li>
<li>Avan de Pavert, S., Mebius, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+insights+into+the+development+of+lymphoid+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">New insights into the development of lymphoid tissues.</a> Nat. Rev. Immunol. 10, 664-674 (2010).</li>
<li>Vondenhoff, M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LTbetaR+signaling+induces+cytokine+expression+and+up-regulates+lymphangiogenic+factors+in+lymph+node+anlagen%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">LTbetaR signaling induces cytokine expression and up-regulates lymphangiogenic factors in lymph node anlagen.</a> J. Immunol. 182, 5439-5445 (2009).</li>
<li>Dougall, W. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RANK+is+essential+for+osteoclast+and+lymph+node+development%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">RANK is essential for osteoclast and lymph node development.</a> Genes Dev. 13, 2412-2424 (1999).</li>
<li>Kim, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+peripheral+lymph+node+genesis+by+the+tumor+necrosis+factor+family+member+TRANCE%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">Regulation of peripheral lymph node genesis by the tumor necrosis factor family member TRANCE.</a> J. Exp. Med. 192, 1467-1478 (2000).</li>
<li>Carragher, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+stroma-derived+defect+in+NF-kappaB2-%2F-+mice+causes+impaired+lymph+node+development+and+lymphocyte+recruitment%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">A stroma-derived defect in NF-kappaB2-/- mice causes impaired lymph node development and lymphocyte recruitment.</a> J. Immunol. 173, 2271-2279 (2004).</li>
<li>White, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lymphotoxin+a-dependent+and+-independent+signals+regulate+stromal+organizer+cell+homeostasis+during+lymph+node+organogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Lymphotoxin a-dependent and -independent signals regulate stromal organizer cell homeostasis during lymph node organogenesis.</a> Blood. 110, 1950-1959 (2007).</li>
<li>Benezech, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lymphotoxin-beta+receptor+signaling+through+NF-kappaB2-RelB+pathway+reprograms+adipocyte+precursors+as+lymph+node+stromal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Lymphotoxin-beta receptor signaling through NF-kappaB2-RelB pathway reprograms adipocyte precursors as lymph node stromal cells.</a> Immunity. 37, 721-734 (2012).</li>
<li>Anderson, G., Jenkinson, E. J., Moore, N. C., Owen, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MHC+class+II-positive+epithelium+and+mesenchyme+cells+are+both+required+for+T-cell+development+in+the+thymus%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">MHC class II-positive epithelium and mesenchyme cells are both required for T-cell development in the thymus.</a> Nature. 362, 70-73 (1993).</li>
<li>Szot, G. L., Koudria, P., Bluestone, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transplantation+of+pancreatic+islets+into+the+kidney+capsule+of+diabetic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Transplantation of pancreatic islets into the kidney capsule of diabetic mice.</a> J. Vis. Exp. (9), e404(2007).</li>
<li>Krautler, N. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Follicular+dendritic+cells+emerge+from+ubiquitous+perivascular+precursors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Follicular dendritic cells emerge from ubiquitous perivascular precursors.</a> Cell. 150, 194-206 (2012).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

Bu makalede, yağ dokusu progenitör hücrelerinin gelişmekte olan LN'lere katkısını test etmek ve ölçmek için bir yöntem ve bunların soylarının analizine izin veren iki teknik sunduk. Embriyonik yağ yastıkçıklarının ve yenidoğan LN'lerinin diseksiyonu hassastır ve gerçek LN-yağ yastığı kimerasının oluşumundan önce birçok uygulama ile kazanılan el becerileri gerektirir. Diseksiyonların kalitesini kontrol etmek için yağ yastıkçıkları ve LN'ler üzerinde akış-sitometrik analiz yapılabilir. Embriyonik yağ yastıkçığı preparasyo...

Lenf düğümleri (LN'ler), lenfatik damar sistemi ağı boyunca vücudun stratejik bölgelerinde bulunan bağışıklık sisteminin kilit organlarıdır. Antijenlerin ve patojenlerin filtrasyonunu sağlarlar ve lenfositlere antijen sunumu ve adaptif immün yanıtların indüklenmesi için bir alan sağlarlar. LN'nin temel yapısını oluşturan ve adaptif immün yanıtın farklı hematopoietik katılımcılarının hareketini düzenleyen stroma, bu organların işlevinin merkezinde yer alır. Farklı stromal hücre popülasyonları, bağışıklık sisteminin hematopoietik bileşeninin hareketleri, lokalizasyonu, hayatta kalması, çoğalması ve olgunlaşması için gerekli ve spesifik ipuçları sağlar1-3. Yetişkin LN stromal hücreleri üç kategoriye ayrılır: kan endotel hücreleri, lenfatik endotel hücreleri ve fibroblastlar. Bu üç kategori heterojen popülasyonları kapsar. Fibroblastik popülasyonlar fibroblastik retiküler hücreler (FRC), foliküler dendritik hücreler (FDC), marjinal retiküler hücreler (MRC), kapsülü oluşturan fibroblastlar, medulla ve henüz tanımlanmamış diğer hücreleri içerir1-5. Farklı LN stromal hücre popülasyonlarının kökenleri ve olgunlaşmasını yöneten mekanizmalar belirsizdir ve spesifik LN stromal hücre popülasyonlarının kader haritasına izin veren spesifik belirteçlerin yokluğu, çalışmalarını özellikle zorlaştırmaktadır. Bununla birlikte, LN stromal hücrelerinin ontogenezisinin tam olarak anlaşılması, adaptif immün yanıtların, toleransa katkıda bulunan mekanizmaların anlaşılması için gereklidir ve yapay LN'lerin gelişiminin temelini oluşturur.
Şimdiye kadar, LN stromal hücre kökeni ve gelişimi üzerine yapılan çalışmalar, çoğunlukla vahşi tip farelerde ve farklı nakavt fare suşlarında6-9 embriyolarda ve yenidoğanlarda LN gelişiminin doğrudan değerlendirilmesi ile sınırlı kalmıştır. Bu yaklaşımlar, LN gelişimi için önemli olan genlerde delesyonlar taşıyan bazı fare suşlarının embriyonik ve perinatal ölümcüllüğü ile sınırlıdır. Ayrıca, lenfoid doku gelişimi için gerekli olan bazı genler, RANK10-11 veya NF-κB212'de olduğu gibi çok çeşitli biyolojik süreçlerde de yer almaktadır. Bu sorunları ele almak için, bir konakçı farenin böbrek kapsülü altında embriyonik LN'lerin izolasyonu ve transplantasyonu gerçekleştirilmiştir12-13. Bu teknik, örneğin, organ gelişimini ve konakçı hücrelerin işe alımını ve organizasyonunu değerlendirmek için genetik olarak değiştirilmiş embriyonik LN'lerin vahşi tip bir ortamda transferine izin verir. Bununla birlikte, yetişkin bir konağın böbrek kapsülü altına aşılanan embriyonik LN'nin büyümesi bozulur ve bu nedenle bu tekniğin kullanımı sınırlanır.
LN'ler ve yağ birikintileri anatomik olarak yakından ilişkilidir ve embriyogenez sırasında eş zamanlı olarak gelişirler. Yakın zamanda, LN/adipoz doku birlikteliğinin, LN'ler için stromal hücre progenitörlerinin sağlanmasında çok önemli bir rol oynadığını gösterdik. Özellikle, LTβR yoluyla sinyalleşme, adipogenezi bloke ederek ve bunun yerine bir LN stromal hücre fenotipi14'e doğru olgunlaşmayı teşvik ederek adiposit öncü hücrelerinin kaderini kontrol eder. Burada, gelişmekte olan LN'de yağ dokusundan türetilmiş hücrelerin izlenmesine izin veren LN-yağ pedi kimeralarının üretilmesine dayanan bir yöntemi açıklıyoruz. Bu yöntem, yağ dokularının farklı LN stromal hücre popülasyonlarına katkısını belirlemek için faydalı olacak ve genetik olarak değiştirilmiş fare suşlarından alınan dokuların kullanımı ile birleştirildiğinde, farklı LN stromal hücre alt kümelerinin farklılaşmasını kontrol eden mekanizmaların daha iyi anlaşılmasını sağlayacaktır.

<table><tbody><tr><td>2-Merkaptoetanol</td><td>Sigma</td><td>M3148</td><td></td></tr><tr><td>50 mm Sterilin Petri Kabı</td><td>Appleton Woods</td><td>SC265</td><td></td></tr><tr><td>90 mm Sterilin Petri Kabı</td><td>Appleton Woods</td><td>SC260</td><td></td></tr><tr><td>Yapışkanlı slaytlar</td><td>Surgipath</td><td>00202</td><td></td></tr><tr><td>Anti-fare CD31 eFluor 450 eBioscience</td><td></td><td>48-0311</td><td></td></tr><tr><td>Anti-fare CD4 Alexa 647</td><td>eBioscience</td><td>51-0041</td><td></td></tr><tr><td>Anti-fare CD45 PerCP-Cy5.5</td><td>eBioscience</td><td>45-0451</td><td></td></tr><tr><td>Anti-fare IgM Rhodamine Red</td><td>Stratech</td><td>715-296-020-JIR</td><td></td></tr><tr><td>Anti-fare Podoplanin PE / Cy7</td><td>Biolegend</td><td>127411</td><td></td></tr><tr><td>Anti-fare Podoplanin saflaştırılmış</td><td>eBioscience</td><td>14-5381</td><td></td></tr><tr><td>Kollajenaz D</td><td>Roche</td><td></td><td></td>11088858001</tr><tr><td>DMEM Orta</td><td>Sigma</td><td>D5671</td><td></td></tr><tr><td>DNase I</td><td>Sigma</td><td>DN25-1G</td><td></td></tr><tr><td>Dumont # 5 Forseps Inox Biologie</td><td>FST</td><td>11252-20</td><td>Embriyonik ve yenidoğan diseksiyonları için ekstra ince forseps</td></tr><tr><td>EDTA çözeltisi 0.5 M</td><td>Sigma</td><td>E7889</td><td></td></tr><tr><td>ERTR-7</td><td>Biogenesis</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fetal sığır serumu</td><td>Sigma</td><td>F9665</td><td></td></tr><tr><td>Sertleştirilmiş ince iris makası düz 11 cm</td><td>FST</td><td>14090-11</td><td>Diseksiyon için küçük makas</td></tr><tr><td>HEPES çözeltisi</td><td>Sigma</td><td>H0887</td><td></td></tr><tr><td>İzopor Membran Filtreler 0.8 & mu; m ATTP</td><td>Millipore</td><td>ATTPO 1300</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamin çözeltisi</td><td>Sigma</td><td>G7513</td><td></td></tr><tr><td>MEM Esansiyel Olmayan Amino Asit Çözeltisi (100x)</td><td>Sigma</td><td>M7145</td><td></td></tr><tr><td>OCT Bileşik</td><td>Doku-Tek</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>Penisilin-Streptomisin</td><td>Sigma</td><td>P4458</td><td></td></tr><tr><td>Kapaklı plastik kutu</td><td>Watkins ve Doncaster</td><td>E6052</td><td>in vitro organ kültürü için sandviç kutusu. CO2 inkübatörde gaz değişimine izin vermek için kapağa iki delik açın.</td></tr><tr><td>RPMI 1640 Orta Sigma</td><td></td><td>R0883</td><td></td></tr><tr><td>Süngerler Vulkan Underwrap</td><td>Patterson Medical</td><td>004383</td><td></td></tr><tr><td>Stereomikroskop</td><td>Leica</td><td>LEICA MZ95</td><td>Yakınlaştırmalı diseksiyon mikroskobu</td></tr><tr><td>Thermomixer</td><td>Eppendorf</td><td>5436</td><td></td></tr><tr>DAPI <td>Vektör Laboratuvarları</td><td>H-1200</td><td></td> <td>ile Vectashield Montaj Ortamı</td></tr></tbody></table>

lenf düğümü stromal hücre menşe Çalışmaları lenf-yağ pad kimeralar Üretimi

Generation of Lymph Node-fat Pad Chimeras for the Study of Lymph Node Stromal Cell Origin

Strom, lenf nodu yapısının ve fonksiyonunun önemli bir bileşenidir. Bununla birlikte, kökeni, kesin hücresel bileşimi ve oluşumunu yöneten mekanizmalar hakkında çok az şey bilinmektedir. Lenf nodları her zaman adipoz doku içinde kapsüllenir ve son zamanlarda lenf nodu stroması oluşumu için bu ilişkinin önemini gösterdik. Adiposit öncü hücreleri, gelişimi sırasında lenf noduna göç eder ve Lenfotoksin-b reseptörünün devreye girmesi üzerine adipogenezi kapatır ve lenfoid stromal hücrelere farklılaşır (Bénézech ve ark.14). Yağ dokusunun lenfoid stroma potansiyeline dayanarak, lenf nodu stromal hücre öncüllerinin soy izlemesine izin veren bir lenf nodu / yağ yastığı kimerası kullanan bir yöntem sunuyoruz. Yenidoğan lenf nodlarının ve EYFP + embriyonik yağ dokusunun nasıl izole edileceğini ve bir LN / EYFP + yağ yastığı kimerasının nasıl yapılacağını gösteriyoruz. Bir konakçı farenin böbrek kapsülü altına transfer edildikten sonra, lenf nodu lokal yağ dokusu öncü hücrelerini içerir ve oluşumunu tamamlar. Elde edilen lenf nodlarındaki EYFP + yağ yastıkçığı hücrelerinin döl analizi, enzimatik olarak sindirilen lenf nodlarının akış sitometrik analizi veya lenf nodlarının kriyoseksiyonlarının immünofloresan analizi ile gerçekleştirilebilir. Farklı nakavt fare modellerinden yağ pedleri kullanarak, bu yöntem farklı lenf nodu stromal hücre popülasyonlarının kökenini analiz etmenin etkili bir yolunu sağlayacaktır.

Transplantasyondan üç hafta sonra, LN/yağ pedi kimerası böbrekten geri alınır. Kimera artık kendi yağ pedi içindeki normal bir LN'ye çok benzerdir ve LN, adipoz dokunun merkezinde görünür durumdadır (Şekil 1). LN tanımlanamıyorsa, böbreğe transplantasyon sırasında kaybedilmiş olması mümkündür. LN gelişimi için potansiyel olarak önemli olan genlerin rolü değerlendirilirken, geri alınan LN'ler çok küçük kalabilir ve bulunmaları daha zor olabilir. LTβR-/- farelerinden alınan adipoz dokunun yeni d...

Lenf nodu stromal hücre orijininin incelenmesi için lenf nodu/yağ yastığı kimeralarının oluşturulması anlatılmaktadır. Yöntem, yeni doğan farelerden ve embriyonik yağ yastıkçıklarından lenf düğümlerinin izolasyonunu, kimerik lenf nodu yağ yastıkçıklarının oluşturulmasını ve bunların bir konakçı farenin böbrek kapsülü altına transferini içerir.

Lenf düğümü Stromal Hücre Menşe Çalışmaları Lenf-yağ Pad Kimeralar Üretimi

The stroma is a key component of the lymph node structure and function. However, little is known about its origin, exact cellular composition and the ...

Bu prosedürün genel amacı, adipoz dokunun lenf düğümü stromasının oluşumuna olan katkısını değerlendirmek için bir lenf düğümü yağ yastığı kimerası oluşturmaktır. Bu işlem, öncelikle yeni doğmuş farelerden lenf düğümlerinin ve 18,5 günlük fare embriyolarından yağ yastıklarının izole edilmesiyle gerçekleştirilir. Lenf düğümü embriyonik yağ yastığından çıkarılır ve yerine yeni doğmuş fare lenf düğümü yerleştirilir.Lenf düğümü yağ pedi kimerası, bir yeni doğmuş lenf düğümü ile bir embriyonik yağ pedinin in vitro ortamda yeniden birleştirilmesi ve ardından kültüre edilmesiyle oluşturulur. Daha sonra kimera, bir konak farenin böbrek kapsülü altına greftlenir. Transplantasyondan üç hafta sonra böbrek hasat edilir ve kimera geri alınır.Nihayetinde, yağ yastığından türetilen hücrelerin lenf düğümü stromasına olan katkısı, akış sitometrik ve immünofloresan mikroskobik analizlerle değerlendirilebilir. Bu yönteme dair ilk fikrimiz, yağ yastığından gelen hücrelerin lenf düğümlerinin oluşumuna katkıda bulunup bulunmadığını değerlendirmenin bir yolunu ararken ortaya çıktı. Yeni doğmuş inguinal lenf düğümlerini izole etmek için, baş bölgesini kestikten sonra bir makas yardımıyla hayvanın gövdesini göğüs bölgesinin üst kısmından karnın altına kadar açın.Karın boşluğundaki tüm viseral organlar dikkatlice çıkarıldıktan sonra, gövde RF 10 ortamı içeren 90 milimetrelik bir Petri kabına yerleştirin. Kabı steril bir doku kültürü davlumbazına yerleştirin ve ardından gövdeyi taze RF 10 içeren yeni, steril bir 90 milimetrelik Petri kabına aktarın. Ardından, kasık bölgesindeki peritonyumu deriden dikkatlice ayırın ve yağ yastığındaki üç kan damarının kesişme noktasında bulunan inguinal lenf düğümlerini bulun.Tüm adipoz dokunun temizlendiğinden emin olarak lenf nodlarını dikkatlice çıkarın. Ardından, 18,5 günlük embriyolardan inguinal yağ yastıklarını izole etmek için lenf nodlarını buz üzerinde RF 10 medyası içeren 50 milimetrelik bir Petri kabına yerleştirin. Az önce gösterildiği gibi viseral organları çıkardıktan sonra, tüm kan kalıntılarını temizlemek için gövdeleri steril PBS ile yıkayın.Temizlenmiş gövdeleri taze bir 90 milimetrelik Petri kabına aktarın; ardından peritonu ayırın, inguinal lenf nodunu lokalize edin ve az önce gösterildiği gibi çıkarın. İzole edilen dokuyu atın. Yağ yastığı kimerasının kontamine olmasını önlemek için lenf nodunun tamamının çıkarıldığından emin olun.Ardından inguinal yağ yastığını çıkarın ve buz üzerinde RF 10 medyası içeren 50 milimetrelik bir Petri kabına yerleştirin. In vitro organ kültürü sistemini kurmak için, önce bir miktar Vulcan under wrap'i 1 ila 1,5 santimetrekarelik parçalar halinde kesin. Daha sonra süngerleri iki saat, filtreleri ise 20 dakika boyunca distile suda kaynatın ve bir hücre kültürü davlumbazında birkaç saat boyunca kurumaya bırakın.Materyaller kuruduktan sonra, her birine iki mililitre besiyeri içeren 50 milimetrelik Petri kabına birer sünger yerleştirin. Her iki tarafı da ıslatmak için her süngeri besiyerine batırın ve ardından, her bir in vitro organ kültürü sistemindeki sıvı-hava arayüzüne birer filtre yerleştirin. Daha sonra, bir embriyonik yağ yastıkçığını bir yeni doğan lenf nodu ile doğrudan her filtrenin üzerine dikkatlice yeniden birleştirin.Petri kaplarını, tabanında su bulunan ve kapağında delikler olan dikdörtgen plastik bir kutuya aktarın. Delikleri açık bırakarak kapağı kutuya bantlayın. Ardından kutuyu 37 °C, %5 CO2 değerine sahip bir hücre kültürü inkübatörüne yerleştirin.Kutunun iki saat boyunca dengelenmesini sağlayın ve ardından kapaktaki delikleri bantla kapatın. Nakilden üç ila dört hafta sonra böbrek kapsülü altına transfer edilmeden önce, lenf düğümlerinin yağ pedlerine tutunmasını sağlamak için dokuları en az iki gün inkübe edin. Her böbrekteki her bir lenf düğümü yağ pedi kimerasını izole edin ve lenf düğümlerini diseke ederek çıkarın.Ardından, enzimatik sindirime yardımcı olmak için her bir lenf noduna küçük bir makasla doku üzerinde tek bir insizyon yapın. Daha sonra, her bir lenf nodunu 600 µL sindirim tamponu içeren ayrı 1,5 mL'lik eppendorf tüplerine yerleştirin. Tüpleri, dokunun ayrışmasına yardımcı olmak için her 10 dakikada bir pipetle yukarı-aşağı çekerek, ajite eden bir termal blok üzerinde 37 °C'de 30 dakika boyunca inkübe edin.Ardından tüplere altı µL EDTA ekleyin ve disosiasyonu tamamlamak için hücre süspansiyonunu birkaç kez trite edin. Daha sonra, geliştirilmiş sarı floresan protein (EYFP) ekspresyonunu korumak amacıyla hücreler, ilgilenilen antikorlarla boyanabilir ve akış sitometrisi ile analiz edilebilir. Lenf düğümlerini üç ila dört saat boyunca fikse edin.Ardından her bir lenf nodu için, küçük bir alüminyum folyo parçasına bir damla soğuk OCT bileşiği damlatın. Hava kabarcığı oluşmamasına dikkat ederek, her bir damlanın ortasına bir lenf nodu yerleştirin ve dokuları dondurmak için folyoyu kuru buz üzerine koyun. Lenf nodları daha sonra kesite ayrılabilir, boyanabilir ve floresan mikroskobu ile analiz edilebilir.Lenf düğümünün dikkatli bir şekilde izole edilmesi, EYFP pozitif adipoz kaynaklı hücrelerin soyunun daha ayrıntılı analiz edilmesine olanak tanır. Lenf düğümünün kriyoseksiyonları ve immünofloresan analizi, EYFP pozitif adipoz kaynaklı hücrelerin lenf düğümüne göç ettiğini ve burada GP 38 pozitif ER-TR7 pozitif lenf düğümü stromal hücre ağına katkıda bulunduğunu ortaya koymaktadır. Akış sitometrik analiz, lenf düğümü stromal hücrelerinin önemli bir kısmının yerel EYFP pozitif adipoz doku progenitör hücrelerinden türediğini doğrulamakta; bu hücreler CD 45 negatif GP 38 pozitif CD 31 negatif fibroblastik fraksiyonun %30'una ve CD 45 negatif GP 38 negatif CD 31 pozitif kan endotel hücresi fraksiyonunun %10'una katkı sağlamaktadır. CD 45 negatif GP 38 pozitif CD 31 negatif fibroblastik fraksiyonun %80'e kadarı adipoz doku öncül hücrelerinden türeyebilmektedir, bu da adipoz dokunun lenf düğümü stromasının büyümesini sürdürmede oynadığı kritik rolü göstermektedir. Bu nedenle, lenfoid stroma gelişiminde rol oynayan farklı molekülleri araştırmak için lenfoid organogenez alanında çalışan bir araştırmacı bu tekniği uzmanlaşarak kullanabilir.

generation-lymph-node-fat-pad-chimeras-for-study-lymph-node-stromal

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Bu video hazırlanması 2-dGuo tedavi timus kültürler gösterilmiştir reaggregate.

Thymus Kültürler Reaggregate

Lenf nodu stromal hücrelerinin izolasyonu, fibroblastik retiküler hücreler, lenfatik ve kan endotel hücreleri elde etmek için enzimatik sindirim ve mekanik ayrıştırmayı içeren çok aşamalı bir prosedürdür. Tarif edilen prosedürde, canlı lenf nodu stromal hücrelerinin yüzey işaretleyici bozulmasını en aza indirmek için kısa bir sindirim otomatik mekanik ayrıştırma ile birleştirilir.

Kemirgen Lenf Düğümü Stromal Hücrelerinin İzolasyonu

Bu çalışma, mikroskopik gözlem için tüm montaj dokusu hazırlığının ardından meme yağ padi transplantasyonu yoluyla vasküler endotel kök hücrelerinin (VESC'lerin) çoğalmasını, farklılaşmasını ve damar oluşturma potansiyelini değerlendirmek için yeni bir yaklaşımı göstermektedir. VESC'lerin in vivo davranışlarını araştırmak için bir soy izleme stratejisi de sunulmuştur.

Vasküler Endotelyal Kök Hücrelerin Damar Oluşumunu Görselleştirmek İçin Yeni Bir Göğüs Göğsü Transplantasyon Tekniği

Bu makalede, üç boyutlu (3D) timik kültür sistemi tarafından tümör antijene özgü indüklenen pluripotent kök hücre kaynaklı timik göçmenler (iTE) oluşturmak için yeni bir yöntem açıklanmaktadır. iTE, proliferasyon, hafıza oluşumu ve tümör baskılanması kapasitesine sahip naif T hücreleri ile yakından ilişkili T hücrelerinin homojen bir alt kümesidir.

Üç boyutlu Timik Kültür Sistemi Murine indüklenen Pluripotent Kök Hücre kaynaklı Tümör Antijen-spesifik Timik Emigrants oluşturmak için

Bu protokol, organ yapısında değişiklik olmadan lenf düğümlerini boşaltmada farklı hücre popülasyonlarını görüntüleyen bir tekniği tanımlar.

Ex-Vivo Konfokal Mikroskopi ile Lenf Nodal Yapısı nın Ve Hücresel Lokalizasyonun Görselleştirilmesi

Bu iletişim kuralı hangi autoreactive photoactivatable yeşil flüoresan protein (PA-GFP) muhabir lenfositleri taşımak spontan otoimmün germinal merkezleri ile karışık fare kemik iliği chimeras nesil açıklar. Bu hücresel aşağı akım moleküler ve fonksiyonel analizleri kurcalayarak konumda bağlantı olanağı sağlar.

Bireysel Autoreactive Germinal merkezleri Photoactivation otoimmünite, karışık Chimeric modeli tarafından sorguya

Bu makalede, alıcı hayvanların interscapular beyaz yağ yastığı içine donör sıçan meme epitel hücreleri greft bir transplantasyon yöntemi açıklanmaktadır. Bu yöntem, meme epitel gelişimi üzerindeki konak ve/veya donör etkilerini incelemek ve ön temizleme ihtiyacını ortadan kaldırmak ve böylece bu tekniğin kullanışlılığını genişletmek için kullanılabilir.

Interscapular Beyaz Yağ Ped içine Rat Mammary Epitel Hücre Nakli

Bu protokol, adipojenik ve fibro-inflamatuar stromal hücre alt popülasyonlarını murin karın içi beyaz yağ dokusu (WAT) depolarından floresanla aktive edilen hücre sınıflandırması veya immünmanyetik boncuk ayırma yoluyla izole etmek için teknik yaklaşımı açıklar.

Murin İntraabdominal Yağ Depolarından Adipojenik ve Fibroinflamatuar Stromal Hücre Alt Popülasyonlarının İzolasyonu

Burada sunulan deneysel tasarım, lenf nodu (LN) metastazı sırasında antijene özgü CD8+ T hücrelerinin çalışmaları için yararlı bir üreme modeli sağlar, bu da seyirci CD8+ T hücrelerinin bozulmasını dışlar.

Tümör Oluşumu Sırasında Antijene Özgü CD8+ T Hücrelerinin Dinamiğinin Değerlendirilmesi için Drenaj Lenf Nodu Metastazı Modeli

Bu makale, yarı katı bir bazal membran matrisi içinde dalak hücrelerini toplamak ve kapsüllemek için bir protokolü açıklamaktadır. Bazal membran matris yapıları, organoid gelişimini incelemek için veya in vivo transplantasyon ve doku rejenerasyon çalışmaları için üç boyutlu kültürde kullanılabilir.

Murin Dalak Dokusu Oluşumunu Araştırmak için Bazal Membran Matris Kapsüllü Hücre Agregasyonu

Keşfedin lenf düğümü-yağ pad kimerası üretimini; yeni doğan farelerden lenf düğümleri ve embriyonik yağ pedleri izole edilerek böbrek kapsülü altına nakledilir. Bu yöntem lenf düğümü stromal hücre menşeini incelemek için kullanılır.

Lenf düğümü Stromal Hücre Menşe Çalışmaları Lenf-yağ Pad Kimeralar Üretimi

Daha fazla video keşfet