Sıralanması Streptomyces Hücre Peletleri
13 Şubat 2014
Sıvı yetiştirilen Streptomyces kültürleri boyut olarak heterojen misel topaklar ile karakterize edilir. Burada analiz etmek için bir yöntem tarif ve yüksek verimli bir şekilde bu sıralama peletler. Bu pelet büyüme heterojenitesini anlamak ve kontrol etmek için yol sağlayacak ileri analizler için kullanılabilir.
Bu prosedürün genel amacı, filamentli streptomyces tarafından oluşturulan misel peletlerini büyük parçacıklı bir COPA akış sitometresi kullanarak boyutlarına göre sıralamaktır. Bu, önce istenen bakteri suşunun büyümesi ve ardından örneklenmesi ile gerçekleştirilir. İkinci adımda, numune suşu coppa ile ölçülür.
Veriler daha sonra in silico olarak analiz edilir ve misel peletleri kullanıcı tanımlı parametrelere göre sıralanır. Sonuç olarak, bu analizler pelet boyutu heterojenliğini daha fazla karakterize etmek için kullanılabilir. Bu yöntem streptomyces için kullanılabilse de, filamentli mantarlar gibi diğer organizmalara da uygulanabilir, bu prosedürün laboratuvarımızdan bir doktora öğrencisi olan MaRous Petrus olacağını göstermektedir.
İlk olarak, her bakteri numunesi için metal sarmal yaylarla donatılmış steril 250 mililitrelik bir erlenmeyer şişesine 100 mililitre maya özütü, malt özü ortamı ve 0.2 mililitre 2.5 molar magnezyum klorür ekleyerek kültürleri büyütün. Daha sonra, mililitrede bir kez 10 ila altı sporluk bir spor konsantrasyonu elde etmek için her bir şişeyi bir kez 10 ila sekiz streptomyces sporu ile aşılayın ve bakterileri 180 RPM'de çalkalayarak 30 santigrat derecede büyütün. İki gün sonra, hücreleri eşit şekilde dağıtmak için şişeyi hafifçe sallarken, her kültürden beş mililitrelik bir numune almak için steril beş mililitrelik bir pipet kullanın.
Daha sonra her bir numuneyi ayrı ayrı 15 mililitrelik konik tüplere dağıtın. Numuneleri copus analizi ile değerlendirmek için copus plus pompa bilgisayarının ve 488 nanometre argon lazerin açık olduğunu onaylayın ve ardından biyo kaynak yazılımını açın. Kılıf sıvı şişesinin dolu olduğunu ve atık şişesinin boş olduğunu onaylayın ve ardından başlat ve çalıştır'a tıklayın.
488 nanometre argon lazeri yaklaşık 60 saniye sonra bekleme modundan açık konuma getirmek için lazer hazır olacaktır. Bitti'ye tıklayın ve ardından basınç göstergelerini kontrol edin. Basınç'ın yanındaki onay kutusunu tıklayın.
Tamam ve ardından sistem akış hücresini hazırladıktan sonra, gecikme ayarının 11'de ve genişliğin yedi'de olduğunu onaylayın. Eşikleri sinyal için 50 ve minimum uçuş süresi için 40 olarak ayarlayın. Ardından numune kabından kalan suyu çıkarın.
Yaklaşık 50 mililitre PBS ekleyin ve ardından strep demy örneklerinden birinin 0.1 mililitresini bardağa ekleyin. Bardağın düzgün bir şekilde kapatıldığından emin olun ve ardından veri toplamaya başlamak için edin'e tıklayın. En az 2.500 olay toplandığında saniyede 30 ila 50 olay elde etmek için akış hızını yönetin.
Her numune için bakteri peletlerini sıralamak üzere sonraki istatistiksel analiz için verileri kaydetmek üzere tıklayın, durdurun ve ardından saklayın. Önce sıralama limitlerini ayarlayın ve minimum ve maksimum uçuş süresi değerleriyle ilgili ayrıntıları girin. Alternatif olarak, bölgeleri seçin ve ardından istenen boyutlara ve özelliklere sahip peletleri seçmek için bir alan oluşturmak için geçit bölgesini tanımlayın.
Sıralama parametrelerini karşılayan peletleri toplamak için 50 mililitrelik bir tüp yerleştirin. Ardından sıralanacak pelet sayısını ayarlayın ve seçilen parametreler için sıralamak için manuel olarak sırala'ya tıklayın. Ayırma işleminden sonra, kalan numuneyi çıkarın ve numune kabını iki kez suyla durulayın.
Copus'u kapatmadan önce, numune kabını %70 etanol ile temizleyin. Şimdi sistemi iki kez çalıştırın. Bir kez klorlu su ile ve bir kez sade su ile, ardından taşma kabını boşaltın Temizledikten sonra, sistemdeki basıncı boşaltmak için durdur'a tıklayın.
Motor durduğunda programı kapatın ve temizlemeden kapat'a tıklayın. Ardından bilgisayarı, kopayı, lazeri ve pompa streptomyces formunu kapatın. Çok çeşitli boyutlara sahip misel peletleri ve sıvı kültürler.
Pelet boyutu dağılımını analiz etmek için, iki günlük sıvı yetiştirilen streptomyces cila renk kültürü, bir milimetrelik bir nozul ile donatılmış bir copus plus profilleyici kullanılarak büyük partikül akış sitometrisine tabi tutuldu. Burada, tipik bir kopus çıktı dağılım grafiği gösterilmektedir. X ekseni uçuş süresini temsil eder.
Temyiz ne kadar büyükse, lazer ışınının geçmesi o kadar uzun sürer. Y ekseni, nesnenin optik yoğunluğunu temsil eden sönmeyi gösterir, içindeki her nokta lazer ışınından geçen tek bir pelete karşılık gelir. Veri noktalarının bir histograma çizilmesi, bu temsili örnekten elde edilen boyutların normal olarak dağılmadığını gösterdi.
Dağıtım, doğru günlüğe göre eğri görünüyordu. Veri setinin dönüştürülmesi de normal bir dağılıma yol açmadı, boyut dağılımının iki normal dağılımın bir karışımı varsayılarak açıklanıp açıklanamayacağını değerlendirmek için veriler matematiksel olarak modellendi. Modelleme gerçekten de, ortalama 248 mikrometre büyüklüğündeki tüm peletlerin %92'sini oluşturan küçük bir pelet popülasyonunu ve ortalama 319 mikrometre büyüklüğündeki tüm peletlerin %8'ini oluşturan büyük pelet popülasyonunu gösterdi.
Burada, büyük ve küçük pelet popülasyonlarından sıralanan mikro kolonilerin temsili bir analizi gösterilmektedir. İki popülasyonun ortalama pelet boyutları, iki boyut dağılımının örtüşen kısmından peletlerin sınıflandırılmasını sınırlamak için sıralama sınırlarını tanımlamak için kullanıldı, 248 mikrometreden küçük peletlerin küçük pelet popülasyonundan olduğu kabul edilirken, 319 mikrometreden büyük peletlerin büyük pelet popülasyonundan olduğu kabul edildi. Sıralanan peletlerin mikroskobik analizi, bu prosedürü takiben farklı boyutlarını doğruladı.
Bu heterojenliğin altında yatan mekanizmaları çözmek için yeni nesil dizileme veya proteomik gibi diğer yöntemler de gerçekleştirilebilir.
Genel Bakış
Bu çalışma, büyük parçacık COPA akış sitometresi kullanarak sıvıda yetiştirilen Streptomyces kültürlerinden miselyal peletleri boyutlarına göre sıralama yöntemi sunmaktadır. Bu yaklaşım, pelet boyutu heterojenliğinin yüksek verimli analizini sağlar ve bu da büyüme kontrolü hakkında bilgiler sağlayabilir.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Bilim Alanı
- Mikrobiyoloji
- Hücre Biyolojisi
- Biyoteknoloji
Arka Plan
- Streptomyces, karmaşık yaşam döngüleriyle bilinen filamentli bakterilerdir.
- Büyüme sırasında oluşan miselyal peletler boyut heterojenliği sergiler.
- Bu heterojenliği anlamak, biyoteknolojideki uygulamalar için önemlidir.
- Akış sitometresi, parçacık boyutunu yüksek verimli bir şekilde analiz etmek için bir yöntem sunar.
Çalışmanın Amacı
- Miselyal peletleri boyutlarına göre sıralama yöntemi geliştirmek.
- Streptomyces peletlerinin boyut dağılımını analiz etmek.
- Büyüme heterojenliği üzerine daha fazla çalışma için bir çerçeve sağlamak.
Kullanılan Yöntemler
- Kontrollü bir ortamda Streptomyces kültürlerinin büyütülmesi.
- Akış sitometre analizi için kültürlerin örneklenmesi ve hazırlanması.
- Pelletleri boyutlarına göre ölçmek ve sıralamak için COPA akış sitometresi kullanımı.
- Boyut dağılımının istatistiksel analizi ve pelet popülasyonlarının modellenmesi.
Ana Sonuçlar
- Boyuta göre iki farklı pelet popülasyonunun tanımlanması.
- Küçük peletlerin ortalama 248 mikrometre, büyük peletlerin ortalama 319 mikrometre olduğu tespit edildi.
- Boyut dağılımı normal dağılım göstermedi, bu da önemli heterojenlik olduğunu gösterdi.
- Mikroskopik analiz, sıralanmış peletlerin farklı boyutlarını doğruladı.
Sonuçlar
- Geliştirilen yöntem, miselyal peletleri boyutlarına göre etkili bir şekilde sırar.
- Daha fazla analiz, boyut heterojenliğinin arkasındaki mekanizmaları aydınlatabilir.
- Bu yaklaşım, diğer filamentli organizmalar için de uyarlanabilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
Heterogeneity in mycelial pellet size directly impacts productivity in streptomycetes-based antibiotic and enzyme production, creating a bottleneck in cell factory optimization. Sorting pellets by size enables mechanistic de-risking of growth variability and supports predictive confidence in strain performance. This capability informs early discovery decisions by linking phenotypic output to bioprocess scalability.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of growth heterogeneity hypotheses by isolating defined pellet subpopulations.
- Operational Value: Provides reproducible fractionation of mycelial pellets for downstream omics or phenotypic screening.
- Strategic Value: Supports target validation by linking pellet size to productivity traits in streptomycetes cell factories.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates size-sorted pellet fractions for standardized assay inputs in enzyme or metabolite screening.
- Operational Value: Delivers quantitative time-of-flight and extinction measurements for pellet classification.
- Strategic Value: Facilitates assay standardization by reducing biological noise from pellet size variability.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Enables continuity from discovery to preclinical scale by providing sorted pellets for RNA, protein, or omics analysis.
- Operational Value: Supports scalable sample preparation for mechanistic studies underlying pellet heterogeneity.
- Strategic Value: Informs risk-adjusted advancement by identifying size-correlated productivity markers.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into early discovery workflows by enabling phenotypic screening of pellet subpopulations prior to lead identification and preclinical validation.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of growth mechanisms through size-based pellet fractionation.
- Screening: Delivers assay-ready, size-homogeneous pellet samples for compound or condition testing.
- Analytics: Provides time-of-flight and extinction readouts for quantitative pellet classification and sorting.
- Translational Research: Connects sorted pellets to downstream molecular analysis for biomarker or mechanism discovery.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for pellet analysis across streptomycetes strain development programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity in growth studies by enabling isolation of defined pellet populations.
- Operational Value: Ensures reproducibility and standardization in pellet analysis across batches and strains.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by linking pellet size to productivity outcomes.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of streptomycetes strains based on size-sorted productivity data.
Implementation Considerations
- Requires expertise in flow cytometry and streptomycetes culture handling.
- Dependent on large particle COPAS instrumentation with appropriate nozzle and laser configuration.
- Necessitates standardization of sample preparation and sheath fluid protocols across users.
- Involves adaptation of sorting gates for different pellet size ranges in various filamentous systems.
- Limited by the need for optimization of flow rates and threshold settings for accurate pellet detection.
