Sıralanması Streptomyces Hücre Peletleri

Bu prosedürün genel amacı, filamentli streptomyces tarafından oluşturulan misel peletlerini büyük parçacıklı bir COPA akış sitometresi kullanarak boyutlarına göre sıralamaktır. Bu, önce istenen bakteri suşunun büyümesi ve ardından örneklenmesi ile gerçekleştirilir. İkinci adımda, numune suşu coppa ile ölçülür.

Veriler daha sonra in silico olarak analiz edilir ve misel peletleri kullanıcı tanımlı parametrelere göre sıralanır. Sonuç olarak, bu analizler pelet boyutu heterojenliğini daha fazla karakterize etmek için kullanılabilir. Bu yöntem streptomyces için kullanılabilse de, filamentli mantarlar gibi diğer organizmalara da uygulanabilir, bu prosedürün laboratuvarımızdan bir doktora öğrencisi olan MaRous Petrus olacağını göstermektedir.

İlk olarak, her bakteri numunesi için metal sarmal yaylarla donatılmış steril 250 mililitrelik bir erlenmeyer şişesine 100 mililitre maya özütü, malt özü ortamı ve 0.2 mililitre 2.5 molar magnezyum klorür ekleyerek kültürleri büyütün. Daha sonra, mililitrede bir kez 10 ila altı sporluk bir spor konsantrasyonu elde etmek için her bir şişeyi bir kez 10 ila sekiz streptomyces sporu ile aşılayın ve bakterileri 180 RPM'de çalkalayarak 30 santigrat derecede büyütün. İki gün sonra, hücreleri eşit şekilde dağıtmak için şişeyi hafifçe sallarken, her kültürden beş mililitrelik bir numune almak için steril beş mililitrelik bir pipet kullanın.

Daha sonra her bir numuneyi ayrı ayrı 15 mililitrelik konik tüplere dağıtın. Numuneleri copus analizi ile değerlendirmek için copus plus pompa bilgisayarının ve 488 nanometre argon lazerin açık olduğunu onaylayın ve ardından biyo kaynak yazılımını açın. Kılıf sıvı şişesinin dolu olduğunu ve atık şişesinin boş olduğunu onaylayın ve ardından başlat ve çalıştır'a tıklayın.

488 nanometre argon lazeri yaklaşık 60 saniye sonra bekleme modundan açık konuma getirmek için lazer hazır olacaktır. Bitti'ye tıklayın ve ardından basınç göstergelerini kontrol edin. Basınç'ın yanındaki onay kutusunu tıklayın.

Tamam ve ardından sistem akış hücresini hazırladıktan sonra, gecikme ayarının 11'de ve genişliğin yedi'de olduğunu onaylayın. Eşikleri sinyal için 50 ve minimum uçuş süresi için 40 olarak ayarlayın. Ardından numune kabından kalan suyu çıkarın.

Yaklaşık 50 mililitre PBS ekleyin ve ardından strep demy örneklerinden birinin 0.1 mililitresini bardağa ekleyin. Bardağın düzgün bir şekilde kapatıldığından emin olun ve ardından veri toplamaya başlamak için edin'e tıklayın. En az 2.500 olay toplandığında saniyede 30 ila 50 olay elde etmek için akış hızını yönetin.

Her numune için bakteri peletlerini sıralamak üzere sonraki istatistiksel analiz için verileri kaydetmek üzere tıklayın, durdurun ve ardından saklayın. Önce sıralama limitlerini ayarlayın ve minimum ve maksimum uçuş süresi değerleriyle ilgili ayrıntıları girin. Alternatif olarak, bölgeleri seçin ve ardından istenen boyutlara ve özelliklere sahip peletleri seçmek için bir alan oluşturmak için geçit bölgesini tanımlayın.

Sıralama parametrelerini karşılayan peletleri toplamak için 50 mililitrelik bir tüp yerleştirin. Ardından sıralanacak pelet sayısını ayarlayın ve seçilen parametreler için sıralamak için manuel olarak sırala'ya tıklayın. Ayırma işleminden sonra, kalan numuneyi çıkarın ve numune kabını iki kez suyla durulayın.

Copus'u kapatmadan önce, numune kabını %70 etanol ile temizleyin. Şimdi sistemi iki kez çalıştırın. Bir kez klorlu su ile ve bir kez sade su ile, ardından taşma kabını boşaltın Temizledikten sonra, sistemdeki basıncı boşaltmak için durdur'a tıklayın.

Motor durduğunda programı kapatın ve temizlemeden kapat'a tıklayın. Ardından bilgisayarı, kopayı, lazeri ve pompa streptomyces formunu kapatın. Çok çeşitli boyutlara sahip misel peletleri ve sıvı kültürler.

Pelet boyutu dağılımını analiz etmek için, iki günlük sıvı yetiştirilen streptomyces cila renk kültürü, bir milimetrelik bir nozul ile donatılmış bir copus plus profilleyici kullanılarak büyük partikül akış sitometrisine tabi tutuldu. Burada, tipik bir kopus çıktı dağılım grafiği gösterilmektedir. X ekseni uçuş süresini temsil eder.

Temyiz ne kadar büyükse, lazer ışınının geçmesi o kadar uzun sürer. Y ekseni, nesnenin optik yoğunluğunu temsil eden sönmeyi gösterir, içindeki her nokta lazer ışınından geçen tek bir pelete karşılık gelir. Veri noktalarının bir histograma çizilmesi, bu temsili örnekten elde edilen boyutların normal olarak dağılmadığını gösterdi.

Dağıtım, doğru günlüğe göre eğri görünüyordu. Veri setinin dönüştürülmesi de normal bir dağılıma yol açmadı, boyut dağılımının iki normal dağılımın bir karışımı varsayılarak açıklanıp açıklanamayacağını değerlendirmek için veriler matematiksel olarak modellendi. Modelleme gerçekten de, ortalama 248 mikrometre büyüklüğündeki tüm peletlerin %92'sini oluşturan küçük bir pelet popülasyonunu ve ortalama 319 mikrometre büyüklüğündeki tüm peletlerin %8'ini oluşturan büyük pelet popülasyonunu gösterdi.

Burada, büyük ve küçük pelet popülasyonlarından sıralanan mikro kolonilerin temsili bir analizi gösterilmektedir. İki popülasyonun ortalama pelet boyutları, iki boyut dağılımının örtüşen kısmından peletlerin sınıflandırılmasını sınırlamak için sıralama sınırlarını tanımlamak için kullanıldı, 248 mikrometreden küçük peletlerin küçük pelet popülasyonundan olduğu kabul edilirken, 319 mikrometreden büyük peletlerin büyük pelet popülasyonundan olduğu kabul edildi. Sıralanan peletlerin mikroskobik analizi, bu prosedürü takiben farklı boyutlarını doğruladı.

Bu heterojenliğin altında yatan mekanizmaları çözmek için yeni nesil dizileme veya proteomik gibi diğer yöntemler de gerçekleştirilebilir.