Sıralanması

Bu prosedürün genel amacı, filamentöz streptomyces tarafından oluşturulan miselyum peletlerini, büyük partikül COPA akış sitometresi kullanarak boyutlarına göre ayırmaktır. Bu işlem, öncelikle istenen bakteri suşunun büyütülmesi ve ardından örneklenmesiyle gerçekleştirilir. İkinci adımda, örnek suş coppa ile ölçülür.

Ardından veriler in silico olarak analiz edilir ve miselyum peletleri kullanıcı tanımlı parametrelere göre sınıflandırılır. Nihayetinde, bu analizler pelet boyutu heterojenliğini daha detaylı karakterize etmek için kullanılabilir. Bu yöntem streptomyces türleri için kullanılabileceği gibi, filamentli mantarlar gibi diğer organizmalara da uygulanabilir; bu prosedür laboratuvarımızdan doktora öğrencisi MaRous Petrus tarafından gösterilecektir.

İlk olarak, her bir bakteri örneği için metal sarmal yaylarla donatılmış steril bir 250 mililitrelik erlenmeyer flask içerisine 100 mililitre maya ekstresi, malt ekstresi besiyeri ve 0,2 mililitre 2,5 molar magnezyum klorür ekleyerek kültürleri büyütün. Ardından, mililitre başına 1 x 10⁶ spor konsantrasyonu elde etmek için her bir flaskı 1 x 10⁸ streptomyces sporu ile inoküle edin ve bakterileri 30 °C'de, 180 RPM hızında çalkalayarak büyütün. İki gün sonra, hücrelerin eşit şekilde dağılması için flaskı hafifçe çalkalarken, her bir kültürden 5 mililitrelik bir örnek toplamak için steril bir 5 mililitrelik pipet kullanın.

Ardından her bir örneği ayrı 15 mililitrelik konik tüplere dağıtın. Örnekleri copus analizi ile değerlendirmek için, copus artı pompa bilgisayarının ve 488 nanometre argon lazerin açık olduğunu doğrulayın ve ardından bio source yazılımını açın. Kılıf sıvısı şişesinin dolu ve atık şişesinin boş olduğunu doğrulayın, ardından start ve run butonlarına tıklayın.

488 nanometre argon lazerini bekleme modundan açık konuma getirmek için tıklayın; yaklaşık 60 saniye sonra lazer hazır olacaktır. "Done" düğmesine tıklayın ve ardından basınç göstergelerini kontrol edin. Basınç seçeneğinin yanındaki onay kutusunu işaretleyin.

Tamam, sistem akış hücresini hazırladıktan sonra, gecikme ayarının 11 ve genişliğin yedi olduğundan emin olun. Eşikleri sinyal için 50 ve minimum uçuş süresi için 40 olarak ayarlayın. Ardından numune kabındaki kalan suyu boşaltın.

Yaklaşık 50 mililitre PBS ekleyin ve ardından strep demy örneklerinden birinin 0,1 mililitresini kaba ekleyin. Kabın düzgünce kapatıldığından emin olun ve ardından veri toplamaya başlamak için acquire düğmesine tıklayın. En az 2.500 olay toplandığında, saniyede 30 ile 50 arasında olay elde edecek şekilde akış hızını ayarlayın.

Her örnek için bakteri peletlerini ayıklamak üzere, verileri sonraki istatistiksel analizler için kaydetmek için tıklayın, durdurun ve ardından depolayın. Öncelikle ayıklama sınırlarını belirleyin ve minimum ile maksimum uçuş süresi değerleri hakkındaki ayrıntıları girin. Alternatif olarak, istenen boyut ve özelliklere sahip peletleri seçmek için bir alan oluşturmak amacıyla bölgeleri seçin ve ardından kapı bölgesini tanımlayın.

Sıralama parametrelerini karşılayan pelletleri toplamak için 50 mililitrelik bir tüp yerleştirin. Ardından sıralanacak pellet sayısını ayarlayın ve seçilen parametrelere göre sıralama yapmak için manuel sırala (sort manually) düğmesine tıklayın. Sıralama işleminden sonra, kalan örneği çıkarın ve örnek kabını iki kez suyla durulayın.

Cihazı kapatmadan önce, numune kabını %70 etanol ile temizleyin. Ardından sistemi iki kez çalıştırın. Bir kez klorlu suyla ve bir kez saf suyla çalıştırdıktan sonra taşma haznesini boşaltın. Temizleme işleminden sonra, sistemdeki basıncı tahliye etmek için durdur düğmesine tıklayın.

Motor durduğunda, programı kapatın ve temizleme yapmadan kapat'a tıklayın. Ardından bilgisayarı, copa'yı, lazeri ve pompayı kapatın streptomyces form. Geniş bir boyut aralığına sahip misel peletleri ve sıvı kültürler.

Pelet boyut dağılımını analiz etmek için, iki günlük sıvı kültürde büyütülmüş streptomyces cila color kültürü, bir milimetrelik nozul ile donatılmış bir copus plus profiler kullanılarak büyük partikül akış sitometrisine tabi tutuldu. Burada, tipik bir copus çıktı saçılım grafiği gösterilmiştir. x ekseni uçuş süresini temsil eder.

Aperatür ne kadar büyükse, lazer ışınının geçiş süresi o kadar uzundur. Y ekseni, nesnenin optik yoğunluğunu temsil eden ekstinksiyonu belirtir ve her bir nokta, lazer ışınından geçen tek bir peleti karşılık gelir. Veri noktalarının bir histograma aktarılması, bu temsilci örnekteki boyutların normal dağılım göstermediğini ortaya koymuştur.

Dağılımın sağa çarpık olduğu görülmüştür. Veri setinin dönüştürülmesi de normal bir dağılıma yol açmamıştır; boyut dağılımının iki normal dağılımın karışımı olduğu varsayılarak açıklanıp açıklanamayacağını değerlendirmek için veriler matematiksel olarak modellenmiştir. Modelleme, gerçekten de tüm peletlerin %92'sini oluşturan 248 mikrometre ortalama boyuta sahip küçük pelet popülasyonu ile tüm peletlerin %8'ini oluşturan 319 mikrometre ortalama boyuta sahip büyük pelet popülasyonu olduğunu göstermiştir.

Burada, büyük ve küçük pelet popülasyonlarından ayrıştırılan mikro kolonilerin temsili bir analizi gösterilmiştir. İki boyut dağılımının örtüşen kısmındaki peletlerin ayrıştırılmasını sınırlamak amacıyla, ayrıştırma sınırlarını tanımlamak için iki popülasyonun ortalama pelet boyutları kullanılmıştır; 248 micrometers'dan küçük peletlerin küçük pelet popülasyonuna, 319 micrometers'dan büyük peletlerin ise büyük pelet popülasyonuna ait olduğu kabul edilmiştir. Ayrıştırılan peletlerin mikroskobik analizi, bu prosedürün ardından belirgin boyut farklarını doğrulamıştır.

Bu heterojenliğin altında yatan mekanizmaları aydınlatmak için yeni nesil dizileme veya proteomik gibi diğer yöntemler uygulanabilir.