Genetik olarak Değiştirilmiş Bakteri Hücrelerinde Hedef Enzim İfadesinin Tespiti

Genetik olarak değiştirilmiş bakteri hücreleri içeren tüplerle başlayın. Her bakteri, çeşitli enzimleri kodlayan yüksek kopyalı fosmidler taşır.

Tüpleri çeşitli hücre içi enzimlerin ekspresyonunu kolaylaştırmak için sarsıntı ile inkübe yapın.

Test tüpüne hedef enzime özgü bir substrat ekleyin ve kontrol tüpüne eşit hacimde tampon ekleyin.

Sallama ile kuluçka yapın. Substrat hücrelere girer ve hedef enzimler onu yararak floresan bir ürün üretir.

Kontrol tüpünü önceden kalibre edilmiş bir akış sitometresine yükleyin.

Her hücre lazer ışınından geçerken ışık saçılır. Tek hücreleri tanımlamak için bir saçılım grafiki oluşturun; bu hücreler kümelerden daha az ışık saçır.

Hücre kümelerini hariç tutun ve tek hücrelerin floresan sinyalini çizerek temel floresansı oluşturun.

Floresans sinyalini ölçmek için substratla işlenmiş tüpü akış sitometresine yerleştirin.

Substratla tedavi edilen hücrelerde kontrol hücrelerine kıyasla artan floresans sinyali, hedef enzim ekspresyonunu doğrular.

İlgilenen metagenomik enzimleri taramak için, sıralanmış hücreleri 37 derece Celsius ve 200 RPM'de kuluçka altına alın, OD_{600 0,5'e} ulaşana kadar. Sonra hücre içi fosmid kopya sayısını artırmak için 1 mikrolitre kopya i