Çok enzim Yüksek verim Genetik Enzim Eleme Sisteminin Kullanılması Eleme

Bu metodolojinin genel amacı, tek bir yüksek verimli tarama sistemi kullanarak birden fazla enzimi değerlendirmektir. Bu yöntem, mikroorganizma ve biyomühendislik alanındaki metagenomik tarama ve enzim mühendisliği ile ilgili temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. MPL mutant duyarlı fenilen bileşiğinden oluşan bir genetik enzim tarama sistemi geliştirdik ve bunun aşağı akış GFP raportörünü kullanıyoruz.

Herhangi bir metagenomik gen, sağlanan substrat ile reaksiyona girerek ilgilendiğimiz enzim aktivitesini gösterdiğinde, reaksiyon ürününün bir fenilen bileşiği Dmp mutantını aktive eder ve bir floresan ölçer ile kolayca yakalanabilen GFP raportör ekspresyonunu tetikler. Bu tekniğin temel avantajı, geleneksel tarama tekniklerinden farklı olarak, bu tek yöntemin, uygun substrat kullanılarak birden fazla farklı enzim türünü taramak için uygulanabilir olmasıdır. Bu prosedürü gösteren, laboratuvarımızda yüksek lisans öğrencisi olan Kil Koang Kwon olacaktır.

Bir fosmid kütüphanesi üretim kiti kullanarak bir fosmid vektörü ile E.Coli'de bir metagenomik kütüphane oluşturduktan sonra, pGESS(E135K)DNA'yı metagenomik kütüphane hücrelerine taşıyın. Daha sonra dönüştürülmüş kütüphane hücrelerini eksi 70 santigrat derecede ve 20 mikrolitrelik alikotlarda saklayın. Yanlış pozitifleri gidermek için önce bir metagenomik kütüphane hücresi alikotunu buz üzerinde çözdürün.

Daha sonra, çözülmüş hücrelerin on mikrolitresini, ampisilin ve kloramfenikol içeren iki mililitre lizojenat suyuna, 37 santigrat derece ve 200 RPM'de 14 mililitrelik yuvarlak tabanlı bir tüpte dört saat boyunca aşılayın. Bu arada, varsayılan FACS yazılımında metagenomik kütüphane hücrelerini okumak için FACS makinesinde uygun parametreleri ayarlayın. İnkübasyonun sonunda, beş mikrolitre hücreyi, beş mililitrelik yuvarlak tabanlı bir tüpte bir mililitre PBS'ye aktarın.

Ardından, seyreltilmiş kitaplık örneğini yükleyin ve olay hızını saniyede 1000 ila 1500 olay olarak ayarlayın. Genel Çalışma Sayfasında kütük ölçekli bir ileri saçılma alanı ve kütük ölçekli yan dağınık alan dağılım grafiği oluşturmak için, bir nokta grafiği oluşturun ve bakteri popülasyonunu içeren singlet olaylarının etrafına bir çokgen kapısı çizin. Hücre sayımına karşı log ölçekli FITC alanı histogramını çizmek için, bir histogram açın ve FITC voltajını, çan şeklindeki dağılımın tepe noktası FITC alanının ikisine ondan az olacak şekilde ayarlayın.

Ardından, günlük FITC alanı grafiğine karşı günlük ölçekli bir ileri saçılma alanı oluşturmak için başka bir nokta grafiği açın ve dağılımın merkezinden hücrelerin artı beş ve eksi yüzde beşi arasında bir R2 sıralama kapısı ayarlayın. Tüm kapılar ayarlandığında, FACS cihaz çıkışına 1.2 mililitre antibiyotik takviyeli lizojenat suyu içeren bir toplama tüpü yerleştirin ve kapılı hücrelerin altıda birine bir kez on ila altıda birini et suyuna sıralayın. Sıralamanın sonunda, toplama tüpünü kapatın ve hücreleri nazikçe girdaplayın.

İlgilenilen metagenomik enzimleri taramak için, sıralanan hücreleri OD600 0.5'e ulaşana kadar 37 santigrat derece ve 200 RPM'de inkübe edin, ardından hücre içi fosmid kopya sayısını artırmak için bir mikrolitre kopya indüksiyon çözeltisi ekleyin. 37 santigrat derece ve 250 RPM'de üç saat sonra, 0.5 mililitre hücreyi, 14 mililitrelik yuvarlak tabanlı bir tüpte uygun substrat ile 100 mikromolar nihai konsantrasyona birleştirin. Daha sonra kontrol ve deney örneklerini 37 santigrat derece ve 200 RPM'de üç saat daha inkübe edin.

Numuneler sallanırken, FACS makine parametrelerini az önce gösterildiği gibi ayarlayın. Daha sonra, her numuneden beş mikrolitre hücreyi, bir mililitre PBS içeren beş mililitrelik yuvarlak tabanlı tüplere ekleyin. Ardından, örnek hücreleri yükleyin ve olay hızını saniyede 1000 ila 3000 olay olarak ayarlayın.

Günlük ölçekli bir ileri saçılma alanı ve kütük ölçekli yan saçılma alanı dağılım grafiği oluşturun ve R1 saçılma geçidini singlet olay bakteri hücrelerini kapsayacak şekilde ayarlayın. Ardından, günlük ölçekli bir ileri dağılım ve günlük ölçekli FITC alanı dağılım grafiği oluşturun ve negatif hücrelerin %0,1'inden daha azının algılanması için bir R2 sıralama kapısı ayarlayın. Şimdi, numune tüpünü yükleyin ve olay hızını gerektiği gibi saniyede 1000 ila 3000 olay olarak yeniden ayarlayın.

Daha sonra FACS cihaz çıkışına 0,5 mililitre lizojenat suyu içeren bir toplama tüpü yerleştirin ve R1 ve R2 kapıları içindeki hücrelerin dörtte biri on ila dörtte birini toplayın. Tüm hücreler izole edildiğinde, toplama tüpünü kapatın ve hücreleri nazikçe girdaplayın. Daha sonra, toplanan örneklerin 0,5 mililitresini antibiyotiklerle desteklenmiş lizojenat suyu içeren iki adet 90 milimetrelik agar plakasına yayın, ardından plakaları gece boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin.

Bu şekilde, negatif sıralama ile yanlış pozitiflerin kaldırılması ve R1 ve R2 sıralama kapıları kullanılarak pozitif isabet seçimi dahil olmak üzere gösterilen tarama protokolü gösterilmektedir. İsabetler daha sonra alt tabaka ile ve alt tabaka olmadan numune floresansı karşılaştırılarak değerlendirilebilir. Bu temsili p-nitrofi asetat aracılı taramada, substrat ile muamele edilen hücrelerin floresansı, kontrol hücrelerininkinden daha yüksekti ve bu deneyde beş lipaz adayını doğruladı.

Bu üç selüloz adayının geniş dağılımlarına rağmen, popülasyonların ortalama FITC yoğunluğunda belirgin farklılıklar gözlenmektedir. Bu dört fosfataz adayı ayrıca kontrol hücrelerine kıyasla yüksek floresan seviyeleri göstermektedir. Ayrıca, orf eklenen vektörlerin alkalin fosfataz aktivitesi, boş plazmidi taşıyan hücrelere göre enzim isabeti için gözlemlenen daha güçlü bir floresan sinyali ile akış sitometrisi ile doğrulanabilir.

Bu tekniğin, uygun bir substrat ve rasyon konsantrasyonu seçerek çok çeşitli enzimlerin taranmasına uygulanabileceğini hatırlamak önemlidir. Bu prosedürü takiben, enzim adayının yüksek verimli bir şekilde tanımlanması ve karakterizasyonu ile ilgili ek soruları yanıtlamak için yeni nesil dizileme gibi diğer yöntemler gerçekleştirilebilir. Geliştirilmesinden sonra, bu yüksek verimli enzim tarama tekniği, enzim mühendisliği alanındaki araştırmacıların bir enzim özgüllüğüne ihtiyaç duymadan çeşitli metagenomik enzimleri keşfetmelerinin yolunu açtı.

Bu videoyu izledikten sonra, metojenik devre tabanlı yüksek verimli tarama sisteminin geniş bir enzim hedefi yelpazesiyle nasıl kullanılacağını iyi anlamış olmalısınız.