Name: Çok enzim Yüksek verim Genetik Enzim Eleme Sisteminin Kullanılması Eleme (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-08-08T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 10 s
Description: Keşfedin çok enzimli yüksek verimli genetik enzim tarama sistemini; lipaz, selüloz ve alkalen fosfataz gibi enzimleri tek bir yöntemle tespit edin. Bu sistem enzim mühendisliği araştırmalarında verimliliği artırır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu araştırma, Intelligent Synthetic Biology Center of Global Frontier Project (2011-0031944), Yeni Nesil Biogreen 21 Programı (PJ009524), NRF-2015M3D3A1A01064875 ve KRIBB Araştırma Girişimi Programı tarafından sağlanan hibelerle desteklenmiştir.

1. PnP-gess ile Metagenomic Kütüphane Hazırlama <ol><li> E. bir metagenomic kütüphane inşa E. coli, bir Fosmid vektör ile üreticinin protokolüne 5&#39;e göre bir Fosmid kitaplığı üretimi kiti kullanılarak. </li><li> Kısım metagenomic kütüphanesi bir hücre kaynağıdır, -70 ° C&#39;de, önceki depolama için kütüphane 100 ul. Not: Bu kütüphane stokunun 600 nm (OD 600) arasında bir dalga uzunluğunda ölçülen bir numunenin optik yoğunluğu yaklaşık 100&#39;dür. </li><li> Buz üzerinde hazır metagenomic kütüphane 100 ul çözülme ve 50 ml Luria-Bertani (LB) ve 2 saat boyunca 37 ° C&#39;de kuluçkalandı ve ardından 12.5 ug / ml kloramfenikol içeren 500 ml&#39;lik bir şişe içinde inoküle. </li><li> 4 ° C&#39;de 20 dakika boyunca 1000 x g&#39;de santrifüj ile 50 ml konik bir tüp içinde hücreler hasat edilir. </li><li> Yine, 4 ° C&#39;de 20 dakika boyunca 1000 x g&#39;de 50 ml buz gibi soğuk damıtılmış su (DW) ve santrifüj hızlı pelletini. </li><li> Res% 10 (h / h) gliserol, 50 ul buz soğukluğunda DW pelet uspend. Elektroporasyon için, bu hücre kısım 50 ul kullanın. </li><li> Buz soğukluğundaki bir elektroporasyon küvetine ve elektroporasyona (1.8 kV / cm, 25 mF) karışım elektro uyumlu hücre 50 ul pGESS (E135K) 5 DNA (100ng) karışımı yerleştirin. </li><li> Hızla katabolik baskı (SOC) orta süper optimum suyu 1 ml ekleyin ve hafifçe hücreleri tekrar süspansiyon. </li><li> bir pipet kullanılarak 14 ml yuvarlak tabanlı bir tüpe hücreleri aktarın ve 1 saat 37 ° C&#39;de inkübe edin. </li><li> 12.5 ug / ml kloramfenikol ve 50 ug / ml ampisilin ihtiva eden LB 20 x 20 cm kare plaka elde edilen hücreler 500 ul yayıldı. 12 saat boyunca 30 ° C&#39;de inkübe plakası. </li><li> Bir hücre kazıyıcı kullanarak koloniler kazıyın ve buz gibi soğuk hücre depolama ortamı kullanarak bir 50 ml konik tüp içine hücreleri toplamak. </li><li> 4 ° C&#39;de 20 dakika boyunca 1000 x g&#39;de santrifüjleyin. 10 ml buz gibi soğuk hücre depolama ortamı pelletiniBir OD 100 600 ulaşmak için. </li><li> Kısım -70 ° C&#39;de depolama için hücreler 20 ul. </li></ol> 2. Metagenomic Kitaplığı&#39;ndan Yanlış Pozitif Çıkarma <ol><li> buz üzerinde metagenomic DNA fosmid ve pGESS (E135K) içeren (Kademe 1.13 den) stok metagenomic kütüphane hücreleri çözülme. </li><li> 14 ml&#39;lik yuvarlak tabanlı bir tüp içinde 50 ug / ml ampisilin ve 12.5 ug / ml kloramfenikol içeren 2 ml LB içinde hücre 10 ul inoküle. 4 saat 200 rpm&#39;de çalkalanarak 37 ° C&#39;de inkübe edin. </li><li> Bu arada, FACS makine açmak ve varsayılan FACS yazılımını açın. aşağıdaki ayarları kullanın: meme ucu çapı, 70 um; İleri Yayılım Alanı (FSC-A) duyarlılık, 300 V-logaritmik büyütme; Yan Dağılım Alanı (SSC-A) duyarlılık, 350 V-logaritmik büyütme; Floresein izotiosiyanat Konum (FITC-A) hassasiyeti, 450 V logaritmik amplifikasyonu; eşik parametresi, FSC değeri 5. Not: Normal ayarlar verilmiştirMalzemelerin Tablo belirtilen FACS cihaz için. Diğer FACS cihazlar için ayarları yapın. </li><li> 1 ml PBS ihtiva eden bir 5-ml&#39;lik yuvarlak tabanlı bir tüpe örnek 5 ul ekleyerek Aşama 2.2 metagenomic kütüphanesi hücreleri seyreltilir. </li><li> FACS enstrüman yükleme noktası üzerine seyreltilmiş kütüphane örnek yerleştirin ve FACS yazılım kazanılması Dashboard&#39;daki Yükle düğmesini tıklayın. </li><li> tıklayıp gösterge paneli üzerinde Debisi düğmelerini kontrol ederek / sn 1,500 olaylar - 1000 olay hızını ayarlayın. </li><li> Günlük araç çubuğunda Dot Plot butonuna tıklayarak bir küresel çalışma sayfasında SSC-A dağılım arsa ölçekli vs günlüğü oluşturmak FSC-A ölçekli. araç çubuğundaki Poligon Kapısı düğmesini kullanarak tekli olayları (bakteriyel nüfus) kapsayacak şekilde dağılım kapısı R1 ayarlayın. </li><li> Günlük Histogram butonuna basarak çalışma sayfasındaki FITC-A ölçekli vs hücre sayımı ile bir histogram çizilir. Daha sonra, Cytome FITC gerilimini ayarlamakÇan-şekilli dağıtım pik FITC-A 10 daha az 2 olacak şekilde Müfettiş Kontrol penceresinden ter Ayarlar sekmesi. </li><li> Vs bir günlük ölçekli FSC-A oluşturun. Günlük FITC Küresel bir çalışma sayfasındaki Dot Plot butonuna tıklayarak arsa. kapı çan zirve etrafında dağılımının merkezine (toplam% 10 hücrelerinden +% 5 ve% -5 hücreleri arasında yer alır, böylece araç çubuğunda Poligon Kapısı düğmesini kullanarak arsa üzerinde bir sıralama kapısı R2 Set şeklinde eğri). </li><li> 1.2 mi LB FACS aletin çıkışında 50 ug / ml ampisilin ve 12.5 ug / ml kloramfenikol içeren ve R1 ve R2, kapılar hem tatmin sıralamak 10 6 hücre ihtiva eden bir toplama tüpü yerleştirin. </li><li> toplama tüpü, kap, ve yavaşça vorteks çıkarın. </li></ol> 3. Metagenomic Enzim Eleme <ol><li> 600 0,5 ulaşana OD kadar 200 rpm&#39;de çalkalanarak 37 ° C&#39;de (Kademe 2.11) kriteri hücreleri inkübe edin. </li><li> 1 ul hücre içi fosmid kopya sayısını yükseltmek için indüksiyon kopyalama çözümüdür ekleyin. 250 rpm&#39;de çalkalanarak 37 ° C&#39;de ek bir 3 saat inkübe hücreleri. </li><li> Nihai konsantrasyonda 14 ml&#39;lik bir yuvarlak tabanlı tüp içine 0.5 kültürlenmiş hücrelerin üzerine ilave edildi ve uygun bir alt tabaka (p-nitrofenil asetat, p-nitrofenil-β-D-selobiosidi ya da fenil fosfat) ekleyin, sıralama için hücrelerin hazırlanması için 100 uM. <ol><li> Kontrol grubu için, 14 ml&#39;lik yuvarlak dipli bir tüp içine Aşama 3.2 kültürlenmiş hücreler 0.5 ml ekleyin. Adım 3.3 substrat hacmi olarak aynı hacimde PBS ekleyin. </li></ol></li><li> 3 saat 200 rpm&#39;de çalkalanarak 37 ° C&#39;de iki örnek inkübe edin. </li><li> Bu arada, Adım 2.3 ile aynı konfigürasyona sahip FACS makineyi hazırlamak. </li><li> sırasıyla 1 ml PBS ihtiva eden iki adet 5 ml&#39;lik yuvarlak tabanlı tüpe (sıralama) hücreleri ve kontrol hücreleri 5 ul ekle. </li><li> Kontrol hücreleri t üzerine içeren tüp yerleştirinO FACS limanını yükleme ve FACS yazılım kazanılması Dashboard&#39;daki Yükle düğmesini tıklayın. Ön paneldeki Debisi düğmelerini kontrol ederek / sn 3000 olayları - 1000 olay Hızı ayarlayın. </li><li> Günlük yazılımının küresel çalışma sayfasındaki Dot Plot butonuna tıklayarak ve tekli olayları kapsayacak şekilde (bakteriyel nüfus) dağılım kapısı R1 ayarlamak üzerinde Poligon Kapısı düğmesini kullanarak SSC-A dağılım arsa ölçekli vs oluşturma günlük FSC-A ölçekli araç çubuğu. </li><li> Günlük araç çubuğunda Poligon Kapısı düğmesini kullanarak arsa üzerinde bir sıralama kapısı R2 çalışma sayfasında Nokta Arsa düğmesini tıklayarak ve set tarafından FITC bir dağılım arsa ölçekli vs oluşturma günlük FSC-A ölçekli böylece daha az% 0.1 negatif hücrelerin R2 kapısı içinde tespit edilir. </li><li> sıralama örnek tüpü ile kontrol örneği tüpü değiştirin ve 1000 olay hızını ayarlamak - gösterge paneli üzerinde Debisi düğmelerini kontrol ederek / sn 3,000 olaylar. </li><li> 0.5 içeren bir toplama tüpü yerleştirinml FACS enstrüman çıkışında LB hem R1 ve R2 kapıları tatmin sıralamak 10 4 hücreleri. Not: sıralama kriteri R2 kapısı FITC-A&#39;nın üst% 0.1 ile% 5 arasında değişebilir. Bu protokolde, üst% 1 hücreleri pozitif olarak toplanmıştır. </li><li> toplama tüpü, kap, ve yavaşça vorteks çıkarın. </li><li> LB, 50 ug / ml ampisilin, 12.5 ug / ml kloramfenikol içeren agar plakaları, iki (90 mm&#39;lik Petri kaplara) üzerine 0.5 mL toplanan numuneleri yayıldı ve bir gece boyunca 37 ° C&#39;de inkübe plakası. </li><li> Gerekirse, adımları 3,1-3,14 yineleyerek FITC bir zenginleşme için sıralama ek mermi gerçekleştirin. </li></ol> 4. Hit Seçme ve Enzim Aktivitesi Onay <ol><li> Flow sitometri analizi <ol><li> Adım 3.14 inkübe plakadan, bir LED aydınlatıcı 488 nm dalga boyundaki gözetiminde bir koloni seçiciyi kullanarak hiçbir floresan gösteren bir koloni seçin. </li><li> 14 mi ro seçilen koloni inoküleund altlı 2 mi LB 600 0.5 ulaşana onun OD kadar 200 rpm&#39;de çalkalanarak 37 ° C&#39;de 50 ug / ml ampisilin ve 12.5 ug / ml kloramfenikol içeren içeren tüp. </li><li> 2 ul hücre içi fosmid kopya sayısını yükseltmek için indüksiyon kopyalama çözümüdür ekleyin. 250 rpm&#39;de çalkalanarak 37 ° C&#39;de ek bir 3 saat inkübe hücreleri. </li><li> 14 ml&#39;lik yuvarlak dipli bir tüp hazırlanır ve kültürlenmiş hücrelerde (Aşama 4.1.3) 1 ml ekleyin. 100 uM&#39;lik bir son konsantrasyonda uygun bir alt tabaka (p-nitrofenil asetat, s -nitrophenyl- β-D-selobiosidi ya da fenil fosfat) ekleyin. <ol><li> Bir kontrol için, bir 14 ml yuvarlak tabanlı tüp içine Adım 4.1.3 den 1 ml kültür hücreleri ekleyin ve Adım 4.1.4 substrat hacmi olarak aynı hacimde PBS ekleyin. </li></ol></li><li> 3 saat 200 rpm&#39;de çalkalanarak 37 ° C&#39;de iki örnek inkübe edin. </li><li> Bu arada, Adım 2.3 ile aynı konfigürasyona sahip FACS makinesi hazırlamak. </li><li> sırasıyla 1 ml PBS ihtiva eden 5 mL&#39;lik yuvarlak dipli bir tüplere kontrolü ve alt-tabaka ile muamele edilmiş hücreler içinde 5 ul ekle. </li><li> FACS cihazın yükleme noktası üzerinde tüp içeren kontrol hücrelerini koyun ve FACS yazılım kazanılması Dashboard&#39;daki Yükle düğmesini tıklayın. Ön paneldeki Debisi düğmelerini kullanarak 3000 olayları / sn - 1000 olay hızını ayarlayın. </li><li> FITC-A ölçmek için Edinme butonuna tıklayın. </li><li> Alt tabaka tedavi numune tüpü ile kontrol numunesi tüpünü değiştirin. Ön paneldeki Debisi düğmelerini kullanarak 3000 olayları / sn - 1000 olay hızını ayarlayın. </li><li> FITC-A ölçmek için Edinme butonuna tıklayın. </li><li> Günlük FITC-A ölçekli vs hücre sayımı bir histogram çizerek hücrelerin iki grup floresan karşılaştırın. </li></ol></li><li> Diğer deneyler, enzim etkinliğini doğrulamak için <ol><li> Seçilen enzim adayların daha tanımlaması için, standart ekstraksiyon pro kullanarak fosmid DNA ayıklamakTicari ekstraksiyon kitleri prosedürleri ve nükleotid sekansı analiz veya in vitro enzim aktivitesi 6,7 test edin. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Eggeling, L., Bott, M., Marienhagen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+screening+methods-biosensors%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Biotech%22%5BJournal%5D)">Novel screening methods-biosensors.</a> Curr. Opin. Biotech. 35, 30-36 (2015).</li>
<li>Uchiyama, T., Abe, T., Ikemura, T., Watanabe, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Substrate-induced+gene-expression+screening+of+environmental+metagenome+libraries+for+isolation+of+catabolic+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Substrate-induced gene-expression screening of environmental metagenome libraries for isolation of catabolic genes.</a> Nat. Biotechnol. 23 (1), 88-93 (2005).</li>
<li>Van Sint Fiet, S., van Beilen, J. B., Witholt, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selection+of+biocatalysts+for+chemical+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Selection of biocatalysts for chemical synthesis.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 103 (6), 1693-1698 (2006).</li>
<li>Binder, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high-throughput+approach+to+identify+genomic+variants+of+bacterial+metabolite+producers+at+the+single-cell+level%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">A high-throughput approach to identify genomic variants of bacterial metabolite producers at the single-cell level.</a> Genome Biol. 13 (5), R40(2012).</li>
<li>Choi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toward+a+generalized+and+High-throughput+Enzyme+Screening+System+Based+on+Artificial+Genetic+Circuits%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Synthetic+Biology%22%5BJournal%5D)">Toward a generalized and High-throughput Enzyme Screening System Based on Artificial Genetic Circuits.</a> ACS Synthetic Biology. 3 (3), 163-171 (2014).</li>
<li>Lee, D. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+psychrophilic+alkaline+phosphatase+from+the+metagenome+of+tidal+flat+sediments%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">A novel psychrophilic alkaline phosphatase from the metagenome of tidal flat sediments.</a> BMC Biotechnology. 15 (1), (2015).</li>
<li>Warnecke, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metagenomic+and+functional+analysis+of+hindgut+microbiota+of+a+wood-feeding+higher+termite%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Metagenomic and functional analysis of hindgut microbiota of a wood-feeding higher termite.</a> Nature. 450 (7169), 560-565 (2007).</li>
<li>Kim, U. J., Shizuya, H., de Jong, P. J., Birren, B., Simon, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stable+propagation+of+cosmid+sized+human+DNA+inserts+in+an+F+factor+based+vector%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Stable propagation of cosmid sized human DNA inserts in an F factor based vector.</a> Nucleic Acids Research. 20 (5), 1083-1085 (1992).</li>
<li>Jemli, S., Ayadi-Zouari, D., Hlima, H. B., Bejar, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biocatalysts%3A+application+and+engineering+for+industrial+purposes%5BTitle%5D)+AND+%22Crc.+Cr.+Rev.+Biotechn%22%5BJournal%5D)">Biocatalysts: application and engineering for industrial purposes.</a> Crc. Cr. Rev. Biotechn. 36 (2), 246-258 (2014).</li>
<li>Lorenz, P., Eck, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metagenomics+and+industrial+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Metagenomics and industrial applications.</a> Nat. Rev. Microbiol. 3 (6), 510-516 (2005).</li>
<li>Uchiyama, T., Miyazaki, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Product-induced+gene+expression%2C+a+product+responsive+reporter+assay+used+to+screen+metagenomic+libraries+for+enzyme+encoding+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+environmental+microbiology%22%5BJournal%5D)">Product-induced gene expression, a product responsive reporter assay used to screen metagenomic libraries for enzyme encoding genes.</a> Applied and environmental microbiology. 76 (21), 7029-7035 (2010).</li>
<li>Mohn, W. W., Garmendia, J., Galvao, T. C., De Lorenzo, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surveying+bio-transformations+with+%C3%A0+la+carte+genetic+traps%3A+translating+dehydrochlorination+of+lindane+%28gamma-hexachlorocyclohexane%29+into+lacZ-based+phenotypes%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+microbiology%22%5BJournal%5D)">Surveying bio-transformations with à la carte genetic traps: translating dehydrochlorination of lindane (gamma-hexachlorocyclohexane) into lacZ-based phenotypes.</a> Environmental microbiology. 8 (3), 546-555 (2006).</li>
<li>Tang, S. Y., Cirino, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+and+application+of+a+mevalonate-responsive+regulatory+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Angew+Chem.+Int.+Ed%22%5BJournal%5D)">Design and application of a mevalonate-responsive regulatory protein.</a> Angew Chem. Int. Ed. 50 (5), 1084-1086 (2011).</li>
<li>Jha, R. K., Kern, T. L., Fox, D. T., Strauss, C. E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+an+Acinetobacter+regulon+for+biosensing+and+high-throughput+enzyme+screening+in+E.+coli+via+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Engineering an Acinetobacter regulon for biosensing and high-throughput enzyme screening in E. coli via flow cytometry.</a> Nucleic Acids Res. 42 (12), 8150-8160 (2014).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

Biyokatalizörler üretim verimliliğinin arttırılması en doğal enzim kaynaklarından biri olarak kabul edilir sanayi 9 ve metagenome bazlı biyo-kimyasal başarısı için bir anahtardır. Bu anlamda, bu genetik kaynakları çoğunluğu 10 keşfedilmemiş olan metagenome elde edilen yeni enzimler tarama için gereklidir. Çeşitli tarama yöntemleri doğrudan kopyalama etkinleştiricileri 11, 12 kullanılarak enzim ürünlerinin tespit geliştirilmiştir, fakat bu teknikler, belirli metabolit duyarlı transkripsiy...

Son yıllarda geliştirilmiş olan, yüksek verimli tek hücreli deney tekniği yeni bir enzim işlevsel etkinlikler 1&#39;e göre büyük ölçekli genetik kütüphaneden taranabilir sağlar. tek hücre düzeyinde, transkripsiyon düzenleyici proteinler, bir hedef enzim etkinliğinin bir sonucu olarak üretilen küçük molekülleri algılayarak raportör gen ekspresyonunu başlatmak için kullanılır. Buna bir yaklaşım, alt-tabaka bir raportör protein 2 ekspresyonunu indükler formül (SIGEX) yöntemini tarama alt-tabaka ile indüklenen gen ekspresyonunu kullanarak, Ralstonia eutropha E2 bir fenol-bozucu operonun izole çıkıyor. Pseudomonas putida NhaR benzaldehid dehidrojenazı 3 seçmek için kullanılır, ve Corynebacterium glutamicum LysG çeşitli mutant kütüphaneler 4 yeni bir L-Lizin üreten soyun yüksek verimli tarama kullanılmıştır. Daha önce, bir genetik enzim screening sistemi (GESS) bir genel uygulanabilir bir tarama platformu 5 olarak önerilmiştir. Bu sistem P., DmpR fenol-tanıma dimetilfenol regülatör kullanır putida. DmpR (E135K) ve DmpR bir mutant, S. nitrofenolu (PNP) saptanması için gess (PNP-GESS) &#39;de kullanılabilmektedir. Fenolik bileşikleri üreten hedef enzimlerin varlığında, GESS E. coli hücreleri bir floresan-aktive edilmiş hücre ayırıcı (FACS) kullanılarak, tek hücrelerin hızlı izole edebilecek, bir floresan sinyali verir. Ancak metagenomic enzimin ekspresyonu geleneksel rekombinant enzimlerin daha zayıf görünmektedir; Bu nedenle, GESS uygun çalışma durumunda 5 ile birlikte ribozomal bağlanma yeri (RBS) ve terminatör dizileri ve kombinasyonunu araştırırken en fazla hassasiyet fenolik bileşikleri tespit etmek için tasarlanmıştır. Gess temel avantajlarından biri bu tek yöntem teorik olarak ov taranmasını izin vermesidirBRENDA veritabanında enzimlerin er 200&#39;den fazla farklı türleri (Tablo 1, http: // www.brenda-enzymes.info, 2013,7) sadece farklı substratlar kullanılarak. O selülaz lipaz gördü ve metil paration hidrolaz (MPH) p-nitrofenil butirat, p-nitrofenil-cellotrioside ve metil paration, sırasıyla, 5, uygun substratlann PNP-gess kullanılarak tespit edilebilir. Son zamanlarda, bu PnP-gess kullanılarak tanımlanan yeni enzim biri bir alkalin fosfataz (AP), soğuğa uyarlanmış deniz metagenomes 6&#39;da bulunan ilk termal olarak AP olduğu kanıtlanmıştır. Burada tarama işleminin detayları PnP-GESS bir metagenomic kütüphane 5,6 arasında yeni aday enzimleri belirlenmesi hızlı enzimleri, lipaz, selülaz ve alkalin fosfataz, üç farklı türde aktivitelerini tespit -ve sunulmuştur. süreçler metagenome PnP-gess ile önişleme ve bir fl işletim dahilsitometri sıralayıcı ow. Elde edilen isabetleri fazla tanımlama için dizilenmiştir gerekir ise, bu protokol akış sitometrisi kullanılarak enzim aktivitesi onay işlemine prosedürünü kapsamaktadır.

<table><tbody><tr><td>CopyControl</td><td>Epicentre</td><td>CCFOS110</td><td>Fosmid kütüphane üretim kiti&nbsp;</td></tr><tr><td>CopyControl İndüksiyon Çözümü</td><td>Epicentre</td><td>CCIS125</td><td>Fosmid kopya indüksiyon çözümü</td></tr><tr><td>EPI300</td><td>Epicentre</td><td>EC300110</td><td>Elektroyetkin hücre</td></tr><tr><td>pCC1FOS</td><td>Epicentre</td><td>CCFOS110</td><td>Fosmid vektör</td></tr><tr><td>Gen Pulser Mxcell</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td>Elektroporasyon küveti ve elektroporat sistemi</td></tr><tr><td>FACSAria III</td><td>Becton Dickinson</td><td></td><td>Akış Sitometrisi (FACS makinesi)</td></tr> <tr><td>AZ100M</td><td>Nikon</td><td></td><td>Mikroskop ve nbsp;</td></tr><tr><td>Ultra İnce&nbsp;</td><td>Maestrojen</td><td></td><td>LED aydınlatıcı</td></tr><tr><td>50 ml konik tüp</td><td>BD Falcon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>14 ml yuvarlak tabanlı tüp&nbsp;</td><td>BD Falcon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>5 ml yuvarlak tabanlı tüp</td><td>BD Falcon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>p-nitrofenil fosfat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N7653</td><td>Substrat</td></tr><tr><td>p-nitrofenil ve beta;-D-selobiyosid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N5759</td><td>Substrat</td></tr><tr><td>p-nitrofenil bütilat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N9876& nbsp;</td><td>Substrat</td></tr><tr><td>Luria-Bertani (LB)</td><td>BD Difco</td><td>244620</td><td>Tripton 10 g/L, Maya özütü 5 g/L, Sodyum Klorür 10 g/L</td></tr><tr><td>Süper Optimal et suyu (SOB)</td><td>BD Difco</td><td>244310</td><td>Tripton 20 g/L, Maya özütü 5 g/L, Sodyum Klorür 0,5 g/L, Magnezyum Sülfat 2,4 g/L, Potasyum Klorür 186 mg/L</td></tr><tr><td>Katabolit baskılanmış süper optimal et suyu (SOC)</td><td></td><td>SOB, % 0.4 glikoz</td><td></td></tr><tr><td>2x Maya Özü Tripton (2xYT)</td> <td>BD Difco</td><td>244020</td><td>Kazeinin pankreas sindirimi 16 g / L, Maya özü 10 g / L, Maya özü 5 g / L</td></tr><tr><td>Hücre depolama ortamı</td><td></td><td></td><td>2x YT et suyu,% 15 Gliserol,% 2 Glikoz</td></tr><tr><td>pGESS(E135K)</td><td></td><td></td> <td>Uygun promotörleri ile dmpR, egfp genleri, RBS ve sonlandırıcı içeren bir DNA vektörü. El yazmasındaki referans 5'e bakın. Daha fazla detay.</td></tr><tr><td>Kloramfenikol</td><td>Sigma</td><td>C0378</td><td></td></tr><tr><td>Ampisilin</td><td>Sigma</td><td>A9518</td><td></td></tr><tr><td>BD FACSDiva</td><td>Becton Dickinson</td><td></td><td>Akış Sitometrisi Yazılımı Sürüm 7.0</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Gibco</td><td>70011-044</td><td>%0.8 NaCl, %0.02 KCl, %0.0144 Na<alt>2< / alt >HPO4, 0.024% KH2OP4, pH 7.4</td></tr></tbody></table>

Çok enzim yüksek verim genetik enzim eleme sisteminin kullanılması eleme

Multi-enzyme Screening Using a High-throughput Genetic Enzyme Screening System

Yüksek verimli tek hücreli bir tahlil tekniğinin yakın zamanda geliştirilmesi, büyük ölçekli bir metagenomik kütüphaneden fonksiyonel aktivitelere dayalı yeni enzimlerin taranmasını sağlar1. Daha önce fenol veya p-nitrofenol tarafından aktive edilen dimetilfenol regülatörü kullanan bir genetik enzim tarama sistemi (GESS) önermiştik. Çok miktarda doğal enzimatik reaksiyon, bu fenolik bileşikleri fenol türeden substratlardan ürettiğinden, bu tek genetik tarama sistemi, BRENDA veritabanındaki 200'den fazla farklı enzimi taramak için teorik olarak uygulanabilir. GESS'in genel uygulanabilirliğine rağmen, tarama işleminin uygulanması, maksimum akış sitometrisi sinyallerine ulaşmak için özel bir prosedür gerektirir. Burada, GESS ile metagenom ön işlemesini ve bir akış sitometrisi sıralayıcısının çalışmasını içeren gelişmiş tarama sürecini detaylandırıyoruz. GESS ile üç farklı fenolik substrat (p-nitrofenil asetat, p-nitrofenil-β-D-selobiyozit ve fenil fosfat) sırasıyla üç farklı enzimi (lipaz, selülaz ve alkalin fosfataz) taramak ve tanımlamak için kullanıldı. Seçilen metagenomik enzim aktiviteleri sadece akış sitometrisi ile doğrulandı, ancak daha ileri gen tanımlaması için DNA dizilimi ve çeşitli in vitro analizler kullanılabilir.

Üç fenolik yüzeyler önerilen protokol takip ederek Taean&#39;ın, Güney Kore okyanus gelgit düz çökellerin bir metagenome kütüphanesinden yeni metagenomic enzimleri belirlemek için incelenmiştir. Kütüphane yapımı için ortalama 30-40 kb metagenome dizileri E. dayanmaktadır fosmids içine yerleştirildi E. coli K faktörü replikon ve bir hücrenin tek bir kopya olarak sunulmuştur. Fosmids yaygın nedeniyle sabit bir yayılma 8 karmaşık genomik kütüphaneler oluşturmak ...

Bu çalışma, teorik olarak 200'den fazla enzime uygulanabilen evrensel bir genetik enzim tarama sistemi kullanarak yüksek verimli bir tarama yöntemi sunmaktadır. Burada, tek tarama sistemi, kullanılan substratı (p-nitrofenil asetat, p-nitrofenil-β-D-selobiosit ve fenil fosfat) değiştirerek üç farklı enzimi (lipaz, selülaz ve alkalin fosfat) tanımlar.

Çok enzim Yüksek verim Genetik Enzim Eleme Sisteminin Kullanılması Eleme

The recent development of a high-throughput single-cell assay technique enables the screening of novel enzymes based on functional activities from a ...

Bu metodolojinin genel amacı, tek bir yüksek kapasiteli tarama sistemi kullanarak birden fazla enzimi değerlendirmektir. Bu yöntem, metagenomik tarama ve enzim mühendisliği ile ilgili mikroorganizma ve biyomühendislik alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. MPL mutant yanıt veren fenilen bileşiği ve bunun aşağı akışındaki GFP raporlayıcısından oluşan genetik bir enzim tarama sistemi geliştirdik.Herhangi bir metagenomik gen, sağlanan substratla reaksiyona girerek ilgilendiğimiz enzim aktivitesini gösterdiğinde, reaksiyon ürününün bir fenilen bileşiği Dmp mutantını aktive eder ve floresan metre ile kolayca tespit edilebilen GFP raporlayıcı ekspresyonunu tetikler. Bu tekniğin temel avantajı, geleneksel tarama tekniklerinin aksine, uygun substrat kullanılarak farklı türdeki birden fazla enzimin taranması için bu tek yöntemin uygulanabilir olmasıdır. Bu prosedürü, laboratuvarımızdaki lisansüstü öğrencisi Kil Koang Kwon uygulamalı olarak gösterecektir.Bir fosmid kütüphanesi üretim kiti kullanarak fosmid vektörle E.Coli içinde bir metagenomik kütüphane oluşturduktan sonra, pGESS(E135K)DNA'yı metagenomik kütüphane hücrelerine aktarın. Ardından, transforme edilmiş kütüphane hücrelerini -70 °C'de ve 20 µL'lik alikotlar halinde saklayın. Yanlış pozitifleri temizlemek için öncelikle bir metagenomik kütüphane hücresi alikotunu buz üzerinde çözdürün.Ardından, çözülmüş hücrelerin on mikrolitresini, ampicillin ve chloramphenicol içeren iki mililitre lizojenat besiyerine, 14 mililitrelik yuvarlak tabanlı bir tüp içerisinde 37 °C'de ve 200 RPM'de dört saat boyunca inoküle edin. Bu sırada, varsayılan FACS yazılımında metagenomik kütüphane hücrelerini okumak için FACS cihazı üzerinde uygun parametreleri ayarlayın. İnkübasyonun sonunda, beş mikrolitre hücreyi beş mililitrelik yuvarlak tabanlı bir tüpteki bir mililitre PBS'ye aktarın.Ardından, seyreltilmiş kütüphane örneğini yükleyin ve olay hızını saniyede 1000 ila 1500 olay olacak şekilde ayarlayın. Global Çalışma Sayfasında (Global Worksheet), logaritmik ölçekli ileri saçılım alanı ile logaritmik ölçekli yan saçılım alanı arasındaki saçılım grafiğini oluşturmak için bir nokta grafiği (dot-plot) oluşturun ve bakteriyel popülasyonu içeren tekli olayların etrafına bir poligon kapısı (polygon gate) çizin. Hücre sayısı ile logaritmik ölçekli FITC-alanı histogramını çizmek için bir histogram açın ve çan şeklindeki dağılımın zirvesi FITC-alanının 10² değerinden küçük olacak şekilde FITC voltajını ayarlayın.Ardından, log ölçekli ileri saçılım alanı (forward scatter area) ile log FITC-alanı grafiği oluşturmak için başka bir nokta grafiği (dot-plot) açın ve dağılımın merkezinden hücrelerin artı beş ile eksi beş yüzdesi arasında bir R2 sıralama kapısı (sorting gate) ayarlayın. Tüm kapılar ayarlandığında, FACS cihazının çıkışına 1,2 milliliters antibiyotik takviyeli lizojenat besiyeri içeren bir toplama tüpü yerleştirin ve kapı içine alınmış hücrelerden 1x10⁶ tanesini besiyerine sıralayın. Sıralama işleminin sonunda, toplama tüpünün kapağını kapatın ve hücreleri nazikçe vorteksleyin.İlgilenilen metagenomik enzimleri taramak için, ayrıştırılmış hücreleri OD600 0,5'e ulaşana kadar 37 °C ve 200 RPM'de inkübe edin, ardından hücre içi fosmid kopya sayısını artırmak için bir µL kopya indüksiyon çözeltisi ekleyin. 37 °C ve 250 RPM'de üç saat beklettikten sonra, 0,5 mL hücreyi 14 mL'lik yuvarlak tabanlı bir tüp içinde uygun substrat ile 100 µM final konsantrasyona ulaşacak şekilde birleştirin. Ardından kontrol ve deney örneklerini 37 °C ve 200 RPM'de üç saat daha inkübe edin.Numuneler çalkalanırken, FACS cihazı parametrelerini az önce gösterildiği şekilde ayarlayın. Ardından, her numuneden beş mikrolitre hücreyi, bir mililitre PBS içeren ayrı beş mililitrelik yuvarlak tabanlı tüplere ekleyin. Sonrasında, numune hücrelerini yükleyin ve olay hızını saniyede 1000 ila 3000 olay olarak ayarlayın.Logaritmik ölçekli ileri saçılım alanı ile logaritmik ölçekli yan saçılım alanı arasında bir saçılım grafiği oluşturun ve R1 saçılım kapısını singlet olay bakteriyel hücreleri kapsayacak şekilde ayarlayın. Ardından, logaritmik ölçekli ileri saçılım ile logaritmik ölçekli FITC-alanı arasında bir saçılım grafiği oluşturun ve negatif hücrelerin %0,1'inden azının tespit edileceği şekilde bir R2 sıralama kapısı belirleyin. Şimdi, numune tüpünü yükleyin ve gerektiği şekilde olay hızını saniyede 1000 ila 3000 olay olacak şekilde yeniden ayarlayın.Ardından, FACS cihazı çıkışına 0,5 mL lizojenat besiyeri içeren bir toplama tüpü yerleştirin ve R1 ile R2 kapıları içindeki 1 × 10⁴ hücreyi toplayın. Tüm hücreler izole edildiğinde, toplama tüpünü kapatın ve hücreleri hafifçe vorteksleyin. Daha sonra, toplanan örneklerin 0,5 mL'sini, antibiyotiklerle takviye edilmiş lizojenat besiyeri içeren iki adet 90 mm'lik agar plakasına yayın ve plakaları 37 °C'de gece boyunca inkübe edin.Bu şekilde, negatif ayıklama ile yalancı pozitiflerin uzaklaştırılmasını ve R1 ve R2 ayıklama kapıları kullanılarak pozitif hit seçimini içeren gösterilen tarama protokolü resmedilmiştir. Hitler daha sonra, örneğin substratlı ve substratsız floresan değerleri karşılaştırılarak değerlendirilebilir. Bu temsili p-nitrofenil asetat aracılı taramada, substratla işlem görmüş hücrelerin floresan değeri kontrol hücrelerininkinden daha yüksek çıkmış ve bu deneyde beş lipaz adayı doğrulanmıştır.Bu üç selüloz adayının geniş dağılımlarına rağmen, popülasyonların ortalama FITC yoğunluklarında belirgin farklar gözlemlenmektedir. Bu dört fosfataz adayı da kontrol hücrelerine kıyasla yüksek floresan seviyeleri göstermektedir. Ayrıca, orf eklenmiş vektörlerin alkali fosfataz aktivitesi, enzim hit'i için boş plazmit taşıyan hücrelere göre daha güçlü bir floresan sinyali gözlemlenerek akış sitometrisi ile doğrulanabilir.Bu tekniğin, uygun bir substrat ve rasyon konsantrasyonu seçilerek geniş bir enzim yelpazesinin taranmasında uygulanabileceğini hatırlamak önemlidir. Bu prosedürün ardından, enzim adayının tanımlanması ve karakterizasyonu hakkında ek soruları yüksek verimli bir şekilde yanıtlamak için yeni nesil dizileme gibi diğer yöntemler gerçekleştirilebilir. Geliştirilmesinin ardından, bu yüksek verimli enzim tarama tekniği, enzim mühendisliği alanındaki araştırmacıların bir enzim özgüllüğüne ihtiyaç duymadan çeşitli metagenomik enzimleri keşfetmelerine yol açmıştır.Bu videoyu izledikten sonra, geniş bir enzim hedef yelpazesine sahip metojenik devre tabanlı yüksek kapasiteli tarama sisteminin nasıl kullanılacağı konusunda kapsamlı bir bilgi edinmiş olmalısınız.

multi-enzyme-screening-using-high-throughput-genetic-enzyme-screening

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Bu protokol, Escherichia coli olarak ifade metagenomic kütüphane selülolitik faaliyetleri için yüksek kapasiteli ekran açıklanmıştır. Ekran, çözüm odaklı ve yüksek otomasyonlu ve absorbans ölçümü gibi son okuma ile 384 iyi mikropleytin bir pot kimya kullanır.

Yüksek Verimli Ekran Metagenomic Kütüphaneler selülaz Aktivitesi Biomining

Biz mantar endoglucanase faaliyet için ekran için düşük maliyetli, yüksek verim yöntemi...

Mantar Endoglucanase Faaliyet Yüksek Verimli Tarama Escherichia coli</em

Kaynak: Kim, H. ve ark., Yüksek verimli Genetik Enzim Tarama Sistemi Kullanarak Çok Enzimli Tarama. J. Vis. Exp. (2016)Bu video, metagenomik fosmid kütüphaneleri ve kromojenik substratlar kullanılarak enzim ifadesini tespit etmek için genetik tarama yöntemini göstermektedir. Akış sitometrisi, renkli ürünler üreten tek hücreleri tanımlar ve izole eder; böylece aktif enzim eksprese eden hücrelerin yüksek verimlilikte seçimini sağlar.

Genetik olarak Değiştirilmiş Bakteri Hücrelerinde Hedef Enzim İfadesinin Tespiti

Bu videoda, çözünmeyen kromojenik polimer hidrojel substratları kullanılarak karbonhidrat aktif enzim taraması için yüksek verimli bir test gösteriyoruz. Enzim, bu substratları, ürünün renk yoğunluğunun ölçülmesiyle ölçülebilen çözünür renkli bir ürüne indirger.

Kromojenik Polimer Hidrojel Bazlı Enzim Tarama Testi: Sentetik Substratlar Kullanarak Karbonhidrat Aktif Enzimleri Taramak İçin Yüksek Verimli Bir Yöntem

Bu yüksek verimli robot transfections ve bir ev yapımı çift ışıma lusiferaz deneyi kullanılarak transkripsiyon düzenleyiciler belirlenmesi için hızlı ve ucuz bir tarama yöntemi sunulmaktadır. Bu protokol, hızlı bir şekilde binlerce gen için doğrudan yan yana fonksiyonel veriler üreten ve ilgi duyulan herhangi bir geni hedef kolayca değiştirilebilir olduğunu.

Bir ev yapımı Çift kızdırma Lusıferaz Testi kullanarak yüksek verim Fonksiyonel Taraması

Burada, hücre bazlı bir raportör gen tahlilini, 3' UTR aracılığıyla uygulanan transkripsiyon sonrası kontrol mekanizmalarını modüle eden bileşikler için kimyasal kitaplıkları taramak için değerli bir araç olarak tanımlıyoruz.

Post-transkripsiyonel ayarlı genlerin kimyasal Modülatörler için yüksek verimli tarama

Protein fosforilasyonu, hücrelerin hücre dışı ortamlarındaki bilgileri nasıl yorumladığının ve ona nasıl yanıt verdiğinin merkezi bir özelliğidir. Burada, ilgilenilen bir substratı (substratları) fosforile eden kinazları hızlı bir şekilde tanımlamak için memeli hücrelerinden saflaştırılmış kinazları kullanan yüksek verimli bir tarama protokolü sunuyoruz.

Yüksek Verimli Tarama kullanma Kinaz-substrat Çiftlerinin Kimlik

Enzim taraması için yüksek verimli bir test tanımlanmıştır. Bu çoğullanmış kullanıma hazır tahlil kiti, önceden seçilmiş Chrömer, Polymer, Hydrogel (CPH) substratları ve kompleks I, çözünmez Chromojenik Biyokütle (ICB) substratlarından oluşur. Hedef enzimler polisakkarit parçalayıcı endo-enzimler ve proteazlardır.

Yeni çözünmez Kromojenik altyapı deneyiyle kitleri kullanılarak karbonhidrat parçalayıcı Enzimlerin yüksek verimli tarama

Bu protokol, endüstriyel mikroorganizmalar için standart yüksek verimli tarama iş akışı sunar. ARTP mutagenezi yoluyla mutant bir kütüphane oluşturmayı, otomatik mikrofluidiklerle pozitif damla taraması yapılmasını ve ardından sonuçların doğrulanmasını içerir. İş akışının güvenilirliği, yüksek verimli B. coagulans suşlarının taramasıyla doğrulandı.

L-laktik asit aşırı üreten Bacillus coagulans mutantlarının yüksek verimli taraması otomatik damla mikrofluidik platform kullanılarak

Sıvı tabanlı kültür ve dağıtımı için bir...

Floresan ile yüksek verim Tarama ve Biyoalgılayıcı C. elegans Suşlarının

Keşfedin çok enzimli yüksek verimli genetik enzim tarama sistemini; lipaz, selüloz ve alkalen fosfataz gibi enzimleri tek bir yöntemle tespit edin. Bu sistem enzim mühendisliği araştırmalarında verimliliği artırır.

Çok enzim Yüksek verim Genetik Enzim Eleme Sisteminin Kullanılması Eleme

Daha fazla video keşfet