Name: Sinir doku rejenerasyonu için Çözünür ve Çözünmeyen Biyotinile Proteinlerin ifade, izolasyon ve saflaştırılması (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-01-22T14:15:00.000+00:00
Duration: 12 min 3 s
Description: Öğrenin, rekombinant biyotinile proteinleri bakteri hücrelerinde ifade edip afinite kromatografi ile saflaştırma yöntemini. Bu teknik, sinir doku rejenerasyonu ve biyomedikal uygulamalar için yüksek verimli protein üretimi sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Yazarlar bu işi desteklenen finansman Akron Üniversitesi kabul etmek istiyorum.

1.. Hedef Protein Tasarımı <ol><li> Biyoteknoloji Bilgi sitesi için Ulusal Merkezi&#39;ni kullanma (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) dikkate ilgi ve herhangi bir ek yeri varyantları tür alarak hedef protein için bir amino dizisini elde. Proteinin ilgi aktif bölgesine karşılık gelen amino asit dizisini seçin. Not: Sema3A için, amino asitler 21-747 seçilmiştir. Bir füzyon proteini barstarın, bir amino asit, 1-90 dizisi, NGF amino asitler 122-241 &#39;e eklendi NGF ile tasarlanmıştır. </li><li> N-terminal dizileri takip eklemek için: arıtma için 6X His etiketi (HHHHHH), Tütün Etch Virüsü His etiketinin çıkarılması için (TEV) proteaz kesme bölgesi (ENLYFQG), biotin K (GLNDIFEAQKIEWHE) de protein biyotinilasyon için dizisi etiketli ve uygun protein refolding (EFPKPSTPPGSSGGAP) için oda sağlayacak boşluklar esnek menteşe. Not: Bu sekanslar, arzu edilen füzyon prot bağlı olarak değişebilirein. </li><li> , Arzu edilen alıcı türleri ve sentezi için gen tasarım / optimizasyonu için bir şirket için tam bir amino asit sekansı gönder. Bir kit kullanılarak BamHI-Notl ile tercih edilen bir vektör içine veya ticari hizmetleri kullanılarak alt-klonlanmıştır. </li></ol> 2. Agar Tabaklar Yapımı Not: Bu antibiyotiklerin, levhalar, tamponlar, tüm hisse senetleri (sıcaklık ve süre) düzgün saklanan çok önemli olduğunu ve (steril) Proteazların serbest kalır. <ol><li> Bir cam şişe içinde ortam, 20 g / L ve yerde 1,5 ağırlık% ve lizojeni suyu (LB) agar tartılır. Bir 500 ml şişe yaklaşık 15 plakaları hale getirir. </li><li> Hacimsel, ultra saf su ekleyin, iyice karıştırın, ve otoklav. </li><li> Dokunmak şişe soğuması ve uygun antibiyotik ekleyin. Şişe çok soğur ve çözelti donmak başlarsa, ancak, mikrodalga içinde tekrar ısıtılmakta, agar erken katılaşmasını önlemek. Not: Bizim plazmid bir ampisilin direnç gen içerire. Bu nedenle, tüm adımlar 100 ug / ml &#39;de ampisilin içermelidir. E. E. coli K12 suşu klonlama tetrasiklin (12.5 ug / ml) antibiyotik gerektirir. BL21 bakteri hücreleri herhangi bir ek antibiyotik gerekmez. </li><li> 90 mm Petri kapları içine solüsyonu 25-30 ml dökün ve kurumasını zaman tanıyın. </li><li> Uygun antibiyotik ve Parafilm ile 4 ° C, veya sıkıca kapanabilen bir torbada mağaza baş aşağı ile etiket çanak. Not: Tabaklar yaklaşık bir ay boyunca iyi. </li></ol> 3. Biotin Tagged Plazmid klonlanması Not: Koşullar aseptik yapılır. <ol><li> Pelet etmek için 3 dakika boyunca 6,000 x g de plazmid vektörü Spin ve steril aşırı saf su içinde 10 ul ekle. </li><li> Kimyasal olarak, yetkili E. 50 ul kaldır -80 ° C ve hemen coli hücreleri, yüksek dönüşüm etkinliği 5-10 dakika için buz üzerine yerleştirin. </li><li> 0,5-1 ng/50 vektörü çözeltisi 1 ul ekle56, 50 ul E. l hücrelerin coli hücreleri ve -80 ° C &#39;de kalan plazmid yerleştirin </li><li> 5 dakika boyunca buz üzerinde vektör içeren bakteri hücreleri yerleştirin. </li><li> Isı şok geri 2 dakika boyunca buz üzerinde 42 ° C su banyosu ve yer hücrelerde 30-45 saniye boyunca hücre ve vektör karışım. </li><li> Katabolik baskı (SOC) ortamı (% 2 v bakto-tripton / w,% 0.5 w / v bakto-maya ekstresi, 8.56 mM NaCl, 2.5 mM KCI, 20 mM MgSO 4, 20 mM glukoz ile süper uygun suyu 250 ul ekle , ultra saf su, pH = 7.0) ve 30 dakika boyunca 37 ° C&#39;de 250 rpm&#39;de çalkalanır. Not: SOC otoklava olmamalı, filtre, bir 0.22 um filtre ile sterilize edilebilir. </li><li> Kuru plakalar önce hücreleri kaplama için 10-15 dk. </li><li> Pipet 25, 50, ve ampisilin (100 ug / ml) ve tetrasiklin (12.5 ug / ml) ihtiva eden antibiyotikler ayrı agar plakaları üzerine hücre çözeltisinin 100 ul. Ağar plakalar üzerinde eşit çözümü dağıtmak için cam boncuk kullanın. </li> &lt;li&gt; 15-18 saat boyunca 37 ° C&#39;de plakaları baş aşağı inkübe edin. </li><li> Tabakalarına küçük bireysel koloniler bakteri için kontrol ve kullanım (Şekil 2A) kadar 4 ° C de ters olarak depolar. <ol><li> Koloniler varsa: <ol><li> Tamponlar ve malzemelerin tazeliği ve sterilite kontrol edin. </li><li> E &#39;e eklendi plazmid miktarını artırmak coli K12 suşu. </li></ol></li><li> Büyük koloniler mevcut olan ya da koloniler (Şekil 2B ve 2C) bir büyüme varsa, düşük ses steril bir aşılama döngü veya tabak hücreleri kullanarak yeni bir agar plaka restreak. </li></ol></li><li> Inoküle 5 ml dönüştürülmüş E. tek bir koloni ile ampisilin (100 ug / ml) ve tetrasiklin (12.5 ug / ml) ihtiva eden LB antibiyotikler coli hücreleri. Büyüme-up hücreler gece boyunca 250-300 rpm&#39;de 37 ° C&#39;de. </li><li> Sonraki gün, bir gece boyunca Gro gelen hedef vektör izole etmek için bir plazmid izolasyon kiti kullanmakw-up sonraki kullanıma kadar -80 ° C &#39;de ve mağaza plazmid saflaştırılmıştır. <ol><li> İsteğe bağlı: 260 ve 280 nm &#39;de elde edilen absorbans ölçümleri kullanılarak plazmid saflık ve konsantrasyon kontrol edin. </li></ol></li></ol> 4. İfade Plazmidi konakçıya transformasyonu Not: Koşullar aseptik yapılır. <ol><li> Tekrar E. için 3,2-3,10 adımları aşağıdaki değişikliklerle coli BL21 hücreleri: Not: BL21 hücreleri, bu nedenle sadece ampisilin dönüşüm için agar plakalarına ilave edilir, herhangi bir ek antibiyotik gerekmez. <ol><li> 50 ul E. adım 3.12 den 0,5-2 ng/50 ul hücre olacak şekilde izole edilmiş plazmid 2-5 ul ekle E. coli ekspresyon konakçı hücreler. </li><li> 60-90 saniye ısıl şok hücreler. </li><li> 60 dakika yerine 30 dakika boyunca 250 rpm&#39;de çözelti ihtiva eden SOC ortam çalkalayın. </li></ol></li><li> Ster ile bir Petri kabı dönüştürülmüş bakteri hücrelerinin tek bir koloni PluckIle uygulama çubuk ve yeri ampisilin uygun konsantrasyona (100 ug / ml) ile birlikte 5 ml LB et suyu ihtiva eden bir deney tüpü içinde. </li><li> 250 rpm&#39;de 37 ° C&#39;de gece boyunca çalkalayıcıda test tüpleri yerleştirin. </li><li> Ertesi sabah, gece boyunca büyümeye-up 200 ul almak ve 100 ug / ml ampisilin içeren 5 ml LB ekleyin. </li><li> 750 ul kültür (steril) 250 ul% 50 gliserol ile kalan hücreleri aşağı dondurma ve -80 ° C&#39;de tutmak Not: Yeni bir test ifade ve ölçek-up işlemleri donmuş hücrelerin bir kazıma elde etmek için steril bir aplikatör çubuk kullanarak ve uygun antibiyotik ile LB aşılayarak yapılabilir. </li><li> Optik yoğunluk (OD) 600 nm &#39;lik bir emişteki 0,7-0,8 arasında ölçülmektedir kadar 37 ° C&#39; de 250-300 rpm&#39;de çalkalayıcı test tüpü yerleştirin. </li><li> 1 mM nihai konsantrasyonunda IPTG ile hücrelerin neden. </li><li> 300 rpm&#39;de 37 ° C&#39;de ek bir 4 saat boyunca çalkalanır. Alternatif hücreler de yapabilirsiniz250-300 rpm&#39;de 18 ° C&#39;de gece boyunca çalkalanır. Bu, hedef proteine ​​bağlı olarak plazmid daha yüksek bir verim üretebilir. </li><li> Testi İfade Sodyum dodesil sülfat poliakrilamid jel elektroforezi (SDS-PAGE) Analizi <ol><li> 1.5 ml tüp içinde kültür ve yerin 500 ul alır. 5 dakika boyunca 13-15 xg&#39;de aşağı spin. Üstteki likit dökün ve etiket &quot;çözünür.&quot; Yükleme boyası (50 ul 2-merkaptoetanol, 950 ul Laemmli numune tampon maddesi) 200 ul vorteks ile süspanse pelet. Not: Çözünür bakteri granül birleştirici protein bakteri hücrelerinin sitoplazmik bölgelerinde olup olmadığını belirlemek için kullanılacaktır. Peletler, gerekli olana kadar bir boya yükleme olmadan -80 ° C&#39;de saklanabilir. Dönüştürülmüş ya da neden olmamıştır bir kontrol bakteri kültürü çözünür hem de karşılaştırma için tedavi edilebilir. </li><li> 1.5 ml tüp içinde kültür ve yerin 1.000 ul alır. 5 dakika boyunca 13-15 xg&#39;de aşağı spin.Üstteki likit dökün ve etiket &quot;çözünmez.&quot; Not: Çözülmez pelet bakteri hücrelerinin dahil vücutlarında bulunan proteinlerin serbest bırakmak için aşağıda denaturasyonu prosedür uygulanır. Peletler, gerekli olana kadar -80 ° C&#39;de saklanabilir. Dönüştürülmüş ya da neden olmamıştır bir kontrol bakteri kültürü çözünmeyen hem de karşılaştırma için tedavi edilebilir. <ol><li> 200 ul BugBuster içinde çözünmeyen pelet yeniden süspanse edin ve 30 dakika için oda sıcaklığında bırakın. </li><li> 5 dakika boyunca 13-15 xg&#39;de tekrar numune aşağı Spin ve üstte 50 ul alır ve yeni &quot;Çözünmeyen&quot; 1.5 ml tüp ekleyin. </li><li> Sonra bu yeni örneğe yükleme boyası 50 ul ekleyin. </li></ol></li><li> SDS-PAGE analizi için proteinleri denatüre etmek için 5 dakika boyunca hem de çözünür ve çözünmez örnekleri kaynatın. </li><li> Standart merdiven ile elektroforez jel halinde her bir numune yükleyin. </li><li> Görselleştirmek amacıyla protein numuneler bir lekelenme kullanımıg reaktif ve şirketin protokolünü uygulayın. </li><li> Protein, SDS-PAGE jel (Şekil on (Not 4.9.1 ve 4.9.2), bu iki şerit karşılaştırma hem de çözünür ve çözünür olmayan kontrol şeride şerit karşılaştırarak çözünür ve / veya çözünmez fraksiyonlar içinde eksprese edip etmediğini belirlemek 2). Koyu bant çözünür veya çözünmez şeritlerde proteinin molekül ağırlığı yaklaşık görünmelidir. Bu, izolasyon prosedürü Protokol 6 kullanılacak belirleyecektir. Not: bir grup izolasyon yöntemi rekombinant proteinin daha yüksek bir verim (Şekil 3) üretir belirlemek için Protokol 6 da kullanılan izolasyon altında gerçekleştirilebilir, ya da her iki yönde protein izole edilebilir, ya da çok bu bölgelerin her ikisinde de varsa . </li><li> 4 saat ve gece boyunca indüksiyon yapıldı ise, ölçek-up işlemi için yüksek protein üretimini (Şekil 2) sahip olan tümevarım metodu belirler. </li></ol></li></ol&gt; 5. Ölçek-up Usul ve Ana Kültür <ol><li> Terrific Broth 85.7 g ve 1.8 L saf su ve 1 saat süre ile sıvı döngüsünde otoklav içinde% 50 gliserol, 28.8 ml büyüme ortamı hazırlayın. </li><li> Adım 4.5 oluşturulan donmuş hücre stok kültürü bir gece boyunca başlatın. Not: Koşullar aseptik yapılır. <ol><li> Steril bir 125 ml Erlenmeyer şişesi içinde 100 ug / ml &#39;de 20 ml LB ve ampisilin bir son konsantrasyon ile karıştırın. </li><li> Steril bir aplikatör kullanarak dönüştürülmüş E. bir hurdaya almak coli hücreleri ve şişeye damla aplikatörü. Köpük stoper ya da pamuk ile aplikatör sopa ve fiş şişeyi çıkarın ve sterilite korumak için alüminyum folyo ile kaplayın. </li><li> 37 ° C&#39;de 250 rpm&#39;de gece boyunca çalkalayın </li></ol></li><li> Ana Kültür Not: Koşullar aseptik yapılır. <ol><li> Steril büyüme ortamı içinde 1.8 L kültür içine dökün ve bir gece boyunca 10 ° ampisilin eklemek0 ug / ml ve bir Pasteur pipeti kullanılarak steril köpük önleyici 204 6-8 damla. </li><li> Havalandırma taş aracılığıyla kültürler içine sıkıştırılmış hava kabarcıkları, süzüldü 0,2 mm olan bir 37 ° C su banyosu içinde yer kültürler. </li><li> OD 600 nm 0,7-0,8 ulaştığında, IPTG (1 mM) ile teşvik ve indüksiyon aşama 4.9 SDS-PAGE çözünür / çözünmeyen sonuçlarına bağlı olarak 18 ° C &#39;de 37 ° C&#39;de ya da gece boyunca 4 saat için ya da oluşmasına izin verir. </li></ol></li><li> E. Toplama Hücreler coli <ol><li> 4 ° C&#39;de 14,000 x g&#39;de 15 dakika boyunca santrifüj 1 L şişe (2 şişe / kültür) hücre kültürü aşağı Spin </li><li> Süpernatantı dökün ve ince bir spatula kullanılarak, bakterilerin iki adet 50 ml tüplere pelet kepçe. Hücreler, bir kaç dakika için santrifüjleme ile tane haline tekrar edilebilir. Not: her bir 1.8 L kültür iki bakteri topaklar, her bir 50 ml santrifüj tüpüne bir neden olur. </li><li> Protein izolasyonu kadar -80 ° saklayın peletler. </li></ol> &lt;/ Li&gt; </ol> 6. Rekombinant Protein izolasyonu ve saflaştırılması Protein aşama 4.9 SDS-PAGE Analizi göre çözünür bölgesinde yer almaktadır, o zaman &quot;yerel yalıtım&quot; olarak kullanılacaktır, ancak çözünmeyen proteinler &quot;Özgün olmayan Isolation&quot; işlemleri için gerçekleştirilir: edin. <ol><li> Cell Lysis <ol><li> Özgün olmayan <ol><li> Kaldır E. dönüştürdü coli topak -80 ° C dondurucu ve her bir santrifüj tüpüne 20 ml Lysis / Wash Buffer (Tablo 1) ekleyin. </li><li> Vortex ve özer ve herhangi bir büyük boyutta olmadan tampon çözeltisi içine çözen kadar donmuş pelet sallayın. Gecede nutator kuluçkaya yatmaktadır. Ertesi sabah, topak artık tamponundan proteinin denatürasyon nedeniyle yapışkan bir harç madde olmalıdır. </li><li> 30 dakika boyunca, oda sıcaklığında 20,500 x g&#39;de santrifüje bulamacı. Izolasyon için, yeni bir tüpe transfer süpernatan ve topak atın. </li></ol></li><li&gt; Yerli <ol><li> Elde transforme edilmiş E. -80 ° C dondurucu coli pelet. </li><li> 30 ml&#39;lik bir son hacme ulaşmak için santrifüj tüpüne Lysis Buffer (Tablo 1) ekleyin ve karıştırın ve sıkı bir şekilde çalkalanarak dondurulmuş pelet çıkarmak. Buz üzerinde pelet yerleştirin. </li><li> 1-2 dakika boyunca% 100 genliğinde% 70 etanol ile sonikatör probu yıkayın. Sonra saf su ile tekrarlayın. </li><li> Sonicate bakteriler 5 dakika (10 dakika toplam geçen süre) için buz üzerinde ise pelet. <ol><li> Sn kapalı on/30 30 saniye darbesi ile% 30 genlikte selenleyicisi ayarlayın. </li><li> Bob santrifüj tüpü ve tamamen hücre pelet kadar kırmak için Sonication aralıkta aşağı. Toplam sürenin sonunda görünür bir bakteri, bir tel, viskoz bir bulamaç kaldı pelet olmalıdır. </li><li> Farklı protein izolasyonların arasındaki sonikatör probu temizleme hem de aşama 6.1.2.3 de tarif edildiği gibi% 70 etanol ve ultra saf su ile depolama için. </li></ol></li&gt; <li> 30 dakika boyunca 4 ° C&#39;de 20,500 x g&#39;de santrifüjleyin bulamacı. Izolasyon için, yeni bir tüpe transfer süpernatan ve topak atın. </li></ol></li></ol></li><li> Ni-NTA Afinite Kromatografisi <ol><li> Özgün olmayan <ol><li> 1 ekleyin ml Ni2 +-NTA her santrifüj tüpünün (1.8 L kültür boyunca 2 ml reçine toplam) hazırlandı reçine çözeltisi ve nutator en az 1 saat oda sıcaklığında inkübe edin. </li><li> Afinite sütuna şerbeti dökün ve çözüm atık behere tamamen musluk vana aracılığıyla akmasına izin. </li><li> Her bir yıkama için Lizis / Yıkama Tamponu 10 ml ile 10 yıkama yapın. <ol><li> İlk iki yıkama, ek reçine kaldırmak ve daha sonra kolon içine dökmek için santrifüj tüpüne 10 ml. Ek yıkama kolonuna doğrudan ilave edilebilir. </li><li> Her yıkamadan sonra, cam bir çubuk ile karıştırma, reçineyi karıştırın. Yıkama atık beher içine damlar, bir sonraki 10 mi ilave edilebilir. </li></ol></li><li> Sonra tamamen dr yıkayınyoluyla ips, valfli yakın vana, atık beher kaldırmak ve protein toplama için 50 ml santrifüj tüpü ile değiştirin. </li><li> Seyreltme Tampon maddesi (Tablo 1) 15 ml eklenir ve karışmaya-up reçine, solüsyon 5 dakika boyunca oturmak için izin verir. Açık musluk vana ve toplamak yıkama. Ilave bir 15 ml &#39;si ile tekrar tekrar edin. </li></ol></li><li> Yerli <ol><li> Aşağıdaki parametreleri ayarlamak dışında (Adımda 6.2.1.1-6.2.1.4) Yukarıdaki Özgün olmayan Affinity Kromatografisi izleyin: <ol><li> Ni 2 nutator en az 1 saat boyunca 4 ° C &#39;de +-NTA reçine solüsyonu inkübe edin. </li><li> Uygun Wash Buffer (Tablo 1) kullanarak. </li></ol></li><li> Elüsyon Tamponu (Tablo 1) 5 ml ve 5 dakika için reçine ile inkübe edin. <ol><li> Açık musluk vanası ve çözeltinin çok kadar elüsyonu toplanması yoluyla damlatılır gelmiştir. </li><li> 96 oyuklu plaka temizlemek için 90 ul / oyuk Bradford reaktifı ilave edin. Her yıkama izin sonra yani 10 ulde 90 ul Bradford reaktifi içeren içine sütundan damla devrim sisi. </li><li> Bradford tahlil artık protein (renk temizlemek için açık mavi, koyu mavi gider) tespit kadar bir seferde 5 ml sıyrılması Tampon eklemeye devam edin. Bu genellikle 4-5 elüsyon hacimleri alır. </li></ol></li></ol></li></ol></li><li> Diyaliz / Renatürasyon <ol><li> 4 ° C. Özgün olmayan (renatürasyonunu) ve yerli diyaliz tamponlar (Tablo 1) ve mağaza olun Not: diyaliz tampon pH&#39;ı, hedef proteinin izoelektrik noktasının (pl) ile tespit edilir. Başparmak proteinlerin bir kural kendi pl değerlerin üstünde veya altında en az bir tam nokta tamponlu gerektiği gibi. </li><li> Uygun molekül ağırlığı kesme (Sema3A için NGF ve 50,000 MWCO için 25,000 MWCO) ile diyaliz boru yerli ve yerli olmayan elüsyonları aktarın. 4 ° C&#39;de 4 saat boyunca, ilgili diyaliz tampon maddesi içinde 1 her bir protein numunesi yerleştirin ve daha sonra söz konusu tampon 2 fazla ile değiştirin4 ° C&#39;de gece Not: Protein doğru ve tekrar katlanmadan gerçekleşmesi için tampon değişimi için en az 4 saat süreyle her bir tampon içinde diyaliz edilmiş olması gerekir. </li><li> Santrifüj sıkma konsantre edici kullanılarak en az 5 ml diyaliz edilmiş protein elüsyonları konsantre edin. Not: Proteinler daha hızlı protein sıvı kromatografisi (FPLC) kullanılarak saflaştırılabilir ve yeniden konsantre edildi olabilir. </li></ol></li><li> Dondurularak önceden tartılmış bir mikrosantrifüj tüpü içinde bir 10-50 ml bir numuneyi kurutmak suretiyle protein konsantrasyonu (mg / ml) belirler. <ol><li> Isteğe bağlı c: l yol uzunluğu olan bir 280nm / εl,: = sönüm katsayısı belirlemek, ε, protein yoğunlaşma Beer-Lambert Yasasına kullanılarak 280 nm &#39;de bir numunenin absorbansı ölçülerek gelecek izolasyon belirlenebilir, böylece. </li></ol></li></ol> 7. Saflaştırılmış protein Biyotinilasyon <ol><li> 10,000 MWCO diyaliz kaseti ag proteinleri Dialyze10 mM Tris ainst (pH = 8.0), 6 değişikliklerin toplam tampon her 4 saat değiştirilmesi. </li><li> Biyotinilasyon için 2 ml mikro santrifüj tüplerine (şimdi 10 mM Tris tamponu içinde) yeniden birleştirici proteinleri aktarın. </li><li> Bir biotin protein ligaz kiti kullanılarak Biotinylate proteinleri. </li><li> 3 tamponu ile 10,000 MWCO diyaliz kaseti kullanılarak PBS (pH = 7.4) karşı proteinleri Dialyze 2 gün boyunca bir gün değişir. </li><li> Bir miktar analiz kiti kullanılarak protein yüzde biyotinilasyonunu belirler. </li><li> 4 ° C&#39;de veya uzun süreli depolama için -20 ° C&#39;de alikot ve mağazada 6.4 ve mağaza de tarif edildiği gibi yeniden konsantrasyonunun belirlenmesi. </li></ol>

<ol><li>Itakura, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+in+Escherichia+coli+of+a+chemically+synthesized+gene+for+the+hormone+somatostatin%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Expression in Escherichia coli of a chemically synthesized gene for the hormone somatostatin.</a> Science. 198 (4321), 1056-1063 (1977).</li>
<li>Goeddel, D. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+in+Escherichia+coli+of+chemically+synthesized+genes+for+human+insulin%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Expression in Escherichia coli of chemically synthesized genes for human insulin.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 76 (1), 106-110 (1979).</li>
<li>Romano, N. H., Sengupta, D., Chung, C., Heilshorn, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein-engineered+biomaterials%3A+nanoscale+mimics+of+the+extracellular+matrix%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim.+Biophys.+Acta%22%5BJournal%5D)">Protein-engineered biomaterials: nanoscale mimics of the extracellular matrix.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1810 (3), 339-349 (2011).</li>
<li>Sengupta, D., Heilshorn, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein-engineered+biomaterials%3A+highly+tunable+tissue+engineering+scaffolds%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng.+Part+B+Rev%22%5BJournal%5D)">Protein-engineered biomaterials: highly tunable tissue engineering scaffolds.</a> Tissue Eng. Part B Rev. 16 (3), 285-293 (2010).</li>
<li>Kamionka, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+of+therapeutic+proteins+production+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Pharm.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Engineering of therapeutic proteins production in Escherichia coli.</a> Curr. Pharm. Biotechnol. 12 (2), 268-274 (2011).</li>
<li>Rao, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+outlook+for+protein+engineering+in+crop+improvement%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">The outlook for protein engineering in crop improvement.</a> Plant Physiol. 147 (1), 6-12 (2008).</li>
<li>Wen, F., Nair, N. U., Zhao, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+engineering+in+designing+tailored+enzymes+and+microorganisms+for+biofuels+production%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Protein engineering in designing tailored enzymes and microorganisms for biofuels production.</a> Curr. Opin. Biotechnol. 20 (4), 412-419 (2009).</li>
<li>Singh, R. K., Tiwari, M. K., Singh, R., Lee, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+protein+engineering+to+immobilization%3A+promising+strategies+for+the+upgrade+of+industrial+enzymes%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Mol.+Sci%22%5BJournal%5D)">From protein engineering to immobilization: promising strategies for the upgrade of industrial enzymes.</a> Int. J. Mol. Sci. 14 (1), 1232-1277 (2013).</li>
<li>Bernaudat, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterologous+expression+of+membrane+proteins%3A+choosing+the+appropriate+host%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Heterologous expression of membrane proteins: choosing the appropriate host.</a> PLoS One. 6 (12), (2011).</li>
<li>McCormick, A. M., Wijekoon, A., Leipzig, N. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific+immobilization+of+biotinylated+fusion+proteins+NGF+and+Sema3A+utilizing+a+photo-cross-linkable+diazirine+compound+for+controlling+neurite+extension%5BTitle%5D)+AND+%22Bioconjug.+Chem%22%5BJournal%5D)">Specific immobilization of biotinylated fusion proteins NGF and Sema3A utilizing a photo-cross-linkable diazirine compound for controlling neurite extension.</a> Bioconjug. Chem. 24 (9), 1515-1526 (2013).</li>
<li>Studier, F. W., Daegelen, P., Lenski, R. E., Maslov, S., Kim, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Understanding+the+differences+between+genome+sequences+of+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22B+strains+REL606+and+BL21%28DE3%29+and+comparison+of+the+E.+coli+B+and+K-12%22%5BJournal%5D)">Understanding the differences between genome sequences of Escherichia coli.</a> B strains REL606 and BL21(DE3) and comparison of the E. coli B and K-12. 394 (4), 653-680 (2009).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Novagen+pET+System+Manual%22">Novagen pET System Manual</a>. Merck KGaA, , 11, User Protocol TB055 Rev. C 0611JN. Darmstadt, Germany. 1-63 (2011).</li>
<li>Balbas, P., Bolivar, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Back+to+basics%3A+pBR322+and+protein+expression+systems+in+E.+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Back to basics: pBR322 and protein expression systems in E. coli.</a> Methods Mol. Biol. 267, 77-90 (2004).</li>
<li>Studier, F. W., Moffatt, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+bacteriophage+T7+RNA+polymerase+to+direct+selective+high-level+expression+of+cloned+genes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Biol.%22%5BJournal%5D)">Use of bacteriophage T7 RNA polymerase to direct selective high-level expression of cloned genes.</a> J. Mol. Biol.. 189 (1), 113-130 (1986).</li>
<li>Dubendorff, J. W., Studier, F. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controlling+basal+expression+in+an+inducible+T7+expression+system+by+blocking+the+target+T7+promoter+with+lac+repressor%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Controlling basal expression in an inducible T7 expression system by blocking the target T7 promoter with lac repressor.</a> J. Mol. Biol. 219 (1), 45-59 (1991).</li>
<li>Studier, F. W., Rosenberg, A. H., Dunn, J. J., Dubendorff, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+T7+RNA+polymerase+to+direct+expression+of+cloned+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Use of T7 RNA polymerase to direct expression of cloned genes.</a> Methods Enzymol. 185, 60-89 (1990).</li>
<li>Tucker, J., Grisshammer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+a+rat+neurotensin+receptor+expressed+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+J.%22%5BJournal%5D)">Purification of a rat neurotensin receptor expressed in Escherichia coli.</a> Biochem. J.. 317, 891-899 (1996).</li>
<li>Schatz, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+peptide+libraries+to+map+the+substrate+specificity+of+a+peptide-modifying+enzyme%3A+a+13+residue+consensus+peptide+specifies+biotinylation+in+Escherichia+coli%29%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Use of peptide libraries to map the substrate specificity of a peptide-modifying enzyme: a 13 residue consensus peptide specifies biotinylation in Escherichia coli).</a> Biotechnology. 11 (10), 1138-1143 (1993).</li>
<li>Anfinsen, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Principles+that+govern+the+folding+of+protein+chains%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Principles that govern the folding of protein chains.</a> Science. 181 (4096), 223-230 (1973).</li>
<li>Villaverde, A., Carrio, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+aggregation+in+recombinant+bacteria%3A+biological+role+of+inclusion+bodies%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol.+Lett%22%5BJournal%5D)">Protein aggregation in recombinant bacteria: biological role of inclusion bodies.</a> Biotechnol. Lett. 25 (17), 1385-1395 (2003).</li>
<li>Leipzig, N. D., Wylie, R. G., Kim, H., Shoichet, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+of+neural+stem+cells+in+three-dimensional+growth+factor-immobilized+chitosan+hydrogel+scaffolds%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Differentiation of neural stem cells in three-dimensional growth factor-immobilized chitosan hydrogel scaffolds.</a> Biomaterials. 32 (1), 57-64 (2011).</li>
<li>Tam, R. Y., Cooke, M. J., Shoichet, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+covalently+modified+hydrogel+blend+of+hyaluronan-methyl+cellulose+with+peptides+and+growth+factors+influences+neural+stem%2Fprogenitor+cell+fate%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mater.+Chem%22%5BJournal%5D)">A covalently modified hydrogel blend of hyaluronan-methyl cellulose with peptides and growth factors influences neural stem/progenitor cell fate.</a> J. Mater. Chem. 22, 19402-19411 (2012).</li>
<li>Li, H., Wijekoon, A., Leipzig, N. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+Differentiation+of+Neural+Stem+Cells+in+Macroporous+Photopolymerizable+Hydrogel+Scaffolds%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">3D Differentiation of Neural Stem Cells in Macroporous Photopolymerizable Hydrogel Scaffolds.</a> PLoS One. 7 (11), (2012).</li>
<li>McCormick, A. M., Leipzig, N. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+regenerative+strategies+incorporating+biomolecular+axon+guidance+signals%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+Biomed.+Eng%22%5BJournal%5D)">Neural regenerative strategies incorporating biomolecular axon guidance signals.</a> Ann. Biomed. Eng. 40 (3), 578-597 (2012).</li>
<li>Kay, B. K., Thai, S., Volgina, V. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+biotinylation+of+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">High-throughput biotinylation of proteins.</a> Methods Mol. Biol. 498, 185-196 (2009).</li>
<li>Bayer, E. A., Wilchek, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+biotinylation%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Protein biotinylation.</a> Methods Enzymol. 184, 138-160 (1990).</li>
<li>Weber, P. C., Ohlendorf, D. H., Wendoloski, J. J., Salemme, F. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+origins+of+high-affinity+biotin+binding+to+streptavidin%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Structural origins of high-affinity biotin binding to streptavidin.</a> Science. 243 (4887), 85-88 (1989).</li>
<li>Chen, I., Ting, A. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Site-specific+labeling+of+proteins+with+small+molecules+in+live+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Site-specific labeling of proteins with small molecules in live cells.</a> Curr. Opin. Biotechnol. 16 (1), 35-40 (2005).</li>
<li>Howarth, M., Ting, A. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+proteins+in+live+mammalian+cells+with+biotin+ligase+and+monovalent+streptavidin%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Imaging proteins in live mammalian cells with biotin ligase and monovalent streptavidin.</a> Nat. Protoc. 3 (3), 534-545 (2008).</li>
<li>Hutsell, S. Q., Kimple, R. J., Siderovski, D. P., Willard, F. S., Kimple, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-affinity+immobilization+of+proteins+using+biotin-+and+GST-based+coupling+strategies%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">High-affinity immobilization of proteins using biotin- and GST-based coupling strategies.</a> Methods Mol. Biol. 627, 75-90 (2010).</li>
<li>Marek, P., Senecal, K., Nida, D., Magnone, J., Senecal, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+a+biotin+functionalized+QD+assay+for+determining+available+binding+sites+on+electrospun+nanofiber+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Nanobiotechnol%22%5BJournal%5D)">Application of a biotin functionalized QD assay for determining available binding sites on electrospun nanofiber membrane.</a> J. Nanobiotechnol. 9, 48 (2011).</li>
<li>Cull, M. G., Schatz, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biotinylation+of+proteins+in+vivo+and+in+vitro+using+small+peptide+tags%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Biotinylation of proteins in vivo and in vitro using small peptide tags.</a> Methods Enzymol. 326, 430-440 (2000).</li>
<li>Miller, R. E., Kopesky, P. W., Grodzinsky, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+factor+delivery+through+self-assembling+peptide+scaffolds%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Orthop.+Relat.+Res%22%5BJournal%5D)">Growth factor delivery through self-assembling peptide scaffolds.</a> Clin. Orthop. Relat. Res. 469 (10), 2716-2724 (2011).</li>
<li>Davis, M. E., Hsieh, P. C., Grodzinsky, A. J., Lee, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Custom+design+of+the+cardiac+microenvironment+with+biomaterials%5BTitle%5D)+AND+%22Circ.+Res%22%5BJournal%5D)">Custom design of the cardiac microenvironment with biomaterials.</a> Circ. Res. 97 (1), 8-15 (2005).</li>
<li>Tokatlian, T., Shrum, C. T., Kadoya, W. M., Segura, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protease+degradable+tethers+for+controlled+and+cell-mediated+release+of+nanoparticles+in+2-+and+3-dimensions%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Protease degradable tethers for controlled and cell-mediated release of nanoparticles in 2- and 3-dimensions.</a> Biomaterials. 31 (31), 8072-8080 (2010).</li>
<li>Gill, R. T., Valdes, J. J., Bentley, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparative+study+of+global+stress+gene+regulation+in+response+to+overexpression+of+recombinant+proteins+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Metab.+Eng%22%5BJournal%5D)">A comparative study of global stress gene regulation in response to overexpression of recombinant proteins in Escherichia coli.</a> Metab. Eng. 2 (3), 178-189 (2000).</li>
<li>Sivashanmugam, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Practical+protocols+for+production+of+very+high+yields+of+recombinant+proteins+using+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Sci%22%5BJournal%5D)">Practical protocols for production of very high yields of recombinant proteins using Escherichia coli.</a> Protein Sci. 18 (5), 936-948 (2009).</li>
<li>Graslund, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+production+and+purification%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Protein production and purification.</a> Nat. Methods. 5 (2), 135-146 (2008).</li>
<li>Marston, F. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+purification+of+eukaryotic+polypeptides+synthesized+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+J%22%5BJournal%5D)">The purification of eukaryotic polypeptides synthesized in Escherichia coli.</a> Biochem. J. 240 (1), 1-12 (1986).</li>
<li>Sorensen, H. P., Mortensen, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Soluble+expression+of+recombinant+proteins+in+the+cytoplasm+of+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Microb.+Cell+Fact%22%5BJournal%5D)">Soluble expression of recombinant proteins in the cytoplasm of Escherichia coli.</a> Microb. Cell Fact. 4 (1), (2005).</li>
<li>de Marco, A., Deuerling, E., Mogk, A., Tomoyasu, T., Bukau, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chaperone-based+procedure+to+increase+yields+of+soluble+recombinant+proteins+produced+in+E.+coli%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Chaperone-based procedure to increase yields of soluble recombinant proteins produced in E. coli.</a> BMC Biotechnol. 7, 32 (2007).</li>
<li>de Groot, N. S., Ventura, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+temperature+on+protein+quality+in+bacterial+inclusion+bodies%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">Effect of temperature on protein quality in bacterial inclusion bodies.</a> FEBS Lett. 580 (27), 6471-6476 (2006).</li>
<li>Ventura, S., Villaverde, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+quality+in+bacterial+inclusion+bodies%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Protein quality in bacterial inclusion bodies.</a> Trends Biotechnol. 24 (4), 179-185 (2006).</li>
<li>Vera, A., Gonzalez-Montalban, N., Aris, A., Villaverde, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+conformational+quality+of+insoluble+recombinant+proteins+is+enhanced+at+low+growth+temperatures%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol.+Bioeng%22%5BJournal%5D)">The conformational quality of insoluble recombinant proteins is enhanced at low growth temperatures.</a> Biotechnol. Bioeng. 96 (6), 1101-1106 (2007).</li>
<li>Peternel, S., Komel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+biologically+active+nanomaterial+%28inclusion+bodies%29+from+bacterial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Microb.+Cell+Fact%22%5BJournal%5D)">Isolation of biologically active nanomaterial (inclusion bodies) from bacterial cells.</a> Microb. Cell Fact. 9, 66 (2010).</li>
<li>Garcia-Fruitos, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inclusion+bodies%3A+a+new+concept%5BTitle%5D)+AND+%22Microb.+Cell+Fact.+9%22%5BJournal%5D)">Inclusion bodies: a new concept.</a> Microb. Cell Fact. 9. 9, 80 (2010).</li>
<li>Li, Y., Sousa, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+and+purification+of+E.+coli+BirA+biotin+ligase+for+in+vitro+biotinylation%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Expr.+Purif%22%5BJournal%5D)">Expression and purification of E. coli BirA biotin ligase for in vitro biotinylation.</a> Protein Expr. Purif. 82 (1), 162-167 (2012).</li>
</ol>

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

Rekombinant protein mühendisliği birçok disiplinin yayılan çok güçlü bir tekniktir. Bu, özel olarak tasarlanmış proteinlerin yüksek verimle üretimini sağlayan, düşük maliyetli, ayarlanabilir ve nispeten basit bir işlemdir. Bu tasarımı ve hedef proteinleri ifade her zaman kolay değildir dikkat etmek önemlidir. Bazal ve rekombinant protein ekspresyon vektörü kararlılık, E. belirli seçenekler bağlıdır coli hücre suşları, peptit etiketi eklemeler ve yetiştirme parametreleri. Bizim özel tasarım kriteri de k...

Proteinler sonuçta uygun doku oluşumu ve organizasyon açan, birçok biyolojik fonksiyon için sorumlu biyomoleküllerin geniş bir yelpazeyi kapsamaktadır. Bu moleküller, insan vücudu içinde bir denge sağlamak, düzenleme-yukarı ve / veya aşağı-regülasyonu gen ve proteinlerin kontrol sinyal yollarının binlerce başlatır. Tek bir protein bozulması yıkıcı bozukluklar ya da hastalıkların başlangıcı yol açabilir sinyallerin tüm bu ağ-etkiler. Laboratuarda bireysel protein mühendislik bu olumsuz etkileri ile mücadele için tek bir çözüm sunar ve küçük moleküllü ilaçlar için bir alternatif sunuyor. 1977 yılında, 14 amino asit sekansını kodlayan bir somatostatin gen E. kullanılarak oluşturulan birinci işlenmiş polipeptitlerin biri coli 1. Kısa bir süre sonra, 1979 yılında, insülin, plasmid pBR322 klonlanmıştır dönüştürülmüş, ifade edildi ve 2 saflaştırılmıştır. O zamandan beri, rekombinant proteinleri res birden alanlara nüfuzlarını genişlettikearch vb biyomalzeme, ilaç dağıtım, doku mühendisliği, biyofarmösetiklerinin, tarım, endüstriyel enzimler, biyoyakıt gibi (yorumlar için başvuruları 3-8). Bu durum da dahil olmak üzere teknik amaçlı uygulamaya özel kimyasal kısımların ve protein dizilerinin eklenmesi ile içerir, ancak, hedef protein tanımlama, stabilizasyon ve arıtma için bunlarla sınırlı olmamak kaydıyla çok yönlülüğünü ölçüde kaynaklanmaktadır. Rekombinant DNA teknolojisi ile, memeli rekombinant proteinleri, bitki, böcek, maya, mantar veya bakteriler dahil olmak üzere ökaryotik ve prokaryotik konak sistemleri çeşitli ifade edilebilir. Her ev sahibi farklı avantajlar sunar ve genellikle iyi sistem protein fonksiyonu, verim, stabilite, genel maliyet ve ölçeklenebilirlik göre belirlenir. Bakteriler ökaryot hücreleri genellikle ana (yani glikosilasyonu disülfit köprü, e sağlamak sonrası modifikasyon mekanizmaları eksikliği<html> tc). 5.. Ancak, bu ana genellikle daha pahalı ve zaman alıcı 9 olan, bir sonucu olarak, memeli ve böcek sistemleri genellikle, ökaryotik proteinlerin daha iyi uyum ve tanımına neden olur. Bu nedenle, E. Hücreler ucuz büyüme koşulları hızla genişletmek ve genetik mekanizmaları ifade de 5,9 anlaşılmıştır çünkü coli ekspresyon sistemi için tercih ev sahipliği yapmaktadır. Buna ek olarak, bu sistem, post-translasyonel modifikasyonlar 10 olmamasına rağmen üretim amaçları ve fonksiyonel proteinleri sonuç için büyütüleceği kolaydır. E. Bu suş yüksek dönüşüm verimleri dayalı mükemmel plazmid verim sağlar, çünkü coli K12 suşu klonlama için bu protokol seçilir. Ayrıca, bir E. Bu konakçı suşu kontrol protein ifadesini ve kararlılığını 11 içerir T7 RNA polimeraz genini içerdiği için coli suşu BL21 ifade için kullanılır. çadır &quot;&gt; ana seçimden sonra, daha fazla bakım rekombinant proteinleri sentezleyen bakteryofaj T7 transkripsiyon ve çeviri sinyallerinin yönlendirmesi altında klonlanır hedef bir DNA dizisi ile başlar. seçilir ve kontrollü bir protein ekspresyonunu kolaylaştırmak için ideal bir ekspresyon vektörü seçiminde de büyük dikkat olmalıdır ve ifadesi T7 RNA polimeraz geninin kromozom kopyasını 12 arasında ihtiva eden konakçı hücrelerde endüklenir. plazmid vektörü pBR322 türetilen Bu vektörler, (inceleme için bkz 13 referans), sıkı bir şekilde, başlangıçta 14 Studier ve arkadaşları tarafından geliştirilen T7 promoter tarafından kontrol edilir ve ek sağlamaktadır lac operatörü ve lac represör (lac1) dahil edilmesi yoluyla kontrol 15,16. yeniden birleştirici protein mühendisliği için, bu ifade sistemi, farklı hedef DNA dizileri sokulmasıyla istenen bir proteinin belirli bir amino asit sekansı ya da uyarlamak için füzyon proteinlerini oluşturmak için olanağı sunar Kombine etki oluşurTek proteinlerden s. Buna ek olarak, bir dizi çizim N veya C terminaline yerleştirilmesi için peptit etiketi modifikasyonlarını içerir. Tasarım amaçları için, bir histidin (His) etiketi saflaştırma için DNA hedef dizisine ilave edildi ve bir 15 amino asit sekansı, biyotinile biyotinilasyon 17,18 için dahil edilmiştir. Bu protokol, bir ampisilin direnç genini ihtiva eden bir plasmid, bizim biyotinile füzyon protein dizileri taşımak için seçildi. Expression T7 lac promotörü, bu vektör ile kontrol edilir ve kolay bir şekilde, izopropil β-D-1-tiogalaktopiranosid (IPTG) ile endüklenir. Deney ifadeler (küçük ölçekli kültürler), saflaştırma işlemleri formüle ya çözünebilir ya da çözünmez formda ifade edilebilir hedef proteinin varlığını ve çözünürlüğünü belirlemek için kullanılır. Bakteri hücre içinde ifade edilen çözünür bir protein kendi doğal yapısı 19 korumak için kendiliğinden katlama uğrayacaktır. Tipik olarak, doğalyapı termodinamik olarak tercih edilir. Birçok durumda ana metabolik aktivitesi çözünmeyen protein üretimi ve çözünmez agregaların oluşan protein inklüzyon cisimciklerinin oluşumuna yol açar sistemde stres yerleştirerek, hedef proteine ​​elverişli değildir. Bu durumda, hedef protein 20 genel olarak, biyolojik olarak aktif olmayan hale getirilerek, denatüre. Her iki test ifadeler-up ölçeklendirilir ve izolasyon prosedürleri hedef proteinin çözünürlükleri tarafından belirlenir. Ek bir renatürasyon adımı yeniden katlama ya da çözünmeyen proteinler için gereklidir. Meydana gelen rekombinant proteinler, bundan başka, boyut dışlama kromatografisi kullanılarak saflaştırılabilir. Evde rekombinant protein üretim hedef proteinin miligramı Ana kültürün her bir litresi için izole edilebilir çünkü ticari ürünlere kıyasla maliyet avantajı sunmaktadır. Gerekli ekipman çoğu, tipik bir biyolojik ya da kimyasal laboratuar mevcuttur. Protein mühendisliği oluşturulması için sağlar:her zaman ticari olarak geçerli değildir ilave fonksiyonlarını özel füzyon proteinlerinin. 1 rekombinant protein mühendisliği ile ilgili olan temel prosedürleri tasvir etmektedir. Bu ekspresyon sistemi ile, örneğin, interferon-gama, trombosit türevli büyüme faktörü, kemik morfojenik proteini-21-23 gibi pek çok biyotinile protein, oluşturduk, ama biz akson rehberlik, NGF (29 kDa için tasarlanmış iki protein üzerinde durulacak ) ve Sema3A (91 kDa) 10 (inceleme için) 24 başvuru bkz. Biyotinilasyon tanımlanması, hareketsizleştirme ve iyi bilinen bir biotin-streptavidin etkileşimini kullanan 25-27 etiketli proteinlerinin izole edilmesi için yaygın bir tekniktir. Biyofizik sondalar 28,29, 30 biyosensörler, ve kuantum noktaları 31 10 -15 M 27 sipariş üzerine bir K d ile biotin-streptavidin konjugasyon yüksek afinite kullanan sistemler bazı örnekler vardır. E. coli biokalay ligazı, BirA, biyotin içinde bulunan lizin yan zincire biyotin kovalent ekinde yardımcı dizisi 18,32 etiketlendi. Malzeme ve biyomoleküllere Tethering biyotin çoklu doku mühendisliği uygulamaları 21,33-35 için hücre büyüme faktörlerinin sürekli teslim üretti. Bu nedenle, bu özel tasarımlı biyotinile proteinleri mühendislik çoklu araştırma çıkarlarını aşabiliriz güçlü bir araçtır.

<table><tbody><tr><td>1,4-Ditio-DL-treitol, DTT, %99,5</td> <td>Chem-Impex International</td><td>127</td><td>100 g</td></tr><tr><td>2-Hidroksietilmerkaptan ve beta;-Merkaptoetanol</td><td>Chem-Impex International</td><td>642</td><td>250 ml</td></tr><tr><td>Asetik asit, buzul</td><td>EMD</td><td>AX0073-9</td><td>2,5 L</td></tr><tr><td>Agar</td><td>Bioshop</td><td>AGR001.500</td><td>500 g</td></tr><tr><td>Ampisilin sodyum tuzu&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9518</td><td>25 g</td></tr><tr><td>Köpük Önleyici 204</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A6426</td><td>500 g</td></tr><tr><td>Barstar-NGF pET-21a(+)</td><td>GenScript USA Inc.</td><td></td><td>4 ve mikro; g</td></tr><tr><td>BL21(DE3) Yetkin Hücreler</td><td>Novagen</td><td>69450</td><td>1 ml; İfade Ana Bilgisayar</td></tr><tr><td>Bradford reaktifi</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B6916</td><td>500 ml</td></tr><tr><td>BugBuster</td><td>Novagen</td><td>70922-3</td><td>100 ml</td></tr><tr><td>Jel filtrasyon standardı</td><td>Bio-Rad</td><td>151-1901</td><td>6 şişe</td></tr><tr><td>Gliserol</td><td>Bioshop</td><td>GLY001.1</td><td>1 L</td></tr><tr><td>Guanidin hidrodiyorid amioformamidin hidroklorür</td><td>Chem-Impex International</td><td>152</td><td>1 kg</td></tr><tr><td>His-Pur Ni-NTA Reçine</td><td>Thermo Scientific</td><td>88222</td><td>100 ml</td></tr><tr><td>Hidroklorik asit</td><td>EMD</td><td>HX0603-3</td><td>2,5 L</td></tr><tr><td>İmidazol&nbsp;</td><td>Chem-Impex International</td><td>418</td><td>250 g</td></tr><tr><td>IPTG</td><td>Chem-Impex International</td><td>194</td><td>100 g</td></tr><tr><td>Laemmli numune tamponu</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0737</td><td>30 ml</td></tr><tr><td>Lauril sülfat sodyum tuzu, Sodyum dodesil yüzey</td><td>Chem-Impex International</td><td>270</td><td>500 g</td></tr><tr><td>LB Et suyu&nbsp; &nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L3022</td><td>1 kg</td></tr><tr><td>NovaBlue Yetkin Hücreler</td><td>Novagen</td><td>69825</td><td>1 ml; Klonlama Ana</td></tr><tr><td>Bilgisayar Fosfat tamponlu salin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5368-10PAK</td><td>10'lu paket</td></tr><tr><td>Potasyum Klorür</td><td>Chem-Impex International</td><td>01247</td><td>1 kg</td></tr><tr><td>Sema3A-pET-21a (+)</td> <td>GenScript USA Inc.</td><td></td><td>4 ve mikro; g</td></tr><tr><td>SimplyBlue SafeStain</td><td>Invitrogen</td><td>LC6060</td><td>1 L</td></tr><tr><td>Sodyum klorür</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5886-1KG</td><td>1 kg</td></tr><tr><td>Sodyum hidroksit</td><td>Fisher Scientific</td><td>S318-500</td><td>500 g</td></tr><tr><td>Sodyum fosfat diabazik</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5136-500G</td><td>500 g</td></tr><tr><td>Sodyum fosfat monobazik</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5011</td><td>500 g</td></tr><tr><td>Müthiş Et Suyu</td><td></td><td>Bioshop TER409.5</td><td>5 kg</td></tr><tr><td>Tetrasiklin hidroklorür</td><td>Chem-Impex International</td><td>667</td><td>25 g</td></tr><tr><td>Tris/Glisin/SDS Tamponu, 10x</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td>1610732 1 L</td></tr><tr><td>Trizma Base</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1503</td><td>1 kg</td></tr><tr><td>Tripton, pankreas</td><td>EMD</td><td>1.07213.1000</td><td>1 kg</td></tr><tr><td>Maya özü, granül</td><td>EMD</td><td>1.03753.0500</td><td>500 g</td></tr><tr><td>&nbsp; &Auml; KTApurifier10</td><td>GE Healthcare</td><td>28-4062-64</td><td>Kitler ve aksesuarlar içerir</td></tr><tr><td>Masaüstü Orbital Çalkalayıcı</td><td>Thermo Scientific</td><td>SHKE4000</td><td>MAXQ 4000</td></tr><tr><td>BirA500</td><td>Avidity</td><td>BirA500</td><td>Enzimi, reaksiyon tamponları ve biyotin çözeltisi ile birlikte gelir</td></tr><tr><td>Diyaliz</td><td>Kaseti Thermo Scientific</td><td>66380</td><td>Slide-A-Lyzer (Ekstra Güç)</td></tr><tr><td>Diyaliz Tüpü</td><td>Spektrum Laboratuvarları</td><td>132127, 132129</td><td>MWCO: 25.000 ve 50.000</td></tr><tr><td>Akış Saptırma Vanası FV-923</td><td>GE Sağlık</td><td>11-0011-70</td><td></td></tr><tr><td>FluoReporter Biyotin Miktar Tayin Test Kiti</td><td>Invitrogen</td><td>1094598</td><td></td></tr><tr><td>Frac-950 Tüp Rafları, Raf C</td><td>GE Sağlık</td><td>18-6083-13</td><td></td></tr><tr><td>Fraksiyon Toplayıcı Frac-950</td><td>GE Sağlık</td><td>18-6083-00</td><td>Kitler ve aksesuarlar dahildir</td></tr><tr><td>Isıtmalı/Soğutmalı Sirkülatör&nbsp;</td><td>VWR</td><td>13271-102</td><td>Model 1156D</td></tr><tr><td>Isıtma Fırını FD Serisi</td><td>Bağlayıcı</td><td></td><td>Model FD 115</td></tr><tr><td>HiLoad 16/60 Superdex 200 sayfa</td><td>GE Healthcare</td><td>17-1069-01</td><td>Durdurulan - Değiştirme Ürün: HiLoad 16/600 Superdex 200 sayfa</td></tr><tr><td>J-26 XPI Avanti Santrifüj</td><td>Beckman Coulter</td><td>393126</td><td></td></tr><tr><td>JA 25.50 Rotor</td><td>Beckman Coulter</td><td>363055</td><td></td></tr><tr><td>JLA 8.1 Rotor</td><td>Beckman Coulter</td><td>969329</td><td>1 L poliporpilen şişe içerir</td></tr><tr><td>JS 5.3 Rotor</td><td>Beckman Coulter</td><td>368690</td><td></td></tr><tr><td>Laminer Akış</td><td>Başlığı Themo Scientific</td><td>1849</td><td>Forma 1800 Serisi Temiz Tezgah</td></tr><tr><td>Mikroplaka Okuyucu</td><td>TECAN</td><td></td><td>sonsuz M200</td></tr><tr><td>Mini-PROTEAN Tetra Cell</td><td>Bio-Rad</td><td>165-8004</td><td>4 jelli dikey elektroforez sistemi</td></tr><tr><td>Mini-PROTEAN TGX Prekast Jeller</td><td>Bio-Rad</td><td>456-9036</td><td>Herhangi bir kDa, 15 oyuklu tarak</td></tr><tr><td>Ni-NTA Kolonu</td><td>Bio-Rad</td><td>737-2512</td><td>49 ml&nbsp; hacim ECONO-Kolon</td></tr><tr><td>Plazmid Miniprep Kiti</td><td>Omega Bio-Tek</td><td>D6943-01</td><td></td></tr><tr><td>PowerPac HC Güç Kaynağı</td><td>Bio-Rad</td><td>164-5052</td><td>250 V, 3 A, 300 W</td></tr><tr><td>Yuvarlak Tabanlı Polipropilen Kopolimer Tüpler</td><td>VWR</td><td>3119-0050</td><td>50 ml&nbsp; JA 25.50 rotor</td></tr><tr><td>Spin-X UF Konsantratörleri</td><td>için borular Corning</td><td>431488, 431483</td><td>&nbsp; 20 ve 6 ml; MWCO: 10.000 Da Alt Klonlama</td></tr><tr><td>Hizmeti</td><td>GenScript USA Inc.</td><td></td><td>Protein Hizmetleri</td></tr><tr><td>Ultrasonik İşlemci&nbsp;</td><td>Cole-Parmer</td><td>18910445A</td><td>Model CV18</td></tr><tr><td>Vortex-Genie 2</td><td>Bilimsel Endüstriler</td><td>SI-0236</td><td>Model G560</td></tr></tbody></table>

sinir doku rejenerasyonu için Çözünür ve Çözünmeyen biyotinile proteinlerin ifade, izolasyon ve saflaştırılması

Expression, Isolation, and Purification of Soluble and Insoluble Biotinylated Proteins for Nerve Tissue Regeneration

Yeniden birleştirici protein mühendisliği Escherichia coli (E. coli) sentezleme yaklaşık 4 yıldır sistemleri ve bugün kullanmıştır E. coli halen en yaygın olarak kullanılan konak organizmadır. Sistemin esneklik, (streptavidin etkileşimler için) bir biyotin etiketi olarak yarımlar ve yeşil fluoresan protein ya da kiraz, kırmızı proteini gibi daha büyük fonksiyonel proteinlerin eklenmesi için izin verir. Ayrıca, post-translasyonel modifikasyonlar kazandıran metal iyonu kenetleyiciler, eşsiz bir biçimde reaktif fonksiyonel grup, spektroskopik sondaları ve moleküller gibi doğal olmayan amino asitlerin protein entegrasyon özelliklerine sahiptir, daha iyi bir manipülasyon sağladı. Sonuç olarak, bu teknik, bir araştırma çeşitli alanları için anlamlı bir yarar sunan özelleştirilebilir füzyon proteinleri oluşturur. Daha özel olarak, biyotinile protein dizisi için avidin ve biotin streptavidin ile arasındaki yüksek afiniteli bir etkileşim çok hedef proteinler dahil edilmiştir. Bu ek etiketli proteinlerin tespiti ve arıtılmasını artırılması yanı sıra hücre sıralama gibi ikincil uygulamalar için önünü açarak destekli vardır. Bu nedenle, biyotin-etiketli moleküller bioindustrial ve biyomedikal alanlarda artan bir ve yaygın etkisini göstermektedir. Araştırmamız amaçla, sinir büyüme faktörünü (NGF) ve semaphorin3A (Sema3A) fonksiyonel bölgeler ihtiva eden yeniden birleştirici füzyon proteinleri biyotinile tasarladık. Bunların biyotinile füzyon proteinleri, diğer aktif protein dizileri ile birlikte, doku mühendisliği ve rejeneratif amacıyla Biyomalzemelere gergin nasıl daha önce bildirilmiştir. Bu protokol bir T7 lak uyarılabilir vektör ve E. kullanan miligram ölçeğinde mühendislik biyotinile proteinlerin temel özetliyor dönüşüm şekilde büyütülebilir-up ve arıtma için başlangıç ​​coli sentezleme ana.

<html> Klonlama ve ifade Testi Kaplama düzgün yapıldığında, tek bir izole koloniler klonal transforme bakteriler hücreleri (Şekil 2A) koparma şansını artırmak için oluşturmalıdır. Çok sayıda hücre plakalanır, ancak plakalar 37 ° C ya da dönüşüm çok uzun inkübe edilir koloniler agar plaka kapak veya hücre daha büyük agregalar (Şekil 2B ve 2C) oluşturabilmektedir, sorgulanabilir. Test ifade sırasında NGF ve Sema3A ilk 37 ° C&#3...

Biyotinile füzyon proteinleri geliştirerek araştırma çeşitli alanlarda birçok potansiyel uygulamalar vardır. Yeniden birleştirici protein mühendisliği özel olarak tasarlanmış proteinlerin yüksek verim sağlayan, düşük maliyetli olan bir düz ön işlemdir.

Sinir doku rejenerasyonu için Çözünür ve Çözünmeyen Biyotinile Proteinlerin ifade, izolasyon ve saflaştırılması

Recombinant protein engineering has utilized Escherichia coli (E. coli) expression systems for nearly 4 decades, and today E. coli is still the most ...

Bu prosedürün genel amacı; problar, sensörler, ilaç iletimi ve doku mühendisliği gibi çeşitli uygulamalara entegre edilebilen rekombinant biyotinlenmiş proteinleri başarıyla tasarlamak, eksprese etmek ve izole etmektir. Bu işlem, öncelikle özel olarak tasarlanmış plazmidin küçük ölçekli kültürler kullanılarak bir bakteriyel konak hücre hattına transforme edilmesi ve ardından hedef proteinin ekspresyonunun indüklenmesiyle gerçekleştirilir. Sonrasında, uygun saflaştırma prosedürlerini formüle etmek amacıyla hedef proteinin varlığı ve çözünürlüğü belirlenir.Ardından, hedef proteinin daha yüksek verimlerde üretilmesi için prosedür ölçeklendirilir ve ardından afinite kromatografisi teknikleri kullanılarak izole edilir. Son olarak proteinler saflaştırılır ve daha sonra alt uygulamalar ile analizler için konsantre edilir. Nihayetinde, SDS page ve FPLC sonuçları rekombinant proteinlerin başarıyla izole edildiğini ve saflaştırıldığını doğrular ve proteinlerin fonksiyonelliği için daha fazla test yapılır.Rekombinant protein mühendisliğinin temel avantajı, tam olarak bilimsel spesifikasyonlarımızı karşılayacak şekilde özel olarak tasarlanmış proteinleri büyük ölçekli veya miligram ölçeğindeki miktarlarda üretmemize olanak tanımasıdır. Örneğin, yeni özellikler kazandırmak amacıyla bu proteinlerin belirli kısımlarına yeni fonksiyonlar ekleyebiliriz. Bugün sizlere, belirli proteinlerin uçlarını nasıl biotinleyebileceğinizi göstereceğiz ve bunu, nöronal büyüme veya nöronal farklılaşma gibi hücresel işlevleri yönlendirmek amacıyla bu proteinleri yüzeylere spesifik olarak sabitlemek veya bağlamak için kullanacağız.Bu tekniği ilk kez uygulayan kişiler, gerek doğal gerekse doğal olmayan protein izolasyon prosedürlerini takip ederken büyük bir zorluk yaşamamalıdır. Birçok adım aynıdır, ancak doğal veya doğal olmayan koşullar için formüle edilmiş spesifik tamponlar gerektirir. Başlangıç aşamasındaki detaylara dikkatle odaklanılmalıdır.Transformasyon ve test ekspresyon aşamaları, daha sonraki nihai ölçek büyütme işlemi sırasında yüksek protein verimi sağlanmasını garanti edecektir. Bu yöntemin görsel olarak gösterilmesi önemlidir çünkü rekombinant proteinlerin basit laboratuvar ekipmanları ve malzemeleri kullanılarak nasıl üretilebileceğini göstermektedir. Basit kesikli reaksiyon kullanılarak, dengeleme ve büyüme medyaları küçük ölçekte büyütülür ve ana kültür başına 10 mg protein üretilir.Ek olarak, proteinlerin alt uygulamalar için nasıl daha fazla saflaştırıldığını göstermek amacıyla kromatografi teknikleri kullanılabilir ve uygulamalı olarak gösterilebilir. Bugün, lisansüstü öğrencisi Alicia, hedef proteinin klonlanması, ekspresyonunun test edilmesi ve 20 mililitrelik bir kültürün gece boyunca büyütülmesinin ardından izlenecek prosedürü uygulamalı olarak gösterecektir. Metin protokolüne göre, gece boyu büyütülen kültürü ampisilin içeren 1,8 litre steril büyüme ortamına aktarın ve steril köpük önleyici eklemek için bir pastör pipetiyle altı ila sekiz damla anti-foam 204 ekleyin. Kültürleri 37 °C'lik bir su banyosuna yerleştirin; 0,2 mikronluk bir filtre üzerinden, havalandırma taşları aracılığıyla kültürlere basınçlı hava verin. Kültür OD 600 değeri 0,7 ile 0,8 arasına ulaştığında, 1 millimolar IPTG ekleyin ve test ekspresyonunda proteinin çözünür veya çözünmez fraksiyonda bulunmasına bağlı olarak, 37 °C'de dört saat veya 18 °C'de gece boyunca indüksiyonu gerçekleştirin.Hücreleri toplamak için deneyleri gerçekleştirin, kültürü bir litrelik santrifüj şişelerine aktarın ve 4 °C'de 14,000 ×g hızında 15 dakika boyunca santrifüjleyin. Süpernatantı dökün ve ince bir spatula kullanarak bakteri peletini iki adet 50 mL'lik tüpe aktarın. Peletleri -80 °C'de saklamadan önce, hücreleri birkaç dakika daha santrifüjleyerek yeniden pelet haline getirin.Yerli olmayan protein izolasyonu gerçekleştirmek için, çözünmez bir protein için her bir dondurulmuş e coli peletine 20 mililitre lizis yıkama tamponu ekleyin; büyük parçaları gidermek ve yeniden süspande etmek için vorteksleyin ve çalkalayın.Bir mutatörde gece boyunca inkübe edildikten sonra, çözelti viskoz bir süspansiyon gibi görünecektir. Süspansiyonu 20.500 ×g'de ve oda sıcaklığında 30 dakika boyunca santrifüjleyin. Natif protein izolasyonu için süpernatanı taze bir tüpe aktarın ve peleti atın.Pelletleri, buz üzerinde resüspansiyon yaparak 30 mililitre nihai hacme sahip lizis tamponunda yeniden süspande edin. Sonikatörü %30 amplitüdde, 30 saniye açık ve 30 saniye kapalı olacak şekilde darbeli moda ayarlayın ve beş dakika boyunca sonikasyon uygulayın. Hücre pelletini tamamen parçalamak için sonikasyon sırasında tüpü yukarı aşağı hareket ettirin.Süspansiyonu 20.500 ×g kuvvetinde ve 4 °C'de 30 dakika boyunca santrifüjleyin. Ardından süpernatanı yeni bir tüpe aktarın ve peleti atın. Doğal olmayan izole bir protein üzerinde afinite kromatografisi gerçekleştirmek için, her bir santrifüj tüpüne bir mililitre nikel NTA reçine çözeltisi ekleyin ve oda sıcaklığında bir rotatör veya çalkalayıcıda en az bir saat inkübe edin.Süspansiyonu bir afinite kolonuna boşaltın ve çözeltinin musluk vanasından tamamen bir atık beherin içine damlamasını bekleyin. Kalan reçineyi uzaklaştırmak için santrifüj tüpüne 10 mililitre yıkama tamponu ekleyin ve çözelti damladıktan sonra bu çözeltiyi kolona ekleyin. Reçineyi karıştırmak için cam bir baget kullanın ve başka bir yıkama eklemeden önce damlamanın tamamlanmasını bekleyin.Ardından, santrifüj tüpünü durulamak için 10 mililitre yıkama tamponu kullanın ve bunu kolona aktarın. Daha sonra, her bir yıkama için 10 mililitre lizis yıkama tamponu kullanarak kolonu sekiz kez daha yıkayın. Yıkama işlemleri tamamlandıktan sonra, musluğu kapatın ve atık beherin yerine 50 mililitrelik santrifüj tüpünü yerleştirin.Kolona 15 mililitre elüsyon tamponu ekleyin, reçineyi karıştırın ve çözeltinin beş dakika boyunca beklemesine izin verin. Ardından stop musluğunu açın ve natif bir proteini saflaştırmak için işlemi ek bir 15 mililitre elüsyon tamponu ile tekrarlamadan önce EIT'yi toplayın. Nikel NTA reçinesi protein çözeltisine eklendikten sonra, bir çalkalayıcıda dört derece Celsius'ta en az bir saat boyunca inkübe edildi.Kolonu yıkama tamponu ile 10 kez yıkadıktan sonra, beş mililitre elüsyon tamponu ekleyin ve reçineyi beş dakika inkübe edin; ardından, EIT kolondan damlarken EIT'nin çoğunu toplamak için yeni bir tüp kullanın ve şeffaf bir 96 kuyucuklu plakadaki her kuyucuğa 90 µL Bradford reaktifi ekleyin. Tamponla yapılan her beş mililitrelik elüsyondan sonra, kolondan 10 µL çözeltinin 90 µL Bradford reaktifi içeren bir kuyucuğa damlamasına izin verin. Protein artık saptanamayana kadar EEU işlemine devam edin; ardından diyaliz ve/veya Rena yapın.Proteinlerin her bir EIT'si diyaliz tüplerine aktarılır ve uygun tampon çözeltiye karşı diyaliz edilir; ilki, ilgili tamponla değiştirilmeden önce dört santigrat derecede dört saat boyunca, ikincisi ise dört santigrat derecede gece boyunca gerçekleştirilir. Diyalize edilen proteinleri beş mililitrenin altına düşürmek için santrifüj konsantratörleri kullanılır ve istenirse atin sekiz kullanılarak boyut dışlama kromatografisi ile daha ileri düzeyde saflaştırma yapılır.Metin protokolüne göre test ekspresyonu sırasında, NGF ve SEthreeA önce 37 °C'de dört saat boyunca indüklenmiş ve SDS-PAGE analizi her iki proteinin de bu çözünür fraksiyonda yer aldığını belirlemiştir. Protein ekspresyonu orta düzeyde göründüğünden, 18 °C'de gece boyu indüksiyon ile başka bir test ekspresyonu incelenmiştir. Çözünür fraksiyonda NGF ekspresyonu artarken, SEMAthree için belirgin bir fark gözlenmemiştir.NGF, doğal ve doğal olmayan koşullar altında izole edilmiş ve saflaştırma için FPLC kolonundan geçirilmiştir. Test ekspresyonu sırasında NGF çözünür fraksiyonda yer almasına rağmen, doğal izolasyon hem 37 degrees Celsius hem de 18 degrees Celsius indüksiyonlarında düşük verim sağlamıştır. Bununla birlikte, yeniden natürasyonla birlikte doğal olmayan izolasyon yoluyla daha yüksek bir NGF verimi elde edilmiştir.Sonuç olarak, NGF doğal olmayan koşullar altında izole edilmiştir. 18 °C'de gece boyunca yapılan indüksiyonun ardından, doğal olmayan izolasyon sonucunda SEMA 3A üretimi gerçekleşmezken; iki litrelik ana kültür için doğal izolasyonda 8,61 ± 3,1 mg elde edilmiştir. Bu nedenle, SEMA 3A 37 °C'de dört saat boyunca indüklenmiş ve doğal izolasyon parametreleri kullanılarak izole edilmiştir.FPLC pikleri toplandı ve NGF ile SEMA three A örnekleri SDS-PAGE ile analiz edildi. SEMA three A için FPLC çıktısında bulunan ek protein pikleri toplandı, SDS-PAGE ile analiz edildi ve SEMA three A moleküler ağırlık bölgesinde yer almadıkları görüldü. Bu fraksiyonlar, SEMA three'ün aksine hücre tabanlı analizlerde fonksiyonel davranış sergilemedikleri için büyük olasılıkla degradasyon ürünleridir.Burada bir pik gösterilmiştir. Rekombinant protein sistemi kurulup optimize edildikten sonra, izolasyon ve saflaştırma işlemleri uygun şekilde gerçekleştirildiğinde sadece birkaç gün sürmelidir. Ancak, protein çözünürlüğünü doğru şekilde belirleyebilmek için başlangıçtaki bakteri transformasyonu ve test ekspresyon aşamaları daha uzun sürer.Çözünürlük belirlendikten sonra, transforme edilmiş bakterilerin bir kütüphanesi -80 °C'de saklanabilir. Ayrıca, protein ekspresyonunun ardından, E. coli peletleri de daha sonraki izolasyon ve deneylere kadar -80 °C'de saklanabilir. Bu prosedür uygulanırken, proteazların proteinlerinizi denatüre etmesini ve parçalamasını önlemek için tamponların sterilize edildiğinden ve taze hazırlandığından emin olmak önemlidir.İzolasyon tamponları her dört ila altı haftada bir hazırlanmalı ve steril edilmeli, diyaliz tamponları ise izolasyondan bir gün önce hazırlanmalıdır. Birden fazla biyotinize proteinden kaynaklanabilecek çapraz kontaminasyonu önlemek için N-I-N-T-A ve FPLC kolonları üretici protokollerine uygun olarak temizlenmiş olmalıdır. Bu videoyu izledikten sonra, bakteriyel konakçı ekspresyon sistemi kullanarak özel tasarlanmış biyotinize proteinlerin nasıl eksprese edileceği, izole edileceği ve saflaştırılacağı konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.Bu, hem bilimsel hem de ticari olarak küçük ve büyük ölçekte yapılan işlemlere benzerdir. Bu nedenle, geniş bir uygulama alanına sahiptir.

expression-isolation-purification-soluble-insoluble-biotinylated

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Biyomühendislik

Düzenlenmiş endositoz, hücre zarı proteinleri çoğunluğu yüzey ekspresyon düzeyleri yönetir. Burada, dopamin taşıyıcısı (DAT), polytopic membran proteini endositik hızını ölçmek için indirgenebilir, Membran geçirgenliği olmayan biyotinilasyon reaktifleri kullanmaktadır. Bu yöntem çoğu plazma membran proteinlerinin endositik oranını ölçmek için basit bir yaklaşımdır kolaylaştırır.

Tersinir biyotinilasyon Plazma Membran Protein endositik Oranları Ölçüm

Bu video, bir astrosit kültüründen hücre yüzeyi ve hücre içi proteinlerin izolasyonunu göstermektedir. Astrosit kültürü, endositozu inhibe etmek için buz üzerine yerleştirilir ve daha sonra hücre yüzeyi proteinleri bir biyotinilasyon reaktifi ile etiketlenir. Hücreler, biyotinile hücre yüzeyi proteinlerini ve biyotinile edilmemiş hücre içi proteinleri serbest bırakmak için parçalanır. Son olarak, streptavidin kaplı boncuklar, biyotinile hücre yüzeyi proteinlerini hücre içi proteinlerden ayırmak...

Bir Astrosit Kültüründen Hücre Yüzeyi ve Hücre İçi Proteinlerin İzolasyonu

Nöronal membran kaçakçılığı dinamik plazma membran proteini kullanılabilirliği ve önemli ölçüde etkiler sinir iletimini kontrol eder. Bugüne kadar, yetişkin nöronlar nöronal endositik ticaretini ölçmek için zor olmuştur. Burada, akut beyin dilimleri yüzey protein ifade ex vivo hızlı değişiklikleri ölçmek için son derece etkili, nicel bir yöntem açıklanmaktadır.

Beyin Dilim Biyotinilasyonu: An<em&gt; Ex Vivo</emYetişkin Nöronlar Bölge özgü Plazma Membran Protein Ticaretiyle Tedbir&gt; Yaklaşım

BDNF, bir nörotrofik faktör, bir aksonal taşınması birçok nöron popülasyonlarının hayatta kalma ve fonksiyonu için kritik öneme sahiptir. Bazı dejeneratif bozukluklar aksonal yapı ve fonksiyon bozulması ile işaretlenmiştir. Biz birincil nöronları kullanarak mikroakışkan odaları QD-BDNF canlı ticaretini incelemek için kullanılan teknikler gösterdi.

Quantum Akson Ulaştırma Gerçek zamanlı Görüntüleme İlköğretim Nöronlar BDNF Dot-etiketli

Rhipicephalus microplus bağırsak dokusundan epitel hücrelerini izole etmek için modifiye bir yoğunluk santrifüj gradyan tabanlı metodoloji kullanıldı. Yüzeye bağlı proteinler, biyotinlenmiş ve streptavidin manyetik boncuklarla arıtılmış uygulamalarda kullanılmak üzere saflaştırılmıştır.

Biyotinile Hücre Yüzey Proteinlerinin Arındırılması<emRhipicephalus microplus</em&gt; Epitelyal Gut Hücreleri

Bu raporda, plazma membranında eksprese edilen proteinlerin hücre yüzeyi ekspresyonunu ve endositik hızını belirlemek için tasarlanan iki biyotinilasyona dayalı yöntemler sunulmuştur.

Primer Astrosit Kültürlerinde Proteinlerin Hücre-Yüzey İfadesi ve Endosit Oranının Biyotinleme Yöntemiyle Belirlenmesi

Burada sunulan bir in vitro nöral-endotel co-kültür sistemi ve biyoortogonal fonksiyonel gruplar ile sialoglycan metabolik birleşme birleştiren bir protokoldür primer nöral kök ve döl hücreleri genişletmek ve yüzey etiket hücre yüzey belirteçlerinin görüntüleme veya kütle spektrometresi analizi için siyaloglycoproteinler.

Primer Nöral Kök ve Progenitor Hücrelerinin Hücre Yüzey Belirteçlerinin Sialoglycan'ın Metabolik Etiketlemesi ile Belirlenmesi

Burada sunulan, protein-nüklik asit etkileşimlerini incelemek için yaygın olarak uygulanabilir olan biotin etiketlerini kullanarak in vitro biyokimyasal kurallara yönelik protokollerdir.

Protein-Nüklik asit etkileşimlerini Incelemek için biotin etiketlerini kullanarak In vitro biyokimyasal asder

Avi dizisi (BDNFAvi) içeren rekombinant BDNF, HEK293 hücrelerinde uygun maliyetli bir şekilde üretilir ve afinite kromatografisi ile saflaştırılır. BDNFavi daha sonra doğrudan mono-biyotinylated enzim BirA ile bir tüp içinde. BDNFavi ve mono-biyotinylated BDNFavi ticari olarak kullanılabilir BDNF ile karşılaştırıldığında kendi biyolojik aktivitelerini korumak.

Nöronlarda Hücresel İnsan Ticareti Çalışmaları Için Bir Tüpte Doğrudan Mono-Biyotinylate Rekombinant BDNF'yi Arındırmak ve Doğrudan Bir Protokol

Protokol, ilgilenilen bir proteine kaynaşmış bir biyotin ligaza yakınlıklarına dayalı olarak biyotinin proteinlere in vivo kovalent bağlanması için bir yöntem sunar. Bu modifikasyon, protein etkileşim çalışmalarında gerektiği gibi streptavidin boncukları kullanılarak proteinlerin seçici olarak zenginleştirilmesine izin verir.

İn vivo Paramecium tetraurelia'da Protein Etkileşim Çalışmaları için Yakınlık Biyotinilasyonu

Öğrenin, rekombinant biyotinile proteinleri bakteri hücrelerinde ifade edip afinite kromatografi ile saflaştırma yöntemini. Bu teknik, sinir doku rejenerasyonu ve biyomedikal uygulamalar için yüksek verimli protein üretimi sağlar.

Sinir doku rejenerasyonu için Çözünür ve Çözünmeyen Biyotinile Proteinlerin ifade, izolasyon ve saflaştırılması

Daha fazla video keşfet