Konsensus Beyin kaynaklı protein, 2D-DIGE ve Mini 2DE İmmünoblotting Hem kullanma İnsan ve Kemirgen Beyin proteomun Çalışmaları Ekstraksiyon Protokolü

Aşağıdaki deneyin genel amacı, proteomik analiz için insan ve fare beyin dokusundan protein ekstrakte etmektir. Bu, iki boyutlu elektroforez yaklaşımlarına uygun aynı protein ekstraksiyonunu elde etmek için yaygın bir lizis tamponu kullanılarak gerçekleştirilir. Ardından, kütle spektrometrisi ile tanımlama yapmak amacıyla proteinleri ayırmak için iki boyutlu floresan fark jel elektroforezi kullanılır.

Bunu, translasyon sonrası modifikasyonları belirlemek için immün blotlama ile birlikte gerçekleştirilen minyatür 2D jel elektroforezi takip eder. Sonuçlar, genel protein ekspresyonunu gösterebilir. Konakçı translasyonel değişiklikleri, izoelektrik nokta ve moleküler ağırlık farklarına dayanarak tüm ligamanlaşma ve katalitik ürünleri gösterir.

2D dash ve 2D monolo kombinasyonu, ekspresyon değişiklikleri hakkında eş zamanlı bilgi sağlayarak nöroproteomik alanındaki temel soruları yanıtlamamıza yardımcı olabilir. Ürünlerdeki post-translasyonel modifikasyonlar ve katabolizma ile başlayın; beyin dokusunu hasat edin ve homojenize edin. İnsan beyin dokusu için dokuyu, ekstraksiyon tamponu içerisinde ağırlık/hacim oranının %10'u olacak şekilde hazırlayın.

Dokuyu cam bir pipetör kullanarak homojenize edin; ancak kemirgen dokusunu parçalamak için Teflon bir homojenizatör kullanın. 60 hertz'de 30 adet yarım saniyelik pulslarla sonikasyon uygulayın. Ardından, standart olarak BSA kullanarak Bradford testi ile protein konsantrasyonunu belirleyin.

Şimdi kloroform metanol çöktürme çözeltilerini bir buz kovasında toplayın. 11 santimetrelik IPG şeritleri için yaklaşık 125 mikrogram veya 18 santimetrelik IPG şeritleri için yaklaşık 1,25 miligram toplamayı planlayın. Çözeltiler dört derece Celsius'a ulaştığında, çöktürme işlemini tamamen buz üzerinde gerçekleştirin.

Öncelikle üç hacim metanol, ardından bir hacim kloroform ekleyin. Bu karışımı çalkalayın. Sonrasında, üç hacim soğuk su ekleyin.

Bu karışımı bir dakika boyunca vorteksleyin, ardından örnek tüpünü 4 °C'de 30 dakika boyunca 12,000 G'de santrifüjleyin. Süpernatantı aspire ederek uzaklaştırın. Daha sonra üç hacim metanol ekleyip vorteksleyin ve proteinleri aynı yöntemle çöktürün.

Toplanan protein peleti, 2D DIGE öncesinde nitrojen gazı altında kurutun. Proteini 2,5 mg/mL konsantrasyonda 2D tamponunda yeniden süspanse edin. Ardından, örnekleri kullanana kadar daha önce yapıldığı gibi sonikasyona tabi tutun.

Bu adıma başlamadan önce ve protein çöktürme işleminden sonra bunları -80 °C'de saklayın. Bradford Analizi ile protein konsantrasyonunun bir kez daha belirlenmesi gereklidir. Psy boya etiketlemesinden önce daha önce gösterilen prosedürün aynısı izlenmelidir.

Protein örneğinin kalitesi, bu amaçla SDS-PAGE ile doğrulanır. 15 µg proteini LDS içinde seyreltin ve bir ısı banyosunda veya blokta 37 °C'ye ısıtın. Ardından bunları bir poliakrilamid jelde yürütün ve jeli en az bir saat boyunca Coomassie Blue çözeltisi ile boyayın.

Ardından jeli gece boyunca %7 asetik asit ve %10 etanol çözeltisinde bekletin. Protein örnek kalitesi belirlendikten sonra, ertesi gün SD etiketleme prosedürüne başlanır. İlk olarak, bazik veya nötr olması gereken lizatın pH değerini ölçün.

Sonraki reaksiyonlar için optimal pH 8.6'dır. Ardından, her bir protein örneği için boya konjugasyon reaksiyonlarını hazırlayın. 50 mikrogram protein ile 400 pikomol S3 boyasını ve 50 mikrogram protein ile 400 pikomol S five boyasını karıştırın.

Örnek başına toplam sekiz D eşleşme reaksiyonu için bu işlemi dörtlü setler halinde gerçekleştirin. Test edilen her örnek için, hastalıklı beyin gibi kontrol kaynaklı proteinler kullanarak tamamlayıcı bir DI eşleşme reaksiyonları seti hazırlayın. Ardından, her reaksiyon çifti için 400 picomole CY iki ve toplam 250 mikrograma ulaşan tüm proteinlerin eşit temsiliyle bir iç kontrol reaksiyonu kurun.

SAI etiketlemesi, tüm reaksiyon karışımlarının dört derece Celsius'ta karanlıkta bir saat boyunca inkübe edilmesiyle gerçekleştirilir. İnkübasyonun ardından, üç farklı siyan reaksiyonundan oluşan tüm setleri, her bir reaksiyon setine 200 mikrolitre 2D tamponu ekleyerek 150 mikrolitrelik hacimlerde birleştirin. Ardından 2D elektroforez adımlarına geçin.

Her örnek ve pozitif kontrol için protein lekelerinin kesileceği preparatif jel için etiketlenmemiş protein çözeltilerinin hazırlanmasıyla başlayın. 300 ila 350 mikrogram etiketlenmemiş proteini 2D tamponu içine paylaştırın ve IPG şeridi ile temas halinde rehidre olmalarını sağlayın. Ardından, etiketlenmiş ve etiketlenmemiş proteinleri rehidrasyona aktarmak için IPG şeritlerini yükleyin.

Ardından her bir kuyucuğu bir IPG reaksiyon şeridi ile kapatın. Bunu mineral yağı ile kaplayarak takip edin ve şeridlerin protein çözeltisi ile gece boyunca, 25 °C'yi geçmeyecek sıcaklıkta pasif olarak rehidrate olmasına izin verin. Ertesi gün, IPG şeritlerinin izoelektrik odaklamasını gerçekleştirin.

Ardından yağı uzaklaştırın ve IPG şeritlerini dengeleme işlemi için -20 °C'de saklayın. Şeritleri 15 dakika boyunca dengeleme tamponu içinde bekletin. Daha sonra, şeritleri yıkayarak DTT içermeyen, dengeleme tamponu içindeki %4,7 IDO asetamidin içine aktarın.

Etiketli proteinler için düşük floresan özellikli cam plakalar kullanarak her örnek başına dört adet %12 SDS-PAGE jeli dökmek üzere büyük bir 2D jel sistemi kullanın. Ayrıca, etiketlenmemiş proteinlerin her biri için 1,5 milimetre kalınlığında standart cam plakalara bir adet %12 SDS-PAGE jeli dökün. Bunlar preparatif jellerdir.

Jeller soğuduğunda, şeritleri jellerin üstüne aktarın ve soğuma tamamlandıktan sonra şeritlerin üzerini %0.5 Aros ile kaplayın; jelleri dört derece Celsius'ta 2.5 watt gücünde gece boyunca çalıştırın ve ertesi gün analiz edin. Birçok 2D reaksiyonu, preparatif jeller için kullanılan protein numuneleri ile gerçekleştirilebilir. 200 microliters 2D tamponuna 100 micrograms'dan az numune ölçerek ekleyin.

Ardından örnek karışımlarını kuvvetlice vorteksleyin ve kısa süreli santrifüjleyin. Örnekleri 11 santimetrelik IPG şeritlerine yükleyin ve mineral yağı ile kaplı halde gece boyunca pasif olarak rehidrate olmalarına izin verin. İzoelektrik odaklama işlemini gerçekleştirin.

Ardından şeritleri, her birinde 15 dakika kalacak şekilde üç adet dengeleme tamponu banyosundan geçirin. Şeritler daha sonra 2D SDS-PAGE jellerinde yürütülür. Her bir şeridi, uygun moleküler ağırlıktaki hazır bir jelin üzerine yerleştirin.

İlgilenilen protein için poliakrilamid. Daha sonra, jelleri NITROCELLULOSE PVDF membrana aktarın ve bu protokolün geliştirilmesi aşamasında antikorlar ile analiz edin. Üç farklı lizis.

Tamponlar test edildi. İlk olarak, yaygın bir biyokimya ve moleküler biyoloji tamponu olan Tris SDS test edildi.

Tris SDS, test edilen diğer bir tampon olan UTS ile karşılaştırıldığında düşük çözünürlük göstermiştir. Üçüncü tampon, test edilebilir örneklerin hazırlanmasına imkan vermediği için elenmiştir. Ardından, insan ve fare beyin proteomları incelenmiştir.

İnsan kontrol korteks örnekleri ve ad korteks örnekleri karşılaştırıldı. AD benzeri tau patolojisine sahip farelerden alınan fare beyin proteinleri de insan örneğiyle birlikte incelendi. Her D için SCI iki, S SI üç ve sci beş bağımsız olarak değerlendirildi. Yüksek leke çözünürlüğü, hizalamayı kolaylaştırdı.

Post-translasyonel modifikasyonları incelemek için kalitatif mini 2D analizi kullanılmıştır ve ad dokusundaki ligamanlaşmış alfa sinükleinin normal bir profile sahip olduğu, ancak ayrıca asteriksle işaretlenmiş bir dimer olarak da bulunduğu saptanmıştır. Oklar, alfa sinükleinin bulunduğu bölgeleri işaretlemektedir. Ubikitinlenmiş amiloid öncül proteini de mini 2D ile görüntülenmiştir.

Sporadik AD, ailesel AD ile karşılaştırılmıştır. Ailesel AD'de beta amiloid 1-42 ve ISO varyans konsantrasyonları daha düşüktür çünkü liga formları 8 kilodaltonda bulunmuştur. Bu videoyu izledikten sonra, protein ekspresyon modifikasyonlarını ölçerek karmaşık örnekleri karşılaştırmak amacıyla proteomun nasıl inceleneceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.