Konsensus Beyin kaynaklı protein, 2D-DIGE ve Mini 2DE İmmünoblotting Hem kullanma İnsan ve Kemirgen Beyin proteomun Çalışmaları Ekstraksiyon Protokolü
April 10th, 2014
İnsan ve fare beyin dokusu için üre / tiyoüre / SDS tamponu kullanılarak ortak bir protein ekstraksiyon protokolü sağlar: 2D-dige ve mini 2DE immunoblotting kendi müteakip özellik tayini ile protein indentification. Bu yöntem, insan biyopsi ve deneysel modellerden gerçekleştirilen daha güvenilir ve tekrarlanabilir sonuçlar elde etmek için bir olanak sağlar.
Aşağıdaki deneyin genel amacı, proteomik analiz için insan ve fare beyin dokusundan protein çıkarmaktır. Bu, iki boyutlu elektroforez yaklaşımları için uyarlanmış aynı protein ekstraksiyonunu elde etmek için ortak bir lizis tamponu kullanılarak elde edilir. Sonraki iki boyutlu floresan farkı jel elektroforezi, kütle spektrometresi tanımlaması için proteinleri ayırmak için kullanılır.
Bunu, translasyon sonrası modifikasyonları tanımlamak için immünoblotlama ile minyatür bir 2D jel elektroforezi takip eder. Sonuçlar küresel protein ekspresyonunu gösterebilir. Konak translasyonu, izoelektrik nokta ve moleküler ağırlıktaki farklılıklara bağlı olarak tüm ligamentizasyonu ve katalitik ürünleri değiştirir.
2D çizgi ve 2D monolo kombinasyonu, aynı anda ifade değişiklikleri hakkında bilgi sağlayarak nöro proteomik alanındaki temel soruyu yanıtlamamıza yardımcı olabilir. Ürünlerde posta modifikasyonu ve katabolizma: Beyin dokusunun toplanması ve homojenleştirilmesi ile başlayın. Dokuyu insan beyin dokusu için ekstraksiyon tamponunda hacimce% 10 ağırlıkta hazırlayın.
Dokuyu bir cam pipetleyici kullanarak homojenize edin, ancak kemirgen dokusunun her iki homojenatı da parçalaması için bir Teflon homojenizatör kullanın. 30 yarım saniye darbe kullanarak 60 hertz'de sonikasyon. Daha sonra, standart olarak BSA'yı kullanarak bir Bradford testi ile protein konsantrasyonunu belirleyin.
Şimdi kloroform metanol çökeltme çözeltilerini bir buz kovasında toplayın. 11 santimetre IPG şeritleri için yaklaşık 125 mikrogram veya 18 santimetre IPG şeritleri için yaklaşık 1.25 miligram toplamayı planlayın. Çözeltiler dört santigrat dereceye ulaştığında, çökeltmeyi tamamen buz üzerinde gerçekleştirin.
Önce üç hacim metanol, ardından bir kloroform ekleyin. Bu karışımı çalkalayın. Ardından, üç hacim soğuk su ekleyin.
Vorteks, bu karışım bir dakika boyunca numune tüpünü dört santigrat derecede 30 dakika boyunca 12.000 G'de santrifüjleyin. Süpernatanı aspire edin ve atın. Daha sonra üç hacim metanol girdabı ekleyin ve proteinleri aynı şekilde döndürün.
Toplanan protein peletini 2D DIGE'den önce nitrojen gazı altında kurutun. Proteini mililitre başına 2.5 miligramda 2D tamponda yeniden süspanse edin. Ardından, numuneleri kullanılana kadar daha önce yapıldığı gibi sonikleştirin.
Bu adıma başlamadan önce ve protein çökeltmesinden sonra eksi 80 santigrat derecede saklayın. Protein konsantrasyonunun Bradford Assease ile bir kez daha belirlenmesi gerekmektedir. Psy boya etiketlemesinden önce daha önce gösterildiği gibi aynı prosedürü izleyerek.
Protein örneğinin kalitesi, bu amaçla SDS sayfası tarafından doğrulanır. LDS'de 15 mikrogram proteini seyreltin ve bir ısı banyosunda veya blokta 37 santigrat dereceye kadar seyreltin. Daha sonra bunları bir poli akrilamid jel üzerinde çalıştırın, jeli en az bir saat kumasi mavisi solüsyonla boyayın.
Daha sonra jeli gece boyunca %7 asetik asit, %10 etanol çözeltisi içinde alıkoyun. Protein numunesi kalitesi belirlendikten sonra, ertesi gün SD etiketleme prosedürü başlatılır. İlk olarak, bazik ila nötr olması gereken lizatın pH'ını ölçün.
Sonraki reaksiyonlar için optimal pH 8.6'dır. Ardından, her protein numunesi için boya konjugasyon reaksiyonlarını ayarlayın. 50 mikrogramı 400 pikomol S3 boyası ile ve 50 mikrogramı 400 pikomol S beş boya ile karıştırın.
Numune başına toplam sekiz D birleştirme reaksiyonu için bunu dörtlü olarak yapın. Test edilen her numune için, hastalıklı bir beyin gibi kontrolden alınan proteini kullanarak ücretsiz bir DI birleştirme reaksiyonu seti yapın. Daha sonra, her reaksiyon çifti için, 400 pikomol CY iki ile bir iç kontrol reaksiyonu ve toplam 250 mikrogramlık tüm proteinlerin eşit bir temsili ayarlayın.
SAI etiketlemesi, tüm reaksiyon karışımlarının karanlıkta dört santigrat derecede bir saat boyunca inkübe edilmesiyle elde edilir. İnkübasyondan sonra, üç farklı camgöbeği reaksiyonunun tüm setlerini, 200 mikrolitre 2D tamponda her bir reaksiyon setine 150 mikrolitrelik hacimlerde birleştirin. Ardından 2D elektroforez adımlarıyla devam edin.
Her numune için protein lekelerinin eksize edileceği hazırlayıcı jel ve pozitif kontrol için etiketlenmemiş protein çözeltileri hazırlamakla başlayın. 300 ila 350 mikrogram etiketlenmemiş proteini 2D tampona alın ve IPG şeridi ile temas halinde yeniden sulanmalarına izin verin. Daha sonra IPG şeritlerini yükleyin, etiketli ve etiketsiz proteini bir rehidrasyona aktarın.
Daha sonra her bir kuyuyu bir IPG reaksiyon şeridi ile örtün. Bunu bir mineral yağ tabakası ile takip edin ve şeritlerin gece boyunca 25 santigrat dereceden fazla olmayan bir sıcaklıkta protein çözeltisi ile pasif olarak rehidre olmasına izin verin. Ertesi gün, IPG şeritlerinin izoelektrik odaklamasını gerçekleştirin.
Ardından yağı çıkarın ve IPG şeritlerini dengelemek için IPG şeritlerini eksi 20 santigrat derecede saklayın. Onları 15 dakika boyunca dengeleme tamponuna batırın. Daha sonra şeritleri, şeritleri yıkarken DTT'den yoksun olan dengeleme tamponunda %4.7 IDO asetamide aktarın.
Etiketli proteinler için düşük floresan cam plakalara numune başına dört adet %12 SDS sayfa jeli dökmek için büyük bir 2D jel sistemi kullanın. Ayrıca, etiketlenmemiş proteinlerin her biri için 1,5 milimetre kalınlığında standart cam plakalara bir adet %12 SDS sayfa jeli dökün. Bunlar hazırlayıcı jellerdir.
Jeller soğuduğunda, şeritleri jellerin üstüne aktarın ve soğuduktan sonra şeritleri %0,5 Aros ile kaplayın, jelleri gece boyunca dört santigrat derecede 2,5 watt'ta çalıştırın ve ertesi gün analiz edin. Hazırlayıcı jeller için kullanılan protein numuneleri ile birçok 2D reaksiyon gerçekleştirilebilir. 100 mikrogramdan daha az numuneyi 200 mikrolitre 2D tampona ölçün.
Daha sonra numune karışımlarını kuvvetlice girdaplayın ve hızlı bir dönüş yapın. Numuneleri 11 santimetrelik IPG şeritlerine yükleyin ve ertesi gün mineral yağla kaplanmış olarak gece boyunca pasif olarak yeniden sulanmalarına izin verin. İzoelektrik odaklamayı gerçekleştirin.
Daha sonra şeritleri banyo başına 15 dakika boyunca üç banyo dengeleme tamponundan geçirin. Şeritler daha sonra 2D SDS sayfa jelleri üzerinde çalıştırılır. Her şeridi uygun moleküler ağırlığa sahip bir prekast jel üzerine katmanlayın.
İlgilenilen protein için poli akrilamid. Daha sonra jelleri NITROSELÜLOZ PVDF membranına aktarın ve bu protokolün geliştirilmesinde antikorlarla analiz edin. Üç farklı lizis.
Tamponlar test edildi. İlk olarak, ortak bir biyokimyasal ve moleküler biyoloji tamponu. Tris SDS test edildi.
Tris SDS, test edilen başka bir tampon UTS'ye kıyasla düşük çözünürlüğe sahipti. De'ye giden üçüncü tampon, test edilebilir numuneler onunla hazırlanamadığı için göz ardı edildi. Daha sonra, insan ve fare beyin proteomları araştırıldı.
İnsan kontrol korteks örnekleri ile ad korteks örnekleri karşılaştırıldı. AD benzeri tau patolojisine sahip farelerden elde edilen fare beyin proteinleri de insan örneğinden görüntülendi. SCI iki, her D için S SI üç ve sci beş gibi bağımsız olarak incelendi. Yüksek nokta çözünürlüğü hizalamayı kolaylaştırdı.
Translasyon sonrası modifikasyonları araştırmak için kalitatif mini 2D analiz kullanıldı ve ad dokusundaki bir ligamentizasyon alfa sinükleinin normal bir profile sahip olduğu, ancak aynı zamanda bir yıldız işareti ile işaretlenmiş bir dimer olarak bulunduğu bulundu. Alfa sinükleinin bulunduğu yeri işaretleyen oklar. Ubikitinated amiloid öncü proteini de mini 2D ile görüntülendi.
Sporadik reklam ile ailesel ad karşılaştırıldı. Ailesel adda beta amiloid bir ila 42 ve ISO varyansı konsantrasyonda daha düşüktür çünkü liga formları sekiz kilodaltonda bulunmuştur. Bu videoyu izledikten sonra, protein ekspresyon modifikasyonlarını ölçerek karmaşık örnekleri karşılaştırmak için proteomu nasıl inceleyeceğinizi iyi anlamış olmalısınız.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Genel Bakış
Bu çalışma, proteomik analiz için proteinleri insan ve fare beyin dokusundan ortak bir lizis tamponu kullanarak çıkarmaya odaklanmaktadır. Yöntem, ileri elektroforez teknikleri aracılığıyla proteinlerin tanımlanmasını ve karakterize edilmesini sağlar.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Bilim Alanı
- Proteomik
- Sinirbilim
- Biyokimya
Arka Plan
- Protein ekstraksiyonu, beyin fonksiyonunu anlamak için kritik öneme sahiptir.
- İki boyutlu elektroforez teknikleri, protein ayrımını artırır.
- Translasyon sonrası modifikasyonlar, protein fonksiyonunu önemli ölçüde etkileyebilir.
- Biyopsilerde ve modellerde tekrarlanabilir sonuçlar için güvenilir yöntemlere ihtiyaç vardır.
Çalışmanın Amacı
- Beyin dokularında proteinlerin analiz için çıkarılması.
- İki boyutlu floresan fark jeli elektroforezi kullanmak.
- İmmunoblotting yoluyla translasyon sonrası modifikasyonların tanımlanması.
Kullanılan Yöntemler
- Ürea/tiyoüre/SDS tamponu kullanarak protein ekstraksiyonu.
- İki boyutlu floresan fark jeli elektroforezi (2D-DIGE).
- İmmunoblotting için mini 2D jeli elektroforezi.
- Protein tanımlama için kitle spektrometrisi.
Ana Sonuçlar
- İnsan ve fare beyin dokularında proteinlerin başarılı şekilde çıkarılması.
- Kitle spektrometrisi kullanarak proteinlerin tanımlanması.
- Translasyon sonrası modifikasyonların karakterize edilmesi.
- Biyopsilerden ve modellerden elde edilen sonuçların tekrarlanabilirliğinin artırılması.
Sonuçlar
- Yöntem, proteomik analiz için güvenilir sonuçlar sağlar.
- Protein ekspresyonu ve modifikasyonlarının çalışmasını kolaylaştırır.
- Bu yaklaşım çeşitli nörolojik çalışmalara uygulanabilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
This protocol enables standardized protein extraction from limited human post-mortem and murine brain tissue, supporting reproducible proteomic profiling in neurodegenerative disease models. By integrating 2D-DIGE for quantitative expression analysis and mini 2DE immunoblotting for post-translational modification validation, the method strengthens target validation confidence and mechanistic de-risking in early discovery. The approach facilitates cross-species comparison and biomarker discovery relevant to Alzheimer’s disease and Lewy body dementia pathways.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses through global protein expression profiling in disease-relevant brain tissues.
- Operational Value: Supports functional target validation by detecting post-translational modifications such as ubiquitination and dimerization of disease-associated proteins like alpha-synuclein and amyloid precursor protein.
- Predictive Value: Enhances portfolio triage by providing qualitative comparison of protein modifications across conditions, aiding in target prioritization.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Prepares validated biological systems for downstream workflows by yielding protein extracts compatible with 2D-DIGE and immunoblotting platforms.
- Reproducibility: Addresses assay standardization through standardized lysis buffer and chloroform-methanol precipitation, improving consistency across human and murine samples.
- Quantitative Output: Enables reliable compound evaluation via fluorescence difference gel electrophoresis, supporting differential expression screening.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Supports study of molecular pathways in neurodegenerative diseases by enabling analysis of protein aggregates such as amyloid-beta and alpha-synuclein.
- Translational Continuity: Provides continuity from discovery through preclinical validation by allowing side-by-side comparison of human and mouse brain proteomes.
- Risk-Adjusted Advancement: Informs go/no-go decisions by identifying disease-associated protein modifications and expression changes in models of tau pathology.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from hypothesis testing to lead identification, particularly in neurodegenerative disease programs requiring mechanistic insight and target de-risking.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by resolving protein expression changes and post-translational modifications via isoelectric point and molecular weight separation.
- Screening: Delivers assay readiness and quantitative outputs through 2D-DIGE, enabling comparison of protein expression across complex samples.
- Analytics: Generates measurable readouts including spot intensity, migration shifts, and modification patterns that help teams compare conditions and prioritize targets.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by enabling analysis of human and murine brain tissue under comparable conditions, supporting biomarker alignment.
- Enterprise Reuse: Functions as a reusable proteomic capability rather than a single-use technique, applicable across multiple targets and disease models.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing mechanistic ambiguity through direct observation of protein modifications and expression shifts.
- Operational Value: Promotes standardization and reproducibility via standardized lysis buffer and protein precipitation protocols, minimizing variability across laboratories.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by enabling early de-risking of targets through mechanistic insight, reducing late-stage failure risk.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization by providing data on protein biomarkers and modification states relevant to disease progression.
Implementation Considerations
- Requires expertise in proteomics, protein biochemistry, and electrophoresis techniques including 2D-DIGE and immunoblotting.
- Depends on instrumentation such as electrophoresis systems, sonicators, centrifuges, and mass spectrometry-compatible platforms.
- Necessitates cross-team standardization of sample handling, protein quantification, and labeling procedures to ensure reproducibility.
- Involves adaptation considerations when applying the protocol to different brain regions, disease models, or sample quantities.
- Includes practical limitations such as the need for careful sample handling to prevent degradation and the dependency on sufficient protein yield from limited tissue inputs.
