Hassas, Büyük Ölçekli Kantitatif metabolomik için bir strateji

Bu prosedürün genel amacı, kültürlenmiş hücrelerde metabolik profillemeyi incelemektir. Bu, önce hücrelerden polar metabolitlerin çıkarılmasıyla gerçekleştirilir. İkinci adım, hücre ekstraktlarının suda yeniden sulandırılması ve numunelerin lc şişelerine aktarılmasıdır.

Daha sonra numuneler, kalibre edilmiş olan lc QE MS cihazına enjekte edilir ve son adımda ham veriler bilgisayara kaydedilir. Metabolit tepe noktaları, ticari yazılım kullanılarak ham verilerden çıkarılır ve bilinmeyen tepe noktaları, yüksek çözünürlüklü bir kütle veritabanına karşı aranır. Bu usta, sars'taki nispi metabolit seviyeleri hakkında fikir verebilse de, serum veya dokular gibi diğer sistemlere de uygulanabilir.

İlk olarak, 20 milimolar amonyum asetat olan 500 mililitre mobil faz A ve %3 aseto, nitril ve su içinde 15 milimolar amonyum hidroksit hazırlayın. Şişeyi gevşek bir şekilde kapattıktan sonra, çözeltiyi ısıtmadan 10 dakika boyunca bir su banyosunda sonikat yapın. Bunu takiben, mililitre başına bir miligramlık bir nihai konsantrasyon elde etmek için beş miligram sodyum floro asetat ve asidi beş mililitre suda çözün.

Daha sonra, mililitre başına 10 mikrogramlık bir nihai konsantrasyon elde etmek için diazinon'u metanol içinde çözün. Bir mililitre negatif düşük kütle kalibrasyon çözeltisi hazırlamak için, 960 mikrolitre termo negatif kalibrasyon çözeltisini 20 mikrolitre sodyum floro asetat ve homovanilik asit çözeltisi ile karıştırın. Bir mililitre pozitif düşük kütle kalibrasyon çözeltisi yapmak için 990 mikrolitre termo pozitif kalibrasyon çözeltisi ve 10 mikrolitre diazinon çözeltisini karıştırın.

Pozitif modda standart bir kütle kalibrasyonu gerçekleştirdikten sonra, cihaz kontrol panelinde tarama aralığını 60 ila 900 kütle / şarj oranına ayarlayın ve 25 elektron voltluk bir kaynak çarpışmasının neden olduğu ayrışma uygulayın. Özelleştirilmiş kalibrasyon iyonlarını girin ve iyon kaynağı kararlı hale geldiğinde, ayar sayfasında özelleştirilmiş kalibrasyonu başlatın. Negatif modda standart bir kütle kalibrasyonu gerçekleştirdikten sonra polariteyi negatif moda geçirin, cihaz kontrol panelinde tarama aralığını 60 ila 900 kütle / şarj oranına ayarlayın ve 35 elektron voltluk bir kaynak çarpışmasının neden olduğu ayrışma uygulayın.

Özelleştirilmiş kalibrasyon iyonlarını girin ve iyon kaynağı kararlı hale geldiğinde özelleştirilmiş kalibrasyonu başlatın. Ayar sayfasında, QE MS cihazını ısıtılmış elektro sprey iyonizasyon veya HESI probu ile C seviyesinde sabitleyerek ve ardından nitrojen gazı girişlerine, buharlaştırıcı kablosuna ve voltaj kablolarına bağlayarak donatın. Bilgisayar ayarlama sayfasında, prob için ilgili ayarlama parametrelerini ayarlayın.

Kılcal damar sıcaklığını 320 santigrat dereceye ve S lensi 55 dereceye ayarlayın. Yöntem programında bir sonraki adımda, aşağıdaki değerleri kullanarak bir tam tarama yöntemi oluşturun. Doğrusal gradyan bilgilerini girerek kromatografi yöntemini oluşturun.

Oda sıcaklığında bileşik ayırma için bir orta sütun kullanın. Bu noktada, 40 mililitre metanol ve 10 mililitre suyu 50 mililitrede manuel olarak karıştırarak bir ekstraksiyon çözücüsü hazırlayın. İki. Daha önce kültürlendiğinde kolon kanseri, H BT, sekiz hücre% 80'e ulaşırbirleşme

Ortamı hızlı bir şekilde aspire edin ve altı kuyulu plakayı kuru buzun üzerine yerleştirin. Daha sonra hemen her bir oyuğa bir mililitre ekstraksiyon çözücüsü ekleyin ve plakayı eksi 80 santigrat derece dondurucuya aktarın. Plakayı dondurucudan çıkardıktan 15 dakika sonra kuru buzun üzerine koyun ve hücreleri çözücünün içine kazıyın.

Çözeltiyi her bir kuyucuktan üç adet 1.7 mililitrelik einor tüpe aktarın ve numuneleri 10 dakika boyunca dört santigrat derecede 20.000 kez G hızında santrifüjleyin. Santrifüjlemeyi takiben, süpernatanı iki yeni einor tüpüne aktarın. Ardından numuneleri hızlı bir vakumda kurutun.

Numuneler kuruduktan sonra eksi 80 santigrat derece dondurucuda saklayın. Numuneleri analiz için dondurucudan çıkardıktan sonra buz sıcaklığına ulaşmalarına izin verin. Daha sonra 20 mikrolitre buz gibi soğuk su ekleyin ve metabolitleri çözmek için numuneleri girdaplayın.

Daha sonra, numuneleri dört santigrat derecede 20.000 kez G'de santrifüjleyin. İki dakika boyunca SUPERNAT'ı lc şişelerine aktarın ve numunelerin beşini analiz için lc QES cihazına enjekte edin. Kalibrasyon, QE MS cihazında düzgün bir şekilde gerçekleştirildikten sonra, lc kolonunu dakikada 85 mililitrelik bir akış hızında mobil faz B'nin %0.15'i ile beş dakika boyunca dengeleyin.

Ardından, LCMS tarafından ortaya çıkan dalgalanmaları her bir numuneye dağıtmak ve farklı numuneler arasında daha doğru bir karşılaştırma sağlamak için numune dizisini rastgele bir sırayla ayarlayın. Her altı numuneden sonra, sistem arka planını ve taşıma seviyelerini değerlendirmek için bir yıkama işlemi ve ardından boş bir numune ekleyin. Sırayı kaydedin ve dizi çalıştırmasını başlatın.

lc sütunu 400 PSI'ye yakın sabit basınç gösterdiğinde, dizinin ilk iki örneği çalıştırıldıktan sonra, numune dizisinin sorunsuz çalıştığından emin olmak için bu kromatogramlardaki tepe noktalarını bilinmeyen metabolitler için kontrol edin. Dizideki tüm örnekler tamamlandıktan sonra, ayrı bir bilgisayarda veri analizi yapın. Piyasada bulunan yazılımda küçük molekül için tepe hizalama ve çerçeve çıkarma yöntemini seçin.

Ardından lc ms ham verilerini yükleyin ve bunları örnek türlerine göre gruplandırın. Tepe hizalaması için bir kromatografi referans numunesi olarak çalışma sırasının ortasındaki numuneleri seçin ve oran grubu veya tam değişim hesaplaması olarak bir grup seçin. Ardından, toplanan verilerle hedeflenen metabolit analizi için bilinen metabolitler ve karşılık gelen çerçeve tohumu dahil olmak üzere bir çerçeve tohumu yükleyin.

Ardından, pozitif veya negatif modda tam spektrum taramasını seçin ve bu veri işleme dosyasını ham verilerle aynı klasöre kaydedin. Veritabanı arama işlevini kapatın ve iş akışını çalıştırın. Ardından işlem verilerini, her karenin tepe alanını içeren bir Excel sayfası olarak dışa aktarın.

Hedeflenmemiş bir metabolit analizi için, bileşen ekstraksiyon yöntemini seçin. Arka plan çıkarma işlemi için örnek ham verileri ve üç boş örneği yükleyin. Bu grubu takiben, ham veriler ve daha önce açıklandığı gibi referans örneklerini ayarlayın.

Bileşen eşiğini 10 üzeri beşte bir olarak ayarlayın. Bilinmeyen bileşik tanımlaması için bir insan metabolom veritabanı kullanın. Bu işlem dosyasını kaydettikten sonra, veritabanı arama işlevini kapatın ve iş akışını başlatın.

Veri işleme tamamlandıktan sonra, çoğaltma örnekleri ve yoğunluk filtreleri içindeki büyük CV'ye sahip bileşenleri çıkarmak için varyasyon katsayıları veya CV filtreleri kullanın. Gürültü seviyesinde algılanan bileşenleri manuel olarak çıkarmak için, her bir bileşeni gözden geçirin ve veritabanı araması için farklı örnek türlerinde iyi tanımlanmış bir tepe noktasına veya nispeten büyük bir farka sahip olanları seçin. Son olarak, verileri veritabanındaki isabetlerle dışa aktarın.

Metabolomik verilerin doğruluğu, cihazın iyi durumda çalışıp çalışmadığını ve uygulanan yöntemin uygun olup olmadığını değerlendirmek için büyük ölçüde lc QEMS cihaz performansına bağlıdır. Bilinen birkaç metabolit lc zirvesi, burada gösterildiği gibi toplam iyon kromatografisinden ekstrakte edilir. Amino asitler, glikoliz, ara ürünler, TCA, ara ürünler, nükleotidler, A, TP ve NADP vitaminleri dahil olmak üzere polar metabolitler, mevcut lc koşulları altında kolon üzerinde iyi tutma ve iyi tepe şekillerine sahiptir.

Bu arada, gösterildiği gibi düşük kütle kalibrasyonundan sonraki 24 saat içinde bir kütle hata testi yapılır. Burada, kütle hatası, tespit edilen kütle / yük oranı, hedeflenen metabolitlerin teorik kütle / yük oranı ile karşılaştırılarak değerlendirilir. Burada, hedeflenen metabolitler 74 ile 744 arasında değişen bir kütle / yük oranına sahiptir.

Buradaki Y ekseni, belirli bir kütle hata aralığı içindeki metabolitlerin birikimli yüzdesini temsil eder. Mavi eğri sıfırdan 12 saate kadar olan sonucu gösterirken, kırmızı renkli eğri kalibrasyondan 12 ila 24 saat sonra toplanan verileri gösterir. Metabolitlerin% 90'ından fazlası milyonda beş parça kütle hatası içindedir, bu da burada geliştirilen düşük kütle aralığı kalibrasyon yönteminin, düşük kütle aralığı tespiti için milyonda beş parça kütle hatasını korumak için yeterli olduğu anlamına gelir.

Üzerinde durulması gereken bir diğer konu ise cihazın mevcut metod ve cihaz kurulumu ile olan hassasiyetidir. 10 santimetrelik bir Petri kabından üç kopya numunelerin seri seyreltilmesi, altı seyreltme faktörü ile beş kez gerçekleştirildi ve bu da altı farklı numune konsantrasyonu ile sonuçlandı. Farklı numune konsantrasyonlarında tespit edilen metabolitlerin sayısını değerlendirmek için hedefe yönelik bir liste kullanılır.

Burada gösterilen sonuçlar, tespit edilen optimal hedeflenen metabolit sayısının 2.78 çarpı 10 ila beşinci ve 1.67 çarpı 10 ila altı hücre arasında olduğunu, bir kez 10 ila yedi hücre arasında olduğunu, bir kez 10 ila yedi hücrenin daha az sayıda tespit edildiğini göstermektedir, bu da iyon baskılama etkilerinden kaynaklanmaktadır. Bu sonuç, bu analiz için ekstrakte edilecek en uygun hücre miktarının kabaca altı kuyulu bir plakadaki bir kuyu olduğunu göstermektedir. Hedeflenmemiş metabolit analizi için, bileşenler tablosunu filtrelemek için %20'lik bir CV kesme ve 10 ila yedinci arasında bir ortalama yoğunluk değeri kullanılır.

Daha fazla tepe noktası eklemek için ortalama yoğunluk değerlerinin azaltılması gerekirken CV kesme değerleri artırılabilir: Tepe noktaları manuel olarak kontrol edildikten sonra, iyi şekillere sahip bileşenler seçilir ve insan metabolom veritabanında aranır. Pozitif modda toplanan verilerden elde edilen sonuçlar burada, negatif modda toplanan sonuçlar ise burada listelenir. Burada tanımlanan metabolitlerin bazıları, glutatyon ve prolin gibi hedeflenen listedeki metabolitlerle örtüşür.

Glikolizden türetilebilen metil glioksal ve 3.2 dakikalık bir alıkonma süresi ile pozitif modda tespit edilen bir pto, iki ELE SN gliserol, üç fosfokolin gibi hedeflenen listede bulunmayan ek metabolitler de araştırılmıştır. Bu videoyu izledikten sonra, kültürlenmiş sarlardan poli metabolitlerin nasıl çıkarılacağını iyi anlamalı ve ardından farklı örneklerde nispi metabolize seviyeleri ölçmek için RC QES'i kullanmalısınız. İzlediğiniz için teşekkürler.