Name: Hassas, Büyük Ölçekli Kantitatif metabolomik için bir strateji (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-05-27T13:45:00.000+00:00
Duration: 14 min 18 s
Description: Öğrenin, kültür hücrelerinden polar metabolitlerin ekstraksiyonu ve LC-MS analiziyle hassas metabolomik profilleme yapmayı. Bu yöntem, metabolik değişiklikleri anlamak için güçlü bir araç sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Yazarlar kütle kalibrasyon ve veri işleme değerli tartışmalar için Detlef Schumann, Jennifer Sutton (Thermo Fisher Scientific) ve Nathaniel Snyder (Pennsylvania Üniversitesi) kabul etmek istiyorum. Bu yayında bildirilen Araştırma Ödülü sayısı R00CA168997 altında Ulusal Sağlık Enstitüleri Ulusal Kanser Enstitüsü tarafından desteklenmiştir. Içeriği sadece yazarların sorumluluğundadır ve mutlaka Ulusal Sağlık Enstitüleri resmi görüşlerini temsil etmemektedir.

1.. LC-MS Kimyasalları, bir Kromatografi Yöntemi Kuruluş hazırlanması ve Enstrüman Çalışma Usul kurulması <ol><li> LC Solventler hazırlanması <ol><li> 500 ml mobil faz hazırlayın. Bir 20 mM amonyum asetat ve% 3 oranında asetonitril / su içinde 15 mM amonyum hidroksit, son pH, 9.0; ve B 100% asetonitrildir. </li><li> Gevşek, şişe kapağı bir su banyosu sonikatörde yerleştirin ve ekstra ısıtma olmadan 10 dakika boyunca sonikasyon. (Bu adım, amonyum tuzları, tüm tam olarak çözünmesi ve herhangi bir artık hava kabarcıkları olduğu sağlamaktır.) </li><li> LC-MS kullanım için bir 250 ml cam şişe için bir çözücü, ve 4 ° C &#39;de kalan tutmak transferi 250 mi </li></ol></li><li> Düşük kütle aralığı kalibrasyon çözeltisi hazırlayın. O doğru kütleleri düşük molekül ağırlıklarında tespit sağlamak için metabolomiks uygulamalar için özelleştirilmiş bir düşük kütle aralığı kalibrasyon karışımının kullanılması önemlidir. <ol><li> Sodi hem de, 5 mg tartılırum fluoroasetat ve homovanillic asit ve 1 mg / ml &#39;lik bir son konsantrasyon sağlamak için 5 ml su içine çözülür. 10 mg / ml &#39;lik bir son konsantrasyon sağlamak için, metanol içinde diazinon çözülür. </li><li> Negatif düşük kütle kalibrasyonu çözeltisi 1 ml hazırlamak için, sodyum fluoroaceate ve homovanillic asit solüsyonu, 20 ml termo negatif kalibrasyon çözeltisi 960 ml karıştırın. Pozitif düşük kütle kalibrasyonu çözeltisi 1 ml yapmak için, ısı ayarlama pozitif çözeltisi 990 ml ve 10 mi diazinon çözelti karıştırın. (Düşük kütle kalibrasyonu solüsyon 4 ° C &#39;de muhafaza edilmelidir ve her 2 ayda bir taze olarak hazırlanmalıdır.) </li></ol></li><li> Düşük Kütle Aralığı QE-MS Kalibrasyon <ol><li> Düşük kütle aralığı kalibrasyonu yapmadan önce, üreticinin talimatlarına göre olumlu ve olumsuz modlarında standart bir kitle kalibrasyon (m / z, 150-2,000) yürütmek. </li><li> Düzenli bir kitle kalibrasyon geçtiğinde, gösterge kontrol panelindeki 60-900 m / z tarama aralığını ayarlamakve pozitif ve negatif mod modu için 35 eV 25 eV kaynağı CID uygulanır. (Bu kafein fragmanı iyon ve sülfat iyonu güçlü sinyaller verecektir. Burada tarama aralığı sabittir, son m / z başlangıç ​​m / z 15x daha büyük olmamalı, çünkü) </li><li> Iyon kaynağı stabil olduktan sonra özel kalibrasyonu gerçekleştirin. Not: Stabil bir kaynak pozitif modda toplam iyon akımı varyasyonun% 10&#39;dan daha az olarak tanımlanır ve negatif modda en az% 15 olduğu. Özel kalibrasyon iyonları ve karşılık gelen m / z Tablo 1 &#39;de listelenmiştir. </li></ol></li><li> Polar metabolit analizi için LC-MS aletleri kurulması. LC metabolit ayrılması ve keşfi için bir QE-MS kuple edilir. <ol><li> Isıtmalı elektrosprey iyonizasyon probu (H-ESI) ile QE-MS donatın. Listelenen prob için ilgili ayar parametrelerini ayarlayın: Isıtıcı sıcaklığı, 120 ° C; kılıf gaz, 30; Yardımcı gaz, 10; Doğal gaz, 3 süpürme; gerilimi, 3.6 kV spreypozitif mod ve negatif mod için 2.5 kV. 55 ° C&#39;de 320 ° C&#39;de kılcal sıcaklık ve S-lens ayarlayın. </li><li> Tam tarama aralığı: aşağıdaki gibi tam bir tarama yöntemi oluşturmak 60-900 (m / z); çözünürlük: 70.000; maksimum enjeksiyon süresi: 50 ms civarında tipik enjeksiyon süreleri ile 200 msn; otomatik kazanç kontrol (AGC): 3,000,000 iyonları. Bu ayarlar hem pozitif hem negatif modda taramaları yürütmek için yaklaşık 550 msn bir görev döngüsü sonuçlanır. </li><li> Kromatografi yöntemi kurmak. Oda sıcaklığında 13,15, bileşik ayrılması için bir sütun amid (100 x 2.1 mm id, 3.5 mm) kullanır. Yukarıda tarif edildiği gibi, mobil faz A ve mobil faz B asetonitrildir. Aşağıdaki gibi lineer bir miktar kullanın: 0 dak,% 85 B; 1.5 dakika,% 85 B, 5.5 dakika,% 35 B; 10 dakika,% 35 B, 10.5 min,% 35 B, 14.5 dak,% 35 B, 15 dakika,% 85 B, 20 dakika,% 85 B Akış hızı 0.15 ml / dk 0-10 dakika ve 15&#39;tir 20 dakika ve 10.5 &#39;den 14.5 dakika, 0.3 ml / dk.&#39; </li></ol></li></ol> 2. Prmetabolit Numune Ayırma <ol><li> Bir ekstraksiyon solventini hazırlayın. 50 ml&#39;lik bir tüp içinde 40 ml metanol (LC-MS sınıf) ve 10 ml su (LC-MS grade) karıştırılmakta ve kullanılmadan önce en az 1 saat boyunca -80 ° C dondurucuda tutun. Not: Bu prosedür ve aşağıdaki adımları biyolojik doku ve sıvı numunelerin çıkarılması için modifiye edilebilir. <ol><li> Tam büyüme ortamı ile üç adet 10 cm tabaklar veya 6 oyuklu plakalar içinde kültür kolon kanseri HCT 8 hücreleri, RPMI 1640,% 10 ısı inaktifleştirilmiş Fetal Sığır Serumu ve 100,000 ünite / L penisilin ve 100 mg / L streptomisin ile takviye edilmiştir. </li><li> Hücreler% 80 izdiham ulaştığınızda, hızla orta kaldırmak ve kuru buz 13,15 üstüne yemek ya da plaka koyun. Hemen (% 80 metanol / su) çözücü 1 ml ekstraksiyon ekleyin ve -80 ° C dondurucu plaka transfer. , 10 cm tabak için, her bir göze bir ekstraksiyon çözücüsü 3 ml ekleyin. (Ortam, bakiye tuzları nedeniyle iyon bastırma etkisini önlemek için mümkün olduğu kadar ortadan kaldırmak için deneyin.)</li><li> 15 dakika boyunca plaka bırakın. Dondurucu çıkarın ve kuru buz üzerinde çözücü içine hücreleri kazıyın. 1.7 ml Eppendorf tüplerine transfer çözeltisi ve 10 dakika boyunca 4 ° C&#39;de 20,000 x g hızında santrifüj ile. (Üç suret örnekleri yapmak için üç ayrı yemekler hücre metabolitleri hazırlayın. Iki tüp tutmanın amacı, bir yedek olarak bir tane olduğunu.) </li><li> Iki yeni Eppendorf tüplerine süpernatant aktarın ve bir hızlı vakum içinde kurutun. Bu, kullanılan hızlı vakum bağlı olarak yaklaşık 3-6 saat sürer. (Numuneler, aynı zamanda, azot gazı altında gece boyunca kurutulabilir.) </li><li> -80 ° C derin dondurucuda her numunenin kurutulması, mağaza tüpler sonra. Hazır olduğunda, 20 ml su (LC-MS grade) içine bir örnek tekrar oluşturmak ve analiz için LC-MS QE-5 ml enjekte edilir. </li></ol></li></ol> Örnek 3. Sekans. Setup <ol><li> Kalibrasyon düzgün QE-MS üzerinde gerçekleştirilmiştir sonra, bir akışta% 85 A&#39;ya, 5 dakika boyunca LC kolon dengeLC gradyanın başlangıç ​​durumdur, 0.15 ml / dakika, oranı. </li><li> Rastgele sırayla örnek sırasını ayarlayın. Not: Bu şekilde, her bir örnek için LC-MS ile tanıtılan dalgalanmaları dağıtır ve farklı numuneler arasında, daha doğru karşılaştırma sağlar. LC gradyan, 10 dakika boyunca% 95 A ve 0.15 ml / dk &#39;lık bir akış oranı ile% 85 A&#39; da, 5 dakika kolon dengeleme izledi hariç her 6 numuneleri, aynı MS yöntemi paylaşan bir yıkama çalışma, ekleyin. Sistem arka plan değerlendirmek ve seviyeleri üzerinde taşımak için her yıkama çalıştırdıktan sonra boş örnekleri (100% su) ekleyin. </li><li> Dizisini kaydedin ve LC sütun 400 psi civarında istikrarlı basıncını gösterir zamanlar, dizi çalışma başlatmak. Başka bir örnek, bu dizinin sonra çalıştırmak için orada ise bitirdikten sonra, daha sonra gradyan sonunda 0 ml / dk &#39;lık bir akış hızı olan sekansı sonunda bir durdurma çalıştırmak ekleyin ve &quot;bekleme&quot; tercih sırası. </li><li> Yeniden çalıştırmak aynı örnek kalibrasyon sonrasında 12 saat ayarlayın. (Bu ikalibrasyon sonrasında kitle hata dalgalanmayı değerlendirmek için s.) </li></ol> 4. Mesaj Analizi Enstrüman Temizleme ve Bakım <ol><li> Dizinin sonunda, 0.2 saat boyunca 2 ml / dak &#39;lık bir akış hızında% 95 A ile sütun yıkama ve gerekirse, yıkamadan önce sütun ters. </li><li> LC sütun çıkarın ve doğrudan bir sendika tarafından iyon kaynağına LC bağlayın. Solvent, su / metanol / formik asit temizleme hazırlayın (v: v: v, 90:10:0.2) bekleme modunda MS ayarlamak, ve 0.1 &#39;lik bir akış oranında yıkama LC-MS sistemi ml / dakika, 1 saat boyunca kaldırmak için kalıntı tuzlar ya da diğer yabancı maddeler çökeltilir. Çok fazla sistem basıncı yoksa akış hızını düşürün. </li><li> 50 ° C&#39;de kılcal sıcaklık ayarlama ve iyon kafes çıkarın. Kılcal sıcaklığı 50 ° C&#39;ye düşer sonra dikkatlice iyon süpürme koni ve iyon transferi tüpü çıkarmak Iyon tarama koninin yüzey üzerinde kalan kirleri çıkarmak için, bu tür zımpara gibi kaba bir örgü kullanın. </li><li> Iyon transferi yerleştirin% 0.1 &#39;lik formik asit ile 10 ml% 90 su / metanol ihtiva eden bir 15 ml Falcon tüpü içine tüpü. 20 dakika boyunca bir su banyo sonikatörü içinde sonike tüp sonra, içindeki solvent dekante 10 mi saf metanol ile değiştirin ve 20 dakika boyunca ultrasonik titremeye maruz bırakılır. (Gerekirse, sonication, 40 ° C ya da daha iyi temizleme sonuçları elde etmek için daha yüksek bir sıcaklıkta yapılabilir.) </li></ol> LC-MS verileri, 5. Analizi <ol><li> Örnek sırasını sağlamak için sırayla ilk iki örnekleri bittikten sonra, bilinmeyen metabolitleri için zirveleri onay, sorunsuz çalışır. Metaboliti isimleri, nötr kimyasal formülü ve algılama modu (pozitif veya negatif), girdi dosyası olarak ve çıktı dosya ayıklanır zirveleri ve ppm kitle hatayı içeren listeleyen bir csv dosyası kullanın. Tepe şekli anormal veya kitle hata fazla 5 ppm kapalıysa, daha sonra dizinin geri kalanı durdurulmuş ve sorun yapılması gereken edilmesi gerekmektedir. </li><li> &quot;Pik hizalama yöntemini seçinve ticari olarak mevcut yazılım üzerinde kare çıkarma &quot;. LC-MS ve grup onlardan ham verileri seçin. Tepe hizalama için kromatografi referans örnek olarak çalıştırmak sekansının ortasında örnekleri almak. Toplanan veriler ile hedeflenen metabolitler analizi ve karşılık gelen çerçeve tohum için bilinen metabolitler içeren bir çerçeve tohum yükleyin. </li><li> Ayrı ayrı pozitif ve negatif modunda veri analizi yapın. Diğer parametreler için varsayılan ayarı kullanın. Veritabanı arama fonksiyonunu kapatın ve iş akışını çalıştırın. Her çerçevenin pik alanı içeren bir excel levha olarak işlenmiş verileri. Çerçeveleri ilk set hedeflenen listesindeki metabolitlere karşılık gelirler. Not: bir hedef metabolit analizi için, metabolitler bilgi önceki çalışmalarda 13,15 göre elde edilir. </li><li> An hedefsiz metabolit analizi için, &quot;bileşen çıkarma&quot; yöntemini seçin. Arka plan çıkarma için boş örnekleri yükleyin. Set tepe yoğunluğu eşikt 10 5, 3 gürültü oranı 10 ppm ve sinyal m / z genişliği. </li><li> Bilinmeyen bileşikler tanımlanması için insan metabolome veritabanı kullan. Tekrar örnekleri içinde büyük özgeçmişleri ile bileşenleri kaldırmak için bir CV filtresi kullanın. El ile her bileşen geçmesi ve iyi tanımlanmış zirve veya veritabanı arama için farklı örnekler türleri nispeten büyük farkı bu almak. Veritabanında hit ile İhracat verileri. (Tepe hizalama puanı çok düşük ise Tepe hizalama bypass olabilir.) </li></ol>

<ol><li>Fiehn, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combining+genomics%2C+metabolome+analysis%2C+and+biochemical+modelling+to+understand+metabolic+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Comparative+and+Functional+Genomics%22%5BJournal%5D)">Combining genomics, metabolome analysis, and biochemical modelling to understand metabolic networks.</a> Comparative and Functional Genomics. 2 (3), 155-168 (2001).</li>
<li>Mulleder, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+prototrophic+deletion+mutant+collection+for+yeast+metabolomics+and+systems+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">A prototrophic deletion mutant collection for yeast metabolomics and systems biology.</a> Nature Biotechnology. 30 (12), 1176-1178 (2012).</li>
<li>Patel, V. R., Eckel-Mahan, K., Sassone-Corsi, P., Baldi, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CircadiOmics%3A+Integrating+circadian+genomics%2C+transcriptomics%2C+proteomics+and+metabolomics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">CircadiOmics: Integrating circadian genomics, transcriptomics, proteomics and metabolomics.</a> Nature Methods. 9 (8), 772-773 (2012).</li>
<li>Ideker, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrated+genomic+and+proteomic+analyses+of+a+systematically+perturbed+metabolic+network%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Integrated genomic and proteomic analyses of a systematically perturbed metabolic network.</a> Science. 292 (5518), 929-934 (2001).</li>
<li>Jonsson, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+strategy+for+identifying+differences+in+large+series+of+metabolomic+samples+analyzed+by+GC%2FMS%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">A strategy for identifying differences in large series of metabolomic samples analyzed by GC/MS.</a> Analytical Chemistry. 76 (6), 1738-1745 (2004).</li>
<li>Jonsson, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+data+analysis+for+detecting+and+identifying+differences+between+samples+in+GC%2FMS-based+metabolomic+analyses%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">High-throughput data analysis for detecting and identifying differences between samples in GC/MS-based metabolomic analyses.</a> Analytical Chemistry. 77 (17), 5635-5642 (2005).</li>
<li>Weljie, A. M., Newton, J., Mercier, P., Carlson, E., Slupsky, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+profiling%3A+Quantitative+analysis+of+1H+NMR+metabolomics+data%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Targeted profiling: Quantitative analysis of 1H NMR metabolomics data.</a> Analytical Chemistry. 78 (13), 4430-4442 (2006).</li>
<li>Wiklund, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+GC%2FTOF-MS-based+metabolomics+data+for+identification+of+biochemically+interesting+compounds+using+OPLS+class+models%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Visualization of GC/TOF-MS-based metabolomics data for identification of biochemically interesting compounds using OPLS class models.</a> Analytical Chemistry. 80 (1), 115-122 (2008).</li>
<li>Xia, J., Bjorndahl, T. C., Tang, P., Wishart, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MetaboMiner--semi-automated+identification+of+metabolites+from+2D+NMR+spectra+of+complex+biofluids%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">MetaboMiner--semi-automated identification of metabolites from 2D NMR spectra of complex biofluids.</a> BMC Bioinformatics. 9, 507(2008).</li>
<li>Lu, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((13C+NMR+isotopomer+analysis+reveals+a+connection+between+pyruvate+cycling+and+glucose-stimulated+insulin+secretion+%28GSIS%29%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">13C NMR isotopomer analysis reveals a connection between pyruvate cycling and glucose-stimulated insulin secretion (GSIS).</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (5), 2708-2713 (2002).</li>
<li>Shen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+the+rate+of+the+glutamate%2Fglutamine+cycle+in+the+human+brain+b.+in+vivo+13C+NMR%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Determination of the rate of the glutamate/glutamine cycle in the human brain b. in vivo 13C NMR.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (14), 8235-8240 (1999).</li>
<li>Kitteringham, N. R., Jenkins, R. E., Lane, C. S., Elliott, V. L., Park, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+reaction+monitoring+for+quantitative+biomarker+analysis+in+proteomics+and+metabolomics%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Chromatography.+B%2C+Analytical+Technologies+in+the+Biomedical+and+Life+Sciences%22%5BJournal%5D)">Multiple reaction monitoring for quantitative biomarker analysis in proteomics and metabolomics.</a> Journal of Chromatography. B, Analytical Technologies in the Biomedical and Life Sciences. 877 (13), 1229-1239 (2009).</li>
<li>Locasale, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolomics+of+human+cerebrospinal+fluid+identifies+signatures+of+malignant+glioma%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+%26+Cellular+Proteomics+%3A+MCP%22%5BJournal%5D)">Metabolomics of human cerebrospinal fluid identifies signatures of malignant glioma.</a> Molecular & Cellular Proteomics : MCP. 11 (6), 10-1074 (2012).</li>
<li>Wolf-Yadlin, A., Hautaniemi, S., Lauffenburger, D. A., White, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+reaction+monitoring+for+robust+quantitative+proteomic+analysis+of+cellular+signaling+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Multiple reaction monitoring for robust quantitative proteomic analysis of cellular signaling networks.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (14), 5860-5865 (2007).</li>
<li>Yuan, M., Breitkopf, S. B., Yang, X., Asara, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+positive%2Fnegative+ion-switching%2C+targeted+mass+spectrometry-based+metabolomics+platform+for+bodily+fluids%2C+cells%2C+and+fresh+and+fixed+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">A positive/negative ion-switching, targeted mass spectrometry-based metabolomics platform for bodily fluids, cells, and fresh and fixed tissue.</a> Nature Protocols. 7 (5), 872-881 (2012).</li>
<li>Ramanathan, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((It+is+time+for+a+paradigm+shift+in+drug+discovery+bioanalysis%3A+From+SRM+to+HRMS%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Mass+Spectrometry+%3A+JM%22%5BJournal%5D)">It is time for a paradigm shift in drug discovery bioanalysis: From SRM to HRMS.</a> Journal of Mass Spectrometry : JM. 46 (6), 595-601 (2011).</li>
<li>Lu, W., Clasquin, M. F., Melamud, E., Amador-Noguez, D., Caudy, A. A., Rabinowitz, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolomic+analysis+via+reversed-phase+ion-pairing+liquid+chromatography+coupled+to+a+stand+alone+orbitrap+mass+spectrometer%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Metabolomic analysis via reversed-phase ion-pairing liquid chromatography coupled to a stand alone orbitrap mass spectrometer.</a> Analytical Chemistry. 82 (8), 3212-3221 (2010).</li>
<li>Michalski, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultra+high+resolution+linear+ion+trap+orbitrap+mass+spectrometer+%28orbitrap+elite%29+facilitates+top+down+LC+MS%2FMS+and+versatile+peptide+fragmentation+modes%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+%26+Cellular+Proteomics+%3A+MCP%22%5BJournal%5D)">Ultra high resolution linear ion trap orbitrap mass spectrometer (orbitrap elite) facilitates top down LC MS/MS and versatile peptide fragmentation modes.</a> Molecular & Cellular Proteomics : MCP. 11 (3), 10-1074 (2012).</li>
<li>Michalski, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+spectrometry-based+proteomics+using+Q+exactive%2C+a+high-performance+benchtop+quadrupole+orbitrap+mass+spectrometer%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+%26+Cellular+Proteomics+%3A+MCP%22%5BJournal%5D)">Mass spectrometry-based proteomics using Q exactive, a high-performance benchtop quadrupole orbitrap mass spectrometer.</a> Molecular & Cellular Proteomics : MCP. 10 (9), (2011).</li>
<li>Snyder, N. W., Khezam, M., Mesaros, C. A., Worth, A., Blair, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Untargeted+Metabolomics+from+Biological+Sources+Using+Ultraperformance+Liquid+Chromatography-High+Resolution+Mass+Spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22UPLC-HRMS%29.+J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Untargeted Metabolomics from Biological Sources Using Ultraperformance Liquid Chromatography-High Resolution Mass Spectrometry.</a> UPLC-HRMS). J. Vis. Exp. (75), (2013).</li>
<li>Gika, H. G., Theodoridis, G. A., Wingate, J. E., Wilson, I. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Within-day+reproducibility+of+an+HPLC-MS-based+method+for+metabonomic+analysis%3A+Application+to+human+urine%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Proteome+Research%22%5BJournal%5D)">Within-day reproducibility of an HPLC-MS-based method for metabonomic analysis: Application to human urine.</a> Journal of Proteome Research. 6 (8), 3291-3303 (2007).</li>
<li>Want, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+metabolic+profiling+procedures+for+urine+using+UPLC-MS%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Global metabolic profiling procedures for urine using UPLC-MS.</a> Nature Protocols. 5 (6), 1005-1018 (2010).</li>
</ol>

Yazarlar çıkar çatışması beyan ederim.

Bu protokol kullanılarak hücre başarılı metabolit profil için en önemli adımlar şunlardır: 1) büyütme ortamı ve hücreler dikkatli çıkarma kontrol edilmesi; 2) kantitatif bir tepe üzerinde yeterince (genellikle en az 10) veri noktaları vardır sağlamak için MS yöntemi kurulum dayalı LC yöntemini ayarlanması; 3) örnekleri çalıştırmadan önce düşük kütle kalibrasyonu yapıyor; 4) vites tutma süresini önlemek için en fazla 5 ml enjekte ve zirve genişletilmesi su neden; ve 5) toplu etkilerini en aza indirmek için aynı parti içi...

Aynı anda birden fazla metabolitleri ölçen bir deney olarak tanımlanan Metabolomik, yoğun bir ilgi alanı olmuştur. Metabolomik moleküler fizyoloji doğrudan okunmasını sağlar ve kanser 1-4 gibi geliştirme ve hastalık halinde anlayışlar sağladı. Nükleer manyetik rezonans (NMR) ve gaz kromatografisi-kütle spektrometrisi (GC-MS), en yaygın olarak kullanılan araçlar 5-9 arasındadır. NMR, özellikle 13 C etiketli metabolitleri gibi ağır izotop etiketli bileşikleri, tarihi akış deneyleri için kullanılmıştır, 10,11-NMR etkindir. Ancak, bu strateji metabolitler onun uygulamalarını sınırlar, nispeten yüksek saflık ve büyük örnek miktar gerektirir. Bu arada, NMR toplanan verilerin analizi yoğun ve karmaşık NMR spektrumları bileşik atama zordur gerekiyor. GC-MS çok polar metabolitleri ve lipid çalışmaları için kullanılmıştır, ama bu uçucu compoun gerektirirds ve bazen zaman alıcı olabilir karmaşık kimya içerir ve deneysel gürültü tanıttı metabolitleri bu nedenle sık sık türetme,. Üçüncü dört kutuplu karakteristik fragmanları veya kız iyonları seçmek için kullanılır ise üçlü dört kutuplu kütle spektrometresi birleştirilmiş sıvı kromatografisi (LC), daha sonra ikinci bir dört kat olarak parçalanmış dokunulmamış ana iyonları, seçme için ilk kuadruple kullanır. Belirli bir kız iyonlarına ana iyonu geçişi kaydeder bu yöntem, çoklu reaksiyon takip işlemi (MRM) olarak adlandırılır. MRM küçük molekül ve protein kantitatif 12-15,21 hem de çok duyarlı, spesifik ve güçlü bir yöntemdir. Ancak, MRM sınırlamaları var. Yüksek özgüllük ulaşmak için MRM yöntemi, her metaboliti için inşa edilmesi gerekmektedir. Bu yöntem, özel bir fragmanının belirlenmesi ve prope ön bilgi gerektirir optimize çarpışma enerjisi, ilgili oluşmaktadırBu tür kimyasal yapı bilgileri gibi ilgilenilen metabolitleri, ve ilgili taraflar. Bu nedenle, ortak parçalarının nötr kaybı ile ilgili bazı özel durumlar dışında, bu yöntem ile bilinmeyen metabolitlerin tespit etmek mümkün değildir. Son yıllarda, yüksek çözünürlüklü kütle spektrometresi (HRMS) aletler gibi LTQ-Orbitrap ve Exactive serisi, QuanTof olarak yayımlanan ve TripleTOF 5600 16-18,22 edilmiştir. HRMS birkaç ppm bir hata payı içinde sağlam iyonları oranını (m / z) şarj etmek için bir kütle sağlayabilir. Bu nedenle, tüm ön-madde iyonları (tam tarama modu) tespit edilmesi ile işletilen bir araç HRMS tam kütlesi ve bir analit &#39;in elde edilen temel bileşiminin doğrudan yapısal bilgi elde edebilir ve bu bilgiler potansiyel metabolitleri tanımlamak için kullanılabilir. Gerçekten de, bir bileşik ile ilgili tüm bilgiler yapısal izomer seviyesine kadar, tam bir kütle ile elde edilebilir. Ayrıca, tam birTarama yöntemi metabolitleri önceki bilgi gerektirmez ve yöntem optimizasyonu gerektirmez. M / z tarama aralığı içine düşen tüm iyonları analiz edilebilir Dahası, HRMS MRM yöntemine göre tek vadede kantifiye edilebilir metabolitlerin sayısı açısından neredeyse sınırsız bir kapasiteye sahiptir. HRMS nedeniyle tarama, tam MS elde edilebilir veri noktaları benzer bir dizi ile sonuçlanan kısa görev döngüsü için, aynı zamanda nicel kapasitede bir üçlü dört kutuplu MRM karşılaştırılabilir. Bu nedenle, HRMS kantitatif metabolitler için alternatif bir yaklaşım sağlar. Son zamanlarda, HRMS geliştirilmiş bir versiyonu (QE-MS) algılama mesafesi 19 genişleten tek bir yöntemle, yeterince hızlı döngü süreleri ile pozitif ve negatif modları arasında geçiş altında ameliyat edilebilir Q-Exactive kütle spektrometresi olarak adlandırılır. Burada QE-MS kullanılarak bizim metabolomiks stratejisini açıklar.

<table><tbody><tr><td>Pozitif kalibrasyon karışımı</td><td>Thermo Scientific</td><td>#88323</td><td>Işığa duyarlıdır. 4 & derecede saklayın; C</td></tr><tr><td>Negatif kalibrasyon karışımı</td><td>Thermo Scientific</td> <td># 88324</td><td>4 & °C'de saklayın; C</td></tr><tr><td>Diazinon</td><td>Sant Cruz Biyoteknoloji</td><td>#C0413</td><td>Gözlerde tahrişe neden olur, bu yüzden kapüşonda çalışın. 4 & derecede saklayın; C</td></tr><tr><td>H-ESI iğne ucu</td><td>Fisher Scientific</td> <td># 1303200</td><td>Bu, tıkanırsa %5 formik asit/su (lastik halkayı çıkarın) ile değiştirilebilir veya temizlenebilir.</td></tr><tr><td>Xbridge amid sütunu</td><td>Waters</td><td>#186004860</td><td>Guard sütunu, sütun ömrünü uzatmak için önerilir.</td></tr></tbody></table>

hassas, büyük Ölçekli kantitatif metabolomik için bir strateji

A Strategy for Sensitive, Large Scale Quantitative Metabolomics

Metabolit profil sağlık ve hastalık metabolizmanın çalışmasında değerli bir varlık olmuştur. Ancak, mevcut platformlar gibi emek yoğun numune hazırlama, düşük tespit limitleri, yavaş tarama hızları, her bir metaboliti için yoğun metot optimizasyonu ve olumlu hem ölçmek için yetersizlik ve tek deneylerde negatif yüklü iyonlar gibi farklı sınırlayıcı faktörler var. Bu nedenle, yeni bir metabolomiks protokol metabolomiks çalışmaları ilerlemek olabilir. Amid bazlı hidrofilik kromatografi kimyasal türetme olmaksızın polar metabolit analizi sağlar. Q-Exactive (QE-MS) kullanılarak yüksek çözünürlüklü MS, iyon optik geliştirilmiş tarama hızlarını (çözünürlükte 70,000 256 msn) artmış, ve pozitif / negatif anahtarlama yürüten yeteneğine sahiptir. Soğuk metanol ekstre strateji kullanarak, ve QE-MS ile bir amid sütun bağlanması aynı anda ek özellikler 168 hedef polar metabolitleri ve binlerce sağlam algılanmasını sağlar. Datbir işleme, yüksek verimli bir şekilde ticari olarak temin edilebilen yazılımı ile gerçekleştirilir, ve kütle spektrumları elde edilen bilinmeyen özellikleri veritabanlarında sorgulanabilir.

Metabolomiks verilerin doğruluğu son derece LC-QE-MS cihazı performansına bağlıdır. Gösterge iyi durumda olup olmadığını değerlendirmek için, ve Şekil 1 &#39;de gösterildiği gibi uygulanan yöntem uygun olup olmadığı, bilinen birkaç metabolit LC zirveleri, toplam iyon kromatografisiyle (TIC) elde edilir. Amino asitler de dahil olmak üzere Polar metabolitler, ara maddeleri, glikoliz , TCA ara maddeleri, nükleotitler, vitaminler, böylece ATP, NADP + ve mevcut LC koşullar altında amit sütun sütun...

Metabolit profil sağlık ve hastalık metabolizmanın çalışmasında değerli bir varlık olmuştur. Polarizasyon değiştirmesi ve hızlı görev döngüsü ile yüksek çözünürlüklü kütle spektrometresi birleştiğinde normal aşamalı sıvı kromatografisi kullanarak, yüksek hassasiyet, doğruluk ve çözünürlük ile biyolojik madde polar metabolik bileşimini analiz etmek için bir protokol açıklar.

Hassas, Büyük Ölçekli Kantitatif metabolomik için bir strateji

Metabolite profiling has been a valuable asset in the study of metabolism in health and disease. However, current platforms have different limiting ...

Bu prosedürün genel amacı, kültürlenmiş hücrelerde metabolik profillemeyi incelemektir. Bu, önce hücrelerden polar metabolitlerin çıkarılmasıyla gerçekleştirilir. İkinci adım, hücre ekstraktlarının suda yeniden sulandırılması ve numunelerin lc şişelerine aktarılmasıdır.Daha sonra numuneler, kalibre edilmiş olan lc QE MS cihazına enjekte edilir ve son adımda ham veriler bilgisayara kaydedilir. Metabolit tepe noktaları, ticari yazılım kullanılarak ham verilerden çıkarılır ve bilinmeyen tepe noktaları, yüksek çözünürlüklü bir kütle veritabanına karşı aranır. Bu usta, sars'taki nispi metabolit seviyeleri hakkında fikir verebilse de, serum veya dokular gibi diğer sistemlere de uygulanabilir.İlk olarak, 20 milimolar amonyum asetat olan 500 mililitre mobil faz A ve %3 aseto, nitril ve su içinde 15 milimolar amonyum hidroksit hazırlayın. Şişeyi gevşek bir şekilde kapattıktan sonra, çözeltiyi ısıtmadan 10 dakika boyunca bir su banyosunda sonikat yapın. Bunu takiben, mililitre başına bir miligramlık bir nihai konsantrasyon elde etmek için beş miligram sodyum floro asetat ve asidi beş mililitre suda çözün.Daha sonra, mililitre başına 10 mikrogramlık bir nihai konsantrasyon elde etmek için dia

a-strategy-for-sensitive-large-scale-quantitative-metabolomics

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Kütle spektrometresi (UPLC-MS) ile birleştirilmiş ultra performanslı sıvı kromatografisi ile hedeflenmemiş metabolit profili, metabolizmayı araştırmak için güçlü bir tekniktir.  Bu makale, numune organizasyonu ve hazırlama, veri toplama, veri analizi, kalite kontrol ve metabolit tanımlaması dahil olmak üzere serumun hedeflenmemiş metabolit profili için kullanılan tipik bir iş akışını özetlemektedir.

Ultra Performans Sıvı Kromatografisi-Kütle Spektrometresi (UPLC-MS) ile Serum Büyük Ölçekli Sigara hedefli metabolomik Profilleme

Hedefsiz metabolomik bir metabolik profili anlık üreten bir hipotez sağlar. Bu protokol, serum hücreler veya doku metabolitlerinin çıkarma ve analiz gösterecektir. Metabolitleri bir dizi sıvı-sıvı faz ekstraksiyon kullanılarak anket vardır, Mikrosirkülasyon Ultra Performanslı sıvı kromatografisi / diferansiyel analiz yazılımı için birleştiğinde yüksek çözünürlüklü kütle spektrometresi (UPLC-HRMS).

Ultra Performanslı Sıvı Kromatografi-Yüksek Çözünürlüklü Kütle Spektrometre (UPLC-HRMS) kullanarak Biyolojik Kaynaklar gelen hedefsiz Metabolomik

Metabolomiks deneylerde sonuçların güvenilirliği numune hazırlama etkinliği ve yeniden üretilebilirlik bağlıdır. Daha sonra bileşikler bin kadar analiz, ya da ilgi sadece bileşik sınıfları seçeneği ile biyolojik sıvılardan metabolitlerin çıkarma sağlayan bir sıkı ve derinlemesine bir yöntem tarif edilmektedir.

Derinlemesine ve Bilgilendirici metabolomic Analizi Çoklu Metaboliti&#39;nin Bileşik Sınıfları Kurtar Multi-step Hazırlama Tekniği

Memeli beyninin nörokimyası birçok nörolojik ve sistemik hastalıkta değişmiştir. Serebral metabolitlerin karakteristik profilleri, beyin dokusunun ham ekstraktlarına dayalı olarak verimli bir şekilde elde edilebilir. Bu amaçla, metabolit konsantrasyonlarının (metabolomikler) ayrıntılı kantitatif analizini sağlayan yüksek çözünürlüklü NMR spektroskopisi kullanılır.

Doku Esansı Yüksek Çözünürlük Nükleer Manyetik Rezonans Spektroskopisi ile Sıçan Beyin metabolomic Analizi

Protein-protein ve protein-metaboliti etkileşimler tüm hücresel fonksiyonları için önemlidir. Burada, biz seçim bir protein ile bu etkileşimlerin paralel analiz sağlayan bir protokol tanımlamak. Bizim iletişim kuralı bitki hücre kültürleri için optimize edildi ve benzeşme arıtma kütle spektrometresi tabanlı protein ve metaboliti algılama ile birleştirir.

2 in 1: tek adımlı benzeşme arıtma paralel analizi için Protein-Protein ve Protein-metaboliti kompleksleri

Bu iletişim kuralı tek bir üretim için doğal organik madde ve mikrobiyal proteomik farklı ekosistemleri içinde tam olarak eşleştirilmiş karakterizasyonu sonuçlanan tamamlayıcı analitik ve omics teknikleri açıklar. Bu yaklaşım sağlam karşılaştırmalar metabolik yollar ve sera gazı üretim tanımlamak ve çevresel değişimin yanıt tahmin için önemli dönüşümleri tanımlamak için izin verir.

Karmaşık doğal organik madde karışımları karakterize için tek işlem hacmi tamamlayıcı yüksek çözünürlüklü analitik teknikler

Saccharomyces cerevisiaemayasında suda çözünen metabolitlerin ana sınıflarının tanımlanması ve nicelliği için bir protokol sunuyoruz. Açıklanan yöntem çok yönlü, sağlam ve hassastır. Suda çözünür metabolitlerin yapısal izomerlerinin ve stereoisomerik formlarının birbirinden ayrılmasına izin verir.

Sıvı KromatografiSi Kullanan Saccharomyces Cerevisiae'nin Nicel Metabolomikleri Tandem Kütle Spektrometresi ile Birleştiğinde

Bu protokolde, birçok numunenin verimli ve hızlı bir şekilde numune hazırlamasını birleştiren optimize edilmiş bir iş akışı sunuyoruz. Ek olarak, metabolik GWAS çalışmalarının yüksek verimli değerlendirilmesi için analitik varyasyonları azaltmak için adım adım bir kılavuz sunuyoruz.

Büyük Ölçekli Multi-omik Genom Çapında İlişkilendirme Çalışmaları (Mo-GWAS): Numune Hazırlama ve Normalleştirme Kılavuzları

XY-Meta ve metaX'i birbirine entegre eden hedefsiz bir metabolomik iş akışı oluşturduk. Bu protokolde, açık erişim spektrumu referansından bir aldatmaca spektral kütüphanesi oluşturmak için XY-Meta'nın nasıl kullanılacağını gösterdik ve daha sonra FDR kontrolünü gerçekleştirdik ve metabolomik spektrumları tanımladıktan sonra metabolitleri ölçmek için metaX'i kullandık.

FDR Kontrol Tabanlı Hedefsiz Metabolom Üzerinde Entegre Bir Tanımlama ve Niceleme İş Akışı

Nükleer manyetik rezonans (NMR) spektroskopisi, çeşitli hastalıkları olan hastalarda metabolitlerdeki düzensizliği tanımlamak için kullanılır. Bu teknik, patofizyolojik içgörüleri çözerek düzensiz metabolitlerin nicelleştirilmesine izin verir. Burada, hastaların metabolik karakterizasyonu için NMR tabanlı yaklaşımın adım adım prosedürünü açıklıyoruz.

NMR Bazlı Metabolomikler Kullanılarak Kritik Hastalarda Düzensiz Metabolitlerin Tanımlanması ve Miktar Tayini

Bu protokol, uçucu tuz çözeltisi yıkama, hızlı sıvı nitrojen söndürme, dondurarak kurutma ve -8 °C'de depolamayı birleştirerek tek hücreli kütle spektrometrisi (SCMS) için hücre metabolitlerini korumayı amaçlamaktadır. Metabolit profillerini korumak için sıvı nitrojen söndürmenin gerekli olduğunu, metabolik değişiklikleri önlemek için uzun süreli soğuk depolamanın en aza indirilmesi gerektiğini göstermektedir.

Tek Hücreli Kütle Spektrometresi Metabolomik Çalışmaları için Numune Hazırlama: Kombine Hücre Yıkama, Söndürme, Kurutma ve Depolama

Öğrenin, kültür hücrelerinden polar metabolitlerin ekstraksiyonu ve LC-MS analiziyle hassas metabolomik profilleme yapmayı. Bu yöntem, metabolik değişiklikleri anlamak için güçlü bir araç sunar.

Hassas, Büyük Ölçekli Kantitatif metabolomik için bir strateji

Daha fazla video keşfet