Derinlemesine ve Bilgilendirici metabolomic Analizi Çoklu Metaboliti'nin Bileşik Sınıfları Kurtar Multi-step Hazırlama Tekniği

Bu prosedürün genel amacı, metabolomun daha iyi kapsanması için basitleştirilmiş numuneler elde etmek amacıyla karmaşık biyolojik sıvılardaki metabolitleri parçalamanın etkili bir yolunu göstermektir. Bu, numune hazırlama ve cihaz koşullarının tekrarlanabilirliğini izlemek için önce her bir numuneyi dahili standartlarla eşleştirerek gerçekleştirilir. İkinci adım, aksi takdirde sonraki kromatografi ve kütle spektrometresi ile analize müdahale edebilecek proteinleri çökeltmek için her numuneye buz gibi soğuk metanol eklemektir.

Daha sonra, sıvı sıvı ekstraksiyon aşaması hidrofilik metabolitleri hidrofobik metabolitlerden ayırır. Son adım, lipid metabolitlerini fosfolipidlere, yağ asitlerine ve nötr lipitlere daha fazla fraksiyonlamak için katı faz ekstraksiyonudur. Sonuç olarak, bu kombine çok aşamalı yöntem, etkili ayırma, mükemmel tekrarlanabilirlik ve plazma metabolomunun daha iyi kapsanmasını göstermek için kullanılır.

Bu tekniğin basit bir metanol ekstraksiyonu gibi mevcut yöntemlere göre en büyük avantajı, metabolomik profil oluşturma çalışmaları yapılırken veya lipitler özellikle ilgi çekici olduğunda önemli olan, özellikle lipitlerin gelişmiş metabolit kapsamını elde etmemizdir. Protein çökeltmeden önce, numuneleri hazırlayın, önce numuneleri oda sıcaklığına çözün. Ardından, numuneleri önceden hazırlanmış dahili standartlar ISTD ile eşleştirin.

Tüm standart konsantrasyonlar, kullanılan MS ve HPLC enstrümantasyonunun hassasiyetine bağlı olarak gerektiği gibi ayarlanmıştır. Analiz için, her numuneyi 10 mikrolitre ile doldurun. Hidrofilik ve hidrofobik standart çözeltilerin her biri, her numuneyi 10 mikrolitre bir x iki x veya dört x pozitif kontrol çözeltisi ile yükseltir.

Tüm numuneler dahili standartlar ve pozitif kontrol çözeltileri ile çivilendikten sonra, her numuneyi 10 saniye boyunca vorteksleyin. Protein çökeltmeye başlamak için, her numuneye 400 mikrolitre buz gibi soğuk metanol ekleyin. Tüp başına 10 saniye vorteks, sıfır santigrat derecede santrifüj, 18.000 kez 15 dakika boyunca.

G, Tüpün dibinde bir protein peleti oluşmalıdır. Santrifüjlemeden sonra, tüm süpernatanı yeni bir cam kültür tüpüne aktarın ve ardından nitrojen altında kurutun. Bu kurutulmuş kalıntı daha sonra sıvı sıvı ekstraksiyonuna tabi tutulacaktır.

Protein pelet fraksiyonunun analizi için, tüp başına 30 saniye boyunca beyaz veya kirli beyaz protein pelet girdabına bir mililitre metil turt böceği eteri veya MTBE ekleyin ve 18.000 kez 15 dakika boyunca sıfır santigrat derecede santrifüjleyin. G MTBE tabakasını yeni bir cam kültür tüpüne boşaltın. Peletin boyutu numuneler arasında değişeceğinden, tüm numuneler için tutarlı bir şekilde aynı miktarda MTBE'yi aspire etmek önemlidir.

Örneğin, en az miktarda süpernatan içeren numune için sadece 900 mikrolitre boşaltılabiliyorsa, 900 mikrolitreyi boşaltın. Tüm numuneler için, protein pelet girdabına 30 saniye boyunca bir mililitre daha MTBE ekleyin ve ardından sıfır santigrat derece veya 15 dakikada santrifüjleyin. Daha önce olduğu gibi 18.000 kez G ekleyin, MTBE tabakasını aspire edin ve daha önce hazırlanan cam kültür tüplerine ekleyin.

Numuneleri nitrojen akışıyla kurutun ve 200 mikrolitre bire bir kloroform metanol içinde yeniden süspanse edin. Her numuneyi bir santrifüj tüpüne aktarın ve 18.000 kez G'de 15 dakika boyunca sıfır santigrat derecede santrifüjleyin. Bu prosedüre başlamak için, daha önce hazırlanan kurutulmuş metanol kalıntısına üç mililitre MTBE eklemek için bir cam pipet kullanın ve 30 saniye boyunca girdap yapın.

Bundan sonra, her tüpe 750 mikrolitre su ekleyin ve 10 saniye boyunca girdap yapın. Oda sıcaklığında 10 dakika boyunca yaklaşık 200 kez G'de santrifüjleyin, iki farklı katman görünür Santrifüjlemeden sonra, alttaki sulu tabakayı pipetlemeden üst MTBE tabakasının 2,5 mililitresini dikkatlice aspire edin ve temiz bir cam kültürüne aktarın. İki. Her numunenin kalan su kısmına üç mililitre MTBE ekleyin.

Ve 10 dakika boyunca yaklaşık 200 kez G'de tüp santrifüj başına 10 saniye girdap. Oda sıcaklığında, üç mililitre MTBE'yi su almadan aspire edin ve önceki MTBE tüpü ile birleştirin. Bu MTBE fraksiyonu daha sonra katı faz ekstraksiyonuna tabi tutulacaktır.

Kalan sulu tabakayı azot altında kurutarak konsantre edin. Kalıntıyı 100 mikrolitrelik bir içinde yeniden süspanse edin ve her tüp girdabına 400 mikrolitre buz gibi soğuk metanol ekleyin ve ardından bir mikro santrifüj tüpüne aktarın. Kalan proteinin metanolde çökelmesine izin vermek için eksi 80 santigrat derecede 20 ila 30 dakika bırakın.

Daha sonra sıfır santigrat derecede 18.000 kez G'de 15 dakika santrifüjleyin, santrifüjlemeden sonra tüpün kenarı boyunca bir çökelti olmalıdır: çökeltiyi aspire etmeden 450 mikrolitre süpernatan aspire edin ve temiz bir mikro santrifüj tüpüne aktarın. Yaklaşık bir ila iki saat boyunca 45 santigrat dereceden fazla olmayan bir vakumlu santrifüj yoğunlaştırıcıda tamamen kurutun. Kurutulmuş süpernatanı 200 mikrolitre% 5 asetil nitril su ve girdapta yeniden süspanse edin.

Numuneleri kısaca otomobillere, numune alma cihazına, şişelere aktarın ve eksi 80 santigrat derecede dondurun. Katı faz ekstraksiyonu prosedürüne başlamak için, daha önce elde edilen MTBE fraksiyonunu iyi bir nitrojen akışı altında 35 ila 15 santigrat derecede 10 ila 15 dakika kurutun. MTBE fraksiyonları tamamen kuruduğunda, nitrojen akışını durdurun ve bir cam pipet girdabı kullanarak her numuneyi bir mililitre kloroform içinde hızlı bir şekilde yeniden süspanse edin.

Katı faz ekstraksiyonunu veya SPE kartuşunu 400 mikrolitre hekzan ile iki kez kısaca yıkayın ve şartlandırın. Atıkları atın ve yeni bir cam toplama tüpü ile değiştirin. Numuneyi SPE sütununa ekleyin, vakum uygulayın ve akışı toplayın.

Bir cam pipetle, SPE kolonuna bir mililitre iki ila bir kloroform izopropil alkol ekleyin ve akışı aynı cam tüplerde toplayın. Bu nötr fraksiyondur. Nötr fraksiyonu nitrojen altında 10 ila 15 dakika kurutun.

Bir cam pipetle oksidasyonu en aza indirmek için, SPE kolonuna etil eter içinde bir mililitre %5 asetik asit ekleyin ve akışı toplayın. Bu yağ asidi fraksiyonudur. Plastik uçlar kullanarak oksidasyonu en aza indirmek için yağ asidi fraksiyonunu nitrojen altında 10 ila 15 dakika kurutun.

SPE kartuşuna 800 mikrolitre metanol ekleyin ve akışı toplayın 15 mililitrelik plastik konik tüplerde, bu fosfolipid fraksiyonudur. Fosfolipid fraksiyonunu 1,5 mililitrelik santrifüj tüplerine aktarın, numuneleri yaklaşık bir ila 1,5 saat boyunca 45 santigrat derecede vakumlu bir santrifüj yoğunlaştırıcı ile kurutun. Son olarak, reus, numunelerin her birini 200 mikrolitre% 100 metanol transferindeki üç fraksiyondan otomobillere, numune alma cihazına, şişelere askıya alır ve negatif 80 santigrat derece dondurucuda saklar.

M-T-B-E-S-P-E yönteminin hem lipid standartlarının hem de endojen metabolitlerin ekstraksiyonunda etkinliği genel olarak gösterilmiştir, genel olarak daha iyi ekstraksiyon ve metabolitlerin kapsamı, metanol ekstraksiyonu veya MTBE ekstraksiyonu gibi diğer yöntemlere kıyasla elde edilmiştir, sadece MTBE ekstraksiyonu, özellik sayısı kalitatif ve kantitatif yazılım kullanılarak karşılaştırıldığında. LC MS analizini takiben, M-T-B-E-S-P-E fraksiyonlarının karşılaştırılması, SPE'yi takip eden üç fraksiyon arasında minimum örtüşme gösterdi, bu da hidrofobik metabolitleri daha güvenli metabolit tanımlaması için ilgili kimyasal sınıflarına ayırmadaki etkinliği göstermektedir. Ek olarak, M-T-B-E-S-P-E yöntemi kullanılarak iç standartların fraksiyonlarda geri kazanılması, NR 12, iç standartların kimyasal sınıflarıyla ilgili fraksiyonda ima edildiğini göstermiştir.

Verilerin kromatografik tekrarlanabilirliğini değerlendirmek için, numune hazırlığı üç ayrı havuzlanmış plazma QC numunesi üzerinde gerçekleştirildi ve her numune LCM MSS cihazına üç kopya halinde enjekte edildi. Tutarlı örtüşme, cihaz ve numune hazırlama tekrarlanabilirliğini gösterir. Yağ asidi fraksiyonunun negatif iyonizasyon modu için gözlenen kimyasal gürültüdeki artış, LCM S çözücülerindeki kirleticilerden kaynaklanıyor olabilir.

Bu nedenle, sadece dokuz dakikadan önce ima edilen metabolitler analiz edildi. Kloroform, MTBE, etil eter ve hatta bu yöntemde kullanılan daha yaygın reaktiflerle çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini ve bu işlemi gerçekleştirirken laboratuvar önlüğü, eldiven ve göz koruması giymek ve çeker ocakta numune hazırlama gibi önlemlerin her zaman alınması gerektiğini unutmayın.