2 in 1: tek adımlı benzeşme arıtma paralel analizi için Protein-Protein ve Protein-metaboliti kompleksleri

Bu yöntem sadece temel araştırmalardaki temel soruları ele almak için değil, aynı zamanda esansiyel proteinlerin yeni küçük moleküler ligandlarını tanımlayarak tıbbi, farmasötik ve biyoteknolojik alanlara da katkıda bulunmak için kullanılabilir. Bu tekniğin temel avantajı, yakın vivo koşullarda protein ve tercih edilen proteinin metabolik ortaklarının paralel analizini mümkün kılmasıdır. Bu yöntem, önceden seçilmiş ligandlarla sınırlı kalmadan etkileşen molekülleri avlamaya yardımcı olur.

Bu yöntem bitkiler için geliştirilmiş olsa da, HeLa hücreleri, E.coli ve S.Cerevisiae gibi diğer sistemler için de uygulanabilir. Başlamak için MSMO ortamını hazırlayın ve bir molar potasyum hidroksit ile pH'ı 5.7'ye ayarlayın. Ardından, çözeltiyi 121 santigrat derecede 15 dakika otoklavlayın.

Deneyin başlamasından hemen önce takviyeleri ortama ekleyin. Şimdi, 100 mililitrelik bir şişede 50 mililitre MSMO ortamında transgenik PSBL Arabidopsis thaliana hücre kültürünü büyütün. Ardından, şişeyi bir orbital platform çalkalayıcıya yerleştirin ve hücreleri ışıkta 20 santigrat derecede 130 rpm'de hafifçe çalkalayın.

Her yedi günde bir, hücreleri taze ortamda bir ila 10 çözelti içinde alt kültürleyin. Ardından, logaritmik büyüme aşamasında hücreleri hasat etmek için bir vakum pompasına bağlı, konik bir şişeye takılmış naylon ağlı bir cam huni kullanın. Daha sonra kurutulmuş hücreleri alüminyum folyoya sarın ve sıvı nitrojen içinde dondurun.

Önceden soğutulmuş bir mikser değirmeni kullanarak, 20 hertz'lik bir titreşim frekansına ayarlayın. Hasat edilmiş ve donmuş bitki hücresi materyalini iki dakika boyunca ince bir toz haline getirin. Daha sonra, çözülmesini önlemek için sıvı nitrojen, önceden soğutulmuş ekipman kullanarak numune başına üç gram öğütülmüş tozu alikotlayın.

Daha sonra, sıvı nitrojen önceden soğutulmuş bir harç kullanarak, öğütülmüş tozu çözülene kadar üç mililitre buz gibi soğuk lizis tamponu ile ezin. Çözülmüş numuneyi hemen iki mililitrelik mikro santrifüj tüpüne bölün. Hücresel kalıntıları gidermek için numuneleri 20, 817 g'da dört santigrat derecede 10 dakika santrifüjleyin.

Numune santrifüjlenirken, numune başına 100 mikrolitre IgG sefaroz boncuğu alın. Bir mililitre lizis tamponu ekleyin ve boncukları girdaplayarak yeniden askıya alın. 2.000 g'da üç saniye boyunca flaş döndürün ve lizis tamponunu atın.

Son olarak, boncukları 400 mikrolitre lizis tamponunda tekrar süspanse edin. Santrifüjlemeden sonra, berrak bitki lizatının üç mililitresini 15 mililitrelik bir konik santrifüj tüpüne aktarın. Önceden dengelenmiş boncukları bitki lizatına ekleyin ve karışımı dört santigrat derecede bir saat boyunca dönen bir tekerlek üzerinde inkübe edin.

Karışımı, vakum manifoldunun üstünde bulunan 35 mikrometre gözenek boyutunda bir filtreye sahip bir döndürme sütunu üzerindeki yem kilitli bir kapağa bağlı bir şırıngaya aktarın. Boncuklara zarar vermemek için vakum pompasını hafif bir basınçla açarak lizatı üniteden geçirin. Bağlanmamış lizat, manifoldun tabanında bulunan atık istasyonuna boşaltılır ve boncuklara bağlı protein kompleksleri filtre üzerinde kalır.

Şırınga hücre lizatından boşaltıldıktan sonra, boncukları yıkamak için 10 mililitre yıkama tamponu ekleyin. Ardından, ikinci yıkama adımını gerçekleştirmek için mililitre elüsyon tamponu ekleyin. Şimdi, şırıngayı çıkarın ve kilit kapağını cezbedin.

Kolondaki alt kapağı kapatın ve boncuklara 50 birim geliştirilmiş tütün aşındırma virüsü (proteaz) içeren 400 mikrolitre elüsyon tamponu ekleyin. Sütunu, 16 santigrat derecede 30 dakika boyunca 1.000 rpm'ye ayarlanmış bir masa çalkalayıcıya yerleştirin. Ardından, kolona 50 birim daha proteaz ekleyin ve karışımı önceki adımda olduğu gibi çalkalayıcı üzerinde inkübe edin.

Ardından, alt kapağı çıkarın ve sütunu iki mililitrelik bir mikro santrifüj tüpüne yerleştirin. Elüatı toplamak için bir dakika boyunca 20.817 g'da santrifüjleyin ve protein ve metabolit ekstraksiyonuna devam edin. Ekstraksiyona başlamak için, elüata bir mililitre üç ila bir MTBE metanol su çözücüsü ekleyin.

Numuneye karıştırmak için tüpü ters çevirin. Daha sonra, karışıma 0.4 mililitre bir ila üç metanol su çözeltisi ekleyin ve numuneyi karıştırmak için tüpü ters çevirin. Ardından, faz ayrılmasına izin vermek için numuneyi oda sıcaklığında iki dakika boyunca 20.817 g'da santrifüjleyin.

Bir mililitrelik manuel sıvı işleme pipeti kullanarak, lipit içeren üst fazı çıkarın. Ardından, 0,2 mililitre metanol ekleyin ve numuneyi karıştırmak için tüpü ters çevirin. Oda sıcaklığında iki dakika boyunca 20.817 g'da santrifüjleyin ve polar fazı metabolit ölçümleri için yeni bir tüpte toplayın.

Protein peletinin yerinden çıkmasını önlemek için tüpün dibinde yaklaşık 50 mikrolitre polar faz bırakın. Daha sonra, polar fazı içeren tüpü gece boyunca santrifüjlü bir buharlaştırıcıda kurutun. Aşırı kurumayı önlemek için protein pelet tüplerini 30 ila 60 dakika kurutun.

Tek aşamalı afinite saflaştırması kullanılarak, kütle spektrometresi ile birlikte transgenik arabidopsis thaliana hücre kültürlerinde protein-protein ve protein-metabolit etkileşimleri tanımlanmıştır. NDPK1 eksprese eden hücre kültürleri, boş vektör, NDPK2 ve NDPK3 örnekleriyle karşılaştırıldığında valin-lösin, izolösin glutamat, lösin izolösin ve izolösin fenilalaninde önemli zenginleştirme gösterir. Bilinen protein-protein ve protein-metabolit etkileşimlerini aramak için, NDPK1 ile birlikte elüte eden 13 protein ve dört dipeptit, dikiş veritabanına karşı queered edilir.

Ana ilişkiler, APX1 ortoloğu ve aldehit dehidrojenaz ailesi ile translasyon başlatma faktörü FBR12 arasında, translasyon başlatma faktörü iki alt birim alfa homoloğu ile görülür. Tanımlanan dipeptitler, rapor edilmiş protein ortakları göstermez. Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik uygun şekilde yapılırsa dört saat içinde yapılabilir.

Bu prosedürü denerken, deney boyunca numuneleri, ekipmanı ve reaktifleri soğuk tutmak önemlidir. Bu prosedürü takiben, moleküller arasındaki doğrudan etkileşimi veya ligandlarının protein aktivitesi üzerindeki çıkarımını belirlemek için mikroskop termoforezi veya aktivite tahlili gibi diğer yöntemler gerçekleştirilebilir. Bu videoyu izledikten sonra, güvenilir sonuçlar elde etmek ve tercih ettiğiniz proteinin ligandlarını belirlemek için tüm prosedür boyunca numunenin nasıl ele alınacağını iyi bir şekilde anlamalısınız.

Metanol ve MTBE çözeltisi ile çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini unutmayın. Bu işlem yapılırken uygun kişisel koruyucu ekipman giyilmeli ve çeker ocak altında çalışma gibi önlemler mutlaka alınmalıdır.