Name: 2 in 1: tek adımlı benzeşme arıtma paralel analizi için Protein-Protein ve Protein-metaboliti kompleksleri (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-06T13:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 23 s
Description: Keşfedin protein-protein ve protein-metabolit etkileşimlerinin paralel analizi için benzeşme arıtma yöntemini. Arabidopsis thaliana hücre kültürlerinde kitlesel spektrometri ile etkileşimleri belirleyin.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Lütfen proje, verimli tartışmalar ve büyük denetleme oynadığı için Prof. Dr. Lothar Willmitzer kabul etmek istiyoruz. Bize proteomik MS ölçümleri ile yardımcı olduğunuz için Dr. Daniel Veyel için minnettarız. Bayan Änne Michaelis kim bize çok değerli teknik yardım LC-MS ölçümleri ile sağladığı için teşekkür ederiz. Ayrıca, Dr Monika Kosmacz ve Dr. Ewelina Sokołowska Weronika Jasińska için onların yardım ve orijinal el yazması ve çalışma katılımı için teknik destek için teşekkür etmek istiyorum.

<ol><li>Li, X., Snyder, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolites+as+global+regulators%3A+A+new+view+of+protein+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Bioessays%22%5BJournal%5D)">Metabolites as global regulators: A new view of protein regulation.</a> Bioessays. 33 (7), 485-489 (2011).</li>
<li>Jacob, F., Monod, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+regulatory+mechanisms+in+the+synthesis+of+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Genetic regulatory mechanisms in the synthesis of proteins.</a> Journal of Molecular Biology. 3 (3), 318-356 (1961).</li>
<li>Schlattner, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual+Function+of+Mitochondrial+Nm23-H4+Protein+in+Phosphotransfer+and+Intermembrane+Transfer+a+cardiolipin-dependent+switch%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Dual Function of Mitochondrial Nm23-H4 Protein in Phosphotransfer and Intermembrane Transfer a cardiolipin-dependent switch.</a> Journal of Biological Chemistry. 288 (1), 111-121 (2013).</li>
<li>Ramírez, M. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GTP+binding+regulates+cellular+localization+of+Parkinson%27s+disease-associated+LRRK2%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Molecular+Genetics%22%5BJournal%5D)">GTP binding regulates cellular localization of Parkinson's disease-associated LRRK2.</a> Human Molecular Genetics. , ddx161(2017).</li>
<li>Jung, H. J., Kwon, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Target+deconvolution+of+bioactive+small+molecules%3A+the+heart+of+chemical+biology+and+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Pharmacal+Research%22%5BJournal%5D)">Target deconvolution of bioactive small molecules: the heart of chemical biology and drug discovery.</a> Archives of Pharmacal Research. 38 (9), 1627-1641 (2015).</li>
<li>Harding, M. W., Galat, A., Uehling, D. E., Schreiber, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+receptor+for+the+immunosuppressant+FK506+is+a+cis-trans+peptidyl-prolyl+isomerase%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A receptor for the immunosuppressant FK506 is a cis-trans peptidyl-prolyl isomerase.</a> Nature. 341 (6244), 758-760 (1989).</li>
<li>Lomenick, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Target+identification+using+drug+affinity+responsive+target+stability+%28DARTS%29%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Target identification using drug affinity responsive target stability (DARTS).</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (51), 21984-21989 (2009).</li>
<li>Manabe, Y., Mukai, M., Ito, S., Kato, N., Ueda, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FLAG+tagging+by+CuAAC+and+nanogram-scale+purification+of+the+target+protein+for+a+bioactive+metabolite+involved+in+circadian+rhythmic+leaf+movement+in+Leguminosae%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Communications%22%5BJournal%5D)">FLAG tagging by CuAAC and nanogram-scale purification of the target protein for a bioactive metabolite involved in circadian rhythmic leaf movement in Leguminosae.</a> Chemical Communications. 46 (3), 469-471 (2010).</li>
<li>Pantoliano, M. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-density+miniaturized+thermal+shift+assays+as+a+general+strategy+for+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomolecular+Screening%22%5BJournal%5D)">High-density miniaturized thermal shift assays as a general strategy for drug discovery.</a> Journal of Biomolecular Screening. 6 (6), 429-440 (2001).</li>
<li>Li, X., Snyder, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analyzing+In+vivo+Metabolite-Protein+Interactions+by+Large-Scale+Systematic+Analyses%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Analyzing In vivo Metabolite-Protein Interactions by Large-Scale Systematic Analyses.</a> Current Protocols in Chemical Biology. , 181-196 (2010).</li>
<li>Maeda, K., Poletto, M., Chiapparino, A., Gavin, A. -C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+generic+protocol+for+the+purification+and+characterization+of+water-soluble+complexes+of+affinity-tagged+proteins+and+lipids%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">A generic protocol for the purification and characterization of water-soluble complexes of affinity-tagged proteins and lipids.</a> Nature Protocols. 9 (9), 2256-2266 (2014).</li>
<li>Li, X., Gianoulis, T. A., Yip, K. Y., Gerstein, M., Snyder, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extensive+in+vivo+metabolite-protein+interactions+revealed+by+large-scale+systematic+analyses%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Extensive in vivo metabolite-protein interactions revealed by large-scale systematic analyses.</a> Cell. 143 (4), 639-650 (2010).</li>
<li>Veyel, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((System-wide+detection+of+protein-small+molecule+complexes+suggests+extensive+metabolite+regulation+in+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">System-wide detection of protein-small molecule complexes suggests extensive metabolite regulation in plants.</a> Scientific Reports. 7, (2017).</li>
<li>Luzarowski, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Affinity+purification+with+metabolomic+and+proteomic+analysis+unravels+diverse+roles+of+nucleoside+diphosphate+kinases%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Botany%22%5BJournal%5D)">Affinity purification with metabolomic and proteomic analysis unravels diverse roles of nucleoside diphosphate kinases.</a> Journal of Experimental Botany. , (2017).</li>
<li>Van Leene, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+interactomics+reveals+a+complex+core+cell+cycle+machinery+in+Arabidopsis+thaliana%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+systems+biology%22%5BJournal%5D)">Targeted interactomics reveals a complex core cell cycle machinery in Arabidopsis thaliana.</a> Molecular systems biology. 6 (1), 397(2010).</li>
<li>Giavalisco, P., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/21699588">Elemental formula annotation of polar and lipophilic metabolites using 13C, 15N and 34S isotope labelling, in combination with high-resolution mass spectrometry.</a> The Plant Journal. 68 (2), 364-376 (2011).</li>
<li>Van Leene, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+transcription+factor+complexes+from+Arabidopsis+cell+suspension+cultures+by+tandem+affinity+purification%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Transcription+Factors%3A+Methods+and+Protocols%22%5BJournal%5D)">Isolation of transcription factor complexes from Arabidopsis cell suspension cultures by tandem affinity purification.</a> Plant Transcription Factors: Methods and Protocols. , 195-218 (2011).</li>
<li>Van Leene, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+tandem+affinity+purification-based+technology+platform+to+study+the+cell+cycle+interactome+in+Arabidopsis+thaliana%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+%26+Cellular+Proteomics%22%5BJournal%5D)">A tandem affinity purification-based technology platform to study the cell cycle interactome in Arabidopsis thaliana.</a> Molecular & Cellular Proteomics. 6 (7), 1226-1238 (2007).</li>
<li>Olsen, J. V., Ong, S. -E., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trypsin+cleaves+exclusively+C-terminal+to+arginine+and+lysine+residues%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+%26+Cellular+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Trypsin cleaves exclusively C-terminal to arginine and lysine residues.</a> Molecular & Cellular Proteomics. 3 (6), 608-614 (2004).</li>
<li>Cox, J., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MaxQuant+enables+high+peptide+identification+rates%2C+individualized+p.p.b.-range+mass+accuracies+and+proteome-wide+protein+quantification%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">MaxQuant enables high peptide identification rates, individualized p.p.b.-range mass accuracies and proteome-wide protein quantification.</a> Nature Biotechnology. 26 (12), 1367-1372 (2008).</li>
<li>Cox, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Andromeda%3A+A+peptide+search+engine+integrated+into+the+MaxQuant+environment%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Proteome+Research%22%5BJournal%5D)">Andromeda: A peptide search engine integrated into the MaxQuant environment.</a> Journal of Proteome Research. 10 (4), 1794-1805 (2011).</li>
<li>Tyanova, S., Temu, T., Cox, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+MaxQuant+computational+platform+for+mass+spectrometry-based+shotgun+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">The MaxQuant computational platform for mass spectrometry-based shotgun proteomics.</a> Nature Protocols. 11 (12), 2301(2016).</li>
<li>Hooper, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SUBAcon%3A+a+consensus+algorithm+for+unifying+the+subcellular+localization+data+of+the+Arabidopsis+proteome%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">SUBAcon: a consensus algorithm for unifying the subcellular localization data of the Arabidopsis proteome.</a> Bioinformatics. 30 (23), 3356-3364 (2014).</li>
<li>Katajamaa, M., Orešič, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Data+processing+for+mass+spectrometry-based+metabolomics%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Chromatography+A%22%5BJournal%5D)">Data processing for mass spectrometry-based metabolomics.</a> Journal of Chromatography A. 1158 (1-2), 318-328 (2007).</li>
<li>Szklarczyk, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((STITCH+5%3A+augmenting+protein-chemical+interaction+networks+with+tissue+and+affinity+data%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">STITCH 5: augmenting protein-chemical interaction networks with tissue and affinity data.</a> Nucleic Acids Research. 1277, (2015).</li>
<li>Tanaka, K. -i, et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dipeptidyl+compounds+ameliorate+the+serum-deprivation-induced+reduction+in+cell+viability+via+the+neurotrophin-activating+effect+in+SH-SY5Y+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Neurological+Research%22%5BJournal%5D)">Dipeptidyl compounds ameliorate the serum-deprivation-induced reduction in cell viability via the neurotrophin-activating effect in SH-SY5Y cells.</a> Neurological Research. 34 (6), 619-622 (2012).</li>
<li>Smith, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((METLIN%3A+A+metabolite+mass+spectral+database%5BTitle%5D)+AND+%22Therapeutic+Drug+Monitoring%22%5BJournal%5D)">METLIN: A metabolite mass spectral database.</a> Therapeutic Drug Monitoring. 27, 747-751 (2005).</li>
<li>Bhattacharyya, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transient+protein-protein+interactions+perturb+E.+coli+metabolome+and+cause+gene+dosage+toxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Transient protein-protein interactions perturb E. coli metabolome and cause gene dosage toxicity.</a> Elife. 5, (2016).</li>
<li>Rigaut, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+generic+protein+purification+method+for+protein+complex+characterization+and+proteome+exploration%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">A generic protein purification method for protein complex characterization and proteome exploration.</a> Nature Biotechnology. 17 (10), 1030-1032 (1999).</li>
</ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

Sunulan Protokolü hedef protein s ve PM kompleksleri paralel kimliği sağlar. Sonuçlar için klonlama üzerinden deneme az 8-12 hafta olarak tamamlanabilir. Tam AP yaklaşık 4-6 h 12-24 örnekleri, bir dizi için bizim protokol orta üretilen iş analizi için uygun işleme alır.
İletişim kuralının rağmen varlık genel olarak basit bir dizi kritik adım vardır. (i) yeterli miktarda giriş protein ve benzeşme boncuk metaboliti algılama dinamik bir dizi ulaşmak çok önemlidir. Etkin hücre lizis bu nedenle yordamı çok önemli bir adımdır. Zavallı protein verimleri yetersiz pulverizasyon malzeme veya suboptimal lizis-tampon/malzeme oranı bir sonucu olabilir. (ii) kullanılan reaktifler MS-dostu olduğunu özen gösterilmelidir. MS algılama ile müdahale güçlü deterjanlar, gliserol veya aşırı miktarda tuz kaçınılmalıdır. (iii) özel boncuk adımları yıkama sırasında aşırı kuru olmamalı, ve bir vakum manifold kullanırken bu şekilde değil boncuk yok veya karmaşık istikrar etkilemek için bir yavaş akış hızı uygulamak önemlidir.
Bazı önemli olası değişiklikler için sunulan Protokolü vardır: (i) kurucu CaMV35S organizatörü yem protein miktarı en üst düzeye çıkarmak için kullanıyoruz. Overexpression, çok yararlı olsa da, hücre homeostazı28 üzerinde ciddi etkiler ve fizyolojik alakasız etkileşimleri oluşumuna yol. İfade tagged proteinlerin kullanarak yerel rehberleri ve nerede mümkün bir işlev kaybı arka planda gerçek biyolojik interactors almak için üstün olarak kabul edilir. Bitki hücre kültürleri içinde normalde proteinlerin için bitki arka plan ilgili interactors tanımlamak gerekli olabilir. (ii) zar proteinleri ile çalışırken, bir MS uyumlu deterjan ile takıma girecek lizis arabelleği gerektiriyor. (iii) ikinci bir benzeşme arıtma adım getirilmesi yanlış-mutlak gerçek pozitif oranı geliştirmek ve EV denetimleri29ihtiyacını ortadan kaldırmak. Bir roman tandem etiketi iki bağımsız proteaz-bölünme site ile zahmetli ve zaman alıcı tarafından Maeda vd. 201411, ekledi boyut-dışlama Kromatografi adım için cazip bir alternatif sunar.
AP'nin en ciddi sıkıntıları yanlış pozitif yüksek oranıdır. Nedenleri çoktur. Bünye overexpression zaten belirtilmiştir. Başka bir kaynak fizyolojik alakasız etkileşimlerin izole organelleri ile çalışma sürece bütün hücreli lysates karışımları proteinler ve metabolitleri üzerinden farklı hücre altı bölmeleri içeren hazırlıktır. Hücre altı yerelleştirme için doğru interactors süzmek için kullanılır. Yine de, yanlış mutlak çoğunluğu özel reçineler ve proteinler arasında belirsiz bağ neden. İkinci bir arıtma adım giriş yukarıda açıklandığı gibi sorunun en iyi çözümü sunmaktadır, ancak zaman ve işlem hacmi pahasına geliyor. Ayrıca, protokol uzatır gibi zayıf etkileşim kaybolabilir. AP'nin başka bir uyarı sağladığı hakkında kapsamlı bilgi hedef protein rağmen interactome, baited protein doğrudan ve dolaylı hedefler arasında differentiating mümkün olmadığı. Hedeflenen bimolecular yaklaşımlar etkileşimleri onaylamak için ihtiyaç vardır.
MS tabanlı metabolomics ile birleştiğinde AP protein-kompleksleri S. cerevisiae12. çalışırdım Benzer şekilde lipidler için polar ve yarı polar bileşikleri hücresel lysates izole protein kompleksleri bağlı kalmasını, bizim daha önceki gözlem13 ile birlikte bu iş için sunulan iletişim kuralı kavramsal zemin sağladı. Bizim iletişim kuralı tarafından üç benzersiz noktaları ile karakterize: (i) buna karşılık12Maya için iş, AP sadece hidrofobik ama aynı zamanda hidrofilik protein ligandlar almak için uygun olduğunu gösterir. (ii) üç tek ayıklama Protokolü tanıtarak, tek bir AP protein ve metaboliti interactors yem protein eğitim için kullanılabilir. (iii) Biz hücreleri bitki Protokolü uyarlanmış.
Gelecekteki çabalar bir roman tandem etiketi ile iki bağımsız proteaz-bölünme site oluşturmaya özen gösterin. Ayrıca bitki hormonları gibi düşük-bereket küçük moleküllere protokol uygunluğu keşfetmek istiyorsunuz.

Yöntem tanımlamak burada amaçları çevre -In-vivo hücresel lysate koşullar seçtiğiniz bir proteinin metaboliti ve protein ortak tanımlaması. Bu bugün karakterize daha çok daha fazla metabolitleri önemli düzenleyici fonksiyonu1var spekülasyonlar. Metabolitleri etkinlik, işlevsellik ve/veya onların reseptör proteinler2,3,4yerelleştirme değiştirme biyolojik anahtarları hareket edebilir. Son on yılda birkaç atılım Yöntem, kimlik PMI vivo içinde veya çevre -In-vivo koşullarda etkinleştirme Gelişmiş5olmuştur. Mevcut yaklaşımları iki gruba ayrılabilir. İlk grup roman protein ortakları tuzak için bilinen-metaboliti yem ile başlatmanız teknikleri kapsar. Benzeşme Kromatografi6, uyuşturucu benzeşme duyarlı hedef-istikrar tahlil7, kemoterapi-proteomik8ve termal Proteom9profil oluşturma yöntemleri içerir. İkinci grup küçük molekül ligandlar10,11tanımlamak için bilinen bir protein ile başlayan tek bir yöntemi içerir.
MS tabanlı lipidomics ile birleştiğinde AP protein-lipid kompleksleri Saccharomyces cerevisiae12. çözümlemeye Bir başlangıç noktası olarak maya suşları 21 enzimler içinde biyosentezi ergosterol dahil ifade yazarlar kullanılan ve 103 kinaz bir tandem-benzeşme saflaştırma (TAP) etiket erimiş. enzimlerin % 70 ve kinazlar % 20'si ışık karmaşık protein-lipid etkileşim ağı akıtan farklı hidrofobik ligandlar bağlamak için bulunamadı.
Daha önce benzer şekilde lipidler için polar ve yarı polar bileşikleri de hücresel lysates13izole protein kompleksleri bağlı kalmasını, göstermek olabilir. Bu bulgulara dayanarak, AP optimize etmek karar yöntemi daha önce bitki hücreleri ve hidrofilik bileşikler14için10,11 yayınlandı. Bu amaçla, biz dokunun vektörel çizimler başarıyla kullanılan bitki PPI çalışmaları15Van Leene ve ark. 2010, tarafından açıklanan kullanılır. Transgenik hatlarını edinmeniz gereken süreyi kısaltmak için Arabidopsis hücre kültürleri üzerinde karar verdi. Çalıştırmaya başladık bir tek adımlı metil tert-butil eter, tek bir protein (Pelet), lipitler (Organik faz) ve hidrofilik metabolitleri (sulu faz)16 karakterizasyonu izin (MTBE) / metanol/su ekstraksiyon yöntemi, benzeşme arıtma deney. EV kontrol şeritleri yanlış pozitif, Örneğin tek başına etiket bağlayıcı proteinler dışlamak için kullanılmaya başlanmıştır. Biz üç (beş) öğesini kavram kanıtı olarak nükleozit nükleotittir kinaz mevcut Arabidopsis genom (NDPK1-NDPK3). Diğer bulgular arasında biz NDPK1 glutatyon Sile etkileşim göstermek olabilir-transferaz ve glutatyon. Sonuç olarak NDPK1 glutathionylation14' e tabi olduğunu kanıtlayabilir.
Özetlemek gerekirse, sunulan Protokolü protein-protein ve protein-küçük-molekül etkileşim ağları karakterize için önemli bir araçtır ve varolan yöntemleri üzerinde büyük bir ilerleme oluşturmaktadır.

<table><tbody><tr><td>Minimal organik içeren Murashige ve Skoog Bazal Tuzları</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M6899</td><td></td></tr><tr><td>1-Naftilasetik asit</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N1641</td><td></td></tr><tr><td>Kinetin çözeltisi</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>K3253</td><td></td></tr><tr><td>Tris tabanı</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>10708976001</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Carl Roth</td><td>2189.1</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>3609</td><td></td></tr><tr><td>NaF</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S6776</td><td></td></tr><tr><td>DTT</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D0632</td><td></td></tr><tr><td>PMSF</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7626</td><td></td></tr><tr><td>E-64 proteaz inhibitörü</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E3132</td><td></td></tr><tr><td>Proteaz İnhibitörü Kokteyl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9599</td><td></td></tr><tr><td>Na3VO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S6508</td><td></td></tr><tr><td>AcTEV</td><td>Proteaz Thermo Fischer Bilimsel</td><td>12575015</td><td></td></tr><tr><td>Rotiforese&nbsp; Jel 30 (37,5:1)</td><td>Carl Roth</td><td>3029.2</td><td></td></tr><tr><td>TEMED</td><td>Carl Roth</td><td>2367.3</td><td></td></tr><tr><td>PageRuler Önceden Boyanmış Protein Merdiveni</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>26616</td><td></td></tr><tr><td>SBP Etiket Antikoru (SB19-C4)</td><td>Santa Cruz Biyoteknoloji</td><td>sc-101595</td><td></td></tr><tr><td>Keçi anti-fare IgG-HRP</td><td>Santa Cruz Biyoteknoloji</td><td>sc-2005</td><td></td></tr><tr><td>Bradford Reaktifi</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B6916</td><td></td></tr><tr><td>Tripsin / Lys-C Karışımı, Kütle Spec Sınıfı</td><td>Promega &nbsp;</td><td>V5071</td><td></td></tr><tr><td>Üre</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>U5128</td><td></td></tr><tr><td>Tiyoüre</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8656</td><td></td></tr><tr><td>Amonyum bikarbonat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>9830</td><td></td></tr><tr><td>İyodoasetamid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I1149</td><td></td></tr><tr><td>MTBE&nbsp;</td><td>Metanol</td><td>138906</td><td></td></tr><tr><td>Biyoçözün&nbsp;</td><td>Biosolve</td><td>136806</td><td></td></tr><tr><td>Su</td><td>Biosolve</td><td>232106</td><td></td></tr><tr><td>Asetonitril</td><td>Biosolve</td><td>12006</td><td></td></tr><tr><td>Trifloroasetik asit&nbsp;</td><td>Biosolve</td><td>202341</td><td></td></tr><tr><td>Formik asit&nbsp;</td><td>Biosolve</td><td>69141</td><td></td></tr><tr><td>Unimax 2010 Platform Çalkalayıcı</td><td>Heidolph</td><td>5421002000</td><td></td></tr><tr><td>Naylon Hasır (Tel çapı 34 ve mikro; M, kalınlık 55 ve mikro; M, açık alan %14)</td><td>Prosepa</td><td>Özel sipariş</td><td></td></tr><tr><td>Cam Hunisi, 47 mm, 300 ml</td><td>Restek</td><td>KT953751-0000</td><td></td></tr><tr><td>Filtre Şişesi Üstü 500 mL 0,2 & mikro; M Pes St</td><td>VWR International GmbH</td><td>514-0340</td><td></td></tr><tr><td>Mikser Değirmeni MM 400</td><td>Retsch GmbH</td><td>207450001</td><td></td></tr><tr><td>IgG Sepharose 6 Hızlı Akış</td><td>GE Healthcare Yaşam Bilimleri</td><td>17-0969-02</td><td></td></tr><tr><td>Filtresiz 2 farklı vidalı kapaklı Mobicol ""Classic""</td><td>MoBiTec GmbH</td><td>M1002</td><td></td></tr><tr><td>Filtre (küçük) 35 ve mikro; Mobicol M 1002, M1003, M1050 & için M gözenek boyutu M1053</td><td>MoBiTec GmbH</td><td>M513515</td><td></td></tr><tr><td>Değişken Hızlı Boru Döndürücü SB 3</td><td>Carl Roth</td><td>Y550.1</td><td></td></tr><tr><td>Döndürücüler için döner çanaklar SB 3</td><td>Carl Roth</td><td>Y555.1</td><td></td></tr><tr><td>Resprep 24 Portlu SPE Manifoldları</td><td>Restek&nbsp;</td><td>26080</td><td></td></tr><tr><td>Finisterre C18/%17 SPE Kolonları 100mg / 1ml</td><td>Teknokroma</td><td>TR-F034000</td><td></td></tr><tr><td>Otomatik Numune Alma Cihazı&nbsp; Şişeler</td><td>Klaus Trott Chromatographie-Zubeh&ouml; r</td><td>40 11 01 740</td><td></td></tr><tr><td>Beğeni PepMap 100 C18 LC Kolon</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>164534</td><td></td></tr><tr><td>EASY-nLC 1000 Sıvı Kromatograf</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>LC120</td><td></td></tr><tr><td>Q Exactive Plus Hibrit Dört Kutuplu Orbitrap Kütle Spektrometresi</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>IQLAAEGAAPFALGMBDK</td><td></td></tr><tr><td>Akreditasyon UPLC sistemi&nbsp;</td><td>Sular&nbsp;</td><td>Özel sipariş</td><td></td></tr><tr><td>ACQUITY UPLC HSS C18 Sütun, 100A, 1.8 ve mikro; M, 2.1 mM X 100 mM, 1/pkg</td><td>Sular&nbsp;</td><td></td><td></td>186003533</tr><tr><td>Sulu temizleme solüsyonları için yüksek güçlü ultrasonik temizleme banyoları</td><td>Bandelin</td><td>RK 31</td><td></td></tr><tr><td>Genedata Dışavurumcu</td><td>Genedata</td><td>NaN</td><td></td></tr><tr><td>Xcalibur Yazılımı</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>NaN</td><td></td></tr><tr><td>MaxQuant</td><td>NaN</td><td>NaN</td><td></td></tr></tbody></table>

2 in 1: tek adımlı benzeşme arıtma paralel analizi için protein-protein ve protein-metaboliti kompleksleri

2 in 1: One-step Affinity Purification for the Parallel Analysis of Protein-Protein and Protein-Metabolite Complexes

Hücresel proteinler, metabolitleri ve nükleik asitler gibi biyolojik moleküller arasındaki etkileşimler tarafından düzenlenmektedir. Protein-protein etkileşimleri (PPI) soruşturma yok yenilik olmakla birlikte, endojen protein-metaboliti etkileşimleri (PMI) karakterize amaçlayan deneysel yaklaşımlar oldukça yeni bir gelişme oluşturmaktadır. Burada, biz aynı anda karakterizasyonu PPI ve PMI yem olarak anılacaktır seçtikleri bir proteinin sağlayan bir protokol mevcut. Arabidopsis hücre kültürleri ve benzeşme arıtma (AP) birleştirir bizim iletişim kuralı (MS) kütle spektrometresi ile optimize edildi-protein ve metaboliti algılama dayalı. Kısacası, bir benzeşme etiketi için erimiş yem protein ifade transgenik Arabidopsis satırları ilk yerel hücresel özü elde etmek için lysed. Anti-etiket antikorlar yem protein protein ve metaboliti ortakları çekmek için kullanılır. Benzeşme saf kompleksleri bir tek adımlı metil tertkullanarak ayıklanır-bütil eter (MTBE) / metanol/su yöntemi. Kutup veya hidrofobik faz metabolitleri ayrı iken, proteinler Pelet içinde bulunabilir. Metabolitleri ve proteinler ultra performanslı sıvı kromatografi-kütle spektrometresi tarafından (UPLC-MS veya UPLC-MS/MS) analiz edilir. Boş-vektör (EV) kontrol şeritleri yanlış pozitif dışlamak için kullanılır. Bizim Protokolü en büyük avantajı fizyolojik şartlarda (hücresel lysate) paralel bir hedef protein protein ve metaboliti ortakların kimlik sağlar olduğunu. Sunulan yöntemi basit, hızlı ve kolayca bitki hücre kültürleri dışındaki biyolojik sistemleri için adapte edilebilir.

Orijinal çalışmada, üç A. thaliana NDPK genler PSB-L hücre süspansiyon kültürlerinde bünye 35S organizatörü14 (Şekil 1) kontrol altına overexpressed. Tandem benzeşme etiket carboxy - veya amino-terminal bir ucunu bir yem protein için erimiş. Benzeşme saf kompleksleri MTBE/metanol/su ekstraksiyon16için tabi tutuldu. Proteinler ilgi çekti ve küçük moleküller MS (Tablolar S2 ve S3) kullanarak tespit edilmiştir.
Yanlış pozitif olarak düzeltmek için küçük molekül kirletici kimyasallar ve laboratuvar sarf malzemeleri dışlamak için boş örnekleri kullanılmıştır. Ayrıca, metabolitleri ve ya bir benzeşme etiketi bağlamak veya yalnız reçine proteinler EV kontrol şeritleri kullanarak sorumluydu. Gerçek pozitif durumlar, iki kuyruklu sigara eşleştirilmiş öğrenci t-testi ve Benjamini &amp; Hochberg yanlış bulma oranı almak için düzeltme metabolitleri (Tablo S4) ve önemli ölçüde NDPKs AP zenginleştirilmiş proteinler (Tablo S5) tanımlamak için uygulanan (N - ve C-ölümcül NDPKs öğesini) deneyler ile karşılaştırıldığında EV kontrol şeritleri (FDR &lt; 0,1). Önceki çalışma, biz devamsızlık/varlığı ölçüt protein ve küçük molekül interactors betimlemek için kullandığını unutmayın.
Temsilcisi sonuçları için NDPK1, dipeptides, bizim grupta okudu küçük molekül düzenleyiciler roman bir sınıfın metaboliti veri odaklanmak süre verilir. Proteomik çözümleme NDPK1 26 sözde protein ortaklarının ortaya. Co NDPK1 aynı hücre altı yerde lokalize proteinler için daha fazla filtreleme tarafından (sitozol), listenin 13 sözde protein interactors aşağı daralmış. Glutatyon Sarasında saptanan proteinler vardı-transferaz, iki uzama başlama faktörleri, tübülin ve aconitate hidrataz. Metabolomic çözümleme ortaya dört dipeptides Val-Leu, Ile-Glu, Leyi-Ile ve Ile-bu özellikle birlikte eluted Phe NDPK1 ile (Şekil 2). Tüm dört dipeptides onların N-terminus paylaşılan bağlama özgüllük düşündüren, hidrofobik bir kalıntı paylaşmak unutmayın.
Bakmak için bilinen protein-protein ve protein-metaboliti kompleksleri için biz sorgulanan 13 proteinler ve dikiş veritabanı25 (Şekil 3) karşı dört dipeptides tespit edilmiştir. Birkaç gözlemler yapılmış olabilir: (i) interactors hiçbiri daha önce NDPK1 için bildirildi. (II) APX1 ortholog aldehid dehidrojenaz aile üyesi ALDH7B4, çeviri başlatma faktörü FBR12 faktörle gen AT2G40290 tarafından kodlanmış başka bir çeviri başlatma sırasında etkileşimli olarak bildirildi. (iii) tanımlanan dipeptides Hayır protein ortakları bildirdi. Ortak eluted dipeptides daha önce herhangi bir erişim tarihi bitki proteini ilişkili rapor değil. Ancak, diğer canlılar arasında önemli rol oynarlar: Leu-Ile, Örneğin, bir insan hücre satırı26' neurotrophin harekete geçirmek bir etkisi vardır. Not deneme sistemi tam topolojisi tanımlama izin vermez. Örneğin, bir dipeptid NDPK1 ile doğrudan etkileşim olabilir ama herhangi bir ortak saf protein de ilgili olabilir.
Birlikte ele alındığında, bizim sonuçları AP kütle spektrometresi ile birlikte istihdam kurulan yordamı protein-protein ve protein-küçük-molekül interactors tanımlaması kolaylaştırır ve yardımcı olur hakkında geniş bilgi oluşturmak göster hedef protein interactome.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57720/57720fig1.jpg"> Şekil 1. AP-MS iş akışı şeması. (A) bir yerel çözünür kesir bitki hücre kültürü üzerinden hazırlanması. (B) AP yordam sonraki adımda. Örnek sütuna yükledikten sonra bir dokunun etiketi erimiş faiz (POI) protein üzerinde özel boncuk immobilize IgG antikor bağlar. Çamaşır sütun ilişkisiz proteinler ve metabolitleri kaldırılmasını kolaylaştırır. AcTEV bölünme gerçekleştirdikten sonra POI protein-metaboliti kompleksleri eluted. Kompleksleri (C) ayrılması protein ve metaboliti kesir yarı kantitatif MS Analizi tarafından takip içine. Bu rakam bir parçası tekrar Luzarowski ve ark. 201714oluşturulur. <a href="/files/ftp_upload/57720/57720fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57720/57720fig2.jpg"> Şekil 2. Özellikle NDPK1 ile birlikte eluting dipeptides. Dört dipeptides Val-Leyi (A), Ile-Glu (B), Leyi-Ile (C)ve Ile-Phe (D) AP deneyde ölçülen ortalama yoğunluklarda çizildi. Tüm dört dipeptides NDPK1 örnekleri EV denetimine göre önemli zenginleştirme göstermek (yıldız işareti temsil FDR &lt; 0,1). Hata çubukları temsil eden 6 ölçümler için standart hata (N-3 çoğaltır ve 3 / C-ölümcül proteinler öğesini). <a href="/files/ftp_upload/57720/57720fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57720/57720fig3.jpg"> Şekil 3. Tüm molekülleri NDPK1 ile birlikte eluting etkileşim ağı yalnızca önceki göz önünde bulundurarak dikiş veritabanında sorgulanan deneysel ve veritabanı delilleri (güven &gt; 0,2). Daha yüksek güven daha yüksek etkileşim olasılığını gösterir ve yatırılan veriler temel alınarak hesaplanır. <a href="/files/ftp_upload/57720/57720fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
Tablo S1. MaxQuant tablo "parameters.txt" çıktı. Tablo tanımı ve miktar gibi kullanılan veritabanları hakkında bilgi için eşik değerlerini içerir. <a href="/files/ftp_upload/57720/Table_S1.xlsx">Bu dosyayı indirmek için buraya tıklayınız.</a>
Tablo S2. Bilgi MaxQuant dan çıkış tablo "proteinGroups.txt". Tablo tüm saptanan protein grupları, yoğunluklarda ve benzersiz peptidler ve puan sayısı gibi ek bilgileri listesini içerir. <a href="/files/ftp_upload/57720/Table_S2.xlsx">Bu dosyayı indirmek için buraya tıklayınız.</a>
Tablo S3. Kutup metabolitleri analizini içeren çıkış dosyası. Tablo tüm tanımlanan kitle özellikleri belirli m/z, RT ve yoğunluğu ile karakterize bir listesini içerir. <a href="/files/ftp_upload/57720/Table_S3.xlsx">Bu dosyayı indirmek için buraya tıklayınız.</a>
Tablo S4. Dipeptides hangi NDPK1, NDPK2 veya NDPK3 yem olarak kullanılan AP örnekleri buldum. Dipeptides boş örnekleri mevcut listeden dışlanan. Her NDPK için iki bağımsız çizgi (ya da N - veya C-terminus öğesini) nüsha işletilmiştir. Öğrenci t-test ve daha fazla pdüzeltilmesi-Benjamini kullanarak değer &amp; Hochberg yöntemi NDPKs önemli ölçüde zenginleştirilmiş interactor ortakları belirlemek için kullanılmıştır (FDR &lt; 0,1). Verilen ΔRT başvuru bileşikleri ve Δppm kitle Metlin27' verilen monoisotopic ile ilgili olarak ilgili olarak hesaplanır. <a href="/files/ftp_upload/57720/Table_S4.xlsx">Bu dosyayı indirmek için buraya tıklayınız.</a>
Tablo S5. NDPK1 ile birlikte saf protein. Her NDPK için iki bağımsız çizgi (ya da N - veya C-terminus öğesini) nüsha çalıştırmak. Öğrenci t-test ve daha fazla pdüzeltilmesi-Benjamini kullanarak değer &amp; Hochberg yöntemi NDPKs önemli ölçüde zenginleştirilmiş interactor ortakları belirlemek için kullanılmıştır (FDR &lt; 0,1). <a href="/files/ftp_upload/57720/Table_S5.xlsx">Bu dosyayı indirmek için buraya tıklayınız.</a>

Protein-protein ve protein-metaboliti etkileşimler tüm hücresel fonksiyonları için önemlidir. Burada, biz seçim bir protein ile bu etkileşimlerin paralel analiz sağlayan bir protokol tanımlamak. Bizim iletişim kuralı bitki hücre kültürleri için optimize edildi ve benzeşme arıtma kütle spektrometresi tabanlı protein ve metaboliti algılama ile birleştirir.

2 in 1: tek adımlı benzeşme arıtma paralel analizi için Protein-Protein ve Protein-metaboliti kompleksleri

Cellular processes are regulated by interactions between biological molecules such as proteins, metabolites, and nucleic acids. While the investigation of ...

Bu yöntem sadece temel araştırmalardaki temel soruları ele almak için değil, aynı zamanda esansiyel proteinlerin yeni küçük moleküler ligandlarını tanımlayarak tıbbi, farmasötik ve biyoteknolojik alanlara da katkıda bulunmak için kullanılabilir. Bu tekniğin temel avantajı, yakın vivo koşullarda protein ve tercih edilen proteinin metabolik ortaklarının paralel analizini mümkün kılmasıdır. Bu yöntem, önceden seçilmiş ligandlarla sınırlı kalmadan etkileşen molekülleri avlamaya yardımcı olur.Bu yöntem bitkiler için geliştirilmiş olsa da, HeLa hücreleri, E.coli ve S.Cerevisiae gibi diğer sistemler için de uygulanabilir. Başlamak için MSMO ortamını hazırlayın ve bir molar potasyum hidroksit ile pH'ı 5.7'ye ayarlayın. Ardından, çözeltiyi 121 santigrat derecede 15 dakika otoklavlayın.Deneyin başlamasından hemen önce takviyeleri ortama ekleyin. Şimdi, 100 mililitrelik bir şişede 50 mililitre MSMO ortamında transgenik PSBL Arabidopsis thaliana hücre kültürünü büyütün. Ardından, şişeyi bir orbital platform çalkalayıcıya yerleştirin ve hücreleri ışıkta 20 santigrat derecede 130 rpm'de hafifçe çalkalayın.Her yedi günde bir, hücreleri taze ortamda bir ila 10 çözelti içinde alt kültürleyin. Ardından, logaritmik büyüme aşamasında hücreleri hasat etmek için bir vakum pompasına bağlı, konik bir şişeye takılmış naylon ağlı bir cam huni kullanın. Daha sonra kurutulmuş hücreleri alüminyum folyoya sarın ve sıvı nitrojen içinde dondurun.Önceden soğutulmuş bir mikser değirmeni kullanarak, 20 hertz'lik bir titreşim frekansına ayarlayın. Hasat edilmiş ve donmuş bitki hücresi materyalini iki dakika boyunca ince bir toz haline getirin. Daha sonra, çözülmesini önlemek için sıvı nitrojen, önceden soğutulmuş ekipman kullanarak numune başına üç gram öğütülmüş tozu alikotlayın.Daha sonra, sıvı nitrojen önceden soğutulmuş bir harç kullanarak, öğütülmüş tozu çözülene kadar üç mililitre buz gibi soğuk lizis tamponu ile ezin. Çözülmüş numuneyi hemen iki mililitrelik mikro santrifüj tüpüne bölün. Hücresel kalıntıları gidermek için numuneleri 20, 817 g'da dört santigrat derecede 10 dakika santrifüjleyin.Numune santrifüjlenirken, numune başına 100 mikrolitre IgG sefaroz boncuğu alın. Bir mililitre lizis tamponu ekleyin ve boncukları girdaplayarak yeniden askıya alın. 2.000 g'da üç saniye boyunca flaş döndürün ve lizis tamponunu atın.Son olarak, boncukları 400 mikrolitre lizis tamponunda tekrar süspanse edin. Santrifüjlemeden sonra, berrak bitki lizatının üç mililitresini 15 mililitrelik bir konik santrifüj tüpüne aktarın. Önceden dengelenmiş boncukları bitki lizatına ekleyin ve karışımı dört santigrat derecede bir saat boyunca dönen bir tekerlek üzerinde inkübe edin.Karışımı, vakum manifoldunun üstünde bulunan 35 mikrometre gözenek boyutunda bir filtreye sahip bir döndürme sütunu üzerindeki yem kilitli bir kapağa bağlı bir şırıngaya aktarın. Boncuklara zarar vermemek için vakum pompasını hafif bir basınçla açarak lizatı üniteden geçirin. Bağlanmamış lizat, manifoldun tabanında bulunan atık istasyonuna boşaltılır ve boncuklara bağlı protein kompleksleri filtre üzerinde kalır.Şırınga hücre lizatından boşaltıldıktan sonra, boncukları yıkamak için 10 mililitre yıkama tamponu ekleyin. Ardından, ikinci yıkama adımını gerçekleştirmek için mililitre elüsyon tamponu ekleyin. Şimdi, şırıngayı çıkarın ve kilit kapağını cezbedin.Kolondaki alt kapağı kapatın ve boncuklara 50 birim geliştirilmiş tütün aşındırma virüsü (proteaz) içeren 400 mikrolitre elüsyon tamponu ekleyin. Sütunu, 16 santigrat derecede 30 dakika boyunca 1.000 rpm'ye ayarlanmış bir masa çalkalayıcıya yerleştirin. Ardından, kolona 50 birim daha proteaz ekleyin ve karışımı önceki adımda olduğu gibi çalkalayıcı üzerinde inkübe edin.Ardından, alt kapağı çıkarın ve sütunu iki mililitrelik bir mikro santrifüj tüpüne yerleştirin. Elüatı toplamak için bir dakika boyunca 20.817 g'da santrifüjleyin ve protein ve metabolit ekstraksiyonuna devam edin. Ekstraksiyona başlamak için, elüata bir mililitre üç ila bir MTBE metanol su çözücüsü ekleyin.Numuneye karıştırmak için tüpü ters çevirin. Daha sonra, karışıma 0.4 mililitre bir ila üç metanol su çözeltisi ekleyin ve numuneyi karıştırmak için tüpü ters çevirin. Ardından, faz ayrılmasına izin vermek için numuneyi oda sıcaklığında iki dakika boyunca 20.817 g'da santrifüjleyin.Bir mililitrelik manuel sıvı işleme pipeti kullanarak, lipit içeren üst fazı çıkarın. Ardından, 0,2 mililitre metanol ekleyin ve numuneyi karıştırmak için tüpü ters çevirin. Oda sıcaklığında iki dakika boyunca 20.817 g'da santrifüjleyin ve polar fazı metabolit ölçümleri için yeni bir tüpte toplayın.Protein peletinin yerinden çıkmasını önlemek için tüpün dibinde yaklaşık 50 mikrolitre polar faz bırakın. Daha sonra, polar fazı içeren tüpü gece boyunca santrifüjlü bir buharlaştırıcıda kurutun. Aşırı kurumayı önlemek için protein pelet tüplerini 30 ila 60 dakika kurutun.Tek aşamalı afinite saflaştırması kullanılarak, kütle spektrometresi ile birlikte transgenik arabidopsis thaliana hücre kültürlerinde protein-protein ve protein-metabolit etkileşimleri tanımlanmıştır. NDPK1 eksprese eden hücre kültürleri, boş vektör, NDPK2 ve NDPK3 örnekleriyle karşılaştırıldığında valin-lösin, izolösin glutamat, lösin izolösin ve izolösin fenilalaninde önemli zenginleştirme gösterir. Bilinen protein-protein ve protein-metabolit etkileşimlerini aramak için, NDPK1 ile birlikte elüte eden 13 protein ve dört dipeptit, dikiş veritabanına karşı queered edilir.Ana ilişkiler, APX1 ortoloğu ve aldehit dehidrojenaz ailesi ile translasyon başlatma faktörü FBR12 arasında, translasyon başlatma faktörü iki alt birim alfa homoloğu ile görülür. Tanımlanan dipeptitler, rapor edilmiş protein ortakları göstermez. Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik uygun şekilde yapılırsa dört saat içinde yapılabilir.Bu prosedürü denerken, deney boyunca numuneleri, ekipmanı ve reaktifleri soğuk tutmak önemlidir. Bu prosedürü takiben, moleküller arasındaki doğrudan etkileşimi veya ligandlarının protein aktivitesi üzerindeki çıkarımını belirlemek için mikroskop termoforezi veya aktivite tahlili gibi diğer yöntemler gerçekleştirilebilir. Bu videoyu izledikten sonra, güvenilir sonuçlar elde etmek ve tercih ettiğiniz proteinin ligandlarını belirlemek için tüm prosedür boyunca numunenin nasıl ele alınacağını iyi bir şekilde anlamalısınız.Metanol ve MTBE çözeltisi ile çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini unutmayın. Bu işlem yapılırken uygun kişisel koruyucu ekipman giyilmeli ve çeker ocak altında çalışma gibi önlemler mutlaka alınmalıdır.

2-1-one-step-affinity-purification-for-parallel-analysis-protein

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biyokimya

Kütle spektrometrisi (antipersonel mayınları) ile kombinasyon halinde etiketli proteinlerin saflaştırılması Affinity protein etkileşimi ağların sistematik eşleme için ve biyolojik süreçlerin mekanistik temeli araştırmak için güçlü bir yöntem. Burada, bakteri için geliştirilmiş optimize edilmiş sıralı peptid afinite (SPA) antipersonel mayınları prosedürü...

Protein Kompleksi belirlenmesi<em&gt; Escherichia coli</em&gt; Tandem Kütle Spektrometresi ile Kombine Sıralı Peptid Affinity Arıtma kullanarak

Bu video, protein-protein etkileşimini incelemek için ökaryotik hücrelerden protein komplekslerini saflaştırmaya yönelik bir teknik olan tandem afinite saflaştırmasını göstermektedir. Kompleks, farklı epitop etiketleriyle etiketlenmiş iki protein içerir. Kompleksin, iki farklı etiket için bir afiniteye sahip iki reçine kullanılarak sıralı bir şekilde saflaştırılması üzerine, elütede her iki proteinin varlığı, ikisi arasındaki etkileşimi doğrular.

Protein-Protein Etkileşimlerini İncelemek için Tandem Afinite Saflaştırma Testi

Tarif edilen karşılaştırmalı nicel proteomik yaklaşım, farklı koşullar altında multiprotein komplekslerinin bileşimi içine bir bakış açısı elde etmeyi amaçlamaktadır ve genetik olarak farklı suşların karşılaştırılması ile gösterilmiştir. Kantitatif analiz için bir sükroz yoğunluk gradyanı farklı fraksiyonların eşit hacimleri kütle spektrometresi ile analiz edilir ve karıştırılır.

Multiprotein kompleksleri Karşılaştırmalı Analizi için Yeni Bir Yaklaşım dayanarak<sup&gt; 15</sup&gt; N Metabolik Etiketleme ve Kantitatif Kütle Spektrometre

Metabolomiks deneylerde sonuçların güvenilirliği numune hazırlama etkinliği ve yeniden üretilebilirlik bağlıdır. Daha sonra bileşikler bin kadar analiz, ya da ilgi sadece bileşik sınıfları seçeneği ile biyolojik sıvılardan metabolitlerin çıkarma sağlayan bir sıkı ve derinlemesine bir yöntem tarif edilmektedir.

Derinlemesine ve Bilgilendirici metabolomic Analizi Çoklu Metaboliti&#39;nin Bileşik Sınıfları Kurtar Multi-step Hazırlama Tekniği

Burada, bir kriyojenik sıcaklıkta katı hal öğütme ile memeli hücrelerin bozulması Elde edilen hücre tozu, bir hücre, ekstrenin üretilmesi ve antikor-bağlı mikron çaplı paramanyetik taneler üzerine afinite yakalama ile ilgili protein kompleksleri izole etmek için protokoller tarif eder.

Cryomilled memeli hücrelerinden protein kompleksi olan ele geçirme kapasitesini

Burada, ökaryotik hücrelerden protein komplekslerinin ekspresyonu, izolasyonu ve karakterizasyonu için yeni, sağlam ve verimli bir tandem afinite saflaştırma (TAP) yöntemini açıklıyoruz. Bu protokol, ayrık komplekslerin biyokimyasal karakterizasyonunun yanı sıra yeni interaktörlerin ve işlevlerini düzenleyen translasyon sonrası modifikasyonların tanımlanması için kullanılabilir.

Ökaryotik Hücrelerde Protein Kompleksleri Tandem Affinity Arıtma

stabilize edici ve yeni bir iki boyutlu poliakrilamit jel elektroforez bağlanmış bir amin-reaktif protein çapraz bağlayıcı kullanılarak modifiye edilmemiş doku lizattan doğal protein kompleksleri ayırmak için bir yöntem olup (PAGE) sistemi sunulmuştur.

Multimer-PAGE: Biyolojik örnekler olarak yakalamak için bir yöntem ve özümleme protein kompleksleri

Burada bir etiket bilgilerini kantitatif kütle spektrometresi kullanılarak protein korelasyon profil ardından afinite protein komplekslerinin saflaştırılması ve mavi doğal PAGE ile onların ayrılması için protokoller, mevcut. Bu yöntem, farklı protein kompleksleri halinde interactomes çözmek için yararlıdır.

Mavi Yerli PAGE ve Protein İlişkisi Profil Yöntemi ile Affinity Saf protein Kompleksler çözümleniyor

Bu el yazması Bimolecular uluslara benzeşme arıtma (BiCAP) protokolünü açıklar. BM complexed bireysel proteinler hem de konut projeleri hariç rakip bağlama ortaklarıyla oluşan iken bu roman yöntemi belirli yalıtım ve aşağı akım proteomik karakterizasyonu herhangi bir iki etkileşen proteinlerin kolaylaştırır.

Bimolecular tamamlayıcı benzeşme arıtma (BiCAP) tarafından parçalanmış çok protein sinyal kompleksleri

Bu iş akışı, nicel küresel proteomik analiz için aynı anda birden fazla protein çeviri sonrası modifikasyonun (PtM) zaman ve maliyet-etkin zenginleşmesinin performansını açıklar. Protokol, ptm çapraz konuşmasına biyolojik kavrayışlar kazandırmak için birden fazla konjuge antikorla peptid düzeyinde PTM zenginleştirme, ardından da veri bağımsız iktisap kütle spektrometresi analizini kullanmaktadır.

Niceleme ve Site Yerelleştirmesi Için İki Çeviri Sonrası Modifikasyonun Eşzamanlı Affinity Zenginleştirmesi

Bu makale, bir 6X-histidin etiketi ile etiketlenmiş bir insan rekombinant proteini olan flep endonükleaz 1'in (FEN1) afinite saflaştırılması için bir prosedür sağlar. Protokol, etiketli proteinin saflaştırılması için iki farklı hareketsizleştirilmiş metal iyon kolonunun kullanılmasını içerir.

Hızlı Protein Sıvı Kromatografi Sistemi Kullanılarak 6X His Etiketli Bir Proteinin Afinite Saflaştırılması 

Keşfedin protein-protein ve protein-metabolit etkileşimlerinin paralel analizi için benzeşme arıtma yöntemini. Arabidopsis thaliana hücre kültürlerinde kitlesel spektrometri ile etkileşimleri belirleyin.

2 in 1: tek adımlı benzeşme arıtma paralel analizi için Protein-Protein ve Protein-metaboliti kompleksleri

Daha fazla video keşfet