Epifluoresan ile Doku Matrix Bileşenler ve İki foton Mikroskopi uzun vadeli Intravital İmmünofloresan Görüntüleme

Bu prosedürün genel amacı, tümör dokusunun matris bileşenlerinin dinamiklerini incelemek için melanom taşıyan farelerin kulağının intra vital immünofloresan görüntülemesini gerçekleştirmektir. Bu, ilk olarak bir fare kulağının B 16 F 10 melanom hücrelerini eksprese eden GFP ile aşılanmasıyla gerçekleştirilir. Daha sonra, ventrali dorsal kulak derisinden ayırmak ve tümör dokusunu ortaya çıkarmak için fare kulağına ameliyat yapılır.

Daha sonra dorsal kulağın açıkta kalan dokusu üzerinde immün boyama yapılır. Son olarak, hayvan intra vital görüntüleme için hazırlanır. Sonuç olarak, tümör hücrelerinin ve matris bileşenlerinin lokalizasyonunu ve dinamik davranışını göstermek için floresan stereo mikroskopi veya çoklu foton mikroskobu kullanılır.

Bu tekniğin diğer canlı görüntüleme yöntemlerine göre en büyük avantajı, tümör hücrelerinin immün hücreler gibi stromal ilişkili hücrelerle dinamik etkileşimlerini görüntüleyebilmemizdir, ancak bu, ekstraselüler matriks gibi fibriler ve mesh bağlamındadır. Dolayısıyla bu yöntem, tümör hücrelerinin fiziksel mikro çevreleriyle nasıl etkileşime girdiği gibi tümör biyolojisi alanındaki temel soruları ele almanıza yardımcı olabilir ve bu da tümörlerin nasıl ilerlediğine dair önemli bilgiler sağlayabilir. Prosedürün bir kısmı, laboratuvarımızın kıdemli bir bilim adamı olan Vita Kki tarafından gösterilecektir: Tümör hücrelerini enjeksiyona hazırlamak için B 16 F 10 GFP melanom hücrelerini kültürleyerek başlayın.

Hücreleri santrifüjledikten sonra, onları 1.5 mililitrelik bir einor tüpüne aktarın ve tekrar döndürün, peletin hemen üzerinde kalan ince bir ortam tabakası dışındaki tüm süpernatantıları çıkarın, hücreleri 10 mikrolitrelik bir hacme yüklemek için hücreleri kalın bir hücre bulamacına yeniden süspanse edin. Hamilton şırıngası. Uç kapağını takılı 33 gauge iğneden çıkarın ve uç haznesinin üzerine 20 mikrolitre bulamaç yükleyin.

Ardından, şırınganın içine beş mikrolitre bulamaç yüklenene kadar pistonu geri çekin. Bir C 57 siyah altı fareyi enjekte edilebilir anestezi ile uyuşturduktan sonra, fare kafasını tıraş edin, baştaki ve kulak çevresindeki tüyleri temizleyin ve suyla durulayın. Yapışkan bant kullanarak kulağın proksimal kenarını işaret parmağının ucuna sabitleyin.

Hamilton şırınga iğnesini, yaklaşık iki ila üç milimetre boyunca kulağın proksimalinden distaline nüfuz eden bir C 57 siyah altı farenin dorsal dermisi ile kulağının kıkırdağı arasına yerleştirin. Hücre bulamacını enjekte edin ve iğneyi ciltten yavaşça geri çekin. Tümör büyümesini, tümör büyümesini takip etmek için bir floresan mikroskobu kullanarak tümör hücrelerinin yedi ila dokuz gün boyunca katı bir tümör oluşturmasına izin verin.

Fareyi uyuşturmak için nemlendirilmiş oksijen ve izo flor karışımı kullandıktan sonra, fareyi 37 santigrat derecelik bir ısıtma yastığına yerleştirin ve hafif bir ayak parmağını sıkıştırın. Hayvanın yeterince anestezi aldığını doğrulamak için. Gözlere oftalmik merhem sürün ve fareyi tüm prosedür boyunca rektal termistör kontrollü bir ısıtma yastığı üzerinde tutun.

Daha sonra, tümör taşıyan kulağı yavaşça bir cam slayt yığınına yerleştirin. Ardından, kulağın ön ve arka kenarlarını bir neşter kullanarak yığına sabitlemek için küçük yapışkan bant şeritleri kullanın, kulağın ventral derisini fare kulak kepçesinin anti sarmalı boyunca kesin. Kavisli cımbız yardımıyla bantları kulaktan çıkarın.

Ventral dermisi ve kıkırdağı dorsal dermisten nazikçe soyun. İmmünofloresan boyama yapmak için kulağı yıkamak için zil tamponu kullanın. Açıkta kalan kulağa bloke edici tamponda hücre dışı matris moleküllerini hedefleyen birincil antikorları uygulayın ve üstüne bir örtü astarı yerleştirin.

Kulağı iki kez yıkamak için yaklaşık beş mililitre zil tamponu kullanmadan önce 15 dakika inkübe edin. Tamponu bloke etmek için uygun ikincil antikorlar veya strep Aden uygulayın. Bir örtü fişi uygulayın ve iki kez yıkamadan önce 15 dakika inkübe edin Daha önce olduğu gibi, açık dermal alanı EM mencia conki'ye katlayın ve dış açılmamış kulak dermisini kurutmak için steril mendiller kullanın.

Kulağı bir cam slayt yığınına yerleştirin ve iki saat veya daha kısa süreli görüntüleme için hareketsiz hale getirmek için ön ve arka sırt kenarlarına 0,5 mikrolitre cerrahi yapıştırıcı uygulayın. Hareketsiz hale getirilmiş kulağın üzerine sorbat halkaları tamponu olarak taze hazırlanmış steril ekleyin ve bir kapak fişi uygulayın. Ardından kulağı görüntülemek için iki lensli bir floresan stereo mikroskop kullanın.

Uzun süreli görüntüleme için. Sorbat halkaları içeren bir rezervuara bağlı bir iğnenin çıkışını, kulaktan yaklaşık 0,5 santimetre uzakta kapak kaymasının altına yerleştirin. Tamponu sürekli olarak hazneye iletmek için dakikada bir mikrolitre hızında peristaltik bir pompa kullanın.

Edinme yazılımını açın. Silikon gresli çoklu foton mikroskobu kullanarak intra vital görüntüleme yapmak için kazanç floresan yoğunluğunu, büyütme ve pozlama süresi görüntüsünü, tümör hücrelerini içeren çeşitli alanları ve ayrıca lekelenmiş hücre dışı matris proteinlerini ayarlayın. Kulağın tabanından başlayarak.

Kulağın etrafına yaklaşık iki santimetre çapında ve iki ila üç milimetre yüksekliğinde dairesel bir duvar inşa edin. Daireyi bir sorbat zil sesi ile doldurun. Fareyi sahneye yerleştirin, 37 santigrat dereceye ayarlanmış bir ısıtma yastığı üzerine ayarlayın ve mikroskobun ayarlarını metin protokolüne göre yapılandırın.

Bu şekilde gösterildiği gibi, birçok yapı immüno boyamadan sonra morfolojilerine göre ayırt edilebilir. Kollajen dört veya prolean gibi bazal membran bileşenleri için, en önemlisi, normalde SHG tarafından tespit edilemeyen yapısal proteinler. Klasik matris algılama yöntemi görselleştirilebilir.

Örneğin, onlarca ve C'nin, tümör mikroçevresi içinde gelişen fibriller kollajen kuvvetlerinden tümör stromasının farklı yerlerinde biriktiğini, tümör matrisinin genişlemesine veya büzülmesine yol açabileceğini ve sonuç olarak tümör vaskülatürünün yara iyileşmesine benzer şekilde yeniden şekillendiğini bulduk. Burada, foton mikroskobuna yüksek foton yoğunluğunda bile, Fluor dörtlüsünün minimum foto ağartması ile aynı anda immüno-etiketli tenaları ve C matrisini görüntülerken, iki foton hızlandırılmış mikroskopi gerçekleştirebileceğimizi gösteriyoruz. Bu videoda, kollajen dördü için boyanmış açıkta kalan dermisin üzerine yerleştirilen tümör hücreleri dokuya yapışmış ve gruplar halinde kan damarlarının ve yağ bölgelerinin bazal zarı boyunca toplu olarak göç etmeye başlamıştır.

Bir kez ustalaştıktan sonra, kulağı açma ve immün boyama prosedürünün tamamı iki saat sürer. Bu videoyu izledikten sonra, epi floresan veya iki foton mikroskobu kullanarak tümörlerde hücre matrisi etkileşimlerini incelemek için intravital immün boyamanın nasıl gerçekleştirileceğini iyi anlamış olmalısınız.