Protein Etkileşimleri keşfetmek ve HaloTag Teknoloji Kullanımı Protein Fonksiyonu Karakterizasyonu

Bu prosedürün genel amacı, memeli hücrelerden protein komplekslerini verimli bir şekilde izole etmektir. Bu işlem, öncelikle hücrelerin, ilgilenilen proteini eksprese etmek için bir halo tag füzyon konstrüktü ile transfect edilmesiyle gerçekleştirilir. İkinci adım ise hücrelerin parçalanması ve protein komplekslerinin halo tag aracılığıyla reçine üzerinde kovalent olarak yakalanmasıdır.

Ardından, spesifik olmayan etkileşimleri gidermek için reçine üzerindeki protein kompleksleri nazikçe yıkanır. Son adım, protein komplekslerinin reçineden elüye edilmesidir. Nihayetinde, halo tag pull down yöntemleri, memeli sistemlerinden yeni protein etkileşimlerini izole etmek ve keşfetmek için kullanılır.

Bugün size göstereceğimiz yöntemler, yeni protein etkileşimlerinin tanımlanması ve hücre içindeki protein lokalizasyonunun belirlenmesi dahil olmak üzere, fonksiyonel proteomik alanında temel keşiflerin önünü açabilir. Bu prosedürleri bugün kıdemli bilim insan 사람들ımız Jackie Mendez ve Alen Beek gerçekleştirecekler. İlk olarak, her bir füzyon veya kontrol için, mililitre başına 3 ila 4 x 10⁵ hücre konsantrasyonunda 30 mililitre hücre içeren veya her bir konstrükt başına toplam 1 ila 1,2 x 10⁷ hücre içeren bir adet 15 santimetrelik kap hazırlayın.

Hücreleri 37 °C'de ve %5 CO2 ortamında 18 ila 24 saat boyunca inkübe edin. İnkübasyonun ardından, konstrüktü istenen transfeksiyon reajeni ile transfekte edin. Transfeksiyondan 24 ila 48 saat sonra, medyumu uzaklaştırın ve hücre tabakasını 20 ila 25 mL buz gibi soğuk PBS ile nazikçe yıkayın; PBS yıkamasını uzaklaştırıp yerine 4 °C'de soğutulmuş 25 ila 30 mL PBS ekleyin.

Bunun ardından, hücreleri bir hücre kazıyıcı yardımıyla kap üzerinden nazikçe kazıyın. Hücreler konik tüplere toplandıktan sonra, örnekleri 2000 ×g'de ve dört °C'de beş ila 10 dakika boyunca santrifüjleyin. Süpernatantı döktükten sonra, hücre peletlerini minimum 30 dakika veya maksimum altı ay boyunca -80 °C'de saklayın.

Her bir füzyon veya kontrol örneği için 18 mililitre rezin dengeleme yıkama tamponu hazırlayın. Homojen bir süspansiyon elde etmek için tüpü ters çevirerek rezini nazikçe karıştırın. Her bir çöktürme deneyi için 1,5 mililitrelik bir mikrosantrifüj tüpüne 200 mikrolitre rezin aktarın.

Numuneyi 800 ×g'de bir dakika boyunca santrifüjleyin. Santrifüjleme işleminin ardından, tüpün altındaki reçineyi bozmadan süpernatanı dikkatlice uzaklaştırın. Süpernatan atıldıktan sonra, numuneye 800 µL reçine dengeleme yıkama tamponu ekleyin ve tüpü birkaç kez ters çevirerek iyice karıştırın. Ardından.

Numuneyi 800 ×g'de iki dakika boyunca santrifüj edin. Süpernatanla dikkatlice uzaklaştırıp atın. Toplam üç yıkama yapmak için önceki adımları iki kez daha tekrarlayın.

Hücre peletleri çözündürüldükten sonra, önceden hazırlanmış 300 µL memeli lizis tamponu içerisinde pipetleme yoluyla resüspend edin. Ardından yeni bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın ve 6 µL 50x proteaz inhibitör kokteyli ekleyin.

Bunun ardından, üç microliter RQ one DNA ekleyin ve örneği 10 dakika boyunca altüst edin. Oda sıcaklığında, örneği 25 veya 27 gauge bir şırınga iğnesinden beş ila 10 kez geçirerek hücreleri lyse edin. Örnek, 4 °C'de beş dakika boyunca 14.000 ×g'de santrifüj edildikten sonra, berrak lizatı yeni bir tüpe aktarın ve buza yerleştirin.

Ardından, berrak lizata önceden hazırlanmış 700 µL 1X TBS tamponu ekleyin ve pipetle yukarı-aşağı çekerek iyice karıştırın. Her tüpün altındaki reçineye dokunmadan, önceden hazırlanmış dengeye getirilmiş reçine tüplerindeki son yıkama sıvılarını uzaklaştırın. Daha sonra, her tüpe bir mililitre seyreltilmiş lizat ekleyin.

Numuneleri bir tüp rotatöründe, 22 °C'de 15 dakika boyunca karıştırarak inkübe edin. Bunun ardından, reçine tüplerini 800 ×g'de iki dakika boyunca santrifüjleyin. Süpernatantı attıktan sonra, bir mililitre reçine dengeleme yıkama tamponu ekleyin ve her bir reçine tüpünü elle birkaç kez ters çevirerek iyice karıştırın; ardından reçine tüplerini 800 ×g'de iki dakika boyunca santrifüjleyin. Önceki yıkama adımları toplam üç kez tekrarlandıktan sonra yıkama solüsyonlarını atın.

Numuneleri 22 °C'de beş dakika boyunca sabit rotasyonla inkübe ettikten sonra tüplere bir mililitre reçine dengeleme yıkama tamponu ekleyin, reçine tüplerini 800 ×g'de iki dakika santrifüjleyin ve yıkama solüsyonlarını atın. Bu noktada, her numunedeki reçineyi 50 µL SDS elüsyon tamponunda yeniden süspanse edin. Tüpleri oda sıcaklığında, otomatik bir mikro santrifüj tüp çalkalayıcı ile 30 dakika boyunca çalkalayın.

800 ×g'de iki dakika santrifüjün ardından, EIT'leri analiz için yeni tüplere aktarın. Western blot veya gümüş boyama jel analizi için, kütle spektrometrisi amacıyla numunelerin 5 ila 10 µL'sini SDS denatüre eden jele yükleyin. Gelecekteki analizler için her numuneden 40 µL'yi -20 °C'de saklayın. Her bir füzyon proteini veya kontrol plakası için sekiz kuyuklu oda bölmeli lamın her bir kuyuğuna, 1-2 × 10⁵ hücre/mL yoğunlukta, uygun besiyerindeki HELOC hücrelerinden 400 µL ekleyin.

Hücreleri 37 °C ve %5 CO2'de 18 ila 24 saat inkübe ettikten sonra, istenen transfeksiyona reaktifi ile onları transfekte edin; transfeksiyondan 18 ila 24 saat sonra TMR ligandını uygun hücre ortamında 1:200 oranında seyreltin. Ardından, her kuyucuğa bu çözeltiden 100 µL ekleyin ve nazikçe karıştırın. Sonrasında, ligand içeren transfekte hücreleri 37 °C ve %5 CO2'de 15 dakika boyunca inkübe edin.

İşlem tamamlandığında, ligand içeren medyumu aspire edin ve yerine, 37 °C'ye önceden ısıtılmış, protein füzyon etiketi ligandı içermeyen 500 µL uygun medyum ekleyin. Önceki adım, toplam üç yıkama olacak şekilde iki kez daha tekrarlandıktan sonra hücreleri 30 dakika boyunca inkübatöre geri yerleştirin.

30 dakikalık inkübasyonun ardından ortamı aspire edin ve yerine 37 °C'ye ön ısıtılmış 500 µL uygun ortam ekleyin. Bu işlemin ardından, halo, BRD4 ve halo tag kontrol ekspresyonu protokolü kullanılarak uygun görüntüleme parametreleri ile mikroskop altında hücreleri görüntüleyin. Füzyon proteini ekspresyonu, anti-halo tag antikorları veya yem proteine yönelik antikorlar kullanılarak Western blot ile de tespit edilebilir.

Halo BRD four ve kontrol pulldown'larının biyolojik tekrarlarının gümüş boyama jelleri, yüksek tekrarlanabilirlik göstermekte ve BRD four proteini ile etkileşime giren proteinleri ortaya koymaktadır. PTF B, CDK nine ve Cyclin T bileşenlerinin yanı sıra BRD nine proteininin yüksek bolluğu, BRD four komplekslerinin spesifik olarak yakalandığını doğrulamaktadır. Jeller, BRD four'ün potansiyel etkileşimcileri olarak tanımlanan diğer proteinleri de göstermiştir.

Ek bir örnek olarak, Halo HD 1 proteini ile kompleks izolasyonları gerçekleştirilmiştir. Bu durumda, Halo etiketi ile HD 1 arasında yer alan linker bölgesini kesmek ve böylece önemli miktarlarda HD 1 yem proteinini serbest bırakmak için TEV proteazı kullanılmıştır. Gözlemlendiği üzere.

HD1 pulldown örnekleri, HDA inhibitörü saha tarafından inhibe edilen yüksek seviyelerde HD1 aktivitesi göstermiştir. Özgüllüğü daha fazla kanıtlamak için, sirtuin ailesi inhibitörü EX 5 27 ile herhangi bir HDA inhibisyonu gözlemlenmemiş ve yalnızca tampon kullanıldığında herhangi bir sinyal saptanmamıştır. Halo BRD4 ve Halo HDAC1 transfekte edilmiş He LA hücreleri, TMR ile floresan işaretlenmiştir.

Ligand Görüntüleme, her ikisinin de çekirdeğe yerleştiğini göstermiş ve etiketin, füzyon ortaklarının fizyolojik hücresel lokalizasyonunu değiştirmediğini kanıtlamıştır. Bu prosedürün ardından, izole edilen proteinler ve etkileşim kurdukları ortaklar tanımlanabilir; kütle spektrometrisi ve western blotting gibi çeşitli analitik yöntemler kullanılarak daha detaylı analiz edilebilir.