Protein Etkileşimleri keşfetmek ve HaloTag Teknoloji Kullanımı Protein Fonksiyonu Karakterizasyonu

Bu prosedürün genel amacı, protein komplekslerini memeli hücrelerinden verimli bir şekilde izole etmektir. Bu, ilgilenilen proteini ifade etmek için önce hücrelerin bir halo tag füzyon yapısı ile kesilmesiyle gerçekleştirilir. İkinci adım, hücreleri dilimlemek ve halo etiketi aracılığıyla reçine üzerindeki protein komplekslerini kovalent olarak yakalamaktır.

Daha sonra, reçine üzerindeki protein kompleksleri, spesifik olmayan etkileşimleri gidermek için nazikçe yıkanır. Son adım, protein komplekslerini reçineden çıkarmaktır. Sonuç olarak, memeli sistemlerinden yeni protein etkileşimlerini izole etmek ve keşfetmek için halo etiket aşağı çekmeleri kullanılır.

Bugün burada size göstereceğimiz yöntemler, yeni protein etkileşimlerinin tanımlanması ve hücreler içindeki protein lokalizasyonunun belirlenmesi de dahil olmak üzere fonksiyonel proteomik alanında önemli keşifleri mümkün kılabilir. Bugün bu prosedürleri gerçekleştiren iki kıdemli bilim insanımız, Jackie Mendez ve Alen Beek. İlk olarak, her füzyon veya kontrol için, mililitre başına üç ila dört kez 10 ila beşinci hücrede veya yapı başına toplam yedi hücreye bir ila 1.2 kez 10 çarpı 30 mililitre hücre içeren 15 santimetrelik bir tabak hazırlayın.

Hücreleri 37 santigrat derece ve% 5 CO2'de 18 ila 24 saat inkübe edin. İnkübasyonun ardından, yapıyı istenen transfeksiyon reaktifi ile transfekte edin. 24 ila 48 saat sonra, transfeksiyondan sonra, ortamı çıkarın ve hücre katmanını 20 ila 25 mililitre buz gibi soğuk PBS ile nazikçe yıkayın, PBS yıkamasını çıkarın ve 25 ila 30 mililitre dört santigrat derece soğutulmuş PBS ekleyin.

Bunu takiben, hücreleri bir hücre kazıyıcı ile tabaktan nazikçe kazıyın. Hücreler konik tüplere toplandıktan sonra, numuneleri 2000 kez G ve dört santigrat derecede beş ila 10 dakika santrifüjleyin. Süpernatanı attıktan sonra, hücre peletlerini en az 30 dakika veya en fazla altı ay boyunca eksi 80 santigrat dereceye yerleştirin.

Her füzyon veya kontrol numunesi için 18 mililitre reçine dengeleme yıkama tamponu hazırlayın. Düzgün bir süspansiyon elde etmek için şişeyi ters çevirerek reçineyi nazikçe karıştırın. Her aşağı çekme deneyi için 200 mikrolitre reçineyi 1,5 mililitrelik bir mikro santrifüj tüpüne dağıtın.

Santrifüjlemeyi takiben numuneyi 800 kez G'de bir dakika santrifüjleyin. Tüpün altındaki reçineyi bozmadan süpernatanı dikkatlice çıkarın. Süpernatan atıldıktan sonra, numuneye 800 mikrolitre reçine dengeleme yıkama tamponu ekleyin ve tüpü birkaç kez ters çevirerek iyice karıştırın. Sonra.

Numuneyi 800 kez iki dakika santrifüjleme. G. Süpernatanı dikkatlice çıkarın ve atın. Toplam üç yıkama için önceki adımları iki kez daha tekrarlayın.

Hücre peletleri resüs çözüldükten sonra, önceden hazırlanmış 300 mikrolitre memeli lizizinde askıya alın. Yukarı ve aşağı pipetleyerek tamponlayın. Daha sonra yeni bir mikro santrifüj tüpüne aktarın ve altı mikrolitre 50 x proteaz inhibitör kokteyli ekleyin.

Bunu takiben, üç mikrolitre RQ bir DNA ekleyin ve numuneyi 10 dakika boyunca ters çevirin. Oda sıcaklığında, numuneyi 25 veya 27 gauge şırınga iğnesinden beş ila 10 kez geçirerek hücreleri katlayın. Numune 14.000 kez santrifüjlendikten sonra, dört santigrat derecede beş dakika boyunca G, berrak lizatı yeni bir tüpe aktarın ve buzun üzerine yerleştirin.

Daha sonra, berrak lizata 700 mikrolitre daha önceden hazırlanmış bir XTBS tamponu ekleyin ve yukarı ve aşağı pipetleyerek iyice karıştırın. Her bir tüpün altındaki reçineyi bozmadan, önceden hazırlanmış dengelenmiş reçine tüplerinden son yıkamaları çıkarın. Daha sonra her tüpe bir mililitre seyreltilmiş lizat ekleyin.

Numuneleri 22 santigrat derecede 15 dakika boyunca bir tüp döndürücü üzerinde karıştırarak inkübe edin. Bu santrifüjü takiben, reçine tüpleri 800 kez G'de iki dakika boyunca yanar.Süpernatanı attıktan sonra, bir mililitre reçine dengeleme yıkama tamponu ekleyin ve reçine tüplerinin 800 kez iki dakika santrifüjlenmesini takiben her bir reçine tüpünü birkaç kez elle ters çevirerek iyice karıştırın. G. Önceki ve yıkama adımları üç kez tekrarlandıktan sonra yıkamaları atın.

Numuneleri 22 santigrat derecede sabit rotasyonla beş dakika inkübe ettikten sonra tüplere bir mililitre reçine dengeleme yıkama tamponu ekleyin, reçine tüplerini 800 kez G'de iki dakika santrifüjleyin ve yıkamaları atın. Bu noktada, reçineyi her numuneden 50 mikrolitre SDS elüsyon tamponunda askıya alır. Tüpleri otomatik bir mikro santrifüj tüp çalkalayıcı ile oda sıcaklığında 30 dakika çalkalayın.

800 kez G'de iki dakika santrifüjlemenin ardından, EIT'leri analiz için yeni tüplere aktarın: Western blot veya gümüş leke jeli için, kütle spektrometresi için bir SDS denatüre edici jel üzerine beş ila 10 mikrolitre numune yükleyin. Gelecekteki analizler için her numuneden 40 mikrolitreyi eksi 20 santigrat derecede saklayın. Her bir füzyon proteini veya kontrol plakası için sekiz iyi odacıklı bir kapak camında, her bir oyukta uygun ortamlarında 400 mikrolitre HELOC hücresi, mililitre başına bir ila iki kez 10 ila beşinci hücre yoğunluğunda.

Hücreleri 37 santigrat derece ve% 5 CO2'de 18 ila 24 saat inkübe ettikten sonra, 18 ila 24 saat sonra istenen transfeksiyon reaktifi ile transfekte edin, transfeksiyon sonrası TMR ligandını uygun hücresel ortamda bir ila 200 oranında seyreltin. Daha sonra her bir kuyucuğa bu çözeltiden 100 mikrolitre ekleyin ve yavaşça karıştırın. Daha sonra, ligandı içeren transfekte edilmiş hücreleri 37 santigrat derece ve% 5 CO2'de 15 dakika inkübe edin.

Bittiğinde, ligandı içeren ortamı aspire edin ve bunu, 37 santigrat dereceye kadar önceden uyarılmış olan protein füzyon etiketi ligandından yoksun 500 mikrolitre uygun ortamla değiştirin. Bir kez, önceki adım toplam üç yıkama için iki kez tekrarlanır. Hücreleri 30 dakika boyunca inkübatöre geri yerleştirin.

30 dakikalık inkübasyondan sonra, ortamı aspire edin ve 37 santigrat dereceye kadar önceden ısıtılmış 500 mikrolitre uygun ortamla değiştirin. Bu görüntüyü takiben, hücrelerin mikroskop üzerinde uygun edinim parametreleri kullanılarak protokol halo, BRD four ve halo etiket kontrol ifadesi kullanılarak gözlenir. Füzyon proteini ekspresyonu, anti halo etiket antikorları veya yem proteinine karşı antikorlar içeren Western blotları kullanılarak da tespit edilebilir.

Halo BRD four'un biyolojik kopyalarının gümüş leke jelleri ve kontrol pulldown'ları, yüksek tekrarlanabilirlik gösterir ve BRD four proteini ile etkileşime giren proteinleri gösterir. PTF B, CDK dokuz ve Siklin T'den gelen bileşenlerin yanı sıra BRD dokuz proteininden gelen yüksek bileşen bolluğu, BRD dört kompleksinin spesifik olarak yakalandığını doğrular. Jeller, BRD dördünün potansiyel interaktörleri olarak tanımlanan diğer proteinleri gösterdi.

Ek bir örnek olarak, Halo HD bir protein ile karmaşık izolasyonlar gerçekleştirildi. Bu durumda, TEV proteaz, Halo etiketi ile H DAC arasındaki bir bağlayıcı bölgede parçalanmak için kullanıldı ve önemli miktarda HD bir yem proteini salındı. Gözlemlendiği gibi.

HD bir pulldown numuneleri, HDA inhibitörü saha tarafından inhibe edilen yüksek seviyelerde HD one aktivitesi gösterdi. Spesifikliği daha da göstermek için, sirtuin ailesi inhibitörü EX 5 27 ile hiçbir HDA inhibisyonu gözlenmedi ve tek başına tampon kullanılarak hiçbir sinyal tespit edilmedi. Halo BRD dört ve Halo HDAC ile transfekte edilen He A hücreleri TMR ile floresan olarak etiketlendi.

Ligand Görüntüleme, hem çekirdeğe lokalize olduğunu hem de etiketin füzyon ortaklarının fizyolojik hücresel lokalizasyonunu değiştirmediğini gösterdi. Bu prosedürü takiben, izole edilen proteinler ve bunların etkileşimli ortakları, kütle spektrometresi ve western blotlama gibi çeşitli analitik yöntemler kullanılarak tanımlanabilir ve daha fazla analiz edilebilir.