Zebra balığı Larva Çoklu Zor-hedef dokular geçiştirilmesi için Kardiyak Ventriküler Injection kullanarak Genetik Morfolino Yaklaşım ters

Bu prosedürün genel amacı, transformasyon sırasındaki işlevlerini değerlendirmek için larvaya, burun yüzgecine ventriküler enjeksiyonlar yoluyla morf eno oligonükleotidleri vermek ve genleri yıkmaktır. Bu, önce larvaların uyuşturulması ve aros kalıbının bir oluğuna yerleştirilmesiyle gerçekleştirilir. Daha sonra, enjeksiyon iğnesi kalp ventrikülüne yerleştirilir.

Daha sonra morfo çözeltisi, kalbin temizlenmesini sağlamak için darbeler arasında ağırlık aralıkları ile ventriküle dört ila altı kez enjekte edilir. Son olarak, coddle yüzgeci kesilir ve üç gün boyunca yenilenmesine izin verilir. Sonuç olarak, kanat rejenerasyonu üzerindeki etki daha sonra Fiji image J açık kaynaklı yazılımının çizgi izleme aracı kullanılarak kanatçığın rejenere alanı ölçülerek değerlendirilebilir.

Bu tekniğin transgenez veya mutajenez gibi mevcut yöntemlere göre en büyük avantajı, doğrudan enjeksiyonlar için uygun olmayan larva dokularında genlerin minos tarafından parçalanmasına izin vermesidir 0.75 milimetre çapında cam kılcal damarlar kullanarak, bir iğne çekicisine yerleştirin ve iğneyi saat ustası cımbızı ile aşağıdaki parametrelerle çekin, Ve mikrometre mercekli bir stereoskop altında, 20 mikrometre çapında bir iğne üretmek için çekilen kılcal damarı kırın. Ardından, iğneyi keskinleştirmek ve 20 mikrometrelik bir eğim oluşturmak için dişli lastik çıkrıklı bir torna tezgahı kullanın. Liyofilize Morpho'yu bir XPBS'de 7.5 milimolar nihai konsantrasyona çözerek morpho stoğunu hazırlayın.

Enjeksiyonları gerçekleştirmek için 3.5 milimolar morf ve 0.5 milimolar endo porter'ın nihai konsantrasyonu için 2.5 mikrolitre Morpho stok çözeltisini 2.8 mikrolitre bir milimolar endo Porter stok çözeltisi ile birleştirerek Morpho enjeksiyon çözeltisini karıştırın. Eğimli cam iğneyi beş mikrolitre morpho çözeltisi ile doldurmak için 10 mikrolitre uçlu bir mikro pipet kullanın. Ardından cam iğneyi pnömatik piko pompasına bağlı mikro manipülatörün iğne tutucusuna yerleştirin.

Enjeksiyonların açısını yaklaşık 45 dereceye ayarlayın, böylece iğnenin yalnızca bir planya yönünde hareket ettirilmesi gerekir. Ardından, mikro enjektör değerlerini aşağıdaki gibi ayarlayın, İnç kare başına 20 pound'luk bir tutma basıncı veya PSI, 15 PSIA'lık bir fırlatma basıncı, 100 milisaniye geçit aralığı ve 10,9 milisaniyeye karşılık gelen 1,9'luk bir periyot değeri. Bir XPBS'de 20 mililitre erimiş% 1.5 aros hazırlayın ve 10 santimetrelik bir petri kabına dökün.

Daha sonra larvaları uyuşturmak için sertleştirilmiş jelde oluklar oluşturmak için ılık aros içine yivli bir enjeksiyon kalıbı yerleştirin. Bunları litre başına 20 milikan ile 100 mililitre akvaryum suyuna koyun. Dokunmaya yanıt vermeyi bıraktıktan sonra, larvaları ıslak aros kalıbının bir oluğuna dikkatlice aktarmak için plastik bir pastoral pipet kullanın, böylece ventral taraf oluğun dikey aros duvarına bakacak şekilde ayarlayın.

Aros plakasını stereo mikroskobun altına, ventrikül enjeksiyon iğnesinden uzağa bakacak şekilde yerleştirin. Daha sonra, iğneyi indirin ve kalp ventrikülüne yaklaşık bir ila iki mikrometre yerleştirin. Çok derine sokmamaya dikkat edin.

Daha sonra, enjeksiyondan sonra beş darbe daha ile tekrarlamadan önce kalbin temizlenmesini sağlamak için ventrikül ve ağırlığa üç nanolitrelik bir Morpho çözeltisi darbesi enjekte edin, iğneyi çıkarın ve kurumayı önlemek için bir XPBS içeren bir Petri kabına yerleştirin. Daha sonra, hücrelerde morfonun alımını ve bakımını sağlamak için larvaları dikkatlice E üç besiyeri içeren bir Petri kabına dikkatlice geri aktarın. Enjeksiyonları değerlendirmek için deney süresince enjeksiyonları her 12 ila 24 saatte bir tekrarlayın.

Balıkları uyuşturduktan sonra, onları görüntülemek için parlak alan ve floresan içeren bir stereo mikroskop kullanmadan önce E üç ortamla kaplı düz bir ıslak aros plakasına yerleştirin. Meydana gelen rejeneratif büyüme miktarını belirlemek için çizgi izleme aracını kullanmak için Fiji Image J ücretsiz yazılımını kullanarak görüntüleri rejenerasyon için analiz edin. İlk olarak, bir dosyayı ana menüdeki ana Fiji penceresine sürükleyip bırakarak görüntüleri kalibre edin.

Açılır menüdeki analiz et'e tıklayarak tüm görüntüler için ölçeği ayarlayın. Ölçeği ayarla'yı tıklayın, ardından onay kutusunu tıklayarak genel seçeneği açın. Şimdi araç çubuğundaki rejeneratif büyüme miktarını ölçmek için görüntüyü tekrar sürükleyip bırakın.

Serbest seçimler aracını seçin ve ölçülecek alanı daire içine alın. Son olarak, Ctrl M'ye basın.Bu, daire içine alınmış alanın değerini kare piksel cinsinden gösteren yeni bir sonuç penceresi açacaktır. Burada enjeksiyondan birkaç dakika sonra görüldüğü gibi, morpho endo porter solüsyonu vaskülatür boyunca yüzgeç kıvrımı ve beyin gibi farklı dokulara en az 12 veya daha fazla saat boyunca dağılır.

Distal larva yüzgeci yapılarının rejenerasyonunu değerlendirmek için, yüzgeç kıvrımının ve omuriliğin distal ucu, distal no kordonu, burada görünmeyen distal gövde kası ve doğrudan enjeksiyonla hedeflenmesi zor olan pigment hücreleri çıkarıldı, ancak seri ventriküler enjeksiyonlardan sonra morfoyu dahil ediyor gibi görünüyor. Bu nedenle, bu yöntem, morfonun bireysel olarak hedeflenmesi zor olan dokulara verilmesini nispeten kolay bir şekilde teşvik eder ve rejenere kanatçıktaki birkaç dokuda aynı anda gen fonksiyonunun değerlendirilmesine izin verir. Rejenerasyonda yer alan spesifik genlerin önemini analiz etmek için, larva coddle yüzgeci kısmen kesilir ve morfoyu içeren tüm dokular rezeke edilir.

Larva yüzgeci kıvrımı, gösterildiği gibi amputasyondan sonraki birkaç gün içinde yapısını yeniler. Burada, morfo, rejenerasyon için gerekli genleri hedef almakta, rejenerasyon tepkisini unin enjekte edilmesine kıyasla bozmaktadır ve uyumsuzluk morpho geliştirildikten sonra kontrolleri kontrol etmektedir. Bu teknik, rejenerasyon alanındaki araştırmacıların zebra balığı yüzgecinin rejenerasyonunda rol oynayan moleküler mekanizmaları keşfetmelerinin yolunu açtı.