Name: Zebra balığı Larva Çoklu Zor-hedef dokular geçiştirilmesi için Kardiyak Ventriküler Injection kullanarak Genetik Morfolino Yaklaşım ters (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-06-17T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 22 s
Description: Öğrenin, zebra balığı larvalarında kardiyak ventriküler enjeksiyonla morfolino dağıtımını ve gen fonksiyonlarını değerlendirin. Bu yöntem, doku rejenerasyonu süreçlerinde gen ekspresyonunu incelemek için güvenilir bir araç sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Bu çalışma Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) tarafından desteklenen, biz teknik destek için Ayele Tsedeke Taddese teşekkür etmek istiyorum.

1.. Cam İğneler hazırlanması (Şekil 1) <ol><li> Enjeksiyon iğneleri (Şekil 1A) hazırlamak için bir 0.75 mm çapa sahip bir cam kılcal kullanın. </li><li> Bir iğne çektirmenin içine cam kılcal yerleştirin ve aşağıdaki parametre ile iğneyi çekin: ısıtma çevrimi değeri: 463; döngüsü değerini çekerek: 230; hız: 150 ms; süresi: 150 msn (Şekil 1B). </li><li> Bir mikrometre mercek ile Stereoskop altında 20 mikron çaplı bir iğne üretmek için saatçi cımbızla çekti cam kılcal kırın. </li><li> Iğne keskinleştirmek ve 20 mikron eğimi (Şekil 1C ve 1D) üretmek için, ıslatılmış kauçuk çıkrık ile bir torna kullanın. Not: Sharp, eğimli iğneler ventrikül içine yerleştirilmesi kolaylaştıracak ve böylece doku hasarı en aza indirmek ve kas delikli iğnenin (Şekiller 1 E-G) çıkarılmasından sonra yeniden mühürlemek için izin verir. </li></ol> 2. PreparMorfolino Çözüm ation <ol><li> 7.5 mM&#39;lik nihai bir konsantrasyona kadar 1x Fosfat Tamponlu Salin (PBS) &#39;de liyofilize morfolino çözülmesiyle morfolino stoku hazırlayın. [Detaylar için üreticinin talimatlarına (Malzemeler tablo) bakın]. </li><li> 3.5 mM ve 0.5 mM morfolino Endo-Porter nihai konsantrasyonu için 2.8 ul Endo-Porter stok çözeltisi (1 mM) (Malzemeler tabloya bakınız) 2.5 ul morfolino stok çözeltisi (7.5 mM) karıştırılarak morfolino enjeksiyon çözeltisi hazırlayın. </li></ol> 3.. Morfolino enjeksiyon preparasyonu (Şekil 2) <ol><li> 10 ul Microloader pipet ucu ile bir mikropipet kullanılarak, bu çözeltinin 5 ul kesik cam iğne yerleştirin. </li><li> Pnömatik pico pompanın (Şekil 2A-C) bağlı mikromanipülatör iğne tutucuya cam iğne takın. </li><li> Sonraki mikroskop iğne tutucu yerleştirin iğne sadece ihtiyaçları böylecelarva (Şekil 2A), kardiyak ventrikül içine eklemek için bir düzlemsel yönde taşınacak. </li><li> Yaklaşık 45 ° enjeksiyonlar için açısını ayarlayın. </li><li> Tutma basıncı aşağıdaki gibidir: mikroenjektör değerlerini ayarlayın inç kare (psi) başına 20 £; ejeksiyon basıncı: 15 psi; Kapılanamaması 100 msn aralığı 1.9 dönemi değeri (10.9 msn karşılık gelir). </li><li> % 1.5 ile 20 ml (w / v) jeli oluşturmak için standart bir mikrodalga kullanılarak 1 x PBS içinde agaroz eritin. , 10 cm Petri kabı içine erimiş jel dökün. Sertleştikten sonra, agaroz sedasyon larva 11 (Şekil 2D ve 2E) yerleştirileceği oluklar içinde olacak, böylece sıcak bir yivli agaroz enjeksiyon formu yerleştirin. </li></ol> 4. Enjeksiyonları (Şekil 3) <ol><li> 20 mg / L tricaine (L-Etil-m-amino-benzoat-metan sülfonat) onlar dokunmak yanıt vermemesine kadar akvaryum suyu 100 ml larva anestezisi. </li><li> Plastik bir Pasteur pipett kullanınventral yan oluk (Şekil 3A) dikey agaroz duvara bakacak şekilde e dikkatle ıslak agaroz kalıbın bir oluğuna sedasyon larva aktarmak için kullanılır. </li><li> Ventrikül uzak enjeksiyon iğnesi (Şekil 3A) bakacak şekilde stereomikroskop altında agaroz plakası yerleştirin. </li><li> Kalbin karıncık içine eklemek için iğne indirin. Sadece 1-2 mikron çok derin iğne (Şekil 3B ve 3C) takmamaya özen ventrikül içine iğne takın. </li><li> Iğne takıldıktan sonra, kalbin (Şekil 3D ve 3E) temizlenmesini sağlamak için aralıklarla bekleyen, 4-6 bakliyat, çözümün her sağlayan 3 nl ile ventrikül içine morfolino çözüm enjekte. </li><li> Enjeksiyondan sonra, iğne (ekleme düzlemine paralel) kaldırmak ve daha sonra dikkatli bir şekilde E3 orta BAC dolu plastik bir Pasteur pipeti kullanarak larva aktarmataze E3 ortamı içeren bir Petri kabı içine k. </li><li> Enjekte edilen larva aktarırken iğnenin kurumasını önlemek için 1x PBS içeren bir petri kabı içine iğne yerleştirin. </li><li> Tekrar 4,1-4,6 deney süresince her 12-24 saat adımları tekrarlayın. Not: enjeksiyon Yinelenen hücrelerdeki morfolino alımını ve bakım sağlar. </li></ol> 5. Enjeksiyonları Analizleri (Şekil 4) <ol><li> Onlar dokunmak yanıt vermemesine kadar 20 mg / L tricaine akvaryum su 100 ml balık anestezisi. </li><li> Düz ıslak% 1.5 üzerinde yanal olarak larva yerleştirin E3 ortam maddesi ile kaplanmış (ağ / hac) agaroz. </li><li> Aydınlık ve floresan görüntüleme ile stereomikroskopta kullanarak görüntü larva. Not: larvalar şeffaf olduğu için, floresein-etiketli morfolino doğrudan enjeksiyondan sonra hayvan boyunca kan damarlarında floresan yeşili gibi görünür olmalıdır. Bu floresan ayrıca aşağıdaki diğer vaskülarize doku içine dağılacaktır15 dakika (Şekil 4A-4C). </li></ol> Rejeneratif kıbet 6. Değerlendirilmesi <ol><li> Fiji Resim J özgür yazılım (http://fiji.sc/Fiji) kullanılarak çekilen görüntüleri değerlendirmek. Rejenerasyon araştırmak için, kontrol ve morfolinodur enjekte larva oluştu rejeneratif büyüme miktarını belirlemek için hat-izleme aracını kullanın. </li><li> Görüntüleri kalibre etmek için, sürükleyerek ve ana Fiji penceresinin içine dosyayı bırakarak Fiji orijinal görüntü dosyalarından birini açın. </li><li> Aşağıdaki tüm görüntüler için ölçeğini ayarlamak için, ana menüde &quot;Analiz&quot; gidin. </li><li> &quot;Set ölçekte&quot; menüsünü tıklatın Açılır. </li><li> Bu pencerede, onay kutusunu tıklatarak &quot;Küresel&quot; seçeneğini açın. </li><li> Şimdi sürükle ve bırak (adım 6.1) tekrar rejeneratif büyüme miktarını ölçmek için görüntüyü açın. </li><li> Araç çubuğunda &quot;serbest seçimler&quot; aracını seçin. </li><li> Ölçülecek alanı (Fi kuşatmakdeerlerini 4J-4L). </li><li> Ctrl + M. Bu kare piksel çevrili alanın değerini gösteren yeni bir &quot;Sonuçlar&quot; penceresi açılacaktır. </li></ol>

<ol><li>Gemberlin, M., Bailey, T. J., Hyde, D. R., Poss, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+zebrafish+as+a+model+for+complex+tissue+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Genetics%22%5BJournal%5D)">The zebrafish as a model for complex tissue regeneration.</a> Trends in Genetics. 29, 611-620 (2013).</li>
<li>Suster, M. L., Abe, G., Schouw, A., Kawakami, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transposon-mediated+BAC+transgenesis+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Transposon-mediated BAC transgenesis in zebrafish.</a> Nature Protocols. 6, 2011 (1998).</li>
<li>Skromne, I., Prince, V. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+perspectives+in+zebrafish+reverse+genetics%3A+moving+forward%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Dynamics%22%5BJournal%5D)">Current perspectives in zebrafish reverse genetics: moving forward.</a> Developmental Dynamics. 237, 861-882 (2008).</li>
<li>Zu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TALEN-mediated+precise+genome+modification+by+homologous+recombination+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">TALEN-mediated precise genome modification by homologous recombination in zebrafish.</a> Nature Protocols. 10, 329-332 (2013).</li>
<li>Bedell, V. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+genome+editing+using+a+high-efficiency+TALEN+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">In vivo genome editing using a high-efficiency TALEN system.</a> Nature. 491, 114-118 (2012).</li>
<li>Kizil, C., IItzsche, A., Kaslin, J., Brand, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micromanipulation+of+gene+expression+in+the+adult+zebrafish+brain+using+cerebroventricular+microinjection+of+morpholino+oligonucleotides%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Micromanipulation of gene expression in the adult zebrafish brain using cerebroventricular microinjection of morpholino oligonucleotides.</a> J Vis Exp. , (2013).</li>
<li>Hyde, D., Godwin, A., Thummel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+electroporation+of+morpholinos+into+the+regenerating+adult+zebrafish+tail+fin%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">In vivo electroporation of morpholinos into the regenerating adult zebrafish tail fin.</a> J Vis Exp. , (2012).</li>
<li>Thummel, R., Bailey, T., Hyde, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+electroporation+of+morpholinos+into+the+adult+zebrafish+retina%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">In vivo electroporation of morpholinos into the adult zebrafish retina.</a> J Vis Exp. , (2011).</li>
<li>Rieger, S., Kulkarni, R. P., Darcy, D., Fraser, S. E., Köster, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantum+dots+are+powerful+multipurose+vital+labeling+agents+in+zebrafish+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Dynamics%22%5BJournal%5D)">Quantum dots are powerful multipurose vital labeling agents in zebrafish embryos.</a> Developmental Dynamics. 234, 670-681 (2005).</li>
<li>Madhavan, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+Pax-6+in+lens+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Science+U%22%5BJournal%5D)">The role of Pax-6 in lens regeneration.</a> Proceedings of the National Academy of Science U. 103, 14848-14853 (2006).</li>
<li>Gilmour, D. T., Jessen, J. R., Lin, S. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGilmour%2C+DT+%22Zebrafish%3A+a+practical+approach%22">Zebrafish: a practical approach</a>. 261, University Press. Oxford. 121-143 (2000).</li>
<li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9, 676-682 (2012).</li>
<li>Eisen, J. S., Smith, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controlling+morpholino+experiments%3A+don%27t+stop+making+antisense%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Controlling morpholino experiments: don't stop making antisense.</a> Development. 135, 1735-1743 (2008).</li>
<li>Bill, B. R., Petzold, A. M., Clark, K. J., Schimmenti, L. A., Ekker, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+primer+for+morpholino+use+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Zebrafish%22%5BJournal%5D)">A primer for morpholino use in zebrafish.</a> Zebrafish. 6, 69-77 (2009).</li>
<li>Hyatt, T. M., Ekker, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vectors+and+techniques+for+ectopic+gene+expression+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Vectors and techniques for ectopic gene expression in zebrafish.</a> Methods Cell Biol. 59, 117-126 (1999).</li>
<li>Hans, S., Kaslin, J., Freudenreich, D., Brand, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temporally+controlled+site-specific+recombination+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Temporally controlled site-specific recombination in zebrafish.</a> PLoS One. 4, (2009).</li>
<li>Lee, Y., Grill, S., Sanchez, A., Murphy-Ryan, M., Poss, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fgf+signaling+instructs+position-dependent+growth+rate+during+zebrafish+fin+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Fgf signaling instructs position-dependent growth rate during zebrafish fin regeneration.</a> Development. 132, 5173-5183 (2005).</li>
<li>Liu, S., D, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+models+for+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Re.+Pathol.+Mech.+Dis%22%5BJournal%5D)">Zebrafish models for cancer.</a> Annu. Re. Pathol. Mech. Dis. 6, 71-93 (2011).</li>
<li>Stoick-Cooper, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+Wnt+signaling+pathways+have+opposing+roles+in+appendage+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Distinct Wnt signaling pathways have opposing roles in appendage regeneration.</a> Development. 134, 479-489 (2007).</li>
<li>Shen, S. P., Aleksic, J., Russell, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identifying+targets+of+the+Sox+domain+proteins+Dichaete+in+the+Drosophila+CNS+via+targeted+expression+of+dominant+negative+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Identifying targets of the Sox domain proteins Dichaete in the Drosophila CNS via targeted expression of dominant negative proteins.</a> BMC Dev. Biol. 13, (2013).</li>
<li>McNeish, J. D., Scott, W. J., Potter Jr, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Legless%2C+a+novel+mutation+found+in+PHT1-1+transgenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Legless, a novel mutation found in PHT1-1 transgenic mice.</a> Science. 241, 837-839 (1988).</li>
<li>Covarrubias, L., Nishida, Y., Terao, M., D'Eustachio, P., Mintz, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+DNA+rearrangements+and+early+developmental+arrest+caused+by+DNA+insertion+in+transgenic+mouse+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">Cellular DNA rearrangements and early developmental arrest caused by DNA insertion in transgenic mouse embryos.</a> Mol. Cell. Biol. 7, 2243-2247 (1987).</li>
</ol>

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

Intraventriküler enjeksiyon Embriyogenez sırasında gen fonksiyonlarını etkilemeden gelişim veya vücut homeostasis ileriki aşamalarında gen fonksiyon testi için hızlı ve güvenilir bir değerlendirme yöntemi sağlar. Bu tekniğin başarı sağlamak için, bir dört kritik noktaların farkında olmalıdır: iğneden 1) iğne boyutu, 2) kurutma, 3) hacmini minimize ve sedasyon çözeltide 4) minimal maruz kalma süresi. Çok büyük iğneler ventrikül zarar ve aşırı kanamaya neden olurken çok küçük iğneler, sık sık yapışmasına neden olacaktır. ...

Organ ve ekleri rejenerasyon yaşam ve spor için temelde önemli olan; Ancak, insan dahil birçok omurgalı rejeneratif yetenekleri sınırlıdır. Çeşitli hayvan modellerde kapsamlı rejeneratif kapasiteye sahip olduğunu mevcut olmakla birlikte, organ ve apendiks rejenerasyon sırasında gen fonksiyonunu değerlendirmek için genetik teknikler ters çok sınırlı ya da varolmayan kalır. Bu nedenle, yeni yaklaşımlar bu model organizmaların yenilenme moleküler biyoloji incelemek gerekmektedir. Zebra balığı birkaç transgenik balık hatları hücreleri izlemek için var, çünkü hücre ve nedeniyle önemli çoklu organ, doku ve uzantıları yeniden yeteneği, ama aynı zamanda değil tek organ ve apendiksinde rejenerasyon 1, moleküler biyoloji anlamak için iyi kurulmuş bir modeldir ve genini aşırı ifade eden 2, 3, oluşturur. Bununla birlikte, larva Zebrafish gen inhibisyonu esas olarak overexpre sınırlıdırolan transgen ürünü genin endojen aktivitesi yansıtmamaktadır kazanç fonksiyon-etkilerini elde etmek için her ilgi genleri ya da mevcut değildir dominant-negatif yapılar, salgılanması. Bu nedenle, özel olarak nakavt veya demonte gen ifadesini ortadan kaldırmak için alternatif bir yöntem, bu sorunların üstesinden gelmek için gereklidir. TALENS gen fonksiyonu nakavt için ters genetik aracı olarak kullanan mevcut gen hedefleme özgü; genin ilk gereksinimleri embriyonik gelişimin ilerleyişi önlemek çünkü ancak, bu nakavt strateji, çok sık erken embriyonik dönemde fonksiyonel değerlendirmelere sınırlıdır. Dolayısıyla, bu tür Talens kullanarak geliştirme sonra rejenerasyon veya organ homeostasisin sonraları olayları inceleyerek, 5 4 engellenir. Bu nedenle, alternatif bir gen çıkarma stratejisi tamamen oluşmuş organ ve yapıların gen gereksinimlerini değerlendirmek için erken gelişme sonrası gen işlevini hedefleyen ihtiyaç duyulmaktadır. </p&gt; Morfolino enjeksiyon birkaç yetişkin organlarında genleri hedef ve yetişkin fin 6-8 rejenere etkili olduğu gösterilmiştir, ancak bu yöntemler elektroporasyon gerektiren ve çok iç organları nedeniyle konuma veya dolayı elektrik duyarlılıklarına ya electroporate zordur bozulması. Doğrudan enjeksiyon yapısal bütünlüğünü bozabilir, çünkü ya da boyut sınırlayıcı olduğu için Dahası, larva bazı dokular doğrudan enjekte etmek zordur. Finfold içine direkt enjeksiyon mümkün değil çünkü larva kuyruk yüzgeci, böyle bir yapıdır. Bu nedenle, elektroporasyon ve direkt enjeksiyon için alternatif ya da enjekte etmek için çok küçük ya da elektroporasyona edilemez dokularda genlerin hedeflenmesi için gerekli idi. Larva kuyruk yüzgeci rejenerasyon sırasında belirli genlerin işlevini inhibe etmek ve hedef amacıyla, mevcut morfolino sağlayan teknolojiler değiştirilmiş olan birGeç-aşamalı larva kuyruk yüzgeci rejenerasyon sırasında gen fonksiyonu ssessment. Bu yöntem, bir arada Endo-Porter transfeksiyon reaktifi 10, fluorescein-etiketli morpholinos intraventriküler teslim 9 kullanmaktadır. Bir kez ventriküle, morfolino-Endo-Porter karışımı hızla damar yoluyla larva yayılır ve hedef önceden imkansız olmuştur dokuları girer. Bu enjeksiyon yöntemi özel dokularda genlerin hedeflenmesi için modifiye edilebilir ve büyük ihtimalle halen gen fonksiyonu inhibe etmek için ters genetik yöntemler eksikliği diğer hayvan modelleri olarak uygulanabilir. Böylece, hemen larva aşamasında genel organı homeostasis ve rejenerasyon sırasında gen işlevini incelemek için geniş bir yelpazede kullanım potansiyeli ile hızlı ve kolay bir yöntem sunar.

<table><tbody><tr><td>3&akut ile Morpholino; floresein etiketi</td><td>Gen Araçları A.Ş.</td><td>Özelleştirilmiş</td><td>Daha fazla bilgi için www.gene-tools.com</td></tr><tr><td>Endo-Porter</td><td>Gene Tools Inc.</td><td></td><td>www.gene-tools.com</td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Serva</td><td>120623'da</td> daha fazla bilgi <td>Enjeksiyonlar ve görüntüleme sırasında balığı yerleştirmek için plakaları dökmek için</td></tr><tr><td>Trikain (L-Etil-m-amino-benzat-metan sülfonat)</td><td>Uygulama</td><td></td><td>Anestezi için</td></tr><tr><td>E3 ortamı (5 mM NaCl; 0.17 mM KCl; 0.33 mM CaCl<alt>2</alt>; 0.33 mM MgSO<alt>4</alt>)Larva</td><td></td><td></td> <td>yetiştiriciliği için</td></tr><tr><td>Petri Kapları</td><td>Sarstedt</td><td>821.472</td><td>Enjeksiyonlar ve görüntüleme sırasında balıkları yerleştirmek için</td></tr><tr><td>İnce Duvar Cam Kılcal</td><td>Damarlar World Precision Instruments, Inc.</td><td>TW100F-3</td><td>Enjeksiyon iğnelerini hazırlamak için</td></tr><tr><td>Microloader pipet uçları</td><td>Eppendorf</td><td>5,242,956,003</td><td>İğneyi yüklemek için</td></tr><tr><td>Pasteur Pipetleri (3 ml/1 ml)</td><td>Marka</td><td>747760/ 74775</td><td>Larvaları aktarmak için</td></tr><tr><td>Alevli/Kahverengi iğne çektirmesi</td><td>Sutter</td><td></td><td>Daha fazla bilgi için www.sutter.com</td></tr><tr><td>Watchmaker (Dumont) Cımbız (boyut 5)</td><td>World Precision Aletler A.Ş.</td><td>501985</td><td>Bileme işleminden önce iğneyi frenlemek için</td></tr><tr><td>Diseksiyon mikroskobu</td><td>Olympus, Leica, Zeiss</td><td>Üreticiye göre değişir</td><td>Tüm enjeksiyon kurulumunun bir parçası</td></tr><tr><td>Floresan kamera</td><td>Olympus, Leica, Zeiss</td><td>Üreticiye göre değişir</td><td>Enjeksiyondan sonra floresanı görüntülemek için</td></tr><tr><td>PicoNozzle kiti (mikroenjektör tutucu)</td><td>World Precision Instruments</td><td>5430-12</td><td>İçin mikroenjeksiyonlar</td></tr><tr><td>Pnömatik PicoPump (mikroenjektör)</td><td>Mikroenjeksiyonlar için</td> <td>Dünya Hassas Aletler</td><td>SYS-PV820</td></tr></tbody></table>

zebra balığı larva Çoklu zor-hedef dokular geçiştirilmesi için kardiyak ventriküler injection kullanarak genetik morfolino yaklaşım ters

Reverse Genetic Morpholino Approach Using Cardiac Ventricular Injection to Transfect Multiple Difficult-to-target Tissues in the Zebrafish Larva

Zebra balığı hücre ve organ ve apendiks yenilenme moleküler biyolojisini anlamak için önemli bir modeldir. Ancak, ters genetik istihdam moleküler stratejiler henüz yeterince Zebrafish embriyogenezin sonra larva dönemlerinde rejenerasyon veya doku homeostazisindeki gen fonksiyonunu değerlendirmek için geliştirilmiş değil, ve Zebra balığı larva içinde çeşitli dokuları hedeflemek için zordur. Gene özgü morpholinos intraventriküler enjeksiyonlar genomik bu aşamalarda, bir zamansal olarak kontrollü bir şekilde zebra balığı genlerin hedef mevcut yetersizlik için alternatif bir yöntem sunar. Bu yöntem, daha önce bu tür larva kuyruk kanadı, genellikle, invaziv olmayan doku yenilenmesini aratmak için kullanılan bir yapı gibi ulaşmak mümkün olmayan yapılar dahil olmak üzere, vücutta çeşitli dokular içine tam dağılım ve morfolino sonraki dahil edilmesine imkan verir. Larva finfold rejenerasyon sırasında aktive edilen çeşitli genler de Presen ediliryetişkin omurgalı doku yenileyici t, yani larva erişkinlerde rejenerasyon anlamak için bir modeldir. Bu yöntem, morfolino dağılım larva doku tamiri gibi embriyojenez sonra doku homeostazını düzenleyen diğer fizyolojik olayları için gerekli genlerin hızlı ve kolay tanımlanması için gereklidir. Bu nedenle, bu dağıtım yöntemi embriyojenez sonra gen fonksiyonunun değerlendirilmesi için zamansal kontrol için şu anda ihtiyaç strateji sağlar.

(Şekil 3A) dorsal yaklaştı keskin, eğimli enjeksiyon iğnesi kolayca Zebra balığı larva kalp ventrikül yerleştirilir. Kalp iğne (Şekil 3B ve 3C) varlığına rağmen devam eder ve pompalama kan akışı muhafaza edilmektedir. Dikkatli enjeksiyonları kalp (Şekil 3E) içine morfolino enjeksiyonu rağmen ventrikül veya kalp kasılmaları (Şekil 3D) morfolojisini bozmayacak. Birkaç dakika içinde, morfolino-Endo-Porter solüs...

Bu tür gen-spesifik morpholinos intraventriküler enjeksiyonları kullanarak doku rejenerasyonu gibi gelişme ve fizyolojik homeostasis sonraki aşamalarında gen fonksiyonunu değerlendirmek için zebrabalıkları için uyarlanabilir ters genetik bir yöntem.

Zebra balığı Larva Çoklu Zor-hedef dokular geçiştirilmesi için Kardiyak Ventriküler Injection kullanarak Genetik Morfolino Yaklaşım ters

The zebrafish is an important model to understand the cell and molecular biology of organ and appendage regeneration. However, molecular strategies to ...

Bu prosedürün genel amacı, morfo lino oligonükleotidleri larvalarının ventriküler enjeksiyon yoluyla iletmek ve rejenerasyon sırasındaki işlevlerini değerlendirmek için genleri nakavt etmektir. Bu işlem, öncelikle larvanın anestezi edilmesi ve aros kalıbının bir kanalına yerleştirilmesiyle gerçekleştirilir. Ardından, enjeksiyon iğnesi kalp ventrikülüne yerleştirilir.Ardından, kalbin temizlenmesine izin vermek için nabızlar arasında bekleme aralıkları bırakılarak, ventriküle dört ila altı kez morfo çözeltisi enjekte edilir. Son olarak, caudal yüzgeç ampute edilir ve üç gün boyunca rejenerasyona bırakılır. Nihayetinde, yüzgeç rejenerasyonu üzerindeki etki, Fiji ImageJ açık kaynaklı yazılımının çizgi izleme aracı kullanılarak yüzgecin rejenerye olan alanının ölçülmesiyle değerlendirilebilir.Bu tekniğin transgenez veya mutajenez gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajı, doğrudan enjeksiyonlar için uygun olmayan larval dokularda minos aracılığıyla genlerin susturulmasına (knockdown) olanak tanımasıdır. 0,75 mm çapındaki cam kapilerlerden birini iğne çekiciye yerleştirin ve iğneyi şu parametrelerle çekin; saatçi cımbızı kullanarak ve mikrometre gözlüklü bir stereoskop altında, çekilen

reverse-genetic-morpholino-approach-using-cardiac-ventricular

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Mikroenjeksiyon döllenmiş zebrafish embriyolar içine yabancı maddeler tanıtmak için bir köklü ve etkili bir yöntemdir. Burada, mRNA aşırı ekspresyonu gerçekleştirmek için sağlam bir mikroenjeksiyon tekniği ve morfolino oligonükleotid gen devirme çalışmaları zebrafish göstermektedir.

Zebra balığı Embriyolar mRNA ve morfolino Antisens Oligonükleotidler Mikroenjeksiyon.

Gen fonksiyonu, başka bir gen tarafından tazminat varsa, fonksiyon kaybı-deneylerde gizlenmiş olabilir. Zebrafish modeli canlı embriyolarının gibi fonksiyonel fazlalık ortaya çıkarmak için nispeten yüksek bir verimlilik anlamına gelir sağlar.

Embriyo sırasında Fonksiyonel Artıklık Test Ters Genetik Yaklaşım

Intravitreal antisens morpholinos enjekte ve retina içine electroporating koşullu yetişkin zebrafish retinanın bir hedef protein ifade demonte bir yöntem açıklanmıştır. Ortaya çıkan protein yenileyici veya sağlam retina proteinin rolünü test edilmesine imkan sağlayan birkaç gün, nakavt edilir.

Morpholinos in vivo Elektroporasyon Yetişkin Zebra balığı Retina

Biz, koşullu yetişkin zebrabalıkları fin rejenerasyon sırasında bir hedef protein ifadesini demonte için bir yöntem açıklanmaktadır. Bu teknik, mikro-enjeksiyon ve yara iyileşmesi, blastem oluşumu ve rejeneratif akıbet de dahil olmak üzere yüzgeç yenilenmesi çeşitli aşamalarında, proteinin rolünü test verir fin dokuya antisens oligonükleotid morpholinos electroporating içerir.

Yenileyici Yetişkin Zebra balığı Tail Fin içine Morpholinos in vivo olarak Elektroporasyon

Protokol, zebra balığında gen ekspresyonunun kuyrukta morfolino enjeksiyonu ile hedefli olarak yok edilmesini açıklar.

Morfolino Enjeksiyonu: Zebra Balıklarında İşlevi İncelemek İçin Hedef Gen Ekspresyonunu Yıkmak İçin Bir Yöntem

Burada, geliştirmek için sistematik bir yaklaşım sunmak fizyolojik, ilgili duyarlı ve...

Br.rerio kullanarak Morbid İnsan Genomu İn Vivo Modelleme

Bu yazıda, morfolino antisens oligonükleotidler kullanılarak yetişkin zebrabalıkları telencephalon ventriküler hücrelerde gen ifadesinin manipülasyonu için bir yöntem ortaya koymaktadır. Biz, yetişkin omurgalı beynin fonksiyonel çalışmalar için kullanılan bir hızlı ve verimli protokolü olarak bu yöntem sunuyoruz.

Morfolino Oligonükleotidler bir Cerebroventricular Mikroenjeksiyon kullanarak Yetişkin Zebra balığı Beyin Gen İfade Mikromanipülasyon

farklı genetik kökenden bireysel WT retina atalarıdır Canlı izleme nöron sırasında hücre özerk olmayan sinyalizasyon katkısı değerlendirilmesi için izin verir. Burada, embriyo transplantasyonu yoluyla ve in vivo time-lapse konfokal görüntüleme gen demonte, kimera nesil bir arada bu amaçla kullanılmıştır.

Kimerik Zebra balığı Embriyolar Bireysel Retina progenitörlerin Transgenik Gen İfade Vivo Görüntüleme Hücre otonom olmayan Etkiler Eğitim için

Nöral tüp oluşumu sonra neuroepithelium daraltır ve tüp embriyonik beyin ventriküller oluşturmak için embriyonik beyin omurilik sıvısı (eCSF) ile doldurur katlanabilir. Biz daha iyi, canlı embriyo nöroepitelyal şekli aksine sıvı dolu boşluk görselleştirmek için bu ventrikül enjeksiyon tekniği geliştirdi.

Zebra balığı Beyin Ventrikül Enjeksiyon

Burada yetişkin zebrafish retroorbital enjeksiyon nasıl yapılacağını göstermektedir.

Yetişkin Zebra balığı retro-orbital Enjeksiyon

Öğrenin, zebra balığı larvalarında kardiyak ventriküler enjeksiyonla morfolino dağıtımını ve gen fonksiyonlarını değerlendirin. Bu yöntem, doku rejenerasyonu süreçlerinde gen ekspresyonunu incelemek için güvenilir bir araç sunar.

Zebra balığı Larva Çoklu Zor-hedef dokular geçiştirilmesi için Kardiyak Ventriküler Injection kullanarak Genetik Morfolino Yaklaşım ters (Video) | JoVE Journal

Zebra balığı Larva Çoklu Zor-hedef dokular geçiştirilmesi için Kardiyak Ventriküler Injection kullanarak Genetik Morfolino Yaklaşım ters

Daha fazla video keşfet