Zebra balığı Larva Çoklu Zor-hedef dokular geçiştirilmesi için Kardiyak Ventriküler Injection kullanarak Genetik Morfolino Yaklaşım ters

Bu prosedürün genel amacı, morfo lino oligonükleotidleri larvalarının ventriküler enjeksiyon yoluyla iletmek ve rejenerasyon sırasındaki işlevlerini değerlendirmek için genleri nakavt etmektir. Bu işlem, öncelikle larvanın anestezi edilmesi ve aros kalıbının bir kanalına yerleştirilmesiyle gerçekleştirilir. Ardından, enjeksiyon iğnesi kalp ventrikülüne yerleştirilir.

Ardından, kalbin temizlenmesine izin vermek için nabızlar arasında bekleme aralıkları bırakılarak, ventriküle dört ila altı kez morfo çözeltisi enjekte edilir. Son olarak, caudal yüzgeç ampute edilir ve üç gün boyunca rejenerasyona bırakılır. Nihayetinde, yüzgeç rejenerasyonu üzerindeki etki, Fiji ImageJ açık kaynaklı yazılımının çizgi izleme aracı kullanılarak yüzgecin rejenerye olan alanının ölçülmesiyle değerlendirilebilir.

Bu tekniğin transgenez veya mutajenez gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajı, doğrudan enjeksiyonlar için uygun olmayan larval dokularda minos aracılığıyla genlerin susturulmasına (knockdown) olanak tanımasıdır. 0,75 mm çapındaki cam kapilerlerden birini iğne çekiciye yerleştirin ve iğneyi şu parametrelerle çekin; saatçi cımbızı kullanarak ve mikrometre gözlüklü bir stereoskop altında, çekilen kapileri kırarak 20 µm çapında bir iğne elde edin. Ardından, iğneyi keskinleştirmek ve 20 µm'lik bir eğim (bevel) oluşturmak için kauçuk döner tekerleğe sahip bir torna tezgahı kullanın. Liyofilize Morpho'yu 1X PBS içerisinde 7,5 mM nihai konsantrasyona kadar çözerek morpho stokunu hazırlayın.

Enjeksiyonları gerçekleştirmek için, 2,5 µL Morpho stok çözeltisini 2,8 µL 1 mM endo Porter stok çözeltisiyle karıştırarak son konsantrasyonu 3,5 mM morph ve 0,5 mM endo porter olan Morpho enjeksiyon çözeltisini hazırlayın. Beveled cam iğneye beş µL morpho çözeltisi yüklemek için 10 µL uçlu bir mikropipet kullanın. Ardından cam iğneyi, pnömatik pikopompayla bağlantılı mikromanipülatörün iğne tutucusuna yerleştirin.

İğnenin yalnızca tek bir düzlemsel yönde hareket ettirilmesi gerekmesi için enjeksiyon açısını yaklaşık 45 dereceye ayarlayın. Ardından, mikro enjektör değerlerini şu şekilde belirleyin: 20 pounds per square inch veya PSI tutma basıncı, 15 PSIA püskürtme basıncı, 100 milisaniyelik bir kapılama aralığı ve 10,9 milisaniyeye karşılık gelen 1,9 periyot değeri. Bir XPBS içerisinde eritilmiş 20 mililitre %1,5 agaroz hazırlayın ve bunu 10 santimetrelik bir petri kabına dökün.

Ardından, larvaları anestezi etmek için sertleşmiş jelde oluklar oluşturmak amacıyla sıcak agar bloğuna oluklu bir enjeksiyon kalıbı yerleştirin. Larvaları, litre başına 20 miligram trican içeren 100 mililitre akvaryum suyuna yerleştirin. Dokunmaya tepki vermeyi bıraktıklarında, larvaları plastik bir pastoral pipet kullanarak dikkatlice ıslak agar kalıbının bir oluğuna, ventral tarafı oluğun dikey agar duvarına bakacak şekilde aktarın.

Aros plakasını, ventrikül enjeksiyon iğnesinin ters yönüne bakacak şekilde stereo mikroskobun altına yerleştirin. Ardından, iğneyi indirin ve kalp ventrikülüne yaklaşık bir ila iki mikrometre derinliğinde yerleştirin. İğneyi çok derine itmemeye dikkat edin.

Ardından, ventriküle üç nanolitre Morpho solüsyonu pulse şeklinde enjekte edin ve kalbin temizlenmesi için bekleyin; enjeksiyondan sonra beş pulse daha tekrarlayın, iğneyi çıkarın ve kurumayı önlemek için bir XPBS içeren Petri kabına yerleştirin. Daha sonra, hücrelerde morpho alımını ve korunmasını sağlamak için, E üç ortamı ile doldurulmuş bir transfer pipeti kullanarak larvaları dikkatlice taze E üç ortamı içeren bir Petri kabına geri aktarın. Enjeksiyonları değerlendirmek için deney süresince her 12 ila 24 saatte bir tekrarlayın.

Balıkları anestezi ettikten sonra, parlak alan ve floresan özellikli bir stereo mikroskop ile görüntülemeden önce, E three medyum ile kaplanmış düz ve ıslak bir aros plakasına yerleştirin. Rejenerasyonu analiz etmek için Fiji Image J ücretsiz yazılımını kullanın ve meydana gelen rejeneratif büyüme miktarını belirlemek için çizgi izleme aracından yararlanın. Öncelikle, ana menüdeki ana Fiji penceresine bir dosya sürükleyip bırakarak görüntüleri kalibre edin.

Açılır menüdeki analyze seçeneğine tıklayarak tüm görüntüler için ölçeği ayarlayın. Set scale seçeneğine tıklayın, ardından onay kutusuna tıklayarak global seçeneğini etkinleştirin. Şimdi, araç çubuğundaki rejeneratif büyüme miktarını ölçmek için görüntüyü tekrar sürükleyip bırakın.

Serbest seçim aracını seçin ve ölçülecek alanı daire içine alın. Son olarak, Ctrl M tuşlarına basın. Bu işlem, daire içine alınan alanın değerini kare piksel cinsinden gösteren yeni bir sonuç penceresi açacaktır. Burada görüldüğü üzere, enjeksiyondan sonraki birkaç dakika içinde, morpho endo porter solüsyonu damar sistemi aracılığıyla yüzgeç kıvrımı ve beyin gibi farklı dokulara dağılır ve en az 12 saat veya daha uzun süre orada kalır.

Distal larva yüzgeç yapılarının rejenerasyonunu değerlendirmek için şu yapılar çıkarılmıştır: yüzgeç kıvrımının distal ucu ve omurilik, distal notokord, burada görünmeyen distal gövde kası ve doğrudan enjeksiyonla hedeflemesi zor olan ancak ardışık ventriküler enjeksiyonlar sonrası morfo içerdiği görülen pigment hücreleri. Bu nedenle, bu yöntem morfonun tek tek hedeflemesi zor olan dokulara iletilmesini nispeten kolaylaştırır ve rejenerasyon halindeki yüzgeçteki birkaç farklı dokuda gen fonksiyonunun aynı anda değerlendirilmesine olanak tanır. Rejenerasyonda yer alan spesifik genlerin önemini analiz etmek için, larva yüzgeci kısmen ampute edilir ve morfo içeren tüm dokular rezeke edilir.

Gösterildiği üzere, larva yüzgeç kıvrımı amputasyondan sonraki birkaç gün içinde yapısını yeniden oluşturur. Burada, rejenerasyon için gerekli genleri hedefleyen morpho, gelişimi sonrası enjeksiyon yapılmamış ve uyumsuz morpho kontrollerine kıyasla rejenerasyon yanıtını bozmuştur. Bu teknik, rejenerasyon alanındaki araştırmacıların zebra balığı yüzgecinin rejenerasyonunda yer alan moleküler mekanizmaları keşfetmelerinin yolunu açmıştır.