Microscale Vortex destekli Sıralı Moleküler Teslimat için Electroporator

Bu prosedürün genel amacı, Vortex destekli mikroakışkan gözenekleyici kullanarak çeşitli biyolojik anlamlı molekül türlerini, yüksek verimlilikle, ardışık ve dozajı kontrol edilebilir bir şekilde iletmektir; bu işlem, öncelikle hücreler ve biyomoleküller içeren DPBS çözeltileriyle doldurulmuş dört adet 50 mililitrelik santrifüj tüpünün ayrı ayrı hazırlanması ve her bir tüpün pnömatik akış kontrol sistemine bağlı ilgili flakon tutucusuna takılmasıyla gerçekleştirilir. İkinci adım, her bir ilgili flakondan gelen giriş borularının, gömülü 15 pinli elektrotlara sahip mikroakışkan cihaza yerleştirilmesidir. Ardından, hücreler cihazın içine akıtılır ve burada elektroporasyon odacıklarında oluşan mikro ölçekli vorteksler içinde hapsedilirler.

Son adım, tutulan hücrelere kısa elektrik darbeleri uygulamak ve hemen ardından sitozole iletilecek biyomolekülleri içeren çözeltileri enjekte etmektir. Sonuç olarak, bu işlemden elde edilen hücreler serbest bırakılabilir ve ileri analizler için toplanabilir. Bu tekniğin mevcut yöntemlere göre temel avantajı, önerilen tekniğin, önceden seçilmiş özdeş bir hücre popülasyonuna birden fazla molekülün kontrollü miktarlarını yüksek verimlilik ve canlılık ile ardışık olarak iletebilme kapasitesidir.

Sıvı değişim basamaklarının her bir çözelti adımındaki soğuk akış zamanlaması nedeniyle öğrenilmesi zor olması sebebiyle, bu yöntemin görsel gösterimi kritik öneme sahiptir. Değiştirme adımı, hücre yakalamanın stabilitesini belirler. Bu deneyde, Leibovitz's L 15 besiyerinde %10 v/v fetal bovine serum ve %1 penisilin ilavesiyle T 75 doku kültürü flaskı başına 10 mL hacimde 1 × 10⁵ hücre/mL konsantrasyonda M-D-A-M-B 2 31 metastatik meme kanseri hücre hattı kullanılacaktır.

Streptomycin içeren hücreleri, %0 karbondioksit ortamında, 37 °C'de nemlendirilmiş bir inkübatörde inkübe edin. Ekimden iki gün sonra, hücreleri deneyler için hasat edin. Hücreleri PBS veya DPBS ile yıkadıktan sonra, hücreleri iki dakika boyunca %0,25 tripsin EDTA ile muamele edin.

Enzim aktivitesini inaktive etmek için sekiz mililitre büyüme ortamı ekleyin; hücreleri 200 ×g'de beş dakika boyunca santrifüjle çöktürün ve mililitre başına 5 × 10⁵ hücre nihai konsantrasyonuna ulaşacak şekilde ortamda yeniden süspande edin. Mikroakışkan elektroporasyon cihazının tasarımı ve üretimi bu videoda gösterilmeyecektir, ancak ekteki makalede açıklanmıştır. Sistem; hücreler, moleküller ve bir yıkama solüsyonu için giriş kanallarından oluşmaktadır.

İnersiyel odaklamanın gerçekleştiği iki düz kanal. Akış deneylerini kurmak için elektrotları olan 10 elektroporasyon odası ve bir çıkış. Bir çıkış, polieter eter keton veya PEEK boru ile kısa palsli yüksek voltaj uygulaması için 15 pinli alüminyum elektrodu mikrokanaldaki delikler aracılığıyla belirlenen yerlere yerleştirin.

15 pinli elektrot, 10 pozitif ve beş negatif elektrottan oluşur. Her bir pozitif elektrot, bir negatif elektrottan 1,5 milimetre uzaklıktadır ve aynı polariteye sahip her bir elektrot arasında 1,35 milimetre mesafe vardır. Yüksek voltajlı kısa kare dalga darbeleri üretmek için kullanılan elektrikli ekipmanı, akan çözeltilerle temas halindeki alüminyum elektrotlara bağlayın.

PDMS kalıpta ekipman, bir darbe jeneratörü ve kurum içi yapım yüksek voltaj amplifikatöründen oluşmalıdır. Her biri ayrı ayrı DPBS ile hücre ve molekül içeren çözeltilerle doldurulmuş dört adet 50 mililitre santrifüj tüpü hazırlayın. Her bir tüpü, pnömatik akış kontrol sistemine bağlı olan ilgili flakon tutucusuna takın.

Vial tutuculardan gelen giriş tepe tüplerini mikroakışkan cihazdaki ilgili giriş deliklerine bağlayın. Ardından, kare dalga darbelerinin voltaj büyüklüğünü 100 volt olarak ayarlayın.

Elektroporasyon odası boyunca elektrik alan şiddetinin 0,7 kilovolt/santimetreye denk olması için basınç regülatörü 40 PSIA değerine ayarlanır; tüm numune tüplerini homojen bir şekilde basınçlandırmak için manuel olarak ayarlanabilen tek bir azot kaynağı kullanılır ve münferit çözelti portlarını zamanında etkinleştirmek için yüksek hızlı bir manifolddan yararlanılır. Valf kontrolü için özel olarak oluşturulmuş LabVIEW yazılımı kullanılır.

Valve runner olarak etiketlenmiş lab view yazılımını açın ve Operate başlıklı açılır menüden run seçeneğine tıklayın. Stabil hücre yakalama vorteks oluşumu için gerekli olan akış hızını hazırlamak amacıyla, DPBS rezervuarının vanasını açmak için ilgili vana simgesi olan valve one'a tıklayarak 1.5 dakika boyunca bekleyin. Vana aktif hale geldiğinde simge gri renkten yeşil renge dönmelidir; hücre yakalama adımından önce hem yıkama hem de hücre solüsyonlarını 10 saniye boyunca eş zamanlı olarak cihazdan geçirin.

Çözelti değiştirme aşamasında akışın kesintiye uğramamasını sağlamak için, bu kısa ortak akış adımı her çözelti değiştirme aşamasında tekrarlanmalıdır. Hücreleri elektroporasyon odasına hapsetmek için aktif çözelti portunu yıkama çözeltisinden hücre çözeltisine 30 saniye boyunca getirin. Bu videoda mavi floresan sinyaller canlı kancaları temsil etmektedir.

3, 3, 3, 4, 5 aşama hücreleri. Yıkama portunu açın ve cihazı 20 saniye boyunca yıkayın. Yakalanmamış kontamine hücreleri uzaklaştırmak için ilgilenilen ilk molekülü içeren çözeltiyi akıtın.

Görselleştirme amacıyla cihaza Propidium iodide ekleyin. Bu gösterimde, boyaların daha üstün gürültü-sinyal oranına sahip olması nedeniyle floresan işaretli DExT dizileri yerine nükleik asit boyaları kullanılmıştır; moleküler solüsyonun enjeksiyonundan hemen sonra beş kısa pals uygulayın, uygulanan elektriksel palslerin büyüklüğünü ve sayısını bir osiloskop kullanarak gerçek zamanlı olarak izleyin, moleküllerin floresan sinyalleri mikroskop altında görselleştirilebilir, hücreleri moleküler solüsyon içinde 100 saniye boyunca inkübe edin. Ardından, ikinci molekül olan nükleik asit boyası yo-yo one içeren solüsyonu cihaza akıtın.

Bu gösterimde, ikinci molekül ek elektrik puls uygulamaları olmadan iletilmiştir. Bu video, hücrelerin şu anda üç floresan sinyalinin tamamını eksprese ettiğini doğrulamaktadır: yo-yo, one için yeşil, propidium iodide için kırmızı ve hooks için mavi.

3, 3, 3, 4, 5. Çalışma basıncını beş PSI'ın altına düşürerek hücreleri, alt analizler için bir 96 kuyucuklu plakaya bırakın. Her bırakma işleminden, yaklaşık 100 hücre içeren 100 µL çözelti toplanır.

Akış sitometrisi santrifüfü için yeterli hücre toplamak amacıyla elektroporasyon prosedürü en az üç kez tekrarlanmalıdır. İşlem görmüş hücreleri içeren 96 kuyucuklu plaka, 228 ×g'de beş dakika boyunca santrifüj edilir. Oda sıcaklığında, fazla floresan molekülleri içeren süpernatan uzaklaştırılır ve hücreler DPBS içinde yeniden süspanse edilir.

Floresan işaretli DExT zincirleri iletildiyse, hücreler daha sonra moleküler alım açısından analiz edilir. Verimlilik akış sitometrisi ile belirlenir. Başarılı moleküler iletim, C iki'deki elektropore edilmiş yörünge hücrelerinin floresan yoğunluğundaki değişimlerin izlenmesiyle kalitatif olarak belirlenmiş olup, bu durum tedavi edilen hücrelerin %90'ının 70, 000 Dalton'luk anyonik bir DExT zincir molekülünü aldığını doğrulamıştır.

İlgili molekülü başarıyla alan hücre sayısının işlem gören toplam hücre sayısına oranı olarak tanımlanan her bir aktarılan dekstran molekülünün verimliliği, moleküler ağırlığa veya elektriksel yüklere bağlı olarak önemli ölçüde farklılık göstermemiştir. Test edilen tüm dekstran molekülleri %70'ten daha yüksek bir verimliliklele sitozole iletilmiştir. Burada, elektroporasyon uygulanmamış hücreler için temsilci akış sitometrisi profilleri gösterilmektedir. Başarılı moleküler iletimi belirten floresan eşiği, kontrol örneklerinden gelen sinyaller eşiğin altında kalacak şekilde verilerden belirlenmiştir.

Sırayla elektropore edilmiş hücrelere ait bu temsili akış sitometrisi verileri, akış sitometrisi grafiğini floresan çizgi görüntülerinin yanında göstermektedir; yeşil kutular yalnızca 3000 Dalton nötr dekstran alan hücrelerden gelen sinyalleri, kırmızı kutular ise yalnızca 3000 Dalton iyonik DExT zinciri alan hücrelerden gelen sinyalleri temsil etmektedir. Her iki DExT zinciri molekülünü alan hücrelerden gelen floresan sinyaller sarı ile gösterilmiştir ve bu durum %56'lık bir çift molekül iletim verimliliğine işaret etmektedir. Geliştirilmesinin ardından bu teknik; kompleks hastalıkların tedavisinde sinerjik etkiler elde etmek için terapötik reaktif kombinasyonlarını araştırmak isteyen tıp, biyoteknoloji ve farmakoloji alanındaki araştırmacılar için faydalı olacaktır.

Yüksek voltajlı elektrik darbeleriyle çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini unutmayın ve bu prosedürü gerçekleştirirken topraklamanın sağlandığından emin olmak gibi önlemler her zaman alınmalıdır.