Name: Microscale Vortex destekli Sıralı Moleküler Teslimat için Electroporator (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-08-07T20:15:00.000+00:00
Duration: 10 min 51 s
Description: Öğrenin mikroakışkan vorteks destekli elektroporasyon ile hücrelere sıralı moleküler teslimat yöntemini. Bu teknik yüksek verimlilik ve canlılık sağlayarak kontrollü dozaj ile çoklu biyomolekül iletimini mümkün kılar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Bu çalışma Rowland Yeni Fellow programı tarafından desteklenmektedir. Chris Stokes özel yapılmış, bilgisayar destekli basınç kontrolü kurulumu, Ph.D. Diane Schaak, gelişmesinde yaptığı yardım için: Yazarlar Harvard&#39;da Rowland Enstitüsü bilim adamları ve personel için minnettarlığını ifade etmek istiyorum biyolojik numune taşıma için onun girişi için, Winfield Tepesi için elektrik kurulumu, Ph.D. Alavaro Sanchez, gelişmekte Basınç kurulumu için gerekli mekanik tesisat bileşenleri işlemek için sitometrede akış, Scott Bevis, Kenny Spencer ve Don Rogers erişim verilmesi için. Mikroakışkan ustaları Harvard Üniversitesi&#39;nde Nano Sistemleri Merkezi (MSS) de imal edildi.

1. Hücre Hazırlanması <ol><li> Levha 1 x 10,% 10 (h / h) cenin sığır serumu ve 1 ile takviye Leibovitz L-15 Vasatı içerisinde doku kültürü T75 şişesi başına 10 ml&#39;lik bir hacim içinde metastatik göğüs kanser hücre hattı MDA-MB-231 5 hücre / mi % penisilin-streptomisin. </li><li> 0% CO2 ortamında 37 ° C&#39;de, nemlendirilmiş bir kuluçka makinesi içinde, MDA-MB-231 hücreleri inkübe edin. </li><li> 2 dakika boyunca% 0.25 tripsin-EDTA ile işleme tabi tutarak hücreler 2 gün sonra tohumlama deneyleri için Hücreleri, büyüme ortamı ve 8 ml eklenerek tripsin enzim aktivitesini bloke ederler. </li><li> 5 x 10 5 hücre / ml &#39;lik bir nihai konsantrasyona (Ca 2 + ve Mg2 + olmaksızın DPBS, 1x) Dulbecco fosfat tamponlu tuzlu su içinde 200 x g ve tekrar süspansiyon 5 dakika boyunca santrifüj ile pelet hücreleri. </li></ol> 2. Cihaz Tasarımı ve İmalatı NOT: Maske, ana kalıp yapımında veMikrokanal parça işlem olup, polidimetilsiloksan (PDMS), mikrokanal döküm işlemi normal bir laboratuvar masa üstü gerçekleştirilebilir ise temiz bir oda içinde gerçekleştirilmiştir edilecektir. <ol><li> AutoCAD, Şekil 1 &#39;de gösterildiği gibi bir mikroakışkan cihaz tasarımı. Cihaz (L = 7 mm W = 40 um arasında, H = 70 um), birden fazla enjeksiyon girişine, kaba filtre ve iki paralel düz dikdörtgen şekilli eylemsiz odaklama kanallı bir giriş oluşmalıdır. Bağımsız bir düz kanal alüminyum elektrotlar delikleri ile iki tane ayrı 800 um yerleştirilir 5 elektroporasyon odası, (W, C = 400 um) oluşur. İki çapraz bitişik kesonlar elektroporasyon negatif elektrot için delik paylaşır. Iki düz kanal elektroporasyon bölgenin mansabında bir prize birleştirme. </li><li> LinkCAD kullanarak bir GDSII dosyaya mikro-desenli CAD dosya dönüştürme. Boş bir 5 &quot;x 5&quot; photomask mikro-desen yazBir lazer maske yazıcı kullanarak. Üreticinin protokolünü takip ederek, maske geliştirir. NOT: Maske gelişim süreci Photoresist gelişen, krom aşındırma ve kaldırma karşı içermektedir. Alternatif olarak, mikro-desenler yüksek çözünürlüklü bir şeffaflık üzerine basılmış (&gt; 20.000 dpi) üçüncü taraf üreticiler satın alınan ve bir photomask olarak kullanılabilir. Bir photomask Final mikro özellikleri olumsuz Fotorezist kutuplarını maç şeffaf olmalıdır. </li><li> 70 um son kalınlığı için 2000 rpm&#39;de, 4 inçlik bir silikon gofret üzerinde olumsuz bir fotorezist tabaka ile bükülmüş, standart yumuşak litografi teknikleri kullanarak cihazı 23 tasarım döküm kalıbı imal. </li><li> 95 ° C&#39;de 20 dakika boyunca negatif fotorezist ile gofret Önceden fırınlanmış patates. </li><li> Gofret ile maske başvurun ve bir maske hizalama kullanarak 80 saniye boyunca bir UV kaynağı (17.4 mj / cm 2) maruz. </li><li> Bir SU-8 geliştirici 4 dakika boyunca maruz gofret geliştirin. </li><li> Tedbiryüzey profilometre kullanarak gelişmiş Fotorezist kalınlığı. </li><li> Madde (silikon elastomer kiti) kurutma elastomer 1 oranında ve PDMS, kopyaları oluşturmak için döküm kalıbı üzerine dökün: dikkatli bir şekilde 10 karıştırın. 30 dakika boyunca gazdan arındırın döküm elastomer ve 2 saat boyunca 70 ° C&#39;de bir fırın içinde gazı alınmış bir elastomer ile döküm kalıbı sertleştirmek. </li><li> Pin mengenesi kullanarak girişleri, çıkış ve elektrot ilaveler için kalıp ve zımba deliklerinden mikrokanallı desenleri ile tedavi PDMS çoğaltma delamine. Not: pim mengenenin normal kesme kenar çapı yerine sıkıca PEEK boru (1/32 OD &quot;) ve alüminyum elektrotlar (0,029 OD&quot;) tutulması için yeterli 0.76 mm olması gerekmektedir. </li><li> Sırasıyla 75 ve 500 W mTorr, bir radyo frekans güç ve oksijen kısmi basıncında 7 saniye boyunca bir oksijen plazma temizleyici bir cam slayt bağlama PDMS kopyalarına kapalı mikroakışkan kanal oluşturur. </li></ol> 3. Akış Deneyler <ol><li> Eklealüminyum elektrotlar (0.029 &quot;OD) ve bir çıkış PEEK boru (1/32&quot; mikrokanalda delikleri yoluyla belirlenen yerlere OD) (Şekil 3B). </li><li> Alüminyum elektrotlara yüksek gerilim kısa kare dalga darbeleri üretmek için 18 sorumlu elektrik donanımı bağlayın PDMS kalıp çözeltilerin akıtılmasıyla ile temas halinde olduğu (Şekil 3C). NOT: ekipman darbe jeneratörü ve bir in-house inşa yüksek gerilim amplifikatör oluşmalıdır 18. </li><li> (Şekil 3A) hücreleri ve bir molekül olarak dört adet 50 ml&#39;lik bir santrifüj tek DPBS ihtiva eden tüpler, çözeltiler hazırlayın ve pnömatik akış kontrol sistemine bağlı olarak, ilgili şişe tutucu için her bir tüpe takmak. 18 </li><li> Mikroakışkan cihaz ilgili giriş deliklerine flakon sahiplerinden giriş PEEK hortumu bağlayın. </li><li> Elektrik Bes olması için 100 V, kare dalga darbeleri, V büyüklüğünü ayarlamaLD gücü E = v / l, e elektroporasyon bölmesi üzerinde 0.7 kV / cm eşdeğer olduğu. Not: Burada, Y e pozitif ve negatif elektrotlar akan çözeltisi ile temas halinde olan iki nokta arasındaki mesafedir (Şekil 1 e bakınız). </li><li> 40 psi&#39;ye kadar basınç regülatörü ayarlayın. NOT:. Tek elle ayarlanabilir azot kaynağı muntazam tüm numune şişeleri basınç vermek için kullanılan ve yüksek hızda manifoldu zamanında ısmarlama LabVIEW yazılımı aracılığıyla bireysel çözüm noktalarını etkinleştirmek için kullanılır 18 </li><li> Valf kontrolü için, Vana Runner etiketli ısmarlama LabVIEW yazılımı açın ve işletmek başlıklı açılır menüden çalıştırmak tıklatın. </li><li> Her gelen valf ikonuna tıklayarak vanalar açın. NOT: aktive olduğunda vana simgesi yeşil dönmelidir. Etkin simgesini tıklayıp devre dışı ve vanasını kapatın olacaktır. Kapalı vana simgesi gri dönmelidir. </li><li> (DPBS rezervuar vanasını açınyani., 1.5 dakika boyunca sabit bir hücre hapsi girdap oluşumu için gereklidir ana akış hızına yıkama çözeltisi). </li><li> 30 saniye (örneğin, hücre yakalama adım) için elektroporasyon bölmesi içinde tuzak hücrelere hücre çözeltisine yıkama çözeltisi, aktif solüsyon noktası geçin. </li><li> Çözüm anahtarlama adım sırasında undisrupted akışını sağlamak için hücre hapsi aşamasından önce 10 saniye aynı anda cihaz yoluyla hem yıkama hem de hücre çözümler akış. NOT: Bu kısa eş akış adım, her bir çözelti anahtarlama adımında tekrar edilmelidir. </li><li> Yıkama portu açın ve non-tuzak kirlenmesine neden olan hücreler ortadan kaldırmak amacıyla 20 saniye boyunca cihazı yıkayın. </li><li> Çevrede cihazına (3000 Da nötr veya anyonik dekstran molekülleri ya da 1.5 mg / 70000 Da nötr dekstran molekülün ml 0.2 mg / ml) ilk molekülü içeren çözelti enjekte edilir. </li><li> Derhal enjeksiyonundan sonra beş kısa darbeleri (Dt 2 sn aralıklarla 30 msn =) UygulaMoleküler çözümü ve bir osiloskop kullanarak gerçek zamanlı olarak uygulanan elektrik akımı büyüklüğünü ve süresini izlemek. </li><li> 3.10 birçok kez ek moleküllerin sayısı olarak adımı tekrar teslim edilmesi. Her moleküler dağıtım için, bu durumda moleküler bir solüsyon içinde 100 sn için kuluçkalayın 100 temizle fazla molekülleri uzaklaştırmak için yıkama çözeltisi ile yıkayın cihazı. </li><li> 5 psi değerinin altında ve çalışma basıncı düşürerek alt analizi için 96 oyuklu bir plaka içerisinde hücreleri bırakın. Not: 100 hücre ile çözelti yaklaşık 100 ul her yayın toplanır. </li><li> Deneysel akış sitometri için yeterli hücreleri toplamak için 3.16 üç kez ile 3.9 adımları çalıştırın. </li><li> 228 x g&#39;de 5 dakika boyunca işlenen hücreleri ihtiva eden 96 oyuklu bir plaka santrifüj. </li><li> Aşırı floresan moleküller içerir süpernatantı. </li><li> Flow sitometri analizi için DPBS&#39;de süspansiyon hücreleri. </li><li> Moleküler u sitometrede akışında yük hücreleriverimlilik analizi emme. </li></ol>

<ol><li>Nakamura, H., Funahashi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electroporation+Past+present+and+future%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Growth+Diff%22%5BJournal%5D)">Electroporation Past present and future.</a> Dev Growth Diff. 55, 15-19 (2013).</li>
<li>Geng, T., Lu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+electroporation+for+cellular+analysis+and+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Microfluidic electroporation for cellular analysis and delivery.</a> Lab Chip. 13, 3803-3821 (2013).</li>
<li>Shahini, M., van Wijngaarden, F., Yeow, J. T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fabrication+of+electro-microfluidic+channel+for+single+cell+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedical+Microdevices%22%5BJournal%5D)">Fabrication of electro-microfluidic channel for single cell electroporation.</a> Biomedical Microdevices. 15, 759-766 (2013).</li>
<li>Neumann, E., Toensing, K., Kakorin, S., Budde, P., Frey, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+of+electroporative+dye+uptake+by+mouse+B+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Mechanism of electroporative dye uptake by mouse B cells.</a> Biophysical Journal. 74, 98-108 (1998).</li>
<li>Jaroszeski, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toxicity+of+anticancer+agents+mediated+by+electroporation+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Anti-Cancer+Drugs%22%5BJournal%5D)">Toxicity of anticancer agents mediated by electroporation in vitro.</a> Anti-Cancer Drugs. 11, 201-208 (2000).</li>
<li>Buntru, M., Gartner, S., Staib, L., Kreuzaler, F., Schlaich, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Delivery+of+multiple+transgenes+to+plant+cells+by+an+improved+version+of+MultiRound+Gateway+technology%5BTitle%5D)+AND+%22Transgenic+Res%22%5BJournal%5D)">Delivery of multiple transgenes to plant cells by an improved version of MultiRound Gateway technology.</a> Transgenic Res. 22, 153-167 (2013).</li>
<li>Mir, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-efficiency+gene+transfer+into+skeletal+muscle+mediated+by+electric+pulses%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">High-efficiency gene transfer into skeletal muscle mediated by electric pulses.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 96, 4262-4267 (1999).</li>
<li>Heller, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intradermal+delivery+of+interleukin-12+plasmid+DNA+by+in+vivo+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22DNA+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Intradermal delivery of interleukin-12 plasmid DNA by in vivo electroporation.</a> DNA Cell Biol. 20, 381-381 (2001).</li>
<li>Boukany, P. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanochannel+electroporation+delivers+precise+amounts+of+biomolecules+into+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Nanotechnol%22%5BJournal%5D)">Nanochannel electroporation delivers precise amounts of biomolecules into living cells.</a> Nat Nanotechnol. 6, 747-754 (2011).</li>
<li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synergistic+Effects+of+Nanosecond+Pulsed+Electric+Fields+Combined+with+Low+Concentration+of+Gemcitabine+on+Human+Oral+Squamous+Cell+Carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22In+Vitro+PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Synergistic Effects of Nanosecond Pulsed Electric Fields Combined with Low Concentration of Gemcitabine on Human Oral Squamous Cell Carcinoma.</a> In Vitro PLoS One. 7, (2012).</li>
<li>Kim, M. J., Kim, T., Cho, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+electroporation+chip+using+multiple+electric+field+zones+in+a+single+channel%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Phys+Lett%22%5BJournal%5D)">Cell electroporation chip using multiple electric field zones in a single channel.</a> Appl Phys Lett. 101, (2012).</li>
<li>Wang, S. N., Lee, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micro-%2Fnanofluidics+based+cell+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22Biomicrofluidics%22%5BJournal%5D)">Micro-/nanofluidics based cell electroporation.</a> Biomicrofluidics. 7, (2013).</li>
<li>Sharei, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+vector-free+microfluidic+platform+for+intracellular+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">A vector-free microfluidic platform for intracellular delivery.</a> Proc. Natl Acad Sci USA. 110, 2082-2087 (2013).</li>
<li>Kim, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+reprogramming+of+human+neural+stem+cells+by+OCT4%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Direct reprogramming of human neural stem cells by OCT4.</a> Nature. 461, U649-U693 (2009).</li>
<li>Ozbas-Turan, S., Aral, C., Kabasakal, L., Keyer-Uysal, M., Akbuga, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Co-encapsulation+of+two+plasmids+in+chitosan+microspheres+as+a+non-viral+gene+delivery+vehicle%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pharm+Pharm+Sci%22%5BJournal%5D)">Co-encapsulation of two plasmids in chitosan microspheres as a non-viral gene delivery vehicle.</a> J Pharm Pharm Sci. 6, 27-32 (2003).</li>
<li>Okita, K., Ichisaka, T., Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+germline-competent+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Generation of germline-competent induced pluripotent stem cells.</a> Nature. 448, U311-U313 (2007).</li>
<li>Hur, S. C., Mach, A. J., Di Carlo, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+size-based+rare+cell+enrichment+using+microscale+vortices%5BTitle%5D)+AND+%22Biomicrofluidics%22%5BJournal%5D)">High-throughput size-based rare cell enrichment using microscale vortices.</a> Biomicrofluidics. 5, (2011).</li>
<li>Yun, H. Y., Hur, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequential+multi-molecule+delivery+using+vortex-assisted+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Sequential multi-molecule delivery using vortex-assisted electroporation.</a> Lab Chip. 13, 2764-2772 (2013).</li>
<li>Gehl, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electroporation+theory+and+methods%2C+perspectives+for+drug+delivery%2C+gene+therapy+and+research%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Physiol+Scand%22%5BJournal%5D)">Electroporation theory and methods, perspectives for drug delivery, gene therapy and research.</a> Acta Physiol Scand. 177, 437-447 (2003).</li>
<li>Wang, J., Zhan, Y. H., Ugaz, V. M., Lu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vortex-assisted+DNA+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Vortex-assisted DNA delivery.</a> Lab Chip. 10, 2057-2061 (2010).</li>
<li>Jia, F. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+nonviral+minicircle+vector+for+deriving+human+iPS+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">A nonviral minicircle vector for deriving human iPS cells.</a> Nature Methods. 7, U146-U197 (2010).</li>
<li>Dunbar, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+transfer+to+hematopoietic+stem+cells+Implications+for+gene+therapy+of+human+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Gene transfer to hematopoietic stem cells Implications for gene therapy of human disease.</a> Annual Review of Medicine. 47, 11-20 (1996).</li>
<li>Xia, Y. N., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Soft+lithography%5BTitle%5D)+AND+%22Angew+Chem-Int+Edit%22%5BJournal%5D)">Soft lithography.</a> Angew Chem-Int Edit. 37, 551-575 (1998).</li>
<li>Graziadei, L., Burfeind, P., Barsagi, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Introduction+of+Unlabeled+Proteins+into+Living+Cells+by+Electroporation+and+Isolation+of+Viable+Protein-Loaded+Cells+Using+Dextran+Fluorescein+Isothiocyanate+as+a+Marker+for+Protein-Uptake%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">Introduction of Unlabeled Proteins into Living Cells by Electroporation and Isolation of Viable Protein-Loaded Cells Using Dextran Fluorescein Isothiocyanate as a Marker for Protein-Uptake.</a> Anal Biochem. 194, 198-203 (1991).</li>
<li>Dimitrov, D. S., Sowers, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+Electroporation-Fast+Molecular-Exchange+by+Electroosmosis%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+Et+Biophysica+Acta%22%5BJournal%5D)">Membrane Electroporation-Fast Molecular-Exchange by Electroosmosis.</a> Biochimica Et Biophysica Acta. 1022, 381-392 (1990).</li>
<li>Sukharev, S. I., Klenchin, V. A., Serov, S. M., Chernomordik, L. V., Chizmadzhev Yu, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electroporation+and+electrophoretic+DNA+transfer+into+cells.+The+effect+of+DNA+interaction+with+electropores%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Electroporation and electrophoretic DNA transfer into cells. The effect of DNA interaction with electropores.</a> Biophysical Journal. 63, 1320-1327 (1992).</li>
<li>Glogauer, M., McCulloch, C. A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Introduction+of+large+molecules+into+viable+fibroblasts+by+electroporation+Optimization+of+loading+and+identification+of+labeled+cellular+compartments%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Introduction of large molecules into viable fibroblasts by electroporation Optimization of loading and identification of labeled cellular compartments.</a> Experimental Cell Research. 200, 227-234 (1992).</li>
<li>Verspohl, E. J., KaiserlingBuddemeier, I., Wienecke, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Introducing+specific+antibodies+into+electropermeabilized+cells+is+a+valuable+tool+for+eliminating+specific+cell+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Biochemistry+and+Function%22%5BJournal%5D)">Introducing specific antibodies into electropermeabilized cells is a valuable tool for eliminating specific cell functions.</a> Cell Biochemistry and Function. 15, 127-134 (1997).</li>
</ol>

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

Verim ve çoklu teslimat molekül verimlilikte yeni paralelleştirilmiş elektroporasyon platformu 10 kat geliştirilmesi ile, daha önce geliştirilmiş tek odacıklı sistem sağladığı tüm yararları ek olarak elde edildi. 18 Daha önce hazır yararları: (i) ön-arıtılması canlılık geliştirme için üniform bir boyut dağılımı, (ii) tam bir dozaj ve ayrı ayrı moleküler kontrol ve (iii) düşük işletme elektrik akımı ile hedef hücrelere. Bu molekül ağırlıkları, konjuge florofor türleri ve bir elektrik yükü geniş kolayca elde ed...

Son yıllarda, hücre dışı molekülleri sitosolik sağlanmasının kolaylaştırılması için elektrik darbeleri kullanımı memeli hücreleri manipüle çekici bir araç haline gelmiştir. 1 ayrıca elektroporasyon gibi bilinen bu yöntem, tersine çevrilebilir şekilde erişim elde etmek için doğal olarak zarın geçirgen moleküller sağlayan, hücresel membran permeabilizes hücrelerin hücre içi muhitine. Hemen hemen herhangi bir molekül, elektroporasyon kullanılarak hücre herhangi bir tip membran geçici oluşturulan gözenekler yoluyla sitosol içine sokulabilir için, teknik olarak rapor edilmiş olan, daha fazla tekrarlanabilir evrensel olarak uygulanabilir, ve virüs aracılı, kimyasal mekanizmayı da içeren diğer yöntemlere göre daha verimli Hücreler, canlı ve sağlam tutarken ve optik yaklaşımlar. 2-3 Bu teknik, floresan molekülleri yerleştirilebilir 4 ilaçlar 5 ve nükleik asitler 6-7 kullanılmıştır. Bu faydaları göz önüne alındığında, elektroporasyon ortak emek olarak kabul edilmiştirDNA, transfeksiyonu için atory teknik, in vivo gen terapisi 8 ve hücre aşı çalışmaları. Başarılı elektroporasyon için gerekli olan elektrik alan gücü yakından hücrenin çapı ilişkilidir, çünkü geleneksel elektroporasyon sistemleri aynı zamanda boyut olarak büyük heterojenlikleriyle bu numuneler için pratik etkinlik ve canlılığı elde etmek için olması, yine de, zordur. Ayrıca, bu sistemlerin çoklu moleküler miktarlarda hassas kontrolü toplu Stokastik moleküler teslimat sürecinde güven nedeniyle teslim izin vermez. 9 bu sorunları ele almak için bir çok grup, alt gözeneklendirmenin gerilimlerinin avantajı sunan, mikrofluidik elektroporasyon platformları geliştirdik Daha iyi transfeksiyon verimi, hücre ölüm oranlarında önemli bir azalma ve çoklu molekülleri iletme kabiliyeti. 10-13 Bu avantajlar, elektrot aralığı olan mikro elektro sistemleri az yer kaplayan sayesinde mümkün olmuşturuzunlukları ölçüde başarılı teslimat için gerekli gerilimleri azalan, alt milimetre. Ayrıca, bu mikro elektroporasyon sistemler dağıtım verimliliğini artırırken, indirgenmiş hücre ölümlerini, sonuçta üretilen ısıyı hızla homojen bir elektrik alan dağılımı elde edebilir. Ayrıca bu mikroçipler için şeffaf malzeme kullanımı istemi parametre değişiklikleri için elektroporasyon işleminin yerinde gözlem sağlar. 2,12 Ancak, hassas dozaj kontrolü ve araştırma ve tedavi uygulamaları, 6 gelişmekte için gerekli moleküllü ve hücresel-bağımlı parametre kontrolü, 14-16 hala çözülmemiş kalır. Bu çalışma, ardışık olarak, hedef hücrelerin önceden seçilmiş aynı popülasyonu içine çok molekül verme yetisine sahip bir mikroakışkan girdap destekli elektroporasyon sistemi sunar. Üniform bir boyut dağılımı olan hücreler, daha önce rapor si kullanılarak Elektroporasyondan önce izole edilirze-seçici yakalama mekanizması. 17-18 bir üniform bir boyut dağılımı, daha az değişim elektroporasyon verimlilikte elde edildi ve belirli bir elektrik alanı gücüne göre geliştirilmiş canlılığı sahip olarak. 19 Bundan başka, sürekli mikro girdapları kullanılarak yakalanan hücrelerin ajite boyunca moleküllerin homojen dağılımı için bırakıldı sonuçları ile uyum içindedir bütün sitosol, daha önce, bu sistem, genel olarak, biyolojik uygulamalarda, molekül, geniş bir aralığına uygulanabilirdir olacağını saptamak. bir girdap destekli platform kullanılarak elektroporasyon 20 bilgi teslim edilmiştir molekül ağırlıkları çok geniş bir yelpazede olan makro moleküller metastatik meme kanseri hücreleridir. Ayrıca, gerçek zamanlı süreç izleme yardımı ile, bu iş ağırlıklı olarak difüzyon-aracılı. 14 karşı elektroforezi-aracılı olmak, electrporation sırasında moleküler teslim mekanizması ile ilgili uzun süredir tartışmalara bir son vermek için daha fazla kanıt sağlar </sup&gt; Diğer elektroporasyon sistemlerden farklı olarak, bu platform benzersiz elektroporasyon hassas çok moleküllü teslimat, yüksek moleküler temin verimi, en az hücre ölüm oranı, boyutu ve teslim moleküllerin ücretler geniş bir açıklık, hem de gerçek zamanlı görsel kombine avantaj sağlamaktadır süreci. Bu yetenekleri göz önüne alındığında, geliştirilen elektroporasyon sistemi elektroporasyon moleküler dağıtım mekanizmalarını derinlemesine anlaşılması için gerektiren hücresel yeniden programlama çalışmaları, 6,14,21-22 ilaç dağıtım uygulamaları 10,19 ve uygulamalar için çok yönlü bir araç olarak pratik bir potansiyele sahiptir.

<table><tbody><tr><td>MDA-MB-231 kanser hücre hattı</td><td>Amerikan Tipi Kültür Koleksiyonu (ATCC)</td><td>HTB-26</td><td></td></tr><tr><td>Leibovitz' s L-15 Orta Boy Cellgro</td><td>, Mediatech, Inc.</td><td>10-045-CV</td><td></td></tr><tr><td>Fetal sığır serumu (FBS)</td><td>Gibco, Yaşam Teknolojileri</td><td>16000-044</td><td></td></tr><tr><td>Penisilin-streptomisin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4333</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco'nun fosfat tamponlu salin (DPBS)</td><td>Cellgro, Mediatech, Inc.</td><td>21-030</td><td></td></tr><tr><td>Tripsin</td><td>Gibco, Yaşam Teknolojileri</td><td>25200-056</td><td></td></tr><tr><td>Akış Sitometresi easyCyte HT</td><td>Millipore</td><td>0500-4008</td><td></td></tr><tr><td>Oksijen Plazma Temizleyici</td><td>Teknikleri Micro-RIE</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dektak 6M yüzey profilleyici</td><td>Veeco</td><td></td><td></td></tr><tr><td>KMPR 1050</td><td>Microchem</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SYLGARD 184 SILIKON ELASTOMER KIT</td><td>Dow Corning</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sıkıştırılmış Azot gazı</td><td>Airgas</td><td>NI 300</td><td></td></tr><tr><td>Yüksek Basınç Regülatörü</td><td>McMaster-Carr</td><td>6162K22</td><td></td></tr><tr><td>Aşağı akış regülatörü</td><td>McMaster-Carr</td><td>4000K563</td><td></td></tr><tr><td>Yüksek hızlı 3/2 8 valf manifoldu</td><td>Festo</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sıralı Çek Valf</td><td>Idex Sağlık ve Bilim</td><td>CV3320</td><td></td></tr><tr><td>5/32" OD x 3/32" ID Poliüretan tüpler</td><td>Pnömadine</td><td>PU-156F-0</td><td></td></tr><tr><td>1/4" OD X 0.17" ID Poliüretan tüpler</td><td>Pnömadin</td><td>PU-250PB-4</td><td></td></tr><tr><td>1/16" PEEK borular</td><td>Festo</td><td>P1533</td><td></td></tr><tr><td>1/32" PEEK borular</td><td>Idex Sağlık ve Bilim</td><td>P1569</td><td></td></tr><tr><td>PEEK boru rakorları</td><td>Idex Sağlık ve Bilim</td><td>P881</td><td></td></tr><tr><td>Darbe Jeneratörü</td><td>HP</td><td>8110A</td><td></td></tr><tr><td>Alüminyum Tel</td><td>Bob Martin Company</td><td>6061 ŞAP</td><td></td></tr><tr><td>Osiloskop</td><td>Agilent</td><td>DSO3062A</td><td></td></tr><tr><td>50 ml santrifüj tüpleri</td><td>VWR</td><td>21008-178</td><td></td></tr><tr><td>15 ml santrifüj tüpü</td><td>VWR</td><td>21008-216</td><td></td></tr><tr><td>T75 kültür şişesi</td><td>VWR</td><td>82050-862</td><td></td></tr><tr><td>Dekstran, Tetrametilrodamin, 3.000 MW, Anyonik</td><td>Gibco, Yaşam Teknolojileri</td><td>D3307</td><td></td></tr><tr><td>Dekstran, Tetrametilrodamin, 70.000 MW, Nötr&nbsp;</td><td>Gibco, Yaşam Teknolojileri</td><td>D1819</td><td></td></tr><tr><td>Dekstran, Teksas Kırmızı, 3.000 MW, Nötr</td><td>Gibco, Yaşam Teknolojileri</td><td>D3329</td><td></td></tr></tbody></table>

microscale vortex destekli sıralı moleküler teslimat için electroporator

Microscale Vortex-assisted Electroporator for Sequential Molecular Delivery

Fiziksel hücrelerine olmayan geçirgenler dışsal moleküler problar tanıtmak için çok güçlü bir tekniktir çünkü elektroporasyon, geçmiş yıllarda artan ilgi görmüştür. Bu çalışma, hassas ve moleküler bağlı bir parametre kontrol memeli hücreleri için birden fazla molekül teslimat gerçekleştirebilen bir mikroakışkan elektroporasyon platformu bildirir. Üniform bir boyut dağılımı ile hücreleri izole etmek için etme kabiliyeti verilen elektrik alanı gücüne göre elektroporasyon verimlilikte az varyasyona izin verir; Bu nedenle örnek canlılığı artırmıştır. Dahası, bu süreç de görselleştirme özelliği verimliliğin arttırılması için in situ moleküler hızlı teslimat parametre ayarlaması izin gerçek zamanlı flüoresan molekül alım işlemi, gözlem için izin verir. Bildirilen platformunun geniş yeteneklerini göstermek için, farklı boyutlarda ve elektrik ücretleri ile Macromolecules (örneğin, Dextran&#39;ın 3.000 ve 70.000 Da MW ile) vardıtest edilen tüm molekülleri için yüksek bir uygulama randımanı (&gt;% 70) ile metastatik meme kanserli hücrelere verilebilir. Geliştirilen platform-chip elektroporasyon teknikleri yararlı olabilir araştırma alanları genişleme kullanım potansiyelini kanıtlamıştır.

Geliştirilen paralel mikroakışkan Electroporator metastatik meme kanseri hücrelerini canlı olarak çeşitli boyutlarda ve elektrik ücretleri makromolekuller teslim. Başarılı moleküler teslimat yerinde niteliksel elektroporasyona yörüngedeki hücrelerinin floresan yoğunluğundaki değişmeler izlenerek tespit ve akış sitometresi analizi ile ölçümü ile teyit edilmiştir. 4A muamele edilen hücrelerin% 90 70000 Da nötr dekstran alımı olduğunu göstermektedir. İstatistiksel analiz ...

Bir mikro-akışkan girdap eliyle elektroporasyon platformu kesin dozaj ve bağımsız kontrolü ile aynı hücre popülasyonlarına dağılımını çok sayıda molekülün ardışık olarak verilmesi için geliştirilmiştir. Sistemin büyüklüğü göre hedef hücre saflaştırma adımı önceki elektroporasyon moleküler verme etkinliğini ve işlenmiş hücre canlılığı arttırmak için destekli.

Microscale Vortex destekli Sıralı Moleküler Teslimat için Electroporator

Electroporation has received increasing attention in the past years, because it is a very powerful technique for physically introducing non-permeant ...

Bu prosedürün genel amacı, Vortex destekli mikroakışkan gözenekleyici kullanarak çeşitli biyolojik anlamlı molekül türlerini, yüksek verimlilikle, ardışık ve dozajı kontrol edilebilir bir şekilde iletmektir; bu işlem, öncelikle hücreler ve biyomoleküller içeren DPBS çözeltileriyle doldurulmuş dört adet 50 mililitrelik santrifüj tüpünün ayrı ayrı hazırlanması ve her bir tüpün pnömatik akış kontrol sistemine bağlı ilgili flakon tutucusuna takılmasıyla gerçekleştirilir. İkinci adım, her bir ilgili flakondan gelen giriş borularının, gömülü 15 pinli elektrotlara sahip mikroakışkan cihaza yerleştirilmesidir. Ardından, hücreler cihazın içine akıtılır ve burada elektroporasyon odacıklarında oluşan mikro ölçekli vorteksler içinde hapsedilirler.Son adım, tutulan hücrelere kısa elektrik darbeleri uygulamak ve hemen ardından sitozole iletilecek biyomolekülleri içeren çözeltileri enjekte etmektir. Sonuç olarak, bu işlemden elde edilen hücreler serbest bırakılabilir ve ileri analizler için toplanabilir. Bu tekniğin mevcut yöntemlere göre temel avantajı, önerilen tekniğin, önceden seçilmiş özdeş bir hücre popülasyonuna birden fazla molekülün kontrollü miktarlarını yüksek verimlilik ve canlılık il

microscale-vortex-assisted-electroporator-for-sequential-molecular

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Biyomühendislik

Roman mikroakışkan sistemi pasif pompalama olgusu ve kullanıcı kontrollü bir sıvı iletim sistemi kullanılarak geliştirilmiştir. Bu mikroakışkan sistem kullanımı düşük maliyetli, kolay, hacimsel hassasiyet, yüksek hız, tekrarlanabilirlik ve otomasyon verilen biyolojik uygulamalar geniş bir yelpazede kullanılan olma potansiyeline sahiptir.

Mikroakışkan Cihazlar Pasif pompalanması için Yüksek Hızlı Damlacık tabanlı Dağıtım Sistemi

Bir aracı ve kimyalarına sırayla elektrik için gerek olmaksızın bir numuneden proteinler tarafından takip nükleik asitler izole etmek için tarif edilmiştir. Aracı izolasyon kimyaları katı-faz ekstraksiyon ilkelere dayalı iken bir transfer pipeti içinde düzenlenen bir sorbent oluşur. İzole makromoleküller immüno-bazlı ve PCR bazlı analizleri ile analiz edilebilir.

Elektrik-Free, Sıralı Nükleik Asit ve Protein İzolasyonu

Sahada ıslatma cihazlarının (Field-DW) imalatı ve çalıştırılması için protokolün yanı sıra, elektrik alanlarının damlacık içerikleri üzerindeki etkilerinin ön çalışmaları açıklanmaktadır.

Azaltılmış Damlacık-yüzey etkileşiminden yararlanarak Dijital Mikroakiskan içinde Bioanalytes ulaşımı optimize etmek

Bu protokol, bir mikroakışkan cihaz kullanarak otomatik küçük hacimli (0,15–1,5 ml) parçacık ayırma işlemleri gerçekleştirmek için bir sistem mimarisini tanımlar ve akustoakışkan cihaz performansını ve çalışmasını optimize etme yöntemlerini tartışır.

Bir mikroakışkan Hassas Küçük hacimli Numune İşleme Platformu ve Akustik mikrocihazda Ayrı Biyolojik Parçacıklar Boyutu Kullanımı

Tek hücreli sıralama genotypic heterojenlik biyolojik sistemlerde ortaya çıkarır, ama daha fazla işlem hacmi derin topluluk kompozisyon ve işlev profil oluşturma için gerekli güncel teknolojileri eksikliği. Burada, biz bir mikrosıvısal iş akışı sıralama için tarif &gt; 50.000 tek hücreli genleri farklı popülasyonlar hücre.

Tek hücreli genom sıralama için bir üretilen iş Ultrahigh mikrosıvısal Platform

Bu eser mikrosıvısal damlacık tabanlı platformlar imalatı ve polyacrylamide mikroküreler microsphere-PCR güçlendirme için uygulanması için bir yöntem sağlar. Microsphere-PCR yöntemi, Çift iplikçikli DNA ayıran olmadan tek iplikçikli DNA amplicons elde olanak verir.

Bir damlacık dayalı mikrosıvısal yaklaşım ve Microsphere-PCR güçlendirme tek iplikçikli DNA'Amplicons için

Bu protokol, akustik damlacık fırlatma teknolojisini kullanarak 384-Well plakasında memelinin hücrelerinin yüksek verim Plasmid transfeksiyonunu açıklar. Zaman alıcı, hataya eğilimli DNA dağıtımı ve çoğullama, aynı zamanda transfeksiyon reaktif dispenpleme, yazılım odaklı ve bir nanodispenser cihaz tarafından gerçekleştirilir. Hücreler daha sonra bu önceden doldurulmuş kuyuların içinde tohumlandı.

Akustik Nanodispensing teknolojisini kullanarak yüksek verim DNA Plasmid multiplexing ve transfeksiyon

Yağdaki su damlacık tahlilleri analitik kimya, enzim evrimi ve tek hücre analizi için yararlıdır, ancak tipik olarak damlacıkları oluşturmak için mikroakışkanlar gerekir. Burada, damlacık tahlillerini gerçekleştirmek için mikroakışkan içermeyen bir yaklaşım olan parçacık şablonlu emülsifikasyonu açıklıyoruz.

Parçacık Şablonlu Emülsifikasyonu MikroakışkanSız Damlacık Tahlillerini Mümkün

Bu protokol, çip üzerinde laboratuvar, mikroakışkan elektroporasyon cihazı oluşturmak için gereken mikrofabrikasyon tekniklerini açıklar. Deney düzeneği, sürekli bir akışta kontrollü, tek hücre düzeyinde transfeksiyonlar gerçekleştirir ve popülasyon tabanlı kontrol ile daha yüksek verimlere genişletilebilir. Hücre zarı geçirgenliğinin derecesini gerçek zamanlı olarak elektriksel olarak izleme yeteneğini gösteren bir analiz sağlanmıştır.

Sürekli akışlı, permeabilizasyon algılamalı mikro-elektroporasyon sisteminin imalatı ve işletilmesi

Hücre dışı veziküller biyomedikal uygulamalar için büyük umut vaat etmektedir, ancak mevcut izolasyon yöntemleri zaman alıcıdır ve klinik kullanım için pratik değildir. Bu çalışmada, hücre dışı veziküllerin büyük hacimli biyoakışkanlardan minimum adımlarla sürekli bir şekilde doğrudan izolasyonunu sağlayan bir mikroakışkan cihaz sunuyoruz.

Çatallı A4F Mikroakışkan Cihaz ile Büyük Hacimli Örneklerden Hücre Dışı Veziküllerin Tek Adımlı İzolasyonu

Bu protokol, birincil insan T hücrelerinde TCRα/β reseptörünün küçültülmüş CRISPR–Cas9 genom düzenlemesini 'DMF-ection' olan dijital mikrofluidik (DMF) elektroporasyon platformu kullanarak tanımlar. Bu yöntem, yüksek canlılıkla paralel, düşük girdili gen düzenlemesini mümkün kılar ve çok hücreli 3D sferoidlere mRNA iletimi için daha da uyarlanabilir.

Düşük Girişli CRISPR Genom Düzenleme ve Süspansiyon T Hücreleri ile 3D Hücre Modellerinde mRNA Transfeksiyonu için Dijital Mikrofluidik Elektroporasyon Platformu

Öğrenin mikroakışkan vorteks destekli elektroporasyon ile hücrelere sıralı moleküler teslimat yöntemini. Bu teknik yüksek verimlilik ve canlılık sağlayarak kontrollü dozaj ile çoklu biyomolekül iletimini mümkün kılar.

Microscale Vortex destekli Sıralı Moleküler Teslimat için Electroporator

Daha fazla video keşfet