Microscale Vortex destekli Sıralı Moleküler Teslimat için Electroporator

Bu prosedürün genel amacı, Vorteks destekli mikroakışkan gözenekli kullanarak yüksek verimlilikle sıralı ve dozaj kontrol edilebilir bir şekilde çeşitli biyolojik olarak anlamlı moleküller sunmaktır, bu, önce hücreler ve biyomoleküller içeren DPBS çözeltilerini ayrı ayrı içeren dört adet 50 mililitrelik santrifüj tüpünün hazırlanması ve her bir tüpün pnömatik akış kontrol sistemine bağlı ilgili flakon tutucusuna bağlanmasıyla gerçekleştirilir. İkinci adım, her bir ilgili flakondan gelen giriş borularını gömülü 15 pinli elektrotlarla mikroakışkan cihaza yerleştirmektir. Daha sonra, hücreler, elektroporasyon odalarında oluşan mikro ölçekli girdaplarda sıkışıp kaldıkları cihaza akar.

Son adım, sıkışmış hücrelere kısa elektrik darbeleri uygulamak ve hemen ardından biyomolekülleri içeren çözeltilerin sitozole enjekte edilmesidir. Sonuç olarak, bu işlemden elde edilen hücreler, aşağı akış analizi için serbest bırakılabilir ve toplanabilir. Bu tekniğin mevcut yöntemlere göre en büyük avantajı, önerilen tekniğin, yüksek verimlilik ve canlılık ile önceden seçilmiş özdeş bir hücre popülasyonuna kontrollü miktarda çoklu molekülü sıralı olarak iletebilmesidir.

Bu yöntemin görsel gösterimi kritik öneme sahiptir, çünkü sıvı değişim adımlarının öğrenilmesi zordur, çünkü her çözeltide soğuk akış adımının zamanlaması vardır. Anahtarlama adımı, hücre yakalamanın stabilitesini belirler. Metastatik bir meme kanseri hücre hattı M-D-A-M-B 2 31, bu deney plakasında, T 75 başına 10 mililitre hacimde mililitre başına 10 ila beşinci hücre kullanılacaktır Leibovitz'in L 15 ortamında doku kültürü şişesi, hacim başına% 10 hacim, fetal sığır serumu ve% 1 penisilin ile desteklenmiştir.

Streptomisin, hücreleri nemlendirilmiş bir inkübatörde 37 santigrat derecede %0 karbondioksit ortamıyla inkübe eder. Tohumlamadan iki gün sonra, deneyler için hücreleri hasat edin. Hücreleri bukos fosfat tamponlu salin veya DPBS ile yıkadıktan sonra, hücreleri iki dakika boyunca% 0.25 tripsin EDTA ile tedavi edin.

Enzimatik aktivite pelet hücrelerini 200 kez G'de beş dakika boyunca santrifüjleme ile etkisiz hale getirmek için sekiz mililitre büyüme ortamı ekleyin ve ortamı mililitre başına beş kez 10 ila beşinci hücrenin nihai konsantrasyonuna yeniden süspanse edin. Mikroakışkan elektroporasyon cihazının tasarımı ve üretimi bu videoda gösterilmeyecektir, ancak beraberindeki el yazmasında açıklanmıştır. Sistem, hücreler, moleküller ve bir yıkama çözeltisi için girişlerden oluşur.

Ataletsel odaklamanın meydana geldiği iki düz kanal. Elektrotlu 10 elektroporasyon odası ve akış deneyleri için kurulacak bir çıkış. Bir priz, poli eter, eter keton veya tepe borusu ve kısa darbe, yüksek voltaj uygulaması için 15 pinli alüminyum elektrotu mikro kanaldaki delikler aracılığıyla belirlenen yerlere yerleştirin.

15 pinli elektrot, 10 pozitif ve beş negatif elektrottan oluşur. Her pozitif elektrot, negatif bir elektrottan 1,5 milimetre aralıklı olarak yerleştirilmiştir ve aynı polariteye sahip her elektrot 1,35 milimetre aralıklı olarak yerleştirilmiştir. Yüksek voltajlı kısa kare dalga darbeleri üretmek için elektrikli ekipmanı, akan çözeltilerle temas halinde olan alüminyum elektrotlara bağlayın.

PDMS kalıbında, ekipman bir darbe jeneratörü ve şirket içi inşa edilmiş bir yüksek voltaj amplifikatöründen oluşmalıdır. DPBS ve hücreler ve moleküller içeren çözeltiler içeren dört adet 50 mililitrelik santrifüj tüpünü ayrı ayrı hazırlayın. Her tüpü pnömatik akış kontrol sistemine bağlı ilgili flakon tutucusuna takın.

Flakon tutuculardan gelen giriş tepe borusunu mikroakışkan cihazdaki ilgili giriş deliklerine bağlayın. Ardından, ayarlayın. Kare dalganın büyüklüğü voltları 100 volta düşürür.

Elektroporasyon odası boyunca elektrik alan kuvvetinin santimetre başına 0.7 kilovolta eşdeğer olması için. Basınç regülatörünü 40 PSIA'ya ayarlayın, tüm numune şişelerini eşit şekilde basınçlandırmak için manuel olarak ayarlanabilen tek bir nitrojen kaynağı kullanılır ve bireysel çözelti portlarını zamanında etkinleştirmek için yüksek hızlı bir manifold kullanır. Valf kontrolü için özel olarak oluşturulmuş laboratuvar görünümü yazılımını kullanma.

Laboratuvar görünümünü açın, valve runner etiketli yazılım ve Çalıştır başlıklı açılır menüden çalıştır'a tıklayın. Kararlı hücre yakalama girdabı oluşumu için gereken akış hızını 1.5 dakika boyunca doldurmak üzere DPBS rezervuarının valfini açmak için ilgili valf simgesi valfine tıklayın. Valf simgesi, hücre yakalama adımından önce 10 saniye boyunca cihazdan aynı anda hem yıkama hem de hücre çözeltileri olan akış etkinleştirildiğinde griden yeşile dönmelidir.

Çözelti değiştirme adımı sırasında kesintisiz akışı sağlamak için, bu kısa eş akış adımı her çözelti değiştirme adımında tekrarlanmalıdır. Hücreleri 30 saniye boyunca elektroporasyon odasında hapsetmek için aktif çözelti portunu yıkama solüsyonundan hücre solüsyonuna geçirin. Bu filmde, mavi floresan sinyaller uygun kancaları temsil ediyor.

3, 3, 3, 4, 5 aşamalı hücreler. Yıkama portunu açın ve cihazı 20 saniye boyunca yıkayın. Hapsolmuş olmayan kirletici hücreleri uzaklaştırmak için, ilgilenilen ilk molekülü içeren çözeltiyi akıtan.

Propidium iyodürü görselleştirme amacıyla cihaza yerleştirin. Bu gösteride, boyaların üstün gürültü-sinyal oranı nedeniyle floresan etiketli DExT iplikleri yerine nükleik asit boyaları kullanılır, moleküler çözeltinin enjeksiyonundan hemen sonra beş kısa darbe uygulayın, uygulanan elektrik darbelerinin büyüklüğünü ve sayısını izleyin bir osiloskop kullanarak gerçek zamanlı olarak, moleküllerin floresan sinyalleri mikroskop altında görselleştirilebilir, Hücreleri moleküler çözelti içinde 100 saniye inkübe edin. Daha sonraki akış, ikinci molekülü içeren çözelti, nükleik asit boyası yo-yo bir cihaza girer.

Bu gösterimde, ikinci molekül ek elektrik darbesi uygulamaları olmadan verilir. Bu film, hücrelerin artık üç floresan sinyalini de ifade ettiğini doğruluyor. Yo-yo için yeşil, bir, propidium, iyodür için kırmızı ve kancalar için mavi.

3, 3, 3, 4, 5. Çalışma basıncını beş PSI'nin altına düşürerek aşağı akış analizi için hücreleri 96 oyuklu bir plakaya bırakın. Her salımdan 100 hücreli yaklaşık 100 mikrolitre çözelti toplanır.

Akış sitometrisi santrifüjü için yeterli hücre toplamak için elektroporasyon prosedürü en az üç kez tekrarlanmalıdır. Beş dakika boyunca 228 kez G'de işlenmiş hücreleri içeren 96 oyuklu plaka. Oda sıcaklığında, fazla floresan molekülleri içeren süpernatanı çıkarın ve DPBS'deki hücreleri yeniden süspanse edin.

Floresan etiketli DExT iplikleri verildiyse, hücreler daha sonra moleküler alım için analiz edilir. Akış sitometrisi ile verimlilik. Başarılı moleküler dağıtım, C iki'deki elektroporasyonlu yörüngeli hücrelerin floresan yoğunluğundaki değişikliklerin izlenmesiyle kalitatif olarak belirlendi, bu da tedavi edilen hücrelerin% 90'ının iyonik bir DExT zinciri molekülü olan 70.000 Dalton'u aldığını doğruladı.

İlgilenilen molekülü başarıyla alan hücre sayısının toplam işlenmiş hücre sayısına oranı olarak tanımlanan aktarılan her bir dekstran molekülü için verimlilik, moleküler ağırlığa veya elektrik yüklerine bağlı olarak önemli ölçüde değişmemiştir. Test edilen tüm dekstran molekülleri, %70'ten daha yüksek bir verimlilikle sitozole verildi Burada, elektroporasyon ile tedavi edilmeyen hücreler için temsili akış sitometri profillerimiz gösterilmiştir. Başarılı moleküler iletimi gösteren floresan eşiği, kontrol numunelerinden gelen sinyaller eşiğin altında bulunacak şekilde verilerden ayarlanır.

Sıralı elektroporasyonlu hücreler için bu temsili akış sitometrisi verileri, floresan çizgi görüntülerinin yanındaki akış sitometrisi grafiğini görüntüler, yeşil kutular 3000'i alan hücrelerden, yalnızca Dalton nötr dekstranından gelen sinyalleri ve kırmızı kutular hücrelerden gelen sinyalleri temsil eder. İyonik bir DExT ipliği olan 3000 Dalton'u almak, yalnızca hücrelerden gelen floresan sinyalleri, sarı ile gösterilen her iki DExT iplikçik molekülü, geliştirilmesinden sonra %56'lık bir çift molekül dağıtım verimliliğini gösterir. Bu teknik, tıp, biyoteknoloji ve farmakoloji alanındaki araştırmacıların, karmaşık hastalıkların tedavisinde sinerjik etkiler elde etmek için terapötik reaktiflerin kombinasyonunu keşfetmeleri için faydalı olacaktır.

Yüksek voltajlı elektrik darbeleriyle çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini ve bu prosedürü gerçekleştirirken topraklı olduğunuzdan emin olmak gibi önlemlerin her zaman alınması gerektiğini unutmayın.