Modelleme Astrositom Patogenez İn Vitro Ve In Vivo Kortikal Astrositler veya Şartlı, Genetiği fareler ile Nöral Kök Hücreler kullanma

Aşağıdaki deneyin genel amacı, in vitro ve in vivo fenotipik karakterizasyon için tanımlanmış hücre tiplerinden genetik olarak tasarlanmış astrositom modelleri oluşturmaktır. Bu, in vitro kültür için yenidoğan koşullu genetik olarak tasarlanmış farelerden Cree eksprese etmeyen vahşi tip birincil hücrelerin toplanmasıyla elde edilir. İkinci adımda, birincil hücreler, in vitro olarak F flox alellerinin genetik rekombinasyonunu indüklemek için Cree rekombinasyonunu kodlayan bir adenoviral vektör ile enfekte edilir.

Daha sonra, yeniden birleştirilen hücreler, fenotipik karakterizasyonları için seri olarak kültürlenir. Sonuç olarak, tanımlanan mutasyonların spesifik nöral hücre tiplerinde glio ageneziyi teşvik edip etmediği, in vitro ve in vivo olarak tümörojenik ilgili fenotiplerin karakterizasyonu ile belirlenir. Bu yöntem, aşağıdaki gibi temel nöro-onkoloji sorularının yanıtlanmasına yardımcı olabilir: Astrositomla ilişkili mutasyonların fenotipik sonuçları nelerdir?

Bu tekniğin etkileri, astrositomlar için klinik öncesi ilaç geliştirmeye kadar uzanır, çünkü bu genetik olarak tanımlanmış hücreler, immün yetkin singenetik farelerde in vitro ve in vivo olarak kullanılabilir. Hücre hasadı ve ortotopik enjeksiyon adımları teknik olarak zor olduğundan ve anatomik yapıların doğru bir şekilde tanımlanmasını gerektirdiğinden, bu yöntemin görsel olarak gösterilmesi kritik öneme sahiptir. Prosedürü göstermek, laboratuvarımdan bir teknisyen olan Ryan Bash olacak Beyin dokusunu toplamak için.

Omurilikten buruna kadar genetik olarak tasarlanmış bir farenin kafatası üzerinde bir ila üç günlük ötenazi yapılmış yenidoğan, deride sagital bir kesim yapmak için etanol sterilize diseksiyon makası kullanarak başlayın. Daha sonra, omurilikten başlayarak ve koku soğancıklarını geçecek şekilde sagital sütür boyunca kafatasında bir kesi yapın. Ardından, düz mikro forseps kullanarak kafatasının her yarım küresini beyinden yanal olarak nazikçe soymak için kavisli forseps kullanın.

Daha sonra, beyincik ve koku soğancığından kaçınmaya özen göstererek her kortikal hemisferin dorsal kısmını nazikçe sıkıştırın ve beyin dokusunu H-B-S-S-N içeren bir doku kültürü kabına yerleştirin. Diseksiyon mikroskobu altında, meninksleri her kortikal hemisferden nazikçe çıkarmak için iki çift mikro forseps kullanın ve beyin dokusunu homojenize etmek için doku kültürü kabını tekrar buzun üzerine yerleştirin. İlk olarak, kortikal hemisferleri zar atmak için temiz bir tıraş bıçağı kullanın.

Daha sonra plakayı bir doku kültürü başlığına taşıyın ve doku parçalarını steril 15 mililitrelik konik bir tüpe aktarın. Plakayı bir mililitre buz gibi HBSS ile durulayın ve yıkamayı da tüpe aktarın. Fazla HBSS'yi iki mililitre oda sıcaklığında çıkardıktan sonra, EDTA ile tüpe tripsin yapın ve bir mililitrelik bir pipetle yaklaşık 10 kez yukarı ve aşağı pipetleyerek doku parçalarını daha da ilişkilendirin.

Hücre süspansiyonunu 37 santigrat derecede 15 ila 20 dakika inkübe edin. İnkübasyondan sonra her beş dakikada bir hücre çözeltisini ters çevirerek dikkatlice karıştırın, az önce gösterildiği gibi 10 kez yukarı ve aşağı pipetleyerek tripsini inhibe etmek için hücre süspansiyonuna üç mililitre tam ortam karıştırıldı. Sonra ayrışmış astrositleri aşağı doğru döndürün.

Snat'ı bir mililitrelik pipetle dikkatlice çıkarın ve peleti dört mililitre 37 santigrat derecede yeniden süspanse edin. Eksiksiz medya. Daha sonra astrosit süspansiyonunu bir T 75 vidalı üst doku kültürü şişesine aktarın ve kortikal astrositleri hasattan yaklaşık 16 saat sonra% 5 karbondioksit içinde 37 santigrat derecede tutun.

Şişeyi dört mililitre 37 santigrat derece HBSS ile yıkayın. Daha sonra dört mililitre tam ortam ekleyin ve kortikal astrositleri% 5 karbondioksitte 37 santigrat derecede tutun. Kültür yaklaşık% 95'e ulaştığında, kültürü gece boyunca% 5 karbondioksit içinde 37 santigrat derecede çalkalayın.

Daha sonra ayrılmış hücreleri içeren ortamı çıkarın ve plakayı dört mililitre daha 37 santigrat derece HBSS ile yıkayın. Daha sonra dört mililitre taze tam ortam ekleyin ve kültürü kortikal astrositler için zenginleştirdikten 24 saat sonra hücreleri tekrar inkübe edin. Kültürü iki mililitre tam ortamla yenileyin.

Daha sonra hücreleri, ilgilenilen adenovirüsün mililitresi başına 10. pfu'nun 10'da 10'da bir mikrolitre, 32 santigrat derecede, beşte %5 karbondioksit içeren bir mililitre tam ortam ile inkübe edin. Gfab CRE enfeksiyonu, kültürde beş ila dokuz geçişten sonra astrosit saflığını% 59'dan% 90'ın üzerine çıkaran rekombine gfab astrositlerinde proliferatif bir avantaja neden olur. Altı saat sonra, virüs içeren besiyerini çıkarın ve kültürü taze, eksiksiz besiyerinde yeniden inkübe edin.

Kortikal astrositler yaklaşık% 90 birleşimde hasat edildikten ve uygun hücre sayısı buz gibi% 5 Metilselüloz içinde yeniden süspanse edildikten sonra. 250 mikrolitrelik bir cam şırıngayı tekrarlayan bir antijen dağıtıcısına yerleştirin ve ardından şırıngaya kör bir 18 gauge iğne takın. Kortikal astrositleri şırıngaya aspire etmek ve hava kabarcıklarını gidermek için 18 gauge iğneyi kullanın.

Ardından 18 gauge iğneyi atın ve şırıngaya 27 gauge iğne takın. Astrositleri implante etmek için yeni iğneden sıvı dışarı atılana kadar antijen dağıtıcısındaki düğmeye basın. Daha sonra, üç ila altı aylık bir immünokompetan alıcı hayvanı stereotaksik bir çerçeve içinde sabitleyin ve kulaklar ve gözler arasında yaklaşık 0,5 santimetre uzunluğunda sagital sütür üzerinde bir kesi yapın.

Koronal ve sagital sütürlerin veya BRE MA'nın kesişimini ve ayrıca lambdoidin sagital sütürlerde veya Lambda'da kesişimini bulun. BMA ve lambda'nın aynı yatay düzlemde olduğundan emin olduktan sonra, şırıngayı ve tekrarlayan antijen dağıtıcısını hayvanın başının üzerindeki stereotaksik çerçeveye takın ve iğnenin ucunu bgma ile temas ettirin. İğneyi kafatası yüzeyinden hafifçe kaldırın ve bgma'dan iki milimetre lateral ve bir milimetre rostral hareket ettirin.

Ardından iğneyi kafatasından dikkatlice hedefine indirin. Breg MA'dan dört milimetre ventral ve tekrarlayan antijen dağıtıcısını aktive edin. Hücre süspansiyonunun beş mikrolitresini enjekte etmek için bir kez.

İntrakraniyal basıncın dengelenmesine izin vermek için iğneyi iki dakika yerinde bırakın ve ardından oluşabilecek herhangi bir kanamaya basınç uygulamak için bir pamuk takası kullanarak iğneyi 30 saniyelik bir süre boyunca yavaşça geri çekin. Son olarak, yara kenarlarına yaklaşmak ve kesiği kapatmak için doku yapıştırıcısı kullanın ve ardından hayvanı iyileşmesi için temiz, ılık bir kafese koyun. Yerleşik insan hücre hatlarının ksenogreftleri, immün yetmezliği olan konakçılara ihtiyaç duyar ve genellikle insan astrositomlarının histopatolojisini özetlemez.

Örneğin, U 87 MG ortotopik ksenogreftler, normal bir beyni istila etmeyen sınırlı tümörler oluşturur. Buna karşılık, T RRP boş astrositlerinin immün yetkin sinjeneik farelerin beyinlerine enjeksiyonu, insan meslektaşlarının histolojik özelliklerini, özellikle de normal beyin dokusunun istilasını özetleyen tümörler verir. TRP boş allogreft büyümesini izlemek için, hücre enjeksiyonundan sonra her beş günde bir fareler safiye edildi ve tümör yükü, h ve e lekeli beyin bölümlerinde tümör alanının ölçülmesiyle belirlendi.

Tümör alanının zaman içinde katlanarak arttığı belirlendi ve alıcı beyinlere bir kez 10 ila beşte bir oranında TP nll astrositlerinin ortotopik enjeksiyonu nörolojik morbiditeye yol açtı. Ortalama 22 günlük sağkalım ile. Uzunlamasına görüntüleme in vivo tümör büyüme kinetiğini tanımlamak için kullanılmıştır.

Bu nedenle, bu deneyde, TR ceza astrositleri ve lusiferazı ifade etmek için tasarlanmış, bağışıklık yetkin sinjeneiklerin beyinlerine enjekte edildi. Altlık eşleri ve tümör büyümesi seri biyolüminesans görüntüleme ile belirlendi. 16 günlük bir süre boyunca biyolüminesansta 15 kat artış gözlendi.

Bu prosedürü takiben, etkinliği belirlemek ve yeni ilaç kombinasyonlarını test etmek için in vitro ve in vivo ilaç testi yapılabilir. Bu videoyu izledikten sonra, koşullu genetik olarak tasarlanmış farelerden krea eksprese eden olmayan farelerden kortikal astrositlerin nasıl hasat edileceğini, in vitro genetik rekombinasyonun nasıl indükleneceğini ve immün yetmezliği olan farelerde ortotopik allogreftler kullanılarak tümörjenezin nasıl modelleneceğini iyi anlamış olmalısınız.