Bir Hücre temelli bir ELISA testi kullanarak, HIV-1 zarf trimerik Glikoproteinler konformasyonel Değerlendirilmesi

Aşağıdaki deneyin genel amacı, RIC HIV tek zarf glikoproteinlerini veya monoklonal antikorlarla ENV onayını sorgulamaktır. Bu, hücre yüzeyinde kimerik HIV bir E NV proteinlerini eksprese etmek için önce aderans hücrelerinin kesilmesiyle elde edilir. İkinci adım olarak, hücreler, epitop maruziyetine bağlı olarak ENV'yi bağlayacak olan anti ENV monoklonal antikorlarla inkübe edilir.

Daha sonra, bir kemilüminesans testi ile antikor etkileşimini ölçmek için bir HRP konjuge ikincil antikor eklenir. Her biri için elde edilen nispi ışık birimlerine dayalı olarak VNV'ye bağlı antikorların nispi seviyelerini gösteren sonuçlar elde edilir. Bu tekniğin, gerçeklere dayalı bağlama gibi mevcut yöntemlere göre en büyük avantajı, bu tekniğin düşük miktarda antikorla yapılabilmesi ve yüksek verimde, laboratuvardaki bir doktora sonrası doktorun bu tekniği uygulayacak olmasıdır.

İnsan osteosarkom hücreleri bu deneyde, transfeksiyon plakasından bir gün önce, iki kez 10 ila dördüncü hücre kullanılır. Lüminesans okuması için uygun opak 96 oyuklu bir hücre kültürü plakasında. Fetal sığır serumu ve penisilin streptomisin ile takviye edilmiş kullanılmış delcos modifiye kartal ortamı, hücreleri gece boyunca 37 santigrat derecede ve ertesi gün% 5 karbondioksitte inkübe eder.

Transfeksiyon karışımını hazırlayın. İlk olarak, iki bölme ve iki B ila iki bölme olmak üzere iki tüp yerleştirin. 25 milimolar hippi ile takviye edilmiş beş mikrolitre DMEM, ardından 10 nanogram tat ve kaplama plazmidi ve 150 nanogram kimerik HIV bir zarf glikoprotein kodlayan plazmid ekleyin.

TAT kodlama plazmidinin yalnızca beş mikrolitre DMM ve 450 nanogram poliethalin veya PEI'de iki B'ye plazmidi kodlayan tat bağımlı HIV bir zarf glikoprotein kullanıldığında gerekli olduğunu unutmayın. Reaktiflerin ve DNA'nın miktarları, aynı HIV bir zarf glikoproteini ile transfekte edilecek kuyucuk sayısına göre ayarlanmalıdır. Daha sonra, iki B'nin içeriğini iki bölmeye ekleyin ve 10 saniye boyunca girdap yaparak iyice karıştırın.

Transfeksiyon karışımını oda sıcaklığında 10 dakika inkübe edin. 10 dakika sonra, 96 oyuklu plakanın oyuğu başına 10 mikrolitre transfeksiyon karışımı ekleyin, 37 santigrat derece ve% 5 karbon oksitte 48 saat inkübe edin. Kimerik HIV bir zarf glikoproteininin monoklonal antikorlar tarafından tanınmasını incelemek için Ali SA, insan osteosarkom hücrelerinin transfeksiyonundan iki gün sonra gerçekleştirilir.

Aynı anda kullanılan plaka başına 250 mililitre yıkama tamponu hazırlayın. Yıkama tamponuna %1 yağsız kuru süt ve beş milimolar tris pH 8.0 ekleyerek plaka başına 125 mililitre bloke edici tampon hazırlayın. Hücre kültürü ortamını ve transfeksiyon karışımını 96 oyuklu plakadan çıkarın.

Oyuk başına 100 mikrolitre engelleme tamponu ekleyin ve 20 dakika inkübe edin. Oda sıcaklığında, süpernatanı çıkarın ve tamponu bloke etmede uygun konsantrasyona seyreltilmiş kuyu başına 50 mikrolitre antikor ekleyin. Oda sıcaklığında bir saat inkübe edin.

100 mikrolitre blokaj tamponu ile üç kez yıkayın ve ardından yıkama işlemini üç kez tekrarlayın. 100 mikrolitre blokaj tamponu ile üç kez yıkayın ve son yıkamadan sonra 100 mikrolitre yıkama tamponu ile üç kez yıkayın. Doymayı çıkarın.

100 mikrolitre bloke edici tampon ekleyin ve beş dakika inkübe edin. Oda sıcaklığında, süpernatanı çıkarın ve bloke edici tamponda bir ila 3000 oranında seyreltilmiş 50 mikrolitre ikincil antikor ekleyin. 40 dakika sonra oda sıcaklığında 40 dakika inkübe edin.

100 mikrolitre yıkama tamponu ile üç kez yıkayın, ardından 100 mikrolitre yıkama tamponu ile üç yıkama yapın. Numuneleri veri toplama için hazırlamak için, süpernatanı 96 oyuklu plakadan çıkarın ve kuyucuk başına 30 mikrolitre bir x geliştirilmiş kemilüminesans substratı ekleyin. Uygun bir plaka okuyucuda oyuk başına bir saniye boyunca kemilüminesans sinyali alın.

Üreticinin talimatlarına göre, çözünür CD dört veya S CD dört'ün CD dört I epitoplarının zarf glikoproteinleri veya ENV üzerindeki maruziyeti üzerindeki etkisi, CD dördünün ENV ile etkileşiminin, ko-reseptör bağlanma bölgesiyle örtüşen 17 B ve 48 D epitoplarını açığa çıkaran ENV doğrulama değişikliklerini indüklediği, ancak antikor iki G 12'yi tanıyan dış alanı etkilemeyen test edildi. NV onayındaki nokta mutasyonlarının etkisini değerlendirmek için, CD dört bağlı onayı kendiliğinden örnekleme eğilimi azalmış olan iki ENV mutantı H 66 A ve NV'yi CD dört bağlı duruma yatkın hale getiren S3 75 W kullanıldı. Ham verileri ekspresyon seviyelerine göre normalleştirmek, H 66 A'nın CD dört I 17 B tanımayı azalttığını, S3 75 W'nin ise 17 B sinyalini geliştirdiğini ve H 66'nın fenotipini eski haline getirmek için yeterli olduğunu ortaya koymaktadır.

Bir mutant tahlil hücresi, artan miktarlarda bir CD dört ekspresör ile transfekte edildi. NV ile birlikte mavi çubuklar, ENV glikoproteininin iç alanındaki süreksiz epitopları tanıyan CD dört I monoklonal antikorlar, A üç, iki ve C 11 için artan sinyaller ortaya çıkardı. İki G 12 antikoru tarafından GP bir 20 ENV tanınması etkilenmedi.

Son olarak, ham veriler iki G 12'ye normalize edildi, ENV, ENV ile etkileşime girme kabiliyeti azalmış bir CD dört mutantı ile transfekte edildiğinde 32 ve C 11 modülasyonunun olmaması, artan sinyallerin E NV CD dört etkileşimine bağlı olduğunu gösterir Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik dört saat içinde yapılabilir.