Name: İnsan İskelet Kası İlköğretim andMyogenic Hücreleri ve Fibroblast İzolasyon ve Kantitatif İmmünositokimyasal Karakterizasyonu (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-01-12T13:15:00.000+00:00
Duration: 11 min 22 s
Description: Öğrenin, insan kas biyopsi örneklerinden CD56 bazlı immünomanyetik ayırma ile miyojenik hücreleri ve fibroblastları izole etme ve kantitatif immünositokimyasal analiz yapma yöntemini.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Yazarlar, teknik yardımları için Carl Hobbs ve Lindsey Majoram'a ve mikroskopi olanaklarının kullanımı için Profesör Pat Doherty'ye teşekkür etmek istiyor. Dr. Agley, King's College London'dan bir öğrenci tarafından desteklendi. Spurrell Trust'tan sağlanan finansman da kabul edilmektedir.

<ol><li>Mauro, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Satellite+cell+of+skeletal+muscle+fibres%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Satellite cell of skeletal muscle fibres.</a> J. Cell Biol. 9, 493-495 (1961).</li>
<li>Hawke, T. J., Garry, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myogenic+satellite+cells%3A+physiology+to+molecular+biology%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Appl.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Myogenic satellite cells: physiology to molecular biology.</a> J. Appl. Physiol. 91, 534-551 (2001).</li>
<li>Yin, H., Price, F., Rudnicki, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Satellite+Cells+and+the+Muscle+Stem+Cell+Niche%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol.+Rev%22%5BJournal%5D)">Satellite Cells and the Muscle Stem Cell Niche.</a> Physiol. Rev. 93, 23-67 (2013).</li>
<li>Alsharidah, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+human+muscle+precursor+cells+obtained+from+young+and+old+donors+produce+similar+proliferative%2C+differentiation+and+senescent+profiles+in+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Aging+Cell%22%5BJournal%5D)">Primary human muscle precursor cells obtained from young and old donors produce similar proliferative, differentiation and senescent profiles in culture.</a> Aging Cell. 12, 333-344 (2013).</li>
<li>Agley, C. C., Rowlerson, A. M., Velloso, C. P., Lazarus, N. R., Harridge, S. D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+skeletal+muscle+fibroblasts%2C+but+not+myogenic+cells%2C+readily+undergo+adipogenic+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Human skeletal muscle fibroblasts, but not myogenic cells, readily undergo adipogenic differentiation.</a> J. Cell Sci. 126, 5610-5625 (2013).</li>
<li>Murphy, M. M., Lawson, J. A., Mathew, S. J., Hutcheson, D. A., Kardon, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Satellite+cells%2C+connective+tissue+fibroblasts+and+their+interactions+are+crucial+for+muscle+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Satellite cells, connective tissue fibroblasts and their interactions are crucial for muscle regeneration.</a> Development. 138, 3625-3637 (2011).</li>
<li>Webster, C., Pavlath, G. K., Parks, D. R., Walsh, F. S., Blau, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+human+myoblasts+with+the+fluorescence-activated+cell+sorter%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Isolation of human myoblasts with the fluorescence-activated cell sorter.</a> Exp. Cell Res. 174, 252-265 (1988).</li>
<li>Pasut, A., Jones, A. E., Rudnicki, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+Culture+of+Individual+Myofibers+and+their+Satellite+Cells+from+Adult+Skeletal+Muscle%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Isolation and Culture of Individual Myofibers and their Satellite Cells from Adult Skeletal Muscle.</a> J. Vis Exp. , e50074(2013).</li>
<li>Kuang, S., Kuroda, K., Le Grand, F., Rudnicki, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Asymmetric+Self-Renewal+and+Commitment+of+Satellite+Stem+Cells+in+Muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Asymmetric Self-Renewal and Commitment of Satellite Stem Cells in Muscle.</a> Cell. 129, 999-1010 (2007).</li>
<li>Mackey, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+satellite+cell+number+and+activity+status+in+human+skeletal+muscle+biopsies%5BTitle%5D)+AND+%22Muscle+a+d+Nerve%22%5BJournal%5D)">Assessment of satellite cell number and activity status in human skeletal muscle biopsies.</a> Muscle a d Nerve. 40, 455-465 (2009).</li>
<li>Stewart, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+proliferating+human+skeletal+muscle-derived+cells+in+vitro%3A+Differential+modulation+of+myoblast+markers+by+TGF-%CE%B22%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Characterization of proliferating human skeletal muscle-derived cells in vitro: Differential modulation of myoblast markers by TGF-β2.</a> J. Cell. Physiol. 196, 70-78 (2003).</li>
<li>Miltenyi, S., Müller, W., Weichel, W., Radbruch, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+gradient+magnetic+cell+separation+with+MACS%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry%22%5BJournal%5D)">High gradient magnetic cell separation with MACS.</a> Cytometry. 11, 231-238 (1990).</li>
<li>Clarke, C., Davies, S. Ch. 2. Methods in Molecular Medicine. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aClarke%2C+C+%22Metastasis+Research+Protocols%22">Metastasis Research Protocols</a>. Brooks, S. A., Schumacher, U. 58, Humana Press. 17-23 (2001).</li>
<li>Grützkau, A., Radbruch, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+but+mighty%3A+How+the+MACS-technology+based+on+nanosized+superparamagnetic+particles+has+helped+to+analyze+the+immune+system+within+the+last+20+years%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+Part+A%22%5BJournal%5D)">Small but mighty: How the MACS-technology based on nanosized superparamagnetic particles has helped to analyze the immune system within the last 20 years.</a> Cytometry Part A. 77A, 643-647 (2010).</li>
<li>Tomlinson, M. J., Tomlinson, S., Yang, X. B., Kirkham, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+separation%3A+Terminology+and+practical+considerations%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Tissue+Engineering%22%5BJournal%5D)">Cell separation: Terminology and practical considerations.</a> Journal of Tissue Engineering. 4, (2013).</li>
<li>Agley, C. C., Velloso, C. P., Lazarus, N. R., Harridge, S. D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Image+Analysis+Method+for+the+Precise+Selection+and+Quantitation+of+Fluorescently+Labeled+Cellular+Constituents%3A+Application+to+the+Measurement+of+Human+Muscle+Cells+in+Culture%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Histochem.+Cytochem%22%5BJournal%5D)">An Image Analysis Method for the Precise Selection and Quantitation of Fluorescently Labeled Cellular Constituents: Application to the Measurement of Human Muscle Cells in Culture.</a> J. Histochem. Cytochem. 60, 428-438 (2012).</li>
<li>Danoviz, M., Yablonka-Reuveni, Z. Ch. 2. Methods in Molecular Biology. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aDanoviz%2C+M+%22Myogenesis%22">Myogenesis</a>. DiMario, J. X. 798, Humana Press. New York, NY. 21-52 (2012).</li>
<li>Bergström, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Muscle+electrolytes+in+man.+Determined+by+neutron+activation+analysis+on+needle+biopsy+specimens.+A+study+on+normal+subjects%2C+kidney+patients%2C+and+patients+with+chronic+diarrhoea%5BTitle%5D)+AND+%22Scand.+J.+Clin.+Lab.+Invest%22%5BJournal%5D)">Muscle electrolytes in man. Determined by neutron activation analysis on needle biopsy specimens. A study on normal subjects, kidney patients, and patients with chronic diarrhoea.</a> Scand. J. Clin. Lab. Invest. 14, 7-100 (1962).</li>
<li>Chazaud, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Satellite+cells+attract+monocytes+and+use+macrophages+as+a+support+to+escape+apoptosis+and+enhance+muscle+growth%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Satellite cells attract monocytes and use macrophages as a support to escape apoptosis and enhance muscle growth.</a> The Journal of Cell Biology. 163, 1133-1143 (2003).</li>
<li>Abou-Khalil, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autocrine+and+Paracrine+Angiopoietin+1%2FTie-2+Signaling+Promotes+Muscle+Satellite+Cell+Self-Renewal%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Autocrine and Paracrine Angiopoietin 1/Tie-2 Signaling Promotes Muscle Satellite Cell Self-Renewal.</a> Cell Stem Cell. 5, 298-309 (2009).</li>
<li>Timpl, R., Kvonder Mark, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+laminin+and+fibronectin+in+selecting+myogenic+versus+fibrogenic+cells+from+skeletal+muscle+cells+in%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Role of laminin and fibronectin in selecting myogenic versus fibrogenic cells from skeletal muscle cells in.</a> 117, 628-635 (1986).</li>
<li>Lichtman, J. W., Conchello, J. -A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Meth%22%5BJournal%5D)">Fluorescence microscopy.</a> Nat Meth. 2, 910-919 (2005).</li>
<li>Koopman, R., Schaart, G., Hesselink, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimisation+of+oil+red+O+staining+permits+combination+with+immunofluorescence+and+automated+quantification+of+lipids%5BTitle%5D)+AND+%22Histochem.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Optimisation of oil red O staining permits combination with immunofluorescence and automated quantification of lipids.</a> Histochem. Cell Biol. 116, 63-68 (2001).</li>
<li>Rossner, M., Yamada, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((What%27s+in+a+picture%3F+The+temptation+of+image+manipulation%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">What's in a picture? The temptation of image manipulation.</a> The Journal of Cell Biology. 166, 11-15 (2004).</li>
<li>Zinchuk, V., Grossenbacher-Zinchuk, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+advances+in+quantitative+colocalization+analysis%3A+Focus+on+neuroscience%5BTitle%5D)+AND+%22Prog.+Histochem.+Cytochem%22%5BJournal%5D)">Recent advances in quantitative colocalization analysis: Focus on neuroscience.</a> Prog. Histochem. Cytochem. 44, 125-172 (2009).</li>
<li>Johnson, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Not+seeing+is+not+believing%3A+improving+the+visibility+of+your+fluorescence+images%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Biol.+Cell%22%5BJournal%5D)">Not seeing is not believing: improving the visibility of your fluorescence images.</a> Mol. Biol. Cell. 23, 754-757 (2012).</li>
<li>Waters, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accuracy+and+precision+in+quantitative+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Accuracy and precision in quantitative fluorescence microscopy.</a> The Journal of Cell Biology. 185, 1135-1148 (2009).</li>
<li>Pawley, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+39+steps%3A+A+cautionary+tale+of+quantitative+3-D+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">The 39 steps: A cautionary tale of quantitative 3-D fluorescence microscopy.</a> Biotechniques. 28, 884-887 (2000).</li>
<li>Bolte, S., Cordelières, F. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+guided+tour+into+subcellular+colocalization+analysis+in+light+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Microsc%22%5BJournal%5D)">A guided tour into subcellular colocalization analysis in light microscopy.</a> J. Microsc. 224, 213-232 (2006).</li>
<li>Brown, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+microscopy+-+avoiding+the+pitfalls%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Fluorescence microscopy - avoiding the pitfalls.</a> J. Cell Sci. 120, 1703-1705 (2007).</li>
<li>Bareja, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+and+Mouse+Skeletal+Muscle+Stem+Cells%3A+Convergent+and+Divergent+Mechanisms+of+Myogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Human and Mouse Skeletal Muscle Stem Cells: Convergent and Divergent Mechanisms of Myogenesis.</a> PLoS ONE. 9, e90398(2014).</li>
<li>Castiglioni, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+Progenitors+that+Exhibit+Myogenic%2FOsteogenic+Bipotency+In+by+Fluorescence-Activated+Cell+Sorting+from+Human+Fetal+Muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Isolation of Progenitors that Exhibit Myogenic/Osteogenic Bipotency In by Fluorescence-Activated Cell Sorting from Human Fetal Muscle.</a> Stem Cell Reports. 2, 560(2014).</li>
<li>Fukada, S. -i, et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD90-positive+cells%2C+an+additional+cell+population%2C+produce+laminin+%CE%B12+upon+transplantation+to+dy3k%2Fdy3k+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">CD90-positive cells, an additional cell population, produce laminin α2 upon transplantation to dy3k/dy3k mice.</a> Exp. Cell Res. 314, 193-203 (2008).</li>
<li>Stickland, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Muscle+development+in+the+human+fetus+as+exemplified+by+m.+sartorius%3A+a+quantitative+study%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Anat%22%5BJournal%5D)">Muscle development in the human fetus as exemplified by m. sartorius: a quantitative study.</a> J. Anat. 132, 557-579 (1981).</li>
</ol>

Yazarlar, rekabet eden hiçbir finansal çıkarları olmadığını beyan ederler.

Biz kas biyopsi materyalinin küçük örneklerinden insan kas-türetilmiş öncülerinin seçici zenginleştirilmesi için bir immunomagentic sıralama prosedürü tarif var. Bu teknik, fibroblastlar insan kas-türetilmiş kültürlerin kaybı üstesinden gelmek için bizim laboratuvarda çok değerli, ama aynı zamanda kas kaynaklı atalarıdır farklı toplumlarda eşsiz davranışını anlamak için vardır. Bir kez saflaştırılmış miyojenik hücre proteini ve / veya gen ekspresyonunda değişiklikler incelenmiştir ya da alt akış deneyleri için de kullan...

iskelet kası onarımı ve yenilenmesi uydu hücreleri 1, miyojenik kök hücreler 2,3. eylemini gerektirir in vivo bu hücreler, her myofibre ve sarcolemma ve bazal lamina arasında yer alan tersine çevrilebilir pasif durumda var, ama çoğalırlar aktif hale, sigorta ve kas dokusu gibi ayırt, hasar tamir ve 3 rejenere edilir. Uydu hücreleri enzimatik sindirim 4 kullanılarak genç ve yaşlı insan kas biyopsi örneklerinde ve onların Miyojenik özelliklerinden izole edilebilir sonradan primer kültür 5 incelenebilir. hücre popülasyonunun iki verim ve saflık açısından, bu izolasyon sürecinin verimliliği kullanılan yöntemler bağlıdır ve örnekten örneğe değişebilir. enzimatik sindiriminden elde edilen iki ana yapışık hücre tipi, CD56 + / desmin hücreleri ve mu başlangıçta tanımlanan uydu hücreler (şimdi olarak adlandırılan miyojenik hücre ya da kas ön-madde hücreleri) vardırSistemik lupus türetilmiş CD56 olarak tanımlanan fibroblastlar, - ve TE7 + hücreleri 5. Fibroblastlar hızlı çoğalma oranı ve kas hücreleri gibi, hücre-hücre temas üzerine geri dönüşü olmayan büyüme durmasını ve nihai farklılaşmasını uğramazlar; Böylece karışık toplumlarda, fibroblastlar kültürü hakim Miyojenik hücreleri istila edebilir. Fibroblastlar genellikle Ancak, kendi başlarına incelenmeye değer hücreleri gibi fibroblastlar artan bir ilgi onlar kas tamir 6 sırasında myojenik hücreleri ile bir kooperatif bir role sahip olduğu gösterilmiştir özellikle de, şimdi var, kas biyologlar için bir tahriş olarak incelendi var . insan kas farklı hücre tiplerinin izolasyonu ve saflaştırılması, böylece kültür hem de hücre tipleri doğal davranışını incelemek için çalışan bir metodolojik bir husustur. Flüoresanslı etkinleştirilmiş hücre tasnif (FACS) hücreleri, ayrıca çalışma için kriteri için kullanılabilecek bir yöntemdir ve / veya sayılarakanaliz edilmiştir. FACS güvenilir insan miyojenik hücrelerini zenginleştirmek için gösterilmiştir, ancak sonraki kültür için hücrelerin verimi bugüne kadar 7 yüksek olmamıştır. Böyle yaşlılığında 4 ile ilişkili uydu hücre kökenli myojenik hücreler ve çok kötü çoğalması ve farklılaşması gibi somatik hücre sınırlı çoğaltma potansiyeli göz önüne alındığında, daha yumuşak yaklaşımlar gereklidir. Tek kas lifi kültürleri başka, daha az agresif, onların sublaminal niş ve kültür 8,9 onların aktivasyon sonrasında hala ikamet kemirgen uydu hücreleri elde anlamına gelir sunuyoruz. Ancak, bu tekniğin insan kas-türetilmiş hücrelerin okuyan ilgilenen birçok araştırma laboratuarları için erişilebilir olmayabilir anlamına (lifler nadiren tendon tendon elde edilebilir çünkü) insan kas biyopsisi malzemeden genellikle mümkün değildir. Ayrıca, tek lif tekniği sadece çok sınırlı hücre sayıları sağlar. Burada gen göre ayrılması bir sistemi tarifTLE enzimatik kolajenaz kullanarak hücrelerin sindirim ve manyetik aktif hücrenin iki ardışık mermi sıralama yüksek saflıkta (&gt;% 95 miyojenik hücre) ve verimle (~ hem de verir (MACS) takip dispaz 2.8 x 10 6 ± 8.87 x 10 5 hücre / Kültürde gerçekleştirilen deneyler g doku). CD56 in situ 10 ve in vitro 11 insan uydu hücrelerin tanımlanması için altın standart yüzey işaretleyici olarak ve boncuk bağlanması için ideal bir yüzey işaretleyici aday sağlamaktadır. Bu yaklaşımda, CD56 antikorları, demir oksit ve polisakarit içeren süperparamanyetik boncuk güçlü bir manyetik alan 12,13 yerleştirilen bir yüksek değişim dereceli manyetik bir hücre ayırma kolonu boyunca hücrelere bağlanan ve geçirilir birleştirilir. ayırma kolonları güçlü manyetik alan eğimleri (~ 4tesla) üreten kendi yüzeyine doğru manyetik alan çizgileri odaklanmak hizmet ferromanyetik çelik yün veya demir küre bir matris ile doldurulur 14. Bu sütunlarda hatta biraz manyetik hücreler çekti ve bunların yüzeye 14 adsorbe. Ilişkisiz (CD56 -) manyetik mikro etiketli CD56 + hücreleri manyetik alanın 12,15 çıkarıldıktan kadar korunur ise hücreler sütununda geçer. Ayırma sürecinin herhangi bir aşamasında elde edilen hücre süspansiyonları ayrıca deney için istenen yoğunluğa kaplama olabilir. Hücresel bileşenler imünosito kullanılarak tespit edilebilir, belirli bir girişim sonra, geniş bir alan veya konfokal floresan mikroskobu kullanılarak görüntülendi ve herhangi bir görüntünün tüm etiketli hücrelerin hızlı amacı ölçümü sağlayan bir görüntü analiz yaklaşımı kullanılarak kantitatif olarak analiz edildi. Miyojenik hücreye iken, insan fibroblastlar kolayca adipositlere transdifferentiate - Laboratuarımızda o CD56 göstermek için görüntü analizi 16 tarafından takip bu çifte immünomanyetik sıralama yaklaşımı kullanmışUydu kökenli lar bu adipojenik dönüşüm 5 derece dirençlidir.

<table><tbody><tr><td>Kollajenaz&nbsp; D</td><td>Roche&nbsp;</td><td></td><td></td>11088866001</tr><tr><td>Dispase II</td><td>Sigma</td><td>D4693-1G</td><td>Kullanmadan önce filtreyle sterilize edilmelidir</td></tr><tr><td>Tripsin/EDTA(</td><td>Gibco) Invitrogen</td><td>15400-054</td><td></td></tr><tr><td>100 &# 956; m hücre süzgeci</td><td>BD Biosciences</td><td>352360</td><td></td></tr><tr><td>Kollajen çözeltisi (% 0.1 asetik asit içinde 3 mg / ml)</td> <td>Sigma, Dorset, UK</td><td>C8919&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Minisart SRP15 şırınga filtresi (0.2 &#956; m)</td><td>Sartorius</td><td>17573ACK</td><td>Politetrafloretilen (PTFE) membran</td></tr><tr><td>CD56 insan Mikro boncukları</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-050-401</td><td>Mikro boncukların sınırlı raf ömrünün farkında olun</td></tr><tr><td>Anti-fibroblast Mikro boncuklar, insan</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-050-601</td><td></td></tr><tr><td>40 &; m Ön ayırma filtreleri</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-041-407</td><td></td></tr><tr><td>Büyük Hücreli Sütunlar</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-042-202</td><td>Bu sütunlar bir akış direnci ile birlikte gelir. Burada açıklanan yüksek miyojenik saflıkları elde etmek için akış direncinin kullanılması gerekli değildir.</td></tr><tr><td>LS sütunları&nbsp;</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-042-401</td><td></td></tr><tr><td>MiniMacs Ayırıcı</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-042-102</td><td>Bu ayırıcı büyük hücre sütununa uyar ancak LS sütununa uymaz.</td></tr><tr><td>MidiMACS</td><td>Miltenyi Biyoteknoloji ve Bilişim Teknolojileri;</td><td>130-042-302</td><td></td></tr><tr><td>MACS multistand</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-042-303</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td></td><td>Kullanmadan önce filtre sterilize edilmelidir</td></tr><tr><td>Yağ Kırmızı O</td><td>Sigma</td><td>O0625</td><td></td></tr><tr><td>Trietil fosfat</td><td>Sigma</td><td>538728</td><td></td></tr><tr><td>Whatman Kağıt</td><td>Sigma</td><td>Z241121-1PAK</td><td>No. 42, Külsüz. Filtreyi hazırlamak için dairesel filtre kağıdını yarım daire yapacak şekilde katlayın, ardından bir koni şekli oluşturmak için yarım daireyi tekrar ikiye katlayın. Filtrelemek için koniyi bir huniye yerleştirin.&nbsp;</td></tr><tr><td>ProLong Altın Antifade Reaktifi</td><td>Moleküler Problar, Invitrogen</td><td>P36930</td><td>Bu, DAPI ile veya DAPI olmadan satın alınabilir ve ilk floresanı söndürmez.</td></tr><tr><td>AxioVision</td><td>Carl Zeiss</td><td>İletişim Zeiss</td><td></td></tr><tr><td>Adobe Photoshop CS5 Genişletilmiş</td><td>Adobe (Pugh Computers'tan satın alındı)</td><td>ADPH16982*&nbsp;</td><td></td></tr></tbody></table>

İnsan İskelet kası İlköğretim andmyogenic hücreleri ve fibroblast İzolasyon ve kantitatif İmmünositokimyasal karakterizasyonu

Isolation and Quantitative Immunocytochemical Characterization of Primary Myogenic Cells and Fibroblasts from Human Skeletal Muscle

onarım ve iskelet kası rejenerasyon ikamet kas kök hücreleri uydu hücrelerinin eylem gerektirir. Bu kültürde okudu insan kas biyopsisi enzimatik sindirim kullanılarak örnekler ve onların Miyojenik özelliklerinden izole edilebilir. Kantitatif olarak, enzimatik sindiriminden elde edilen iki ana yapışık hücre tipleri şunlardır: (i) uydu CD56 + başlangıçta tanımlanan hücreler (bunlara miyojenik hücre ya da kas öncü hücreleri), daha sonra, CD56 + / + hücrelerinin desmin ve (ii) kaslarını ve TE-7 + - CD56 olarak tanımlanan türetilmiş fibroblastlar,. Fibroblastlar kültüründe çok verimli çoğalır ve karışık hücre popülasyonlarının bu hücrelerin kültürü hakim Miyojenik hücreleri istila edebilir. İnsan kas farklı hücre tiplerinin izolasyonu ve saflaştırılması, böylece kültür ya hücre tipi doğuştan davranışını araştırmak için çalışan önemli bir metodolojik bir husustur. Burada açıklanmayanher ikisi de, yüksek saflıkta (&gt;% 95 miyojenik hücre) ve iyi bir verim (~ veren kolajenaz kullanarak hücrelerin yumuşak enzimatik sindirimiyle göre ayrılması ve manyetik aktive hücre sınıflandırma (MACS) takip dispaz bir sistem ibe 2.8 x 10 6 ± 8.87 kültür deneyleri için in vitro 7 gün sonra) x 10 5 hücre / g doku. Bu yaklaşım, CD56 karşı bir antikora konjuge manyetik mikro-boncuklar ile karışık kas kaynaklı hücre sicimli fragmanlar popülasyonu, ve daha sonra, bir manyetik alan da hücrelerin geçen dayanmaktadır. Mikro bağlı CD56 + hücreler CD56 ise alan tarafından korunur - hücreler sütununda boyunca engellenmeden geçen. Ayırma sürecinin herhangi bir aşamasında elde edilen hücre süspansiyonları kaplama ve kültüre edilebilir. Belirli bir müdahale, hücre morfolojisi, ifadesi ve nükleer transkripsiyon faktörleri de dahil olmak üzere protein lokalizasyonu izlenerek özel antikorlar ve bir görüntü p immünofloresan etiketleme kullanılarak belirlenebilirrocessing ve analiz paketi.

Saflaştırılmış miyojenik hücreleri ve fibroblastlar adipojenez potansiyellerini değerlendirmek için herhangi bir yerde 7-30 arasında gün adipojenik beslenme ortamı, ardından üç gün adipojenik farklılaşma ortam içinde kültive edilebilir. Saflaştırılmış hücre popülasyonu kullanarak, adipojenik ve miyojenik soy belirteçleri için immün ile birlikte Oil Red O boyama sadece fibroblast fraksiyonu adipojenik farklılaşma (Şekil 2) yeteneğine sahip olduğunu gösterdi. fibroblastlar tarafından yağ birikimi büyük çı...

İnsan kasından türetilen ana yapışık hücre tipleri miyojenik hücreler ve fibroblastlardır. Burada, hücre popülasyonları, CD56 antijenine dayalı olarak manyetik olarak aktive edilen hücre sıralaması kullanılarak zenginleştirilir. Spesifik antikorlarla müteakip immüno-etiketleme ve görüntü analiz tekniklerinin kullanılması, tek tek hücrelerde sitoplazmik ve nükleer özelliklerin miktar tayinine izin verir.

İnsan İskelet Kası İlköğretim andMyogenic Hücreleri ve Fibroblast İzolasyon ve Kantitatif İmmünositokimyasal Karakterizasyonu

The repair and regeneration of skeletal muscle requires the action of satellite cells, which are the resident muscle stem cells. These can be isolated ...

Bu prosedürün genel amacı, spesifik fenotipik ve transkripsiyon faktörü belirteçlerinin değerlendirilmesine izin vermek için insan kas biyopsi örneklerinden elde edilen iki ana hücre popülasyonunu yüksek verimlilik ve verimle ayırmaktır. Bu, ilk adımda, bir insan kas biyopsisi örneğinin tek bir hücre süspansiyonuna ayrıştırılmasıyla elde edilir. Yedi günlük bir kültürden sonra, hücreler, miyojenik hücreler olan CD 56 pozitif ve fibroblastlar olan CD 56 negatif fraksiyonlar olarak sınıflandırılan immünomanyetik boncuklarla ayrılır.Hücreler daha sonra boyanır ve istenen fenotipik ve ilgilenilen protein belirteçleri için görüntülenir. Sonuç olarak, immünofloresan mikroskobu ve kantitatif görüntü analizi, sıralanan hücre popülasyonları içinde seçilen nükleer lokalize transkripsiyon faktörlerinin yoğunluğunu ölçmek için kullanılabilir. Floresan ile aktive edilmiş hücre ayıklama gibi mevcut yöntemlere göre immünomanyetik hücre ayıklama kullanan bu tekniğin temel avantajları, nazik olması, insan birincil kas hücrelerinin yüksek verim ve canlılık ile mükemmel bir şekilde sınıflandırılmasına izin vermesi ve hızlı bir şekilde gerçekleştirilebilmesidir.Bu tekniğin etkileri, yaşlanmada ve bir dizi kas patolojisinde gözlenen fibro yağlı kas dejenerasyonunun hücresel temeli hakkındaki anlayışımızı arttırmaya doğru uzanır: Biyopsi alındıktan sonra kas kaynaklı öncü hücreleri mümkün olan en kısa sürede izole etmek. İlk olarak, doku örneğinin ağırlığını belirleyin ve daha sonra örneği fazla kandan arındırmak için kasları bazal ortamda birkaç kez şişirin. Kas tortusunu oda sıcaklığında 30 ila 60 saniye bekletin ve ardından tüpten son iki ila üç mililitre ortam hariç hepsini aspire edin.Daha sonra, kalan sıvının kası tabağa taşımasına izin vermek için tüpü steril bir petri kabına ters çevirin. Şimdi, herhangi bir belirgin yağ veya bağ dokusunun görünür parçalarının örneğini temizleyin. Daha sonra kalan ortamı harekete geçirmek için tabağı döndürün ve ardından tüm ortamı aspire edin ve 100 ila 400 miligram doku başına üç mililitre bir kollajenaz ve disbe enzim çözeltisi ekleyin ve kas örneğini çok küçük bir ila iki milimetre küp parçalar halinde kesin.Numune yeterince kıyıldığında. Doku parçalarını ve enzim çözeltisini steril 10 ila 20 mililitrelik konik bir tüpe aktarmak için geniş bir yaban domuzu 25 mililitre pipet kullanın. Plakayı üç mililitre enzim çözeltisi ile yıkayın ve ardından kalan kas parçalarını tüpe aktarmak için 10 mililitrelik bir pipet kullanın.Tüpü 60 dakika boyunca 37 santigrat dereceye yerleştirin. Doku süspansiyonunu her 15 dakikada bir 10 mililitrelik bir pipetle yeniden düzenlemek. Daha sonra enzimatik ayrışmayı en az eşdeğer miktarda taze yeniden ısıtılmış büyüme ortamı ile sonlandırın.Daha sonra, büyük döküntü parçalarını temizlemek için hücre süspansiyonunu 100 mikrometrelik bir filtreden geçirin ve ardından hücreleri yeniden santrifüjleyin. Peleti yedi ila sekiz mililitre büyüme ortamında süspanse edin ve daha sonra hücreleri kaplanmamış bir T 25 doku kültürü şişesinde inkübe edin. Yedi gün boyunca% 37 karbondioksit ile 5 santigrat derece.Haftanın sonunda, tripsin hücre tek tabakasını üç dakika boyunca gözler. Hücreler ayrıldığında, aşırı sindirimi önlemek için beş ila 10 mililitre iskelet kası büyümesi, orta ekleyin ve hücreleri santrifüjleme ile uygulayın. Daha sonra saydıktan sonra, hücrelerin bir kısmını hücre soy işaretleyici karakterizasyonu için ayırın ve kalan hücreleri 15 mililitre PBS santrifüj kazancında yıkayın.Bu sefer peleti 170 mikrolitre oda sıcaklığında maksimum ayırma tamponunda yeniden süspanse edin ve tekrarlamak için nazikçe pipetleyin. Hücreleri 35 mikrolitre iyi karıştırılmış anti CD 56 antikor konjuge manyetik mikro boncuklarda askıya alın. Hücre çözeltisini pipetle birkaç kez karıştırın ve karışımı yumuşak bitki örtüsü ile 15 dakika dört santigrat derece inkübe edin.İnkübasyondan sonraki yarıda, hücre ve boncuk çözeltisini 10 mililitre ayırma tampon santrifüjü ve reus ile yıkayın. Peleti bir mililitre taze ayırma tamponunda askıya alın. Ardından, pres ayırma filtresini ve kolonu 500 mikrolitre kaynak tamponu ile yağlayın.Ve daha sonra hemen karıştırın ve bir mililitre hücre süspansiyonunun tamamını pres ayırma filtresinden geçirin ve kolona aktarın, kolonu bir mililitre kaynak tamponu güç yıkama ile üç kez durulayın, tutmayan fibroblast fraksiyonunu toplayın, kolondan steril bir 50 mililitre konik tüpe az miktarda büyüme ortamı içeren konik tüp. Ardından sütunu mıknatıstan çıkarın ve CD 56 pozitif hücre fraksiyonunu toplamak için pistonu sütunun üstüne bastırın. Sıcak büyüme içeren ayrı bir 50 mililitrelik konik tüpte, bu adımdan orta büyüme ortamı yayılır.Çift sıralama yapılacaksa, toplanan pozitif ve negatif hücre fraksiyonlarını düşünün. Ekstra saflık için çift kaynak kullanılması gerekiyorsa, ilk sıralamada CD 56 pozitif toplama tüpüne ortam koymayın, ancak uygun deney son noktasında filtre ve kolon yağlamasından başlayarak adımları tekrarlayın. CD 56 pozitif hücre kültürlerini, eşdeğer hacimde buz gibi,% 8 para formaldehit kullanarak kültür ortamlarına sabitleyin.Yumuşak bitki örtüsü ile 10 dakika. Daha sonra fiksatifi aspire edin ve hücre yüzey antijenlerini immün boyamak için hücreleri PBS ile iki kez yıkayın. PBS'de% 1 BSA'da hücreleri en az bir saat bloke edin ve ardından hücreleri ilgili birincil ve ardından ikincil antikorlarla etiketleyin.Dedektörü, lazer gücünü ve mikroskobunuz ve lekenizle ilgili pozlama ayarlarını optimize edin. Görüntüleme öncesinde hücreler, istenilen sayıda algılama kanalında ve altıdan fazla farklı görüş alanındaki hücrelerin görüntülerini alır. Analiz için, uygun TIFF görüntü dosyalarını açın ve uygun karşılık gelen kanalları kaplamak için görüntüleri birbirine sürükleyin.Her kanal, katmanlar panelinde ayrı bir katman olarak görünecektir. Analiz penceresinde, veri noktalarını seç'i ve ardından özel'i seçin ve istediğiniz ölçümleri seçin. Nükleer floresan yoğunluğunu analiz etmek için renk aralığı iletişim kutusunu açın ve açılır menüden örneklenmiş renkleri seçin.Ardından shift tuşunu basılı tutarak, etiketli çekirdeklere özgü tonları seçin. Bu renk aralığı seçim maskesini aynı oturumda seçilen diğer görüntülerle kullanmak üzere saklamak için kaydet'i tıklatın. Çekirdekler seçildikten sonra, tıklayın ve doldurun.Ardından açılır menüden siyahı seçin ve opaklığın %100 olarak ayarlandığını onaylayınArdından, seç ve tersini tıklayın. Ardından sağ tıklayın ve tekrar Doldur'u seçin ve açılır menüden beyaz bir dolgu seçin. Şimdi ikili nükleer katmanda kısmen örtüşen çekirdekleri ayırmak için bir havza algoritması gerçekleştirin.Seç'e gidin, ardından renk aralığına gidin ve ardından tek tek ayrılmış çekirdekleri seçmek için gölgeler. Ardından seçimi, istenen işaretçinin 16 bit gri tonlamalı görüntüsünü içeren katmana aktarın ve ölçümleri kaydet'e tıklayın. Son olarak, seçilen ölçümleri daha fazla işleme yağı için metin dosyaları olarak uygun analiz yazılımına aktarın.Adipojenik ve miyojenik soy belirteçleri için immüno boyama ile birlikte saflaştırılmış hücre popülasyonlarının kırmızı boyanması, yalnızca fibroblast fraksiyonunun, fibroblastların çıplak gözle görülebilmesi ve tedavinin 15. gününde bu hücreler tarafından nükleer PPAR gamasının güçlü bir şekilde ifade edilmesiyle tam dönüşümlerinin daha fazla gösterilmesi ile epijenik bir farklılaşma yeteneğine sahip olduğunu ortaya koymaktadır. bu hücreler, kalan herhangi bir TE yedi A bağ dokusu antijenini substratlarına salmıştır. Buna karşılık, miyojenik hücreler, nükleer PPAR gama ekspresyonunun yukarı regülasyonu olmaksızın desmin ve miyozin ağır zincir ekspresyonu dahil olmak üzere normal fenotiplerini korurlar. Bu şekilde, Desmond pozitif miyojenik hücrelerin bir alanının ve bu verilerin elde edildiği alanın kantitatif analizinin bir örneği gösterilmekte olup, bu spesifik tohumlama yoğunluğu ve zaman noktasında tek tek çekirdeklerdeki miyojenik ekspresyonun varyasyonu gösterilmektedir.Bu grafikte, bir hücre üzerindeki farklı hücre tiplerindeki transkripsiyon faktörü seviyelerini hücre bazında doğrudan karşılaştırma yönteminin faydası gösterilmiştir. Örneğin, bu CD 56 negatif kas fibroblastları, yüksek düzeyde nükleer adipojenik transkripsiyon faktörü, PPAR gama eksprese ederken, çeşitli CD 56 pozitif miyojenik hücreler, adiposit indükleyici ortama maruz kaldıktan sonra sadece çok düşük seviyelerde nükleer reseptör transkripsiyon faktörünü korur. Bu teknik, kas biyolojisi alanındaki araştırmacıların, sağlıklı veya patolojik insan kas örneklerinde hücre kaderi kararlarının mekanizmalarını keşfetmelerine olanak tanır.Bu videoyu izledikten sonra, öncelikle, saflaştırılmış ve iyi karakterize edilmiş insan kası türevli hücrelerin yüksek verimlerinin nasıl elde edileceğini ve ikinci olarak, immünofloresan boyama ile tanımlanan hücresel bileşenlerin objektif kantitatif analizinin nasıl yapılacağını iyi anlamalısınız.

isolation-quantitative-immunocytochemical-characterization-primary

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Gelişim Biyolojisi

Myofibers izolasyonu ve kültürü altın...

Yetişkin İskelet Kası gelen bireysel Myofibers ve Uydu Hücre İzolasyonu ve Kültür

Miyofibroblast normal ve hastalık her iki durumda önemli fizyolojik işlemleri düzenleyen gastrointestinal sistemin etkili bir stromal hücresidir. Biz, fare ve in vitro deney için kullanılabilir insan kolon dokusu, hem birincil miyofibroblastlar izolasyonu sağlayan bir tekniği açıklar.

Fare ve İnsan Kolon Doku Primer miyofibroblastlar İzolasyonu

Miyofibroblast fenotipine sahip murin ve insan özofagus stromal hücrelerinin primer kültürlerini oluşturmak için bir protokol sunuyoruz. Kültürlenmiş hücreler iğ şeklinde morfolojiye sahiptir, α-SMA ve vimentin eksprese eder ve epitelyal, hematopoietik ve endotel hücre yüzey belirteçlerinden yoksundur. Karakterize edilmiş stromal hücreler, epitelyal-stromal etkileşimlerin fonksiyonel çalışmalarında kullanılabilir.

Fare ve İnsan Özofagus gelen miyofibroblastların izolasyonu

Bu protokol, kas veya cilt dokusundan miyojenik ve fibroblast hücre hatlarının canlı hücre izolasyonu ve birincil kültürü için teknikleri açıklar.  Bu hücre dizilerinin ölümsüzleştirilmesi için bir teknik de tarif edilmiştir.  Toplamda, bu protokoller, aşağı akış uygulamaları için hastadan türetilen hücreleri oluşturmak ve korumak için güvenilir bir araç sağlar.

Hastalık Modelleme için kas biyopsisi Hasta türetilmiş Hücre Hatları İzolasyonu ve Ölümsüzleştirme

Burada, insan miyoblastlarının saf bir popülasyonunu yetişkin kas dokusundan elde etmek için bir metodoloji tarif ederiz. Bu hücreler, in vitro iskelet kası diferansiasyonunu incelemek ve özellikle Ca 2+ sinyallemeyle ilgili proteinleri incelemek için kullanılırlar.

İnsan Myoblastlarının İzolasyonu, Miyojenik Farklılaşmanın Değerlendirilmesi ve Mağazada Kullanılan Kalsiyum Giriş Ölçümü

İskelet kas biyopsi sözünde nizolating, culturing, karakterizasyonu ve insan primer kas atası hücreleri (hMPCs) ayırt etme teknikleri salıyoruz.  bu yöntemlerle elde edilen ve karakterize edilen hMPC'ler daha sonra insan miyogenezi ve iskelet kası rejenerasyonu ile ilgili araştırma sorularını ele almak için kullanılabilir.

İskelet Kas Biyopsisi Prosedüründen İnsan Kas Atası Hücrelerinin İzolasyon, Kültür, Karakterizasyonu ve Farklılaşması

Miyoblastlar polinükleatlı miyotüpler ve sonunda iskelet kası miyofiberleri oluşturmak için farklılaşan öncül hücrelerdir. Burada, genç yetişkin fare iskelet kaslarından etkili izolasyon ve birincil miyoblast kültürü için bir protokol salıyoruz. Bu yöntem, kültürdeki kas hücrelerinin moleküler, genetik ve metabolik çalışmalarını mümkün kılar.

Fare İskelet Kas Ekstranında Primer Miyoblastların İzolasyon ve Farklılaşması

Fibroblastların saf bir popülasyon elde yara onarımı ve fibrozis rollerini incelemek için çok önemlidir. Burada açıklanan yaralanmamış ve yaralı fare kalplerinden fibroblastlar ve miyofibroblastlar izole etmek için ayrıntılı bir yöntem immünofloresan, RTPCR, floresan destekli hücre sıralama ve saflık ve işlevsellik karakterizasyonu takip kollajen jel kontraksiyonu.

Erişkin Kardiyak Fibroblastlar ve Miyofibroblastların İzolasyon ve Karakterizasyonu

Burada, homozigot mutant Lamin Δ8-11 fare modeli, Emery-Dreifuss kas distrofisi (EDMD) için çok ciddi bir model erken doğum sonrası gelişim aşamalarında verimli bir şekilde tek kas lifleri elde etmek için bir yöntem öneriyoruz.

Erken Doğum Sonrası Gelişimde Emery-Dreifuss Musküler Distrofi'nin Murine Modelinden Tek Miyofiber İzolasyon ve Kültür

Bu protokol, yetişkin ve yenidoğan fare iskelet kaslarından birincil miyoblastların doku ayrışması, ardışık filtrasyon, ön kaplama ve tanımlanmış kültür koşulları yoluyla izole edilmesi ve zenginleştirilmesi için standartlaştırılmış bir yöntem sunar; böylece uydu hücresinden türetilen miyoblast kültürlerinin sonraki deneysel uygulamalar için oluşturulması ve bakımı mümkün olur.

In vitro miyogenez çalışmaları için iskelet kası uydu hücrelerinin izolasyonu

Bu protokol, oksidatif soleus'tan sağlam tek kas liflerinin izole edilmesini ve bu liflerden türetilen yüksek saf miyoblast kültürlerinin oluşturulmasını açıklar. Optimize edilmiş prosedür, fare başına yaklaşık 300–500 sağlam miyofiber elde ederek sonraki moleküler ve hücresel analizleri mümkün kılar.

Oksidatif Miyofiber Davranışının Değerlendirilmesi İçin Tek Lifli İzolasyon Testi

Öğrenin, insan kas biyopsi örneklerinden CD56 bazlı immünomanyetik ayırma ile miyojenik hücreleri ve fibroblastları izole etme ve kantitatif immünositokimyasal analiz yapma yöntemini.

İnsan İskelet Kası İlköğretim andMyogenic Hücreleri ve Fibroblast İzolasyon ve Kantitatif İmmünositokimyasal Karakterizasyonu

Daha fazla video keşfet