İnsan İskelet Kası İlköğretim andMyogenic Hücreleri ve Fibroblast İzolasyon ve Kantitatif İmmünositokimyasal Karakterizasyonu

Bu prosedürün genel amacı, spesifik fenotipik ve transkripsiyon faktörü belirteçlerinin değerlendirilmesine izin vermek için insan kas biyopsi örneklerinden elde edilen iki ana hücre popülasyonunu yüksek verimlilik ve verimle ayırmaktır. Bu, ilk adımda, bir insan kas biyopsisi örneğinin tek bir hücre süspansiyonuna ayrıştırılmasıyla elde edilir. Yedi günlük bir kültürden sonra, hücreler, miyojenik hücreler olan CD 56 pozitif ve fibroblastlar olan CD 56 negatif fraksiyonlar olarak sınıflandırılan immünomanyetik boncuklarla ayrılır.

Hücreler daha sonra boyanır ve istenen fenotipik ve ilgilenilen protein belirteçleri için görüntülenir. Sonuç olarak, immünofloresan mikroskobu ve kantitatif görüntü analizi, sıralanan hücre popülasyonları içinde seçilen nükleer lokalize transkripsiyon faktörlerinin yoğunluğunu ölçmek için kullanılabilir. Floresan ile aktive edilmiş hücre ayıklama gibi mevcut yöntemlere göre immünomanyetik hücre ayıklama kullanan bu tekniğin temel avantajları, nazik olması, insan birincil kas hücrelerinin yüksek verim ve canlılık ile mükemmel bir şekilde sınıflandırılmasına izin vermesi ve hızlı bir şekilde gerçekleştirilebilmesidir.

Bu tekniğin etkileri, yaşlanmada ve bir dizi kas patolojisinde gözlenen fibro yağlı kas dejenerasyonunun hücresel temeli hakkındaki anlayışımızı arttırmaya doğru uzanır: Biyopsi alındıktan sonra kas kaynaklı öncü hücreleri mümkün olan en kısa sürede izole etmek. İlk olarak, doku örneğinin ağırlığını belirleyin ve daha sonra örneği fazla kandan arındırmak için kasları bazal ortamda birkaç kez şişirin. Kas tortusunu oda sıcaklığında 30 ila 60 saniye bekletin ve ardından tüpten son iki ila üç mililitre ortam hariç hepsini aspire edin.

Daha sonra, kalan sıvının kası tabağa taşımasına izin vermek için tüpü steril bir petri kabına ters çevirin. Şimdi, herhangi bir belirgin yağ veya bağ dokusunun görünür parçalarının örneğini temizleyin. Daha sonra kalan ortamı harekete geçirmek için tabağı döndürün ve ardından tüm ortamı aspire edin ve 100 ila 400 miligram doku başına üç mililitre bir kollajenaz ve disbe enzim çözeltisi ekleyin ve kas örneğini çok küçük bir ila iki milimetre küp parçalar halinde kesin.

Numune yeterince kıyıldığında. Doku parçalarını ve enzim çözeltisini steril 10 ila 20 mililitrelik konik bir tüpe aktarmak için geniş bir yaban domuzu 25 mililitre pipet kullanın. Plakayı üç mililitre enzim çözeltisi ile yıkayın ve ardından kalan kas parçalarını tüpe aktarmak için 10 mililitrelik bir pipet kullanın.

Tüpü 60 dakika boyunca 37 santigrat dereceye yerleştirin. Doku süspansiyonunu her 15 dakikada bir 10 mililitrelik bir pipetle yeniden düzenlemek. Daha sonra enzimatik ayrışmayı en az eşdeğer miktarda taze yeniden ısıtılmış büyüme ortamı ile sonlandırın.

Daha sonra, büyük döküntü parçalarını temizlemek için hücre süspansiyonunu 100 mikrometrelik bir filtreden geçirin ve ardından hücreleri yeniden santrifüjleyin. Peleti yedi ila sekiz mililitre büyüme ortamında süspanse edin ve daha sonra hücreleri kaplanmamış bir T 25 doku kültürü şişesinde inkübe edin. Yedi gün boyunca% 37 karbondioksit ile 5 santigrat derece.

Haftanın sonunda, tripsin hücre tek tabakasını üç dakika boyunca gözler. Hücreler ayrıldığında, aşırı sindirimi önlemek için beş ila 10 mililitre iskelet kası büyümesi, orta ekleyin ve hücreleri santrifüjleme ile uygulayın. Daha sonra saydıktan sonra, hücrelerin bir kısmını hücre soy işaretleyici karakterizasyonu için ayırın ve kalan hücreleri 15 mililitre PBS santrifüj kazancında yıkayın.

Bu sefer peleti 170 mikrolitre oda sıcaklığında maksimum ayırma tamponunda yeniden süspanse edin ve tekrarlamak için nazikçe pipetleyin. Hücreleri 35 mikrolitre iyi karıştırılmış anti CD 56 antikor konjuge manyetik mikro boncuklarda askıya alın. Hücre çözeltisini pipetle birkaç kez karıştırın ve karışımı yumuşak bitki örtüsü ile 15 dakika dört santigrat derece inkübe edin.

İnkübasyondan sonraki yarıda, hücre ve boncuk çözeltisini 10 mililitre ayırma tampon santrifüjü ve reus ile yıkayın. Peleti bir mililitre taze ayırma tamponunda askıya alın. Ardından, pres ayırma filtresini ve kolonu 500 mikrolitre kaynak tamponu ile yağlayın.

Ve daha sonra hemen karıştırın ve bir mililitre hücre süspansiyonunun tamamını pres ayırma filtresinden geçirin ve kolona aktarın, kolonu bir mililitre kaynak tamponu güç yıkama ile üç kez durulayın, tutmayan fibroblast fraksiyonunu toplayın, kolondan steril bir 50 mililitre konik tüpe az miktarda büyüme ortamı içeren konik tüp. Ardından sütunu mıknatıstan çıkarın ve CD 56 pozitif hücre fraksiyonunu toplamak için pistonu sütunun üstüne bastırın. Sıcak büyüme içeren ayrı bir 50 mililitrelik konik tüpte, bu adımdan orta büyüme ortamı yayılır.

Çift sıralama yapılacaksa, toplanan pozitif ve negatif hücre fraksiyonlarını düşünün. Ekstra saflık için çift kaynak kullanılması gerekiyorsa, ilk sıralamada CD 56 pozitif toplama tüpüne ortam koymayın, ancak uygun deney son noktasında filtre ve kolon yağlamasından başlayarak adımları tekrarlayın. CD 56 pozitif hücre kültürlerini, eşdeğer hacimde buz gibi,% 8 para formaldehit kullanarak kültür ortamlarına sabitleyin.

Yumuşak bitki örtüsü ile 10 dakika. Daha sonra fiksatifi aspire edin ve hücre yüzey antijenlerini immün boyamak için hücreleri PBS ile iki kez yıkayın. PBS'de% 1 BSA'da hücreleri en az bir saat bloke edin ve ardından hücreleri ilgili birincil ve ardından ikincil antikorlarla etiketleyin.

Dedektörü, lazer gücünü ve mikroskobunuz ve lekenizle ilgili pozlama ayarlarını optimize edin. Görüntüleme öncesinde hücreler, istenilen sayıda algılama kanalında ve altıdan fazla farklı görüş alanındaki hücrelerin görüntülerini alır. Analiz için, uygun TIFF görüntü dosyalarını açın ve uygun karşılık gelen kanalları kaplamak için görüntüleri birbirine sürükleyin.

Her kanal, katmanlar panelinde ayrı bir katman olarak görünecektir. Analiz penceresinde, veri noktalarını seç'i ve ardından özel'i seçin ve istediğiniz ölçümleri seçin. Nükleer floresan yoğunluğunu analiz etmek için renk aralığı iletişim kutusunu açın ve açılır menüden örneklenmiş renkleri seçin.

Ardından shift tuşunu basılı tutarak, etiketli çekirdeklere özgü tonları seçin. Bu renk aralığı seçim maskesini aynı oturumda seçilen diğer görüntülerle kullanmak üzere saklamak için kaydet'i tıklatın. Çekirdekler seçildikten sonra, tıklayın ve doldurun.

Ardından açılır menüden siyahı seçin ve opaklığın %100 olarak ayarlandığını onaylayınArdından, seç ve tersini tıklayın. Ardından sağ tıklayın ve tekrar Doldur'u seçin ve açılır menüden beyaz bir dolgu seçin. Şimdi ikili nükleer katmanda kısmen örtüşen çekirdekleri ayırmak için bir havza algoritması gerçekleştirin.

Seç'e gidin, ardından renk aralığına gidin ve ardından tek tek ayrılmış çekirdekleri seçmek için gölgeler. Ardından seçimi, istenen işaretçinin 16 bit gri tonlamalı görüntüsünü içeren katmana aktarın ve ölçümleri kaydet'e tıklayın. Son olarak, seçilen ölçümleri daha fazla işleme yağı için metin dosyaları olarak uygun analiz yazılımına aktarın.

Adipojenik ve miyojenik soy belirteçleri için immüno boyama ile birlikte saflaştırılmış hücre popülasyonlarının kırmızı boyanması, yalnızca fibroblast fraksiyonunun, fibroblastların çıplak gözle görülebilmesi ve tedavinin 15. gününde bu hücreler tarafından nükleer PPAR gamasının güçlü bir şekilde ifade edilmesiyle tam dönüşümlerinin daha fazla gösterilmesi ile epijenik bir farklılaşma yeteneğine sahip olduğunu ortaya koymaktadır. bu hücreler, kalan herhangi bir TE yedi A bağ dokusu antijenini substratlarına salmıştır. Buna karşılık, miyojenik hücreler, nükleer PPAR gama ekspresyonunun yukarı regülasyonu olmaksızın desmin ve miyozin ağır zincir ekspresyonu dahil olmak üzere normal fenotiplerini korurlar. Bu şekilde, Desmond pozitif miyojenik hücrelerin bir alanının ve bu verilerin elde edildiği alanın kantitatif analizinin bir örneği gösterilmekte olup, bu spesifik tohumlama yoğunluğu ve zaman noktasında tek tek çekirdeklerdeki miyojenik ekspresyonun varyasyonu gösterilmektedir.

Bu grafikte, bir hücre üzerindeki farklı hücre tiplerindeki transkripsiyon faktörü seviyelerini hücre bazında doğrudan karşılaştırma yönteminin faydası gösterilmiştir. Örneğin, bu CD 56 negatif kas fibroblastları, yüksek düzeyde nükleer adipojenik transkripsiyon faktörü, PPAR gama eksprese ederken, çeşitli CD 56 pozitif miyojenik hücreler, adiposit indükleyici ortama maruz kaldıktan sonra sadece çok düşük seviyelerde nükleer reseptör transkripsiyon faktörünü korur. Bu teknik, kas biyolojisi alanındaki araştırmacıların, sağlıklı veya patolojik insan kas örneklerinde hücre kaderi kararlarının mekanizmalarını keşfetmelerine olanak tanır.

Bu videoyu izledikten sonra, öncelikle, saflaştırılmış ve iyi karakterize edilmiş insan kası türevli hücrelerin yüksek verimlerinin nasıl elde edileceğini ve ikinci olarak, immünofloresan boyama ile tanımlanan hücresel bileşenlerin objektif kantitatif analizinin nasıl yapılacağını iyi anlamalısınız.