Sigara litik Ekzositoz görselleştirme Cryptococcus neoformans Dijital Işık mikroskopi ile Makrofagların gelen

Bu prosedürün genel amacı, primer kemik iliği nöron makrofajlarından cryptococcus neoformans'ın litik olmayan ekzositozunu görselleştirmektir. Bu, fagositoza ve Xeomin'in içselleştirilmesine izin vermek için önce aktive edilmiş nöro makrofajların mantar hücreleri ile kaplanması ve enfekte edilmesiyle gerçekleştirilir. İkinci adım, enfekte ve enfekte olmamış makrofajların berrak bir tek tabakasını sağlamak için hücre dışı mantar hücrelerini çıkarmaktır.

Daha sonraki makrofajlar, karbondioksit sıcaklık kontrollü bir odada inkübe edilir ve litik olmayan ekzositoz ve diğer etkileşimlerin örneklerini yakalamak için 24 saat boyunca kaydedilir. Son adım, 24 saatlik bir süre içinde yapılan tüm kareleri sıkıştırarak bir film oluşturmaktır. Sonuç olarak, dijital ışık mikroskobu ile makrofaj görselleştirmesi, makrofajların 24 saatlik bir enfeksiyon boyunca geçirdiği çeşitli litik olmayan ekzositoz tiplerini gözlemlemek için kullanılır.

Bu yöntem, hücresel olayların zamanlaması ve niceliklerinin belirlenmesi gibi konak patojen etkileşim alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir Deneyden bir gün önce, bir sbarro agar plakasında yetiştirilen tek bir kıdemli ustabaşı kolonisi seçin ve aşılayın. 10 mililitre sbarro suyu. Kültürün gece boyunca 37 santigrat derecede büyümesine izin verin ve yazılı protokolde açıklandığı gibi farelerin ötenazisini takiben 250 RPM hızında sallayın.

Tüm vücudu %70 etil alkol ile sterilize edin. Hem femurları hem de tibiayı çıkarın ve kemikleri steril ikililere, modifiye kartal ortamına veya DMEM'e yerleştirin. Ardından, kemikler tamamen temizlenene kadar hassas mendiller kullanarak fazla doku ve kası çıkarın.

%70 etil alkol içeren bir Petri kabına sadece sağlam kemikleri yerleştirin ve ilişkili mikroorganizmaları öldürmek için üç dakika inkübe edin. Kemikleri çıkarın ve steril DMEM ile bir Petri kabına yerleştirin. Sonra, kemiklerin uçlarını dikkatlice kesin.

Kemiği buz üzerine yerleştirilmiş bir MT 50 mililitrelik konik tüp üzerinde tutun ve her kemikten 10 mililitre soğuk DMEM'i dikkatlice akıtmak için 25 gauge bir iğne kullanın. Daha sonra toplanan hücre süspansiyonunu oda sıcaklığında 650 kez G'de 10 dakika santrifüjleyin.Bu santrifüjleme sırasında, metin protokolünde açıklandığı gibi kemik iliği makrofaj besleme ortamını hazırlayın ve filtreleyin. Ardından, elde edilen paleti 10 mililitre besleme ortamı ile yeniden askıya alın.

Hücre kümelerini bozmak ve büyük kalıntıları gidermek için hücre süspansiyonunu 70 mikrometrelik bir hücre süzgecinden geçirin. Daha sonra, suş hücresi süspansiyonunun bir mililitresini, doku kültürü kullanımı için belirlenmiş Petri kapları olan 10 mililitre besleme ortamına yerleştirin. Hücrelerin yedi gün boyunca% 10 karbondioksit ile 37 santigrat derecede yapışmasına izin verin.

Deneyden bir gün önce metin protokolünde açıklandığı gibi besleme ortamının değiştirilmesi. Besleme ortamını çıkararak makrofajları plakadan ayırın ve hücrelerin beş ila 10 dakika inkübe edilmesini takiben plakaya beş mililitre yumuşak bir hücre sıyırma reaktifi ekleyin. 37 santigrat derecede, makrofajları nazik pipetleme ile çıkarın.

Hücreleri 10 dakika boyunca 650 kez G'de santrifüjleme ile peletleyin ve peleti bir mililitre besleme ortamında reus bükün. Bir ila 20 seyreltme kullanarak, 10 mikrolitre hücre süspansiyonunu 14 milimetre cam tabanlı bir hemo sitometreye pipetleyerek makrofaj konsantrasyonunu hesaplayın. Petri kapları, maksimum 200 mikrolitre tutan iç kuyuya doğrudan 10 ila beşinci makrofajlar arasında bir konsantrasyon yerleştirir.

Bu hacmi aşmamaya dikkat edin. Bulaşıkları bir saat boyunca 37 santigrat derece inkübatöre yerleştirerek hücrelerin cam Petri kabına yapışmasına izin verin. Daha sonra, mililitre başına bir miligram ve interferon gama ile lipopolisakkarit ile desteklenmiş bir ila iki mililitre besleme ortamı ekleyin.

Mililitre başına 500 birimde, hücrelerin deney gününde gece boyunca inkübe etmesine izin verin. Gece boyunca aşılanmış bir G hücre kültürünün bir mililitresini çıkarın ve maya hücrelerini beş dakika boyunca 420 kez santrifüjleme ile pal G.To ortamı ve hücre dışı kriptokok ürünlerini çıkarın, hücreleri fosfat tamponlu salin veya PBS ile üç kez yıkayın ve ardından daha önce olduğu gibi santrifüjleyin. Maya hücresi peletini bir mililitre steril PBS içinde askıya aldıktan ve bir ila 100 seyreltme yaptıktan sonra, 10 mikrolitre seyreltmeyi bir hemo sitometreye pipetleyin ve hücreleri sayın.

Bir ila beş arasında bir enfeksiyon çokluğu için gereken maya hücrelerinin konsantrasyonunu hesaplayın. Hesaplanan kriptokok hücre süspansiyonu hacmini, monoklonal antikor ile bir mililitre besleme ortamına, mililitre başına 10 mikrogram konsantrasyonda 18 B yediye ekleyin. Hücre süspansiyonunu oda sıcaklığında beş dakika inkübe edin.

Daha sonra, besleme ortamını cam Petri kabından çıkarın ve makrofajları steril PBS ile bir kez yıkayın. Daha sonra 100 mikrolitre opsonize cmin doğrudan kuyuya ekleyin, ardından maya ile 37 santigrat derecede ve% 10 karbondioksit tarafında iki saat inkübe edin. Ko inkübasyondan sonra, makrofajların içselleştirilmiş c olduğu mikroskopla kontrol edildikten sonra, içselleştirilmiş kriptokok hücreleri olarak kabul edilecek eFormlar, büyük ok başı ile gösterildiği gibi makrofajın sınırları içinde açıkça görülmelidir.

Daha küçük ok başı, mantar hücresi olmayan enfekte olmamış bir makrofajı gösterir. Tüm hücre dışı c neoformanları çıkarmak için Petri kabını steril PBS ile üç kez yıkayın. Daha sonra bu deneyleri gerçekleştirmek için monoklonal antikor olmadan bir ila iki mililitre besleme ortamı ekleyin.

Deneyden önce karbondioksit iletimi ve bir ısıtma ünitesi içeren ekli bir inkübasyon odası ile donatılmış bir mikroskop gereklidir. Kuluçka odasını 37 santigrat derecede en az 30 dakika önceden ısıtın. Deneyin başında karbondioksit ünitesinin %5'i okuduğundan emin olun.

Cam tabanlı Petri kabını mikroskop platformuna yerleştirin, karbondioksit yanan bir kapakla kapatın ve ısı kaçmamasını sağlamak için tüm kapıları kapatın, faz kontrastlı mikroskop ile 10 x objektifi kullanın, enfekte makrofajların net bir alanına odaklanın, mikroskop yazılımını 24 saatlik bir süre boyunca her dört dakikada bir görüntü alacak şekilde ayarlayın. 24 saat sonra deney tamamlanmış olacak ve toplam 361 görüntü toplanmış olacak. Bu görüntüleri %5 sıkıştırmayla JPEG olarak dışa aktarın.

Image J yazılımını kullanarak, görüntüleri saniyede beş kare hızında görsel bir yığın olarak görüntüleyin. Filmin ilk karesi, bazıları enfekte olmamış ve bazıları değişen miktarlarda kriptokok hücrelerine sahip olan birçok makrofajı göstermektedir. Film ilerledikçe, hücrelerin hepsi modur ve bu filmde alanda hareket ederken görülebilir, kriptokok hücrelerinin enfekte olmuş bir makrofajın sınırları içinde olduğu açıktır.

Makrofaj çalkalanır ve bir maya hücresi görülebilir, ancak FGA bölgesi içinde, kriptokok hücreleri daha sonra hızla çevreye atılır. Enfekte olmuş ikinci bir makrofaj, litik olmayan ekzositoza uğrar ve hücre dışı boşluğa daha fazla maya hücresi salınır. Konak hücreler, hareket etmeye devam etme yetenekleri ile belirtildiği gibi kriptokokal ekzositozdan sonra canlı kalır.

Bazen, makrofajlar, konakçı hücreler arasında kriptokok hücrelerinin transferini kolaylaştıracak şekilde etkileşime girecektir. Maya hücreleri hücre dışı ortama maruz kalmaz ve konakçı hücreler canlı kalır. Bu filmde, enfekte olmuş iki makrofaj, kriptokok hücrelerini bir makrofajdan diğerine taşımak için iki ayrı durumda hücreden hücreye köprüler oluşturur.

Bu videoyu izledikten sonra, litik olmayan ekzositoz geçiren makrofajları ve diğer konakçı patojen etkileşimlerini görselleştirmek için dijital ışık mikroskobunun nasıl kullanılacağını iyi anlamış olmalısınız.