Bir Geliştirilmesi In vitro bir model sistem Equus Caballus ile IgE

Aşağıdaki deneyin genel amacı, RAD Bazofil lösemi hücrelerinden IgE'ye bağımlı mediatör salınımının miktarını ölçmektir. Alerji semptomları, histamin gibi aracıların salınmasından kaynaklanır. Şimdi, bazofiller tarafından salınan tek mediatör histamin mast hücreleri değildir.

Bu hücreler tarafından salınan tüm mediatörlerin toplamı, ani ve gecikmiş aşırı duyarlılığın belirti ve semptomlarına neden olur. Şimdi, köpekler ve atlar da alerjiden muzdarip olan tek organizma insanlar değil. Araştırmayı daha da geliştirmek ve aşılar gibi alerjiye karşı tedaviler bulmak için, varsa araştırma tedavisinden salınan aracıların miktarını ölçmek için bir salım testi gereklidir.

Bu serbest bırakma testinin nedeni budur. İnsan sistemi için serbest bırakılan RBL aracısı testi ilk olarak 1986 yılında Ian ve Hook tarafından geliştirilmiş ve yayınlanmıştır. Daha sonra DOC sistemi için ve şimdi de at sistemi için geliştirildi.

Modifikasyonlar, ilgilenilen proteinleri değiştirmek kadar basittir. Hücre hattı haberleri, at yüksek FNT ffc Serin R bir reseptör alfa zincirini mililitre başına 500.000 hücrelik bir hücre yoğunluğuna ifade eden Rat Baso lösemisi veya RBL iki H 3.1 hücre hattıydı. İlgilenilen IgE antikorunu mililitre başına bir nanogramlık bir nihai konsantrasyona ekleyin.

Karışımdan 100 mikrolitre 96 toprak plakasına ekleyin ve 37 derecede 16 saat inkübe edin. Bu, hücrelerin kuyu yüzeyine yapışmasına izin verir ve antikor, reseptör yıkamasına bağlanır. Kalan bağlanmamış antikoru ve ölü hücreleri içeren ortamın iki katı 100 mikrolitre ılık 37 derece serbest bırakma tamponu.

Tamponu son yıkamadan atın ve ilgilenilen konsantrasyonda 100 mikrolitre ilgilenilen antijen ile değiştirin. 37 derecede 20 dakikalık inkübasyondan sonra, salım mediatörlerini içeren 50 mikrolitre SUP natini yeni bir kuyucuğa aktarın ve kalan süpernatanı hücreleri bağlamak ve kalan mediyatörleri hücrelerin içinde serbest bırakmak için 50 mikrolitre Triton X tamponu ile değiştirin. 50 mikrolitrede 2 milyon molar beta hx.

Birçok gün substrat sitrat tamponu içinde çözülür. 37 derecede iki saatlik bir inkübasyondan sonra, her kuyucuğa 150 mikrolitre tris tamponu ekleyin ve kuyuyu sarıya çevirin. 16 saat sonra 405 nanometrede renk emilimini ölçün.

Ian Buffer olarak da bilinen serbest bırakma tahlil tamponunu 37 derecede ısıtın. Ayrıca, konsantrasyonlarda salım tamponundaki antijenin konsantrasyon gradyanını hazırlayın. Sıfır 0.1 1 10, 100, 1000 ve mililitre başına 10.000 nanogram.

Sonra 37 derecede ısıtın. Ortamı çıkarmak için tabağı hızlı bir şekilde hafifçe vurarak kuyuları yıkayın ve kuyuların duvarlarına doğru yavaşça 100 mikrolitre ılık salma tamponu ekleyin. Bu, sıcaklık farkından kaynaklanan hücre stresini azaltmak içindir, bu da aracıları erken serbest bırakmalarına neden olur.

Çanak iki kez yıkanmalıdır. Son salım tamponunu atın, yıkayın ve 100 mikrolitre antijen ekleyin, negatif kontrol için A satırında sıfır antijen konsantrasyonundan başlayarak ve konsantrasyon gradyanını B satırlarından G'ye ve son olarak Triton X dilimlerine indirgeyin, H satırında tamponlayın. Plakayı 37 derecede 20 dakika inkübe edin.

Bu, hücrelerin inkübasyon döneminden sonra mediyatörleri serbest bıraktığı noktadır. Her kuyucuğun içindeki 50 mikrolitre sıvıyı ilgili kuyucuğuna aktarın. Yedi ila 12 sütununda, kalan sıvıyı bir ila altı konumlarında tamamen dışarı çıkarın ve atın ve 50 mikrolitre Triton X lizis tamponu ile değiştirin.

Yemeğin 96 kuyusunun tümüne hazırlanan substrattan 50 mikrolitre ekleyin. İki saat boyunca 37 derecede inkübe edin. Beta H, birçok gün substratı dört nitro fenole dönüştürür.

Kuluçka süresinden sonra, 150 mikrolitre tris tamponu ekleyerek reaksiyonu durdurun ve dört nitrofenolü sarı bir renge dönüştürün. 405 Nanometrede bir plaka spektrofotometresi kullanarak plakayı okuyun. Absorbans verilerini ölçtükten sonra, A kuyu pozisyonundaki hücrelerin içindeki toplam aracıların miktarını çarparak hesaplayın.

Yediye iki konumunda karşılık gelen kuyu ve sonucu birdeki değere ekler. Bunun nedeni, deney sırasında, onu yeni bir kuyu muhalefetine aktardığımız gibi, serbest bırakma aracıları A muhalefetini içeren supinatın olmasıdır. Bir yedi.

Kuyuların geri kalanı için hesaplamaları tekrarlayın. Kuyu karşıtlığındaki serbest bırakma aracılarının yüzdesini, A yedi konum değerini iki ile çarparak hücrelerin içindeki hesaplanan toplam aracılardan A yedi'yi hesaplayın. Yine, çünkü deney sırasında, Reese aracılarını içeren süpernata sahibiz.

Onu yeni bir ürüne aktarırken, o ürünü 100 ile çarpın ve bu ürünü, o konum için hücrelerin içindeki aracıların karşılık gelen toplam değerine bölün. Bu, şişme için serbest bırakma aracılarının yüzdesini verir. Kuyucukların geri kalanı için hesaplamaları tekrarlayın, çünkü her sıradaki altı şişme aynı antijen ortalaması konsantrasyonu ile karşı karşıya kalır.

Bu değerler ve standart sapmayı hesaplayın, bu değerleri aşağıdaki gibi bir grafik üzerinde çizin. Grafik, antijen konsantrasyonu arttıkça, mililitre başına 100 nanogramda zirveye ulaşana kadar daha fazla aracının salındığını, ardından aracı salınımının artan antijen konsantrasyonu ile azaldığını göstermektedir. Açık mavi renkteki kontrol salım testi, IgE antikorları içermez ve bu nedenle artan antijen konsantrasyonu ile aracı salınımında herhangi bir değişiklik göstermez.

Bunu, IgE antikoru içerebilecek koyu mavi renkli deneysel sonuçla karşılaştırın. Bu, güvenlik açısından test edilen bir anti-IgE aşısının bir örneğidir. Kırmızı renkteki bu grafikten, anti-IgE serumunun hücre yüzeyindeki reseptörleri çapraz bağladığı ve RBL hücrelerinin tıpkı mor pozitif kontrolde görüldüğü gibi gri renkteki negatif kontrole kıyasla granül hale gelmesine neden olduğu ve bu aşıyı güvensiz hale getirdiği açıktır.

Bu test çok yararlıdır, çünkü potansiyel anti-alerji ilaçları veya aşıları test edilirken aracı salınımını ölçebilir veya bunun gecikmesini ölçebilir, ayrıca gösterildiği gibi insan köpek veya at sistemleri için de uyarlanabilir, tahlil, anti-alerji antikorlarını test ederken mediatör salınımının başarılı bir şekilde bloke edilmesini veya başarısız bir şekilde bloke edilmesini belirleyebilir.