Solunum Sıvılarda equid Herpes-2 Teşhis için bir Nicel PCR Yöntemi Geliştirilmesi ve Validasyonu

qPCR yönteminin genel amacı, atlardan alınan biyolojik örneklerdeki equine herpesvirus-2 viral yükünü değerlendirmektir. Bu yöntem, atlardaki solunum yolu hastalıklarının tanı alanındaki temel soruların yanıtlanmasına ve uygulamacılar için yeni yorumlayıcı yardımcılar hakkında kantitatif veriler sağlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı; hassas, spesifik ve hızlı bir yöntem olmasıdır.

Bir diğer avantaj ise, uluslararası normalizasyon komitesinin Fransa temsilcisi olan AFNOR norme NF U47-600 standardına göre geliştirilmiş olmasıdır. Prosedürü, birimimden genç bir araştırmacı olan Erika Hue uygulamalı olarak gösterecek. Solunum sıvıları biyolojik örneğinden nükleik asitleri ekstrakte etmek için, bir çeker ocuk altında, 560 microliter lizis solüsyonuna 140 microliter biyolojik örnek ekleyerek başlayın ve oda sıcaklığında 10 dakika boyunca inkübe edin.

Numuneye 560 µL etanol ekleyin, toplam çözeltiden 630 µL'sini bir silika kolonuna uygulayın ve santrifüjleyin. Kalan 630 µL'yi silika kolonuna uygulayın ve tekrar santrifüjleyin. Numune kolona uygulandıktan sonra, kolonu iki kez yıkamak için AW1 ve AW2 yıkama tamponlarından 500 µL'şer kullanın.

Ardından, nükleik asitleri kolondan elüe etmek için 50 µL oda sıcaklığında elüsyon veya AVE tamponu ekleyin. Kapağı kapatın ve oda sıcaklığında bir dakika boyunca inkübe edin. Ardından 6.000 ×g'de bir dakika boyunca santrifüjleyin.

DNA'yı amplifiye etmek için, primerleri ve probu metin protokolüne göre titre ettikten sonra; her bir reaksiyon için 12,5 µL PCR master mix, 20 µM ileri ve geri primerler, 10 µM prob ve 22,5 µL'ye tamamlayacak kadar ultra saf su ekleyerek 22,5 µL reaksiyon karışımı hazırlayın. Kontaminasyonu önlemek için PCR reaksiyon karışımını her zaman özel bir alanda hazırlayın. Uygun reaksiyon karışımından 22,5 µL'lik porsiyonları 96 kuyucuklu plakanın her bir reaksiyon kuyucuğuna dağıtın.

Reaktiflerin istenmeyen DNA ile kontamine olmadığını doğrulamak için ekstraksiyon ve PCR için negatif kontroller ekleyin. Ardından; örneği, ekstraksiyon negatif kontrolünü, PCR negatif kontrolünü veya pozitif kontrol örneğini 2,5 µL hacminde ilgili reaksiyon kuyucuklarına ekleyin. Sonrasında plakayı kapatmak için yapışkan bir plaka sızdırmazlık filmi kullanın.

Ardından 6, 000 gs'de 10 saniye boyunca santrifüjleyin. Plakayı bir gerçek zamanlı PCR sistemine yerleştirin. Daha sonra, burada gösterilen analiz düzeni şablonunu ve PCR program ayarlarını seçerek çalışmayı başlatın.

Ham veriler gerçek zamanlı PCR sisteminden bir hesap tablosuna aktarıldıktan sonra, her bir örnek için eşik döngüsünü (threshold cycle) elde etmek amacıyla amplifikasyon grafiklerindeki eşik değeri, baz çizgisinin üzerine ve eksponansiyel büyüme bölgesine ayarlayın. Doğrusallığı belirlemek için her bir nokta standart setini bir standart eğri olarak çizin. Ardından, farklı örnekler için kopya sayısını standart eğriye dayanarak hesaplayın.

qRT-PCR sonuçlarının saptama sınırını belirlemek için, altı tüpe 90 µL ultra saf su ekleyin. Azaltma bölgesini hedeflemek üzere plazmidin altı adet on katlı seri dilüsyonunu hazırlamak için, öncelikle plazmid çalışma dilüsyonundan 10 µL alarak 90 µL ultra saf su içeren tüpe aktarın. Tüpü kısa süre vortexleyip santrifüjleyin.

Ardından, tüpten 10 µL alarak bir sonraki su tüpüne aktarın. Vorteksleme ve santrifüjlemeden sonra, tüm su tüpleri plazmidi alana kadar aktarma işlemini tekrarlayın. Bu videonun başında açıklandığı şekilde, altı adet on katlı seri dilüsyonda DNA'yı amplifiye ettikten sonra, pozitif sinyal veren son plazmid dilüsyonu ile deteksiyonun gerçekleşmediği ilk dilüsyona karşılık gelen azalma bölgesini belirleyin.

Altı adet iki katlı seri dilüsyon hazırlamak için altı tüpe 25 microliters ultra saf su ekleyin. On katlı dilüsyonlarda pozitif sinyal veren son plazmid dilüsyonundan, tüpteki 25 microliters örneği ilk su tüpüne aktarın. Gösterildiği şekilde kalan beş dilüsyonu hazırlamadan önce vorteksleyin ve santrifüjleyin.

Bu videoda daha önce açıklandığı gibi, iki katlı seri dilüsyonlardan elde edilen DNA'yı amplifiye edin. Üç bağımsız denemeden elde edilen DNA'yı amplifiye ettikten sonra, her bir plazmid konsantrasyon seviyesi için 24 replikat üzerinden pozitif replikat sayısını hesaplayın. 24 replikattan 23'ünün pozitif tespit edildiği seviye olan %95 güven aralığındaki LOD'yi veya LOD %95 PCR değerini belirleyin.

Yöntemin LOD değerini belirlemek için, pozitif sinyal veren on katlı bir dilüsyondaki son konsantrasyondan dört kat daha konsantre olan 25 microliter plazmit çalışma dilüsyonu ile başlayarak beş adet iki katlı seri dilüsyon hazırlayın. Amplifikasyon adımında kullanılan plazmit, kontaminasyonu önlemek için belirli bir alanda hazırlanan plazmit çalışma dilüsyonundan gelir. Bu kritik bir adımdır.

Beş pozitif standardın dört tekrarını elde etmek için, plazmidin her bir dilüsyonundan 5 µL'yi, 135 µL negatif kaynak materyal içeren dört tüpe aktarın. Beş pozitif standart için dört tekrarın ekstraksiyonunu gerçekleştirin ve bu videonun önceki bölümlerinde açıklandığı şekilde amplifikasyon prosedürünü uygulayın. Her bir plazmid konsantrasyon seviyesi için sekiz tekrar arasından pozitif tekrar sayısını sayın.

Son olarak, sekiz replikadan sekizinin de pozitif olduğu son seviye olan LOD yöntemini belirleyin. Bu videoda açıklanan kantitatif RT-PCR yöntemi, solunum sıvılarındaki equid herpesvirus-2'yi tespit eder ve miktarını belirler. Bu deneyde, 10⁻⁹ ile 10⁻¹⁰ dilüsyonlar arasında yer alan azalma bölgesini tahmin etmek için on katlı seri dilüsyonlar yapılmıştır.

LOD PCR değeri, azalma bölgesinde yeni bir iki katlı seri dilüsyon ile belirlenmiştir. Lineerlik aralığını ve LOQ PCR değerini belirlemek için, LOD PCR değeri olan 2,6 ile 2,5 µL örnek başına 260.000 kopya arasındaki altı adet on katlı seri dilüsyon aralığının başlangıç noktası olarak kullanılmıştır. LOQ PCR, lineerlik aralığındaki en düşük konsantrasyondur.

Tüm yöntemin karakterizasyonu, solunum örneğinden DNA ekstraksiyonundan başlayarak hedefin amplifikasyonu ve kantifikasyonuna kadar qRT-PCR verilerini elde etmek için gerekli olan tüm basamakların validasyonudur. qRT-PCR bütünsel analitik yönteminin kantitatif performansı değerlendirilmiş ve bu grafikte sunulan bir doğruluk profili ile valide edilmiştir. Solunum bozuklukları olan atlardan alınan 172 nazal sürüntü örneğindeki EHV2 viral genom yükleri burada gösterildiği gibi kantifiye edilmiştir.

Viral genom yükleri genç atlarda daha yüksek olup, en yüksek yük mililitre başına 1,9 x 10¹¹ kopya olarak tespit edilmiştir. Bu teknik bir kez kavrandıktan sonra, amplifikasyon basamağı başına iki saatten kısa sürede tamamlanabilir ve uygun şekilde yürütüldüğünde toplam validasyon basamakları dört haftadan kısa sürede gerçekleştirilebilir. Bu prosedür uygulanırken, özellikle bir plazmit solüsyonu ile çalışırken kontaminasyon riskinden kaçınmak gerektiğini hatırlamak önemlidir.

Bu prosedürün ardından, genom tanımlama gibi ek soruları yanıtlamak amacıyla dizileme gibi diğer yöntemler uygulanabilir. Bu videoyu izledikten sonra, DNA ekstraksiyonu ve amplifikasyonunun nasıl gerçekleştirileceği ve PCR rezervlerinin nasıl karakterize edileceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız. Patojenler gibi biyolojik örneklerle çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini unutmayın.

Bu prosedürü gerçekleştirirken, çeker ocak içinde çalışmak ve uygun güvenlik seviyesindeki bir alanda bulunmak gibi bazı önlemler her zaman alınmalıdır.