Solunum Sıvılarda equid Herpes-2 Teşhis için bir Nicel PCR Yöntemi Geliştirilmesi ve Validasyonu
March 17th, 2016
Burada, at solunum sıvılarında EHV-2 DNA'sının tespiti ve miktarının belirlenmesi için kullanılan kantitatif bir PCR yönteminin geliştirilmesi ve doğrulanması için bir protokol sunuyoruz. EHV-2 qRT-PCR doğrulama protokolü üç bölümden oluşan bir prosedür içerir: geliştirme, tek başına qRT-PCR testinin karakterizasyonu ve tüm analitik yöntemin karakterizasyonu.
qPCR yönteminin genel amacı, atlardan alınan biyolojik örneklerde at herpesvirüsü-2'nin viral yükünü değerlendirmektir. Bu yöntem, atlarda solunum yolu hastalığının tanı alanlarındaki temel soruların, uygulayıcılar için yeni yorumlayıcı yardımcılara ilişkin nicel verilerin yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin en büyük avantajı hassas, spesifik ve hızlı bir yöntem olmasıdır.
Diğer bir avantaj, uluslararası normalleşme komitesinde Fransız temsilcisi olan AFNOR norme NF U47-600'e göre geliştirmedir. Prosedürü göstermek, birimimden genç bir araştırmacı olan Erika Hue olacak. Biyolojik bir solunum sıvısı örneğinden nükleik asitleri çıkarmak için, bir davlumbaz altında, 560 mikrolitre lizis çözeltisine 140 mikrolitre biyolojik numune ekleyerek başlayın ve oda sıcaklığında 10 dakika inkübe edin.
Numuneye 560 mikrolitre etanol ekleyin ve toplam çözeltinin 630 mikrolitresini bir silika kolonuna ve santrifüje uygulayın. Kalan 630 mikrolitreyi silika kolonuna uygulayın ve tekrar santrifüjleyin. Numune kolona uygulandıktan sonra, kolonu iki kez yıkamak için AW1 ve AW2 yıkama tamponlarının her biri 500 mikrolitre kullanın.
Daha sonra nükleik asitleri kolondan çıkarmak için 50 mikrolitre oda sıcaklığında elüsyon veya AVE tamponu ekleyin. Kapağı kapatın ve oda sıcaklığında bir dakika inkübe edin. Daha sonra bir dakika boyunca 6.000 gs'de santrifüjleyin.
DNA'yı amplifiye etmek için, primerleri ve probu metin protokolüne göre titre ettikten sonra, 12,5 mikrolitre PCR ana karışımı, 20 mikromolar ileri ve geri primer, probun 10 mikromolar ve 22,5 mikrolitreye ulaşmak için gerektiği kadar yeterli ultra saf su ekleyerek her reaksiyon için 22,5 mikrolitre reaksiyon karışımı hazırlayın. Kontaminasyonu önlemek için PCR reaksiyon karışımını her zaman belirli bir alanda hazırlayın. 96 oyuklu bir plakanın her bir reaksiyon kuyusuna 22.5 mikrolitre uygun reaksiyon karışımını ekleyin.
Reaktiflerin hiçbirinin istenmeyen DNA ile kontamine olmadığından emin olmak için ekstraksiyon ve PCR için negatif kontrolleri dahil edin. Daha sonra, ilgili reaksiyon kuyucuklarına numuneden, ekstraksiyon negatif kontrolünden, PCR negatif kontrolünden veya pozitif kontrol numunesinden 2,5 mikrolitre ekleyin. Ardından plakayı kaplamak için yapışkan bir plaka contası kullanın.
Ve 10 saniye boyunca 6.000 gs'de santrifüjleyin. Plakayı gerçek zamanlı bir PCR sistemine yerleştirin. Ardından tahlil düzeni için şablonu ve burada gösterilen PCR program ayarlarını seçin ve çalıştırmayı başlatın.
Ham verileri gerçek zamanlı PCR sisteminden bir elektronik tabloya aktardıktan sonra, her numune için eşik döngüsünü elde etmek için amplifikasyon grafiklerinde eşiği taban çizgisinin üzerinde ve üstel büyüme bölgesi içinde ayarlayın. Doğrusallık elde etmek için her nokta standart setini standart bir eğri olarak çizin. Ardından, standart eğriye göre farklı numuneler için kopya numarasını hesaplayın.
qRT-PCR sonuçlarının tespit sınırını belirlemek için 90 mikrolitre ultra saf suyu altı tüpe dağıtın. Azaltma bölgesini hedeflemek için plazmitin altı on kat seri seyreltmesini hazırlamak için, plazmit çalışma seyreltmesinden 10 mikrolitreyi 90 mikrolitre ultra saf su ile tüpe aktararak başlayın. Tüpü kısaca girdap haline getirin ve santrifüjleyin.
Ardından tüpten 10 mikrolitreyi bir sonraki su tüpüne aktarın. Girdaplama ve santrifüjlemeden sonra, tüm su tüpleri plazmidi alana kadar transferi tekrarlayın. Bu videoda daha önce tarif edildiği gibi altı on kat seri seyreltmede DNA'yı amplifiye ettikten sonra, pozitif bir sinyal üreten plazmitin son seyreltilmesi ve tespit edilmeden ilk seyreltme olan azaltma bölgesini belirleyin.
Altı adet iki katlı seri seyreltme hazırlamak için, 25 mikrolitre ultra saf suyu altı tüpe dağıtın. On kat seyreltmeden pozitif bir sinyal veren son plazmid seyreltilmesinden, tüpten 25 mikrolitreyi ilk su tüpüne aktarın. Vorteks ve santrifüj hazırlamadan önce kalan beş seyreltmeyi az önce gösterildiği gibi hazırlayın.
Bu videoda daha önce anlatıldığı gibi iki katlı seri seyreltmelerden DNA'yı çoğaltın. Üç bağımsız denemeden elde edilen DNA'yı çoğalttıktan sonra: Her plazmit konsantrasyonu seviyesi için 24 kopyadan pozitif kopyaların sayısını hesaplayın. LOD'yi yüzde 95 veya LOD'nin yüzde 95'i PCR güveniyle belirleyin, bu da 24 tekrardan 23 pozitif kopyanın algılanmasıyla sonuçlanan seviyedir.
Yöntemin LOD'sini belirlemek için: Pozitif bir sinyal veren on katlı bir seyreltmeden son konsantrasyondan dört kat daha konsantre olan 25 mikrolitre plazmit çalışma seyreltmesi ile başlayarak beş adet iki katlı seri seyreltme hazırlayın. Amplifikasyon adımında kullanılan plazmit, kontaminasyonu önlemek için belirli bir alanda hazırlanan bir plazmit çalışma seyreltmesinden gelir. Bu kritik bir adım.
Beş pozitif standardın dört kopyasını elde etmek için her plazmid seyreltmesinden 5 mikrolitreyi 135 mikrolitre negatif kaynak materyali ile dört tüpe aktarın. Beş pozitif standart için dört kopyanın ekstraksiyonunu gerçekleştirin ve bu videoda daha önce açıklandığı gibi amplifikasyon prosedürünü gerçekleştirin. Her plazmit konsantrasyonu seviyesi için sekiz kopyadan pozitif kopyaların sayısını sayın.
Son olarak, sekiz kopyadan sekizinin pozitif olduğu son seviye olan LOD yöntemini belirleyin. Bu videoda açıklanan kantitatif RT-PCR yöntemi, solunum sıvılarındaki equid herpesvirus-2'yi tespit eder ve miktarını belirler. Bu deneyde, 10 ila negatif 9. ve 10 ila negatif 10. seyreltmeler arasında yer alan azaltma bölgesini tahmin etmek için on kat seri seyreltme yapıldı.
LOD PCR değeri, azaltma bölgesinde yeni bir iki kat seri seyreltme ile belirlendi. Doğrusallık aralığını ve LOQ PCR'yi belirlemek için LOD PCR değeri, 2.6, LOD PCR değeri ve 2.5 mikrolitre numune başına 260.000 kopya arasında altı on kat seri seyreltme aralığını başlatmak için kullanıldı. LOQ PCR, doğrusallık aralığındaki en düşük konsantrasyondur.
Tüm yöntemin karakterizasyonu, solunum örneğinden DNA'nın ekstraksiyonundan hedefin amplifikasyonuna ve miktar tayinine kadar qRT-PCR verilerini elde etmek için gerekli tüm adımların doğrulanmasıdır. qRT-PCR tüm analitik yönteminin kantitatif performansı, bu grafikte temsil edilen bir doğruluk profili ile değerlendirildi ve doğrulandı. EHV2 viral genomu, burada gösterildiği gibi ölçüldüğü durumlarda, solunum bozukluğu olan atlardan alınan 172 burun sürüntü örneğine yüklenir.
Viral genom yükleri genç atlarda daha yüksekti ve en yüksek yük mililitre başına 1.9 kez 10 ila 11. kopya olarak tespit edildi. Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik amplifikasyon adımı başına iki saatten daha kısa sürede yapılabilir ve uygun şekilde gerçekleştirilirse doğrulama adımlarının toplamı dört haftadan daha kısa sürede gerçekleştirilebilir. Bu prosedürü denerken, özellikle bir plazmid çözeltisi ile çalışırken kontaminasyon riskinden kaçınmayı unutmamak önemlidir.
Bu prosedürü takiben, genom tanımlama gibi ek soruları yanıtlamak için dizileme gibi diğer yöntemler de gerçekleştirilebilir. Bu videoyu izledikten sonra, DNA'nın ekstraksiyonu ve amplifikasyonunun nasıl gerçekleştirileceğini ve PCR rezervlerini nasıl karakterize edeceğinizi iyi anlamış olmalısınız. Patojenler gibi biyolojik örneklerle çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini unutmayın.
Bu prosedür gerçekleştirilirken davlumbazda çalışma ve uyarlanmış güvenlik seviyesi alanı gibi bazı önlemler her zaman alınmalıdır.
Genel Bakış
Bu makale, atlarda solunum yolu sıvılarında EHV-2 DNA'sını tespit etmek için bir nicel PCR yönteminin geliştirilmesi ve doğrulanması için bir protokol sunmaktadır. Yöntem, atlarda solunum yolu hastalıklarını teşhis etmeye yardımcı olmak için hassas ve spesifik nicel veriler sağlamayı amaçlamaktadır.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Bilim Alanı
- Veteriner teşhis
- Viroloji
- Moleküler biyoloji
Arka Plan
- At herpesvirüs-2 (EHV-2), atlarda solunum yolu hastalıkları ile ilişkilidir.
- Nicellendirilmiş PCR (qPCR), viral yükleri değerlendirmek için değerli bir araçtır.
- Yöntemin standardizasyonu, güvenilir sonuçlar için kritik öneme sahiptir.
- Protokol, kalite güvencesi için AFNOR norme NF U47-600'e uymaktadır.
Çalışmanın Amacı
- EHV-2 tespiti için güvenilir bir qPCR yöntemi geliştirmek.
- Yöntemi klinik teşhislerde kullanım için doğrulamak.
- Uygulayıcılara daha iyi karar verme için nicel veriler sağlamak.
Kullanılan Yöntemler
- Solunum yolu sıvı örneklerinden nükleik asitlerin ekstraksiyonu.
- Spesifik primerler ve problar ile PCR reaksiyon karışımlarının hazırlanması.
- Amplifikasyon ve tespit için gerçek zamanlı PCR sisteminin uygulanması.
- Seri dilüsyonlar yoluyla tespit sınırının (LOD) belirlenmesi.
Ana Sonuçlar
- qPCR yöntemi, at solunum yolu sıvılarında EHV-2'yi başarıyla tespit etti.
- On kat dilüsyonlar yoluyla hafifleme bölgesinin tahmini belirlendi.
- Yöntem, yüksek hassasiyet ve spesifiklik gösterdi.
- Doğru ölçümler için doğrusal aralık ve kantitatif tespit sınırı (LOQ) belirlendi.
Sonuçlar
- Doğrulanmış qPCR yöntemi, klinik örneklerde EHV-2 tespiti için etkilidir.
- Bu protokol, at solunum yolu hastalıkları için teşhis yeteneklerini artırabilir.
- Gelecekteki çalışmalar, bu yöntemin farklı bağlamlardaki uygulamasını genişletebilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
This protocol establishes a standardized quantitative PCR method for equid herpesvirus-2 detection in respiratory fluids, addressing the need for harmonized viral load quantification across laboratories. By incorporating full method validation from extraction to amplification per AFNOR NF U47-600, it reduces inter-laboratory variability and supports reliable comparative diagnostics. The approach enables predictive confidence in viral burden assessment, informing go/no-go decisions in equine respiratory disease research and therapeutic development pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of viral load dynamics as a biomarker for respiratory disease pathogenesis in equine models.
- Operational Value: Provides specific and sensitive quantification of EHV-2 genome copies, supporting mechanistic de-risking of host-pathogen interaction studies.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Delivers quantitative outputs with defined limit of detection and linearity range, enabling reliable compound screening against viral replication.
- Operational Value: Standardized extraction and amplification workflow ensures reproducibility across plate-based formats for high-throughput applications.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Viral genome load results in international units (IU) facilitate cross-study comparison and translational biomarker alignment in preclinical efficacy studies.
- Operational Value: Validation of the whole analytical method supports risk-adjusted advancement decisions by accounting for extraction-related variability.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from early target validation through preclinical evaluation, where quantitative viral load measurement informs mechanistic understanding and therapeutic intervention assessment.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing regarding viral load thresholds associated with respiratory disease phenotypes in equine models.
- Screening: Enables assay-ready biological systems with standardized nucleic acid extraction for consistent compound evaluation.
- Analytics: Provides threshold cycle measurements and standard curve-derived copy numbers for quantitative comparison across experimental conditions.
- Translational Research: Connects discovery-phase viral load data to preclinical validation through internationally comparable IU measurements.
- Enterprise Reuse: The validated workflow serves as a reusable platform for respiratory virus quantification beyond EHV-2, applicable to other equine pathogens.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in viral quantification reduces mechanistic ambiguity in respiratory disease models.
- Operational Value: Standardization per AFNOR norm ensures reproducibility and scalability across laboratory settings.
- Strategic Value: Accurate viral load data improves go/no-go decisions by reducing false negatives in antiviral screening.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization of candidates based on dose-response relationships with quantified viral burden.
Implementation Considerations
- Requires expertise in molecular diagnostics and real-time PCR instrumentation.
- Dependent on access to silica column-based extraction kits and calibrated thermocyclers.
- Necessitates standardized operating procedures for contamination control when handling plasmid standards.
- Adaptation to alternative sample types (e.g., blood, tissue) would require re-validation of extraction efficiency.
- Practical limitation: Plasmid dilution series must be prepared in a contamination-controlled area to maintain quantification accuracy.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
0:55
Extraction of Nucleic Acids
2:03
Amplification Procedure
3:57
Limit of Detection of qRT-PCR
5:54
Limit of Detection of the Method Determined by Two Independent Trials
7:04
Results: Validation of Quantitative PCR Method for Equid Herpesvirus-2 Diagnosis
8:45
Conclusion
