Name: Solunum Sıvılarda equid Herpes-2 Teşhis için bir Nicel PCR Yöntemi Geliştirilmesi ve Validasyonu (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-03-17T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 57 s
Description: Öğrenin at solunum sıvılarında EHV-2 DNA tespiti için qPCR yöntemi geliştirme ve validasyon sürecini. Bu hassas yöntem veteriner tanı alanında viral yük değerlendirmesi sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Yazarlar teknik destekleri için Sophie Castagnet ve Nadia Doubli-Bounoua'ya teşekkür eder. Bu çalışma, Calvados Genel Konseyi'nden mali destek aldı ve Basse-Normandie Bölgesi ile Fransız Hükümeti'nin anlaşmasını imzaladı (CPER 2007-2013; proje R25 p3). Yazarlar, AFNOR grubunun uzmanlarına ve özellikle Jean-Philippe Buffereau ve Eric Dubois'ya teşekkür eder.

<ol><li>Brault, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+immune+response+of+foals+to+natural+infection+with+equid+herpesvirus-2+and+its+association+with+febrile+illness%5BTitle%5D)+AND+%22Vet.Immunol.Immunopathol%22%5BJournal%5D)">The immune response of foals to natural infection with equid herpesvirus-2 and its association with febrile illness.</a> Vet.Immunol.Immunopathol. 137 (1-2), 136-141 (2010).</li>
<li>Fortier, G., Van Erck, E., Pronost, S., Lekeux, P., Thiry, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Equine+gammaherpesviruses%3A+pathogenesis%2C+epidemiology+and+diagnosis%5BTitle%5D)+AND+%22Vet.J%22%5BJournal%5D)">Equine gammaherpesviruses: pathogenesis, epidemiology and diagnosis.</a> Vet.J. 186 (2), 148-156 (2010).</li>
<li>Hue, E. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+and+quantitation+of+equid+gammaherpesviruses+%28EHV-2%2C+EHV-5%29+in+nasal+swabs+using+an+accredited+standardised+quantitative+PCR+method%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol.Methods%22%5BJournal%5D)">Detection and quantitation of equid gammaherpesviruses (EHV-2, EHV-5) in nasal swabs using an accredited standardised quantitative PCR method.</a> J Virol.Methods. 198 (1), 18-25 (2014).</li>
<li>Diallo, I. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplex+real-time+PCR+for+the+detection+and+differentiation+of+equid+herpesvirus+1+%28EHV-1%29+and+equid+herpesvirus+4+%28EHV-4%29%5BTitle%5D)+AND+%22Vet.Microbiol%22%5BJournal%5D)">Multiplex real-time PCR for the detection and differentiation of equid herpesvirus 1 (EHV-1) and equid herpesvirus 4 (EHV-4).</a> Vet.Microbiol. 4 (1-3), 93-103 (2007).</li>
<li>Williams, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Equine+multinodular+pulmonary+fibrosis%3A+a+newly+recognized+herpesvirus-associated+fibrotic+lung+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Vet.Pathol%22%5BJournal%5D)">Equine multinodular pulmonary fibrosis: a newly recognized herpesvirus-associated fibrotic lung disease.</a> Vet.Pathol. 44 (6), 849-862 (2007).</li>
<li>Mullis, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific+enzymatic+amplification+of+DNA+in+vitro%3A+the+polymerase+chain+reaction%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb.Symp.Quant.Biol%22%5BJournal%5D)">Specific enzymatic amplification of DNA in vitro: the polymerase chain reaction.</a> Cold Spring Harb.Symp.Quant.Biol. 51 (1), 263-273 (1986).</li>
<li>EPA Office of Water (4607). <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22EPA-815-B-04-001.+Quality+Assurance%2FQuality+Control+Guidance+for+Laboratories+Performing+PCR+Analyses+on+Environmental+Samples%22">EPA-815-B-04-001. Quality Assurance/Quality Control Guidance for Laboratories Performing PCR Analyses on Environmental Samples</a>. , (2004).</li>
<li>Telford, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Equine+herpesviruses+2+and+5+are+gamma-herpesviruses%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">Equine herpesviruses 2 and 5 are gamma-herpesviruses.</a> Virology. 195 (2), 492-499 (1993).</li>
<li>Fortier, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+equid+herpesvirus-5+in+respiratory+liquids%3A+A+retrospective+study+of+785+samples+taken+in+2006-2007%5BTitle%5D)+AND+%22Vet.J%22%5BJournal%5D)">Identification of equid herpesvirus-5 in respiratory liquids: A retrospective study of 785 samples taken in 2006-2007.</a> Vet.J. 182 (2), 346-348 (2009).</li>
<li>Brault, S. A., Bird, B. H., Balasuriya, U. B., MacLachlan, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+heterogeneity+and+variation+in+viral+load+during+equid+herpesvirus-2+infection+of+foals%5BTitle%5D)+AND+%22Vet.Microbiol%22%5BJournal%5D)">Genetic heterogeneity and variation in viral load during equid herpesvirus-2 infection of foals.</a> Vet.Microbiol. 147 (3-4), 253-261 (2011).</li>
<li>Association Francaise de Normalisation. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22NFU+47-600-1.+Animal+health+analysis+methods-PCR-Part+1%3A+Requirements+and+recommandations+for+the+implementation+of+veterinary+PCR%22">NFU 47-600-1. Animal health analysis methods-PCR-Part 1: Requirements and recommandations for the implementation of veterinary PCR</a>. , (2015).</li>
<li>Association Francaise de Normalisation. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22NFU+47-600-2.+Animal+health+analysis+methods-PCR-Part+2%3A+Requirements+and+recommendations+for+the+development+and+the+validation+of+veterinary+PCR%22">NFU 47-600-2. Animal health analysis methods-PCR-Part 2: Requirements and recommendations for the development and the validation of veterinary PCR</a>. , (2015).</li>
<li>ISO. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22EN+ISO-CEI+17025.+General+requirements+for+the+competence+of+testing+and+calibration+laboratories%22">EN ISO-CEI 17025. General requirements for the competence of testing and calibration laboratories</a>. , (2005).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Manual+of+Diagnostic+Tests+and+Vaccines+for+Terrestrial+Animals+2010.+Chapter1.1.1.4%2F+5.+Principles+and+Methods+of+Validation+of+Diagnostic+Assay+for+Infectious+Diseases%22">Manual of Diagnostic Tests and Vaccines for Terrestrial Animals 2010. Chapter1.1.1.4/ 5. Principles and Methods of Validation of Diagnostic Assay for Infectious Diseases</a>. , This thoroughly revised chapter replaces Chapter 1.1.4 Principles of validation of diagnostic assays for infectious diseases and Chapter 1.1.5 Validation and quality control of polymerase chain reaction methods used for the diagnosis of infectious diseases from the sixth edition of the OIE Terrestrial Manual (2009).</li>
<li>Apaza, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+and+genogrouping+of+noroviruses+from+children%27s+stools+by+Taqman+One-step+RT-PCR%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis.Exp%22%5BJournal%5D)">Detection and genogrouping of noroviruses from children's stools by Taqman One-step RT-PCR.</a> J Vis.Exp. (65), e3232(2012).</li>
<li>Lorenz, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polymerase+chain+reaction%3A+basic+protocol+plus+troubleshooting+and+optimization+strategies%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis.Exp%22%5BJournal%5D)">Polymerase chain reaction: basic protocol plus troubleshooting and optimization strategies.</a> J Vis.Exp. (63), e3998(2012).</li>
<li>Sanger, F., Coulson, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+method+for+determining+sequences+in+DNA+by+primed+synthesis+with+DNA+polymerase%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol.Biol%22%5BJournal%5D)">A rapid method for determining sequences in DNA by primed synthesis with DNA polymerase.</a> J Mol.Biol. 94 (3), 441-448 (1975).</li>
<li>Sanger, F., Nicklen, S., Coulson, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+sequencing+with+chain-terminating+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A%22%5BJournal%5D)">DNA sequencing with chain-terminating inhibitors.</a> Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 74 (12), 5463-5467 (1977).</li>
<li>NCBI. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22BLAST+Homepage+and+Selected+Search+Pages.+Introducing+the+BLAST+homepage+and+form+elements%2Ffunctions+of+selected+search+pages%22">BLAST Homepage and Selected Search Pages. Introducing the BLAST homepage and form elements/functions of selected search pages</a>. , (2015).</li>
<li>Greiner, M., Gardner, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+diagnostic+tests+in+veterinary+epidemiologic+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Prev.Vet+Med%22%5BJournal%5D)">Application of diagnostic tests in veterinary epidemiologic studies.</a> Prev.Vet Med. 45 (1-2), 43-59 (2000).</li>
<li>Blanchard, P., Regnault, J., Schurr, F., Dubois, E., Ribiere, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intra-laboratory+validation+of+chronic+bee+paralysis+virus+quantitation+using+an+accredited+standardised+real-time+quantitative+RT-PCR+method%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol.Methods%22%5BJournal%5D)">Intra-laboratory validation of chronic bee paralysis virus quantitation using an accredited standardised real-time quantitative RT-PCR method.</a> J Virol.Methods. 180 (1-2), 26-31 (2012).</li>
</ol>

Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarları olduğunu beyan ederim.

2000&#39;li yıllardan itibaren, gerçek zamanlı PCR laboratuarlarının artan sayıda altın standart teknikler (hücre kültürü ve bakteri kültürü yöntemleri) yerine edilmiştir. tekniğin uygulanması kolaydır. Ancak laboratuvar yöntemlerinin doğrulama doğru, tekrarlanabilir ve güvenilir veri sağlamak için moleküler algılama ve patojenlerin ölçümü için esastır. özütleme aşaması biyolojik maddenin başlıca nedenidir olduğu için, bir protokol ve diğeri arasındaki miktar hatası ana kaynağı olarak kabul edilebilir. Bu şekilde, esas olarak literatürde QRT-PCR esnasında DNA plazmidinin standart bir eğri, yaratılması, viral genomun yükünü gösteren, ancak, ekstre etme aşaması dikkate almaz. AFNOR norm NF U47-600-2 bir bütün yöntem doğrulama işlemi için de novo strateji açıklaması bu alanda önemli bir ilerlemeyi temsil ediyor. gösterildiği gibiÇYG-2 atların için bu kağıt ya da arı 21 başkaları tarafından, bu gelişme aşamasında ve tüm yöntem PCR karakterizasyonu ve karakterizasyonu ile doğrulama adımı arasında açık bir farklılaşma gerektirir. Bu ilginç yaklaşımda bir sınırlama protokolünde herhangi bir değişiklik çok pahalıya mal olabilir tam süreci revalidate zorunluluğu neden olacaktır. Bu sınırlama, aynı zamanda ölçümü sakıncaları virüs (örneğin, solunum sıvıları, organlar, kan veya idrar) ile ekstre edildiği kaynağa bağlı olduğu gerçeği ile vurgulanmış. Aslında, her matris fiziko-kimyasal özellikleri farklı spesifisitelere sunulur ve bağımsız bir şekilde QRT-PCR ile virüs tespit ve miktar tayini için kullanılan her bir farklı matris tanımlamak önemlidir. Bu durumda, her bir biyolojik numunenin viral genomun yükü daha kesin çıkartılmasından belirlenebilir. karakterizasyonu de dikkate termo mod içine alırEl ve önceden iyi karakterize yöntemin kullanımı (örneğin, bu yazıda anlatılan EHV- 2 qPCR yöntemi) ana laboratuvar veya başka bir laboratuarda makinenin yeni bir tür zorunlu olduğunda, bir o aracın performansını onaylamanız gerekir. Tüm testler laboratuvar haline getirmek için qPCR testinin performans onayı şarttır. Bu, normal olarak bilinen özelliklere sahip olan bir referans örneği analiz edilmesi ile elde edilir. Böyle bir çek bir ön ve qPCR (LOD, LOQ verimlilik) performansını ve bütün yöntemle (LOD, LOQ) sağlamlığını doğrulamak için NF 47-600-1 AFNOR norm tarafından talep edildiği gibi zorunlu kabul edilir. Sadece geliştirme ve karakterizasyon adımları sırasında ancak araştırma veya teşhis amaçlı kullanılan, aynı zamanda zaman, risk faktörleri tespit ve iyi protokol standardizasyonu sağlamak için kontrol edilebilir. Özellikle kaygı verici yeterli personel eğitimi, kalifiye personel, sarf malzemeleri kalite kontrolKullanılmış ve depolama, deneyde yer alan bilimsel aletlerin performansını etkileyebilir acil çevre koşulları ve metrolojik koşulları farkındalık kontrolü. laboratuvarlar arası karşılaştırmalar için referans örneklerinin kullanılması da belirsizlikler kontrol etmenize yardımcı olabilir. Bu şekilde, laboratuarlar arasında veri karşılaştırması kolaylaştırılabilir. Nitekim, laboratuvarlar arası yeterlilik testleri değerlendirmek ve yöntemin tekrarlanabilirliği onaylamak için gereklidir. analiz biyolojik matris uluslararası birim (IU) olarak ifade edilmiştir viral genom yük sonuçları (IU: sıvıları veya kopya için kopya / ml dokular için / g) Farklı laboratuarlar arasında sonuçları karşılaştırmak için kullanımı daha kolaydır. LOQ üzerindeki tüm sonuç olmayan bir ölçülebilir pozitif sonuç olarak alınır kopya / ml LOD ve LOQ arasında bir sonucu olarak ifade edilmiştir. Bu şekilde genomun niceleme verileri sunmak proces daha doğrusu uygundurAnaliz S (genom amplifikasyonu). Aslında, hücre kültürü deneylerinde, TCID50 viral yük ekspresyonu (ortalama doku kültürü enfektif dozu) hücre ve virüs türlerinin özelliklerine bağlıdır. Her suş hattı ilk sitopatojenik etkisi belirgindir önce eşsiz enfeksiyon kinetik ve ÇYG-2 gibi bazı virüsler birkaç gün sürebilir sahiptir. Sonuç olarak, Mah-PCR karakterizasyonu bu yeni yöntem laboratuarlar arasında veri sunumu ve yorumlama uyumu kolaylaştıracaktır. Bu hastalık durumunun beyanı yerine sadece patojenin varlığı ya da yokluğu için cut-off değerinin kurulması gibi gelecekte Mah-PCR potansiyel yeni uygulamalar için çok yararlı olacaktır.

Equid herpes virüsü 2 (EHV-2) gibi burun akıntısı, farenjit ve lenf düğümleri 1-3 potansiyel klinik olarak, solunum sendromu yer almaktadır. Bu virüs aynı zamanda at endüstrisi 2 için önemli ve olumsuz ekonomik etkileri neden olabilir atların kötü performans ile ilişkili olduğu şüphesi. Şimdiye kadar, gama-ÇYG için altın standart (γ-ÇYG) algılama hücre kültürü yöntemi oldu. Bu prosedürün ilk rahatsızlık EHV-2 ve diğer arasında ayrım yokluğuydu y-EHV&#39;lerin (örneğin, EHV-5). İkinci rahatsızlık 4,5 tezahür 12 28 gün arasında sürer sitopatik sürecin yavaş gelişme oldu. valide ve normalize kantitatif gerçek zamanlı polimeraz zincir reaksiyonu Gelişimi (QRT-PCR) yöntemi hızla ÇYG-2 ve EHV- ayırt etmek, virüs tespit yardımcı olacaktır5 ve viral genomun yükü ve miktar yönüyle hastalık sayesinde arasındaki ilişkiyi incelemek için. Polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) Mullis 6 tarafından 1986 yılında ilk kez tarif ve biyolojik tanı (insan, çevre ve veteriner) alanlarının çoğunda yeni altın standart haline hakkındadır. özgüllük, duyarlılık ve hızı: patojenlerin genomunun bir bölümünün yükseltilmesi dayanan bu yöntem, bir çok avantaj sunar. Ayrıca, amplikon kontaminasyon riski Mah-PCR gelişiyle ve kalite güvencesi 7 beri gerilemiştir. Yine de, yeni bir altın standart yöntem olarak PCR tanınması sadece gelişmiş performans verileri değil, aynı zamanda zamanla performans bozulma olmadan tüm yöntem geliştirme ve validasyon adımları kontrol gösteri daha gerektirmiştir. saptanması için kullanılan ilk moleküler araçlar ÇYG-2 kez c vardıİç içe PCR ile onsuming ve ilgili spesifik olmayan amplifikasyon sıralama 8 izledi. Herpes virüsleri için hedeflenen genlerin deoksiribonükleik asit (DNA) polimeraz ve DNA ambalaj 9 idi. Ancak, iç içe PCR amplikonlarının tarafından kontaminasyon riski yüksek sunuyor. O zamandan beri, geleneksel PCR testleri Daha yakın zamanlarda, gerçek zamanlı PCR özellikleri EHV-2 10 ölçümü için tarif edilmiştir. 2, 2009 gözden interlökin 10 gibi geni ya da glikoprotein B geni, amplifiye etmek için tasarlanmıştır, ancak herhangi bir veri mevcut olan ayıklama işlemi de dahil olmak üzere tüm yöntemin doğrulama ile ilgili. Bu protokolde, geliştirme ve doğrulama işlemleri, Association Française de normalleşme göre at solunum sıvılarda EHV- 2 DNA tespiti ve ölçülmesi için bir kantitatif PCR yöntemi için (AFNOR) norm NF U47-600 3,11,12 tarif edilmiştir Fransız temsilcisi olarak hangiuluslararası normalizasyon komitesi. Bu norm NF EN ISO / CEI 17025, 2005 13 ve OIE (Dünya Hayvan Sağlığı Örgütü) &#39;e göre, 11,12 &quot;hayvan sağlığı analizi yöntemiyle veteriner PCR uygulanması, geliştirilmesi ve onaylanması için Gereksinimleri ve öneriler&quot; ayrıntıları . QRT-PCR testinin (a) geliştirme, (b) tek başına QRT-PCR testinin karakterizasyonu ve bütünün (c) karakterizasyonu: önerileri 2010 14 EHV- 2 QRT-PCR doğrulama protokolü üç bölümlü bir prosedür içerir (PCR analizine biyolojik numuneden nükleik asitlerin ekstre gelen) analitik yöntem. Algılama (LOD) limitini ve tayin sınırı (LOQ): QRT-PCR testinin ve tüm analitik yöntem karakterizasyonu iki sınır tanımını içerir. LOD% 95 PCR Tüm cas% 95 tespit edilebilir birim hacim başına nükleik asit kopya düşük sayıyı temsil ederes. LOQ% 95 PCR dikkate belirsizlikler alınarak tespit edilebilir nükleik asit kopya düşük miktarını temsil eder. Bu Mah-PCR yöntemi kesin algılama ve solunum sıvılarda ÇYG-2 hızlı ölçümü sağlar. Bundan başka, yöntem, diğer yeni QRT-PCR deneyleri geliştirilmesi için standart bir prosedür ve genel bir şablon temin etmek için başka laboratuarlarda uygulanabilir.

<table><tbody><tr><td>AB-1900 doğal renk ABgene 96 kuyulu plaka&nbsp;</td><td>Dutsher</td><td>16924</td><td></td></tr><tr><td>Yapışkan film qPCR Mutlak&nbsp;</td><td>Dutsher</td><td>16629</td><td>qRT-PCR çalışmasından önce plakayı kapatmak için kullanılan yapışkan film</td></tr><tr><td>0.5 ml mikrotüpler, etekli, kapaklar</td><td>Dutsher</td><td>039258</td><td></td></tr><tr><td>Etanol %98</td> <td>Sodipro</td><td>SAF322941000</td><td></td></tr><tr><td>Primerler</td><td>Eurofins</td><td>Özel sipariş</td><td></td></tr><tr><td>Prob</td><td>Ömrü Teknolojileri</td><td>Özel sipariş</td><td></td></tr><tr><td>Plazmid</td><td>Eurofins</td><td>Özel sipariş</td><td></td></tr><tr><td>QIAamp&nbsp; RNA viral Mini Kit (içeren: QIAamp Mini kolon, AVL&nbsp; tampon,&nbsp; AW1 tamponu, AW2 tamponu, AVE tamponu, toplama tüpleri)&nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>52906</td><td>AVL tamponu: 72 ° C'de 5 dakika ön ısıtma; C</td></tr><tr><td>Sanger yöntemi ile dizileme</td><td>Eurofins</td><td>Özel sipariş</td><td></td></tr><tr><td>Taqman Universal PCR Master Mix</td><td>Life Technologies</td><td>4364340</td><td></td></tr><tr><td>Tris-EDTA tampon çözeltisi</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-296653A</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop 2000c Spektrofotometre</td><td>Termobilimsel</td><td>ND-2000C</td><td></td></tr><tr><td>StepOnePlus Gerçek Zamanlı PCR sistemleri</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>4376600</td><td>ön ısıtma 15 dk&nbsp;</td></tr></tbody></table>

solunum sıvılarda equid herpes-2 teşhis için bir nicel pcr yöntemi geliştirilmesi ve validasyonu

Development and Validation of a Quantitative PCR Method for Equid Herpesvirus-2 Diagnostics in Respiratory Fluids

Protokol, NF U47-600 normuna göre at solunum sıvılarında EHV-2'nin tespiti ve miktarının belirlenmesi için kantitatif bir RT-PCR yöntemini tanımlar. Geliştirme ve ilk doğrulama adımından sonra, AFNOR normuna göre iki farklı karakterizasyon adımı gerçekleştirildi: (a) tek başına qRT-PCR testinin karakterizasyonu ve (b) tüm analitik yöntemin karakterizasyonu. Tüm analitik yöntemin doğrulanması, nükleik asitlerin ekstraksiyonu ile nihai PCR analizi arasındaki tüm adımların tasvirini içeriyordu. 
Viral genom yükünün doğru bir şekilde belirlenmesini sağlamak için tüm yöntemin doğrulanması, qRT-PCR ile virüs tespiti için çok önemlidir. Ekstraksiyon adımı, biyolojik materyal kaybının birincil kaynağı olduğundan, bir protokol ile diğeri arasındaki kantitasyon hatasının ana kaynağı olarak kabul edilebilir. Bu nedenle, AFNOR normu NF-U-47-600, ekstraksiyon adımından önce plazmit seyreltme aralığının dahil edilmesini önerir. Ek olarak, nicelik belirleme sınırları, virüsün çıkarıldığı kaynağa bağlıdır. Uluslararası birimler (IU) cinsinden ifade edilen viral genom yükü sonuçlarının, farklı laboratuvarlar arasında sonuçları karşılaştırmak için kullanımı daha kolaydır. 
qRT-PCR'nin bu yeni karakterizasyon yöntemi, laboratuvarlar arasında veri sunumu ve yorumlamasının uyumlaştırılmasını kolaylaştırmalıdır.

Yukarıda tarif edildiği gibi kantitatif RT-PCR yöntemi, tespit ve solunum sıvılarda equid herpesvirüs-2 ölçmek için uygulanmıştır. Şekil 1 AFNOR NF normuna göre olan bir nicel RT-PCR yöntemi geliştirilmesi ve doğrulama için bir şematik iş akışları görüntülemektedir U47-600. Öncüllerin ve problann Özelliği PCR adım adım gelişimi sırasında doğrulanmıştır. Sadece EHV-2 suş bu sistemde amplifiye edilmiştir. Daha sonra, qRT-PCR performansı, özelliği gerekiyordu. İlk olarak, bir 6 on kat seri seyreltme azaltma bölgesi (Şekil 2) için yapıldı LOD PCR tahmin etmek. Bu örnekte, 6, on kat seri seyreltmeler LOD PCR tahmin etmek için (26.000 0.26 kopya / 2.5 ul numune arasında) 10 -5 10 -10 arasında yapıldı. azaltım bölgesi l(2.6 ve 0.26 kopya / 2.5 ul numune arasında) 10 -9 ve 10 -10 seyreltmeleri arasındaki ler. Bu durumda, LOD PCR değeri belirlemek için, plazmid 6, iki kat seri seyreltiler, bu azaltım bölgesinde 5.2 ve 0.16 kopya / 2.5 ul numune arasında yapılmıştır. LOD PCR değeri 2.6 kopya / 2.5 ul örnek oldu. Doğrusallık aralığı ve LOQ PCR belirlemek için, LOD PCR değeri 2.6 (LOD PCR) ile 260,000 kopya / 2.5 ul numune arasında 6 on kat seri dilüsyonları aralığı başlatmak için kullanılmıştır. 3 EHV2 için doğrusal regresyon göstermektedir Şekil bir deneme Mah-PCR. Lineer regresyon (Şekil 4) performansları Tablo 3&#39;te anlatılan hesaplamalar kullanılarak dört nüsha olarak doğrulanır. Hesaplamalar kriterlerine göre doğrusallık aralığı tanımlamak için yapılır mutlak Eğilim i value plazmid yükü ne düzeyde i, 10 günlük ≤0.25. Bu durumda, doğrusallık 2.6 ila 260.000 kopya / 2.5 ul örnek yatıyordu aralığı. LOQ PCR doğrusallık aralığında en düşük konsantrasyon (yani, 2.6 kopya / bu durumda 2.5 ul örnek). U LIN aralığında 2.6-260,000 kopya / DNA 2.5 ul 0.12 log 10 olduğu tespit edildi. Mah-PCR (Şekil 1, sarı) gelişimi (Şekil 1, mavi) ve karakterizasyonu sonra, AFNOR NF U47-600 norm Mah-PCR (Şekil 1, turuncu) DNA ekstraksiyon gelen tüm analitik metodun karakterizasyonu önerir. (Doğruluk profili ile Tablo 4&#39;te açıklandığı gibi tanısal duyarlılık ve özgüllük. Hesaplandı QRT-PCR bütün analitik yöntemin kantitatif performansları değerlendirilmiş ve onaylanmıştır <strong&gt; Şekil 5). state-of-the-art moleküler teknolojisini kullanan Bu protokol, bize algılamak ve solunum bozuklukları ve / veya enfeksiyon klinik şüphesi olan atları elde edilen 172 nazal sürüntü örneklerinde EHV- 2 viral genomun yükü ölçmek için izin verdi. EHV-2 alanı (biyolojik) örneklerden insidansı bu popülasyonda% 50 (86/172) idi. Kantitatif analizleri ÇYG-2 viral genom yükleri genç atlar anlamlı derecede yüksek bulundu ve viral genomun yüklerinin bölümlerini yeniden yaşı (Şekil 6) ile azaldığını gösterdi. Bu çalışmada, yüksek EHV-2 viral genomun yük (1.9 x 10 11 kopya / ml) taylar (Şekil 6) tespit edildi. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/53672/53672fig1.jpg" /> Şekil 1: geliştirme (mavi) için iş akışı şeması, nicel RT-PCR karakterizasyonuAFNOR norm NF U47-600-2 göre (sarı) ve QRT-PCR (turuncu) DNA ekstraksiyon gelen tüm analitik yöntemin karakterizasyonu. akışı grafik gelişimi için farklı adımlar devam eder, kantitatif RT karakterizasyonu -PCR ve QRT-PCR ile DNA ekstraksiyonu gelen tüm analitik yöntemin karakterizasyonu. Her adım için, iş akışı tablosu gerekli çalışan sayısını gösterir, seyreltiler gerçekleştirmek ve gerekli analistlerin sayısı edilmesi. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53672/53672fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="şekil 2" src="/files/ftp_upload/53672/53672fig2.jpg" /> Şekil 2: Plazmid 6 on kat seri seyreltmeleri ile elde edilen gerçek-zamanlı PCR eğrilerden Örnek sonuçlar azaltma bölgesinin belirlenmesi. azaltım bölge tahmin etmek için, 6, on kat seriseyreltmeler 10 -5 arası (26.000 kopya / 2.5 ul numune) ve 10 -10 (0.26 kopya / 2.5 ul numune) yapılır. Azaltım bölgesi 10 -9 seyreltilmiş arasında (2.6 kopya / 2.5 ul numune) ve 10 -10 (0.26 kopya / 2.5 ul numune) yatıyor. Bu durumda, plazmid 6 iki kat seri seyreltme 5.2 ve 0.16 kopya / 2.5 ul örnek arasında, LOD% 95 PCR belirlemek için bu azaltma bölgesinde yapılmıştır. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53672/53672fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 3," src="/files/ftp_upload/53672/53672fig3.jpg" /> Şekil 3:. EHV2 QRT-PCR için lineer regresyon kantitatif tayini doğrusallığı belirli bir aralıkta bulunan hedef konsantrasyonu ile orantılı sonuçlar üretme yeteneğidir. Bu tarafından örnek alınabilirlineer regresyon enstrümantal yanıt (Döngü eşiği veya Ct) ve hedefin miktarının logaritma arasındaki (y = ax + b) (hedef kopya / 2.5 ul numune sayısı). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53672/53672fig3large.jpg" target="_blank">tıklayınız Bu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için .</a> <img alt="Şekil 4," src="/files/ftp_upload/53672/53672fig4.jpg" /> Şekil 4:. EHV- 2 qPCR doğrusal regresyon Performans ortalama sapma (ölçülen plazmid miktarı arasındaki ortalama farkı temsil <img alt="fig4-1" src="/files/ftp_upload/53672/fig4-1.jpg" /> ) Ve her bir plazmid seviyesinde teorik plazmid miktarı (X &#39;I)&#39; in. Dikey çubuklar formülle verilen doğrusallığı belirsizliği (U Lini) temsil <img alt="fig4-2" src="/files/ftp_upload/53672/fig4-2.jpg" /> SD&#39;i standart sapma O olduğu<html> f ölçülen plazmid miktarı. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53672/53672fig4large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 5," src="/files/ftp_upload/53672/53672fig5.jpg" /> Şekil 5:. EHV- 2 Mah-PCR yöntemiyle doğrulama sonuçlarına göre Doğruluk profilleri yeşil hat (daireler) veri gerçekliğini (sistematik hata, ya da önyargı) temsil eder. Kabul edilebilirlik sınırları laboratuvar (kesik çizgiler) tarafından ± 0.75 Log 10 tanımlanır. Alt ve üst doğruluk sınırları güvenilirlik verileri (kırmızı çizgiler) iki kez ortalama ± standart sapma önyargı her plazmid yük seviyesi için belirlenmiştir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53672/53672fig5large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> 1 &quot;&gt; <img alt="Şekil 6," src="/files/ftp_upload/53672/53672fig6.jpg" /> Şekil 6:. ÇYG-2 yaşına göre viral genom yük miktarının belirlenmesi ÇYG-2 nazal sürüntü örneklerinde tespit viral genom yük dağılımı farklı yaş grupları için temsil edilir. yatay çizgiler standart sapma (m = ay) içindeki ortalama değerleri temsil etmektedir. * Newman-Keuls post-hoc testi (p &lt;0.05) ile ANOVA ile önemli ölçüde farklı. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53672/53672fig6large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Hedef gen, </td><td colspan="3"> Primerler, prob ve plasmid dizileri (5&#39;-3 &#39;), </td><td> nükleotid pozisyonu </td><td> Ürün boyutu (nükleotidler) </td><td colspan="2"><strong&gt; Termal döngü koşulları </td><td> Kaynaklar </td></tr><tr><td rowspan="4"> EHV2 gB (HQ247755.1) </td><td colspan="3"> İleri: GTGGCCAGCGGGGTGTTC </td><td> 2113-2130 </td><td rowspan="4"> 78 </td><td> 95 ° C 5 dakika </td><td></td><td rowspan="4"> 11 </td></tr><tr><td colspan="3"> Ters: CCCCCAAAGGGATTYTTGAA </td><td> 2189-2170 </td><td> 95 ° C 15 sn </td><td rowspan="2"> 45 devir </td></tr><tr><td colspan="3"> Sonda: FAM-CCCTCTTTGGGAGCATAGTCTCGGGG-MGB </td><td> 2132-2157 </td><td> 60 ° C 1 dakika </td></tr><tr><td colspan="3"> Plazmid: ACCTGGGCACCATAGGCAAGGTGGTGGTCA ATGTGGCCAGCGGGGTGTTCTCCCTCTTTG GGAGCATAGTCTCGGGGGTGATAAGCTTTTT CAAAAATCCCTTTGGGGGCATGCTGCTCATA GTCCTCATCATAGCCGGGGTAGTGGTGGTG TACCTGTTTATGACCAGGTCCAGGAGCATAT ACTCTGCCCCCATTAGAATGCTCTACCCCGG GGTGGAGAGGGCGGCCCAGGAGCCGGGCG CGCACCCGGTGTCAGAAGACCAAATCAGGA ACATCCTGATGGGAATGCACCAATTTCAG </td><td> 2081-2381 </td><td></td><td></td></tr></tbody></table> Tablo 1:. Bu protokolde kullanılan primerler, problar ve pozitif sentetik DNA kontrol sekansları plazmidinin dizisi (pozitif sentetik DNA) konumlarını EHV2gB dizisi (HQ247755.1) arasında 2081-2381 nükleotidine karşılık gelir. Bu protokolde kullanılan primerler ve problar tasarımı özel bir yazılım kullanılarak elde edilmiştir. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td rowspan="2"> PATOJENLERDEN </td><td rowspan="2"> Referans (orijin) </td><td rowspan="2"> Suşların sayısı </td><td> SONUÇLAR </td></tr><tr><td> EHV-2 </td></tr><tr><td rowspan="2"> EHV-2 </td><td> VR701 (ATCC) </td><td rowaçıklık = &quot;2&quot;&gt; 20 </td><td rowspan="2"> pozitif </td></tr><tr><td> 20 numune (FDL toplama) </td></tr><tr><td rowspan="2"> EHV-5 </td><td> KD05 (GERC) </td><td rowspan="2"> 20 </td><td rowspan="2"> Negatif </td></tr><tr><td> 20 numune (FDL toplama) </td></tr><tr><td rowspan="2"> EHV-3 </td><td> VR352 (ATCC) </td><td rowspan="2"> 2 </td><td rowspan="2"> Negatif </td></tr><tr><td> T934 WSV (GERC) </td></tr><tr><td rowspan="2"> EHV-1 </td><td> Kentucky suşu Ky A (ATCC) </td><td rowspan="2"> 3 </td><td rowspan="2"> Negatif </td></tr><tr><td> 2 numune (FDL toplama) </td></tr><tr><td> EHV-4 </td><td> VR2230 (ATCC) </td><td> 1 </td><td> Negatif </td></tr><tr><td> Eşek herpesvirüs AHV5 </td><td> FDL Koleksiyonu </td><td> 1 </td><td> Negatif </td></tr><tr><td rowspan="2"> AtGrip Virüsü </td><td> A / at / Jouars / / 2006 4 (H3N8) </td><td rowspan="2"> 1 </td><td rowspan="2"> Negatif </td></tr><tr><td> (Erişim Numarası JX091752) </td></tr><tr><td> Atçılık Arterit Virüs </td><td> VR796 (ATCC) </td><td> 2 </td><td> Negatif </td></tr><tr><td> Rhodococcus equi </td><td> FDL Koleksiyonu </td><td> 1 </td><td> Negatif </td></tr><tr><td> Streptococcus equi subsp. Zooepidemicus </td><td> FDL Koleksiyonu </td><td> 1 </td><td> Negatif </td></tr><tr><td> Streptococcus equi subsp. equi </td><td> FDL Koleksiyonu </td><td> 1 </td><td> Negatif </td></tr><tr><td> Coxiella burnetii </td><td> ADI-142-100 (ADIAGENE) </td><td> 1 </td><td> Negatif </td></tr><tr><td> Chlamydophila abortus </td><td> ADI-211-50 (ADIAGENE) </td><td> 1 </td><td> Negatif </td></tr><tr><td> Klebsiella pneumoniae </td><td> FDL Koleksiyonu </td><td> 1 </td><td> Negatif </td></tr></tbody></table> Tablo 2: EHV-2 qRT-PCR analitik özgüllük. <img alt="Tablo 3" src="/files/ftp_upload/53672/53672table3.jpg" /> Tablo 3: (NF U47-600-2 12 uyarlanmıştır) önyargı ve doğrusallık belirsizlik hesaplanması. Her deneme için, lineer regresyon performansları (y = ax + b) y elde edilen çevrim eşik tablo kullanılarak doğrulanır; bir yamaç elde edilmektedir;. X plazmid seviyesi ve b kesmek i plazmid olduğunu düzeyi (i K seviyeleri, 1 arasında değişir) t k kullanılan plazmid seviyeleri sayısıdır (örneğin, k = 6onun tablo) j (j i denemelere 1 arasında değişir) deneme, bu tabloda, örneğin I = 4) (3 ve 6 denemeler arasında bulunan, deneme sayısı X Her için tahmin edilen plazmid miktarıdır. ben seviyesini plazmid. x i seviyesini plazmid her i = 10 log (x i) &#39;i denklemi x elde edilen teorik plazmid miktar&#39;. Her j duruşma sırasında, devir eşiği her i için elde edilen plazmid seviyesi lineer regresyon ile hesaplanır y i, j j x i, j + B j =. <img alt="table3-1" src="/files/ftp_upload/53672/table3-1.jpg" /> Deneme j sırasında ölçülen plazmid miktarıdır. Bias i </<html> sub&gt; ölçülen plazmid miktarı ve her deneme için teorik plazmid miktarı ve her plazmid seviyesinde arasında gözlenen farktır. <img alt="table3-2" src="/files/ftp_upload/53672/table3-2.jpg" /> ortalama değeri <img alt="table3-3" src="/files/ftp_upload/53672/table3-3.jpg" /> Her tarafından i düzeyini plazmid; SD &#39;i ölçülen miktarın standart sapma olduğunu <img alt="table3-4" src="/files/ftp_upload/53672/table3-4.jpg" /> Her i için plazmid seviyesi önyargı ortalama Bias i ortalamasıdır; U Lini i SD&#39;i hesaplanan seviyesini plazmid ve önyargı ortalama her biri için belirlenen doğrusallık belirsizliktir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53672/53672table3large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> 1 &quot;fo: keep-together.within sayfa =&quot; 1 &quot;fo: keep-ile-next.within sayfa =&quot; always &quot;&gt; <tbody><tr><td></td><td></td><td colspan="2"> Numunenin gerçek durumu </td></tr><tr><td></td><td></td><td> pozitif </td><td> Negatif </td></tr><tr><td rowspan="3"> Sonuçlar Tüm yöntem ile elde edilen </td><td> pozitif </td><td> RP (Gerçek pozitif) </td><td> FP (yalancı pozitif) </td></tr><tr><td> Negatif </td><td> FN (yalancı negatif) </td><td> RN (gerçek negatif) </td></tr><tr><td> Toplam </td><td> RP + FN </td><td> AP + RN </td></tr><tr><td></td><td></td><td> Se = RP / (RP + FN) </td><td> Sp = RN / (RN + FP) </td></tr></tbody></table> Tablo 4:. Bütün yöntemin tanı duyarlılığı hesaplanması (Se), özgüllüğü (SP), Schwartz Tablo confid hesaplanması için kullanılmıştırNF U47-600-2 açıklandığı gibi tüm yöntemin duyarlılık ve özgüllük% 95 ence aralığı.

Burada, at solunum sıvılarında EHV-2 DNA'sının tespiti ve miktarının belirlenmesi için kullanılan kantitatif bir PCR yönteminin geliştirilmesi ve doğrulanması için bir protokol sunuyoruz. EHV-2 qRT-PCR doğrulama protokolü üç bölümden oluşan bir prosedür içerir: geliştirme, tek başına qRT-PCR testinin karakterizasyonu ve tüm analitik yöntemin karakterizasyonu.

Solunum Sıvılarda equid Herpes-2 Teşhis için bir Nicel PCR Yöntemi Geliştirilmesi ve Validasyonu

The protocol describes a quantitative RT-PCR method for the detection and quantification of EHV-2 in equine respiratory fluids according to the NF U47-600 ...

qPCR yönteminin genel amacı, atlardan alınan biyolojik örneklerdeki equine herpesvirus-2 viral yükünü değerlendirmektir. Bu yöntem, atlardaki solunum yolu hastalıklarının tanı alanındaki temel soruların yanıtlanmasına ve uygulamacılar için yeni yorumlayıcı yardımcılar hakkında kantitatif veriler sağlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı; hassas, spesifik ve hızlı bir yöntem olmasıdır.Bir diğer avantaj ise, uluslararası normalizasyon komitesinin Fransa temsilcisi olan AFNOR norme NF U47-600 standardına göre geliştirilmiş olmasıdır. Prosedürü, birimimden genç bir araştırmacı olan Erika Hue uygulamalı olarak gösterecek. Solunum sıvıları biyolojik örneğinden nükleik asitleri ekstrakte etmek için, bir çeker ocuk altında, 560 microliter lizis solüsyonuna 140 microliter biyolojik örnek ekleyerek başlayın ve oda sıcaklığında 10 dakika boyunca inkübe edin.Numuneye 560 µL etanol ekleyin, toplam çözeltiden 630 µL'sini bir silika kolonuna uygulayın ve santrifüjleyin. Kalan 630 µL'yi silika kolonuna uygulayın ve tekrar santrifüjleyin. Numune kolona uygulandıktan sonra, kolonu iki kez yıkamak için AW1 ve AW2 yıkama tamponlarından 500 µL'şer kullanın.Ardından, nükleik asitleri kolondan elüe etmek için 50 µL oda sıcaklığında elüsyon veya AVE tamponu ekleyin. Kapağı kapatın ve oda sıcaklığında bir dakika boyunca inkübe edin. Ardından 6.000 ×g'de bir dakika boyunca santrifüjleyin.DNA'yı amplifiye etmek için, primerleri ve probu metin protokolüne göre titre ettikten sonra; her bir reaksiyon için 12,5 µL PCR master mix, 20 µM ileri ve geri primerler, 10 µM prob ve 22,5 µL'ye tamamlayacak kadar ultra saf su ekleyerek 22,5 µL reaksiyon karışımı hazırlayın. Kontaminasyonu önlemek için PCR reaksiyon karışımını her zaman özel bir alanda hazırlayın. Uygun reaksiyon karışımından 22,5 µL'lik porsiyonları 96 kuyucuklu plakanın her bir reaksiyon kuyucuğuna dağıtın.Reaktiflerin istenmeyen DNA ile kontamine olmadığını doğrulamak için ekstraksiyon ve PCR için negatif kontroller ekleyin. Ardından; örneği, ekstraksiyon negatif kontrolünü, PCR negatif kontrolünü veya pozitif kontrol örneğini 2,5 µL hacminde ilgili reaksiyon kuyucuklarına ekleyin. Sonrasında plakayı kapatmak için yapışkan bir plaka sızdırmazlık filmi kullanın.Ardından 6, 000 gs'de 10 saniye boyunca santrifüjleyin. Plakayı bir gerçek zamanlı PCR sistemine yerleştirin. Daha sonra, burada gösterilen analiz düzeni şablonunu ve PCR program ayarlarını seçerek çalışmayı başlatın.Ham veriler gerçek zamanlı PCR sisteminden bir hesap tablosuna aktarıldıktan sonra, her bir örnek için eşik döngüsünü (threshold cycle) elde etmek amacıyla amplifikasyon grafiklerindeki eşik değeri, baz çizgisinin üzerine ve eksponansiyel büyüme bölgesine ayarlayın. Doğrusallığı belirlemek için her bir nokta standart setini bir standart eğri olarak çizin. Ardından, farklı örnekler için kopya sayısını standart eğriye dayanarak hesaplayın.qRT-PCR sonuçlarının saptama sınırını belirlemek için, altı tüpe 90 µL ultra saf su ekleyin. Azaltma bölgesini hedeflemek üzere plazmidin altı adet on katlı seri dilüsyonunu hazırlamak için, öncelikle plazmid çalışma dilüsyonundan 10 µL alarak 90 µL ultra saf su içeren tüpe aktarın. Tüpü kısa süre vortexleyip santrifüjleyin.Ardından, tüpten 10 µL alarak bir sonraki su tüpüne aktarın. Vorteksleme ve santrifüjlemeden sonra, tüm su tüpleri plazmidi alana kadar aktarma işlemini tekrarlayın. Bu videonun başında açıklandığı şekilde, altı adet on katlı seri dilüsyonda DNA'yı amplifiye ettikten sonra, pozitif sinyal veren son plazmid dilüsyonu ile deteksiyonun gerçekleşmediği ilk dilüsyona karşılık gelen azalma bölgesini belirleyin.Altı adet iki katlı seri dilüsyon hazırlamak için altı tüpe 25 microliters ultra saf su ekleyin. On katlı dilüsyonlarda pozitif sinyal veren son plazmid dilüsyonundan, tüpteki 25 microliters örneği ilk su tüpüne aktarın. Gösterildiği şekilde kalan beş dilüsyonu hazırlamadan önce vorteksleyin ve santrifüjleyin.Bu videoda daha önce açıklandığı gibi, iki katlı seri dilüsyonlardan elde edilen DNA'yı amplifiye edin. Üç bağımsız denemeden elde edilen DNA'yı amplifiye ettikten sonra, her bir plazmid konsantrasyon seviyesi için 24 replikat üzerinden pozitif replikat sayısını hesaplayın. 24 replikattan 23'ünün pozitif tespit edildiği seviye olan %95 güven aralığındaki LOD'yi veya LOD %95 PCR değerini belirleyin.Yöntemin LOD değerini belirlemek için, pozitif sinyal veren on katlı bir dilüsyondaki son konsantrasyondan dört kat daha konsantre olan 25 microliter plazmit çalışma dilüsyonu ile başlayarak beş adet iki katlı seri dilüsyon hazırlayın. Amplifikasyon adımında kullanılan plazmit, kontaminasyonu önlemek için belirli bir alanda hazırlanan plazmit çalışma dilüsyonundan gelir. Bu kritik bir adımdır.Beş pozitif standardın dört tekrarını elde etmek için, plazmidin her bir dilüsyonundan 5 µL'yi, 135 µL negatif kaynak materyal içeren dört tüpe aktarın. Beş pozitif standart için dört tekrarın ekstraksiyonunu gerçekleştirin ve bu videonun önceki bölümlerinde açıklandığı şekilde amplifikasyon prosedürünü uygulayın. Her bir plazmid konsantrasyon seviyesi için sekiz tekrar arasından pozitif tekrar sayısını sayın.Son olarak, sekiz replikadan sekizinin de pozitif olduğu son seviye olan LOD yöntemini belirleyin. Bu videoda açıklanan kantitatif RT-PCR yöntemi, solunum sıvılarındaki equid herpesvirus-2'yi tespit eder ve miktarını belirler. Bu deneyde, 10⁻⁹ ile 10⁻¹⁰ dilüsyonlar arasında yer alan azalma bölgesini tahmin etmek için on katlı seri dilüsyonlar yapılmıştır.LOD PCR değeri, azalma bölgesinde yeni bir iki katlı seri dilüsyon ile belirlenmiştir. Lineerlik aralığını ve LOQ PCR değerini belirlemek için, LOD PCR değeri olan 2,6 ile 2,5 µL örnek başına 260.000 kopya arasındaki altı adet on katlı seri dilüsyon aralığının başlangıç noktası olarak kullanılmıştır. LOQ PCR, lineerlik aralığındaki en düşük konsantrasyondur.Tüm yöntemin karakterizasyonu, solunum örneğinden DNA ekstraksiyonundan başlayarak hedefin amplifikasyonu ve kantifikasyonuna kadar qRT-PCR verilerini elde etmek için gerekli olan tüm basamakların validasyonudur. qRT-PCR bütünsel analitik yönteminin kantitatif performansı değerlendirilmiş ve bu grafikte sunulan bir doğruluk profili ile valide edilmiştir. Solunum bozuklukları olan atlardan alınan 172 nazal sürüntü örneğindeki EHV2 viral genom yükleri burada gösterildiği gibi kantifiye edilmiştir.Viral genom yükleri genç atlarda daha yüksek olup, en yüksek yük mililitre başına 1,9 x 10¹¹ kopya olarak tespit edilmiştir. Bu teknik bir kez kavrandıktan sonra, amplifikasyon basamağı başına iki saatten kısa sürede tamamlanabilir ve uygun şekilde yürütüldüğünde toplam validasyon basamakları dört haftadan kısa sürede gerçekleştirilebilir. Bu prosedür uygulanırken, özellikle bir plazmit solüsyonu ile çalışırken kontaminasyon riskinden kaçınmak gerektiğini hatırlamak önemlidir.Bu prosedürün ardından, genom tanımlama gibi ek soruları yanıtlamak amacıyla dizileme gibi diğer yöntemler uygulanabilir. Bu videoyu izledikten sonra, DNA ekstraksiyonu ve amplifikasyonunun nasıl gerçekleştirileceği ve PCR rezervlerinin nasıl karakterize edileceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız. Patojenler gibi biyolojik örneklerle çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini unutmayın.Bu prosedürü gerçekleştirirken, çeker ocak içinde çalışmak ve uygun güvenlik seviyesindeki bir alanda bulunmak gibi bazı önlemler her zaman alınmalıdır.

development-validation-quantitative-pcr-method-for-equid-herpesvirus

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Bu çalışma, MST araçları olarak önerilen insan / / sığır domuz DNA virüsleri, adenovirüs ve polyomaviruses, belirli bir miktar tayini için qPCR kullanarak suda nitrat dışkı / idrar kirlenme veya kontaminasyon kaynağının belirlenmesi için maliyet-etkin bir yöntem açıklanır.

Özgül İnsan ve Hayvan Virüsler Mikrobiyal Kaynak Takip için maliyet-etkin Yöntemi

Bu çalışmada, taşınabilir bir RRT-PCR sistemi kullanarak vahşi kuşlarda kuş gribi teşhisi açıklamaktadır. Bu yöntem, bir salgın senaryosunun tipik olmayan bir laboratuar ortamında yabani kuşlar, ekrana dondurularak kurutulmuş reaktifler yararlanır. Moleküler araçlarını kullanın, hızlı tanı için doğru ve hassas alternatifler sunuyor.

Yabani Kuşlar Kuş Gribi Virüsü Hızlı Teşhis: Alanında Taşınabilir RRT-PCR ve Dondurulmuş kuru Reaktifler Kullanımı

Bu video, gerçek zamanlı ters transkripsiyon PCR kullanarak viral enfeksiyonu tespit etmek için nicel bir yöntemi göstermektedir. Ters transkripsiyon adımı, RNA'yı cDNA'ya dönüştürür ve bu daha sonra PCR döngüleri yoluyla amplifiye edilir. Numunede viral RNA'nın varlığı, PCR'den elde edilen DNA'nın amplifikasyon ve ayrışma eğrileri analiz edilerek doğrulanır.

Viral enfeksiyonları teşhis etmek için gerçek zamanlı kantitatif ters transkripsiyon PCR

Son 15 yılda, köpek adenovirüsü tip 2 (CAV2) türevi vektörler, in vitro ve in vivo hücreleri dönüştürme etkinliklerini kanıtlamıştır ve aşılama ve gen tedavisi için yaygın olarak kullanılmaktadır. Burada, yüksek titreli viral süspansiyonlara yol açan CAV2 vektörlerini oluşturmak, üretmek ve saflaştırmak için bir prosedür açıklıyoruz.

Non Replikatif Kanin adenovirüs tip 2 türetilmiş vektörler üretimi ve saflaştırılması

Nano ölçekli PCR ile DNA ve RNA bazlı patojenlerin yüksek verimlilik testi bir sendromik köpek ve at solunum PCR panelini kullanarak tarif edilir.

Nano PCR ile Hayvan Örnekler Solunum Patojenler yüksek verimlilik Algılama

Bu çalışmada açıklar yüksek işlem hacmi, nötralize antikorlar respiratuvar sinsityal virüs (RSV) için belirli titresi belirlemek için görüntüleme tabanlı mikro-nötralizasyon tahlil. Bu tahlil biçimi farklı örnek türleri üzerinde test edilmiştir.

Bir geliştirilmiş ve yüksek üretilen iş respiratuvar sinsityal virüs (RSV) mikro-nötralizasyon tahlil

Biz üretmek için bir yöntem tanımlamak ve genetik olarak yükseltecek solunum sinsisyal virüs (RSVs) ve bir en iyi duruma getirilmiş plak tahlil RSVs için değiştirilebilir. Biz bu protokolü sırasıyla miktar RSV çoğaltma izin ve analiz RSV dahil organları ve granül dahil organları ilişkili dynamics canlı iki rekombinant virüs oluşturarak göstermektedir.

Üretimi, güçlendirme ve titrasyon rekombinant solunum sinsisyal virüs

Bir Pan-Lyssavirus iç içe Ters transkripsiyon polimeraz zincir reaksiyonu özellikle tüm bilinen lyssaviruses algılamak için geliştirilmiştir. Farklı hayvan türlerinin kuduz beyin örneklerini kullanarak doğrulama Bu yöntemin altın standart floresan antikor testi için bir duyarlılık ve özgüllük eşdeğer olduğunu gösterdi ve rutin kuduz tanısı için kullanılabilir.

Lyssaviruses tespiti için evrensel Iç Içe Ters transkripsiyon polimeraz zincir reaksiyonu değerlendirilmesi

Beyin biyopsisi örneklemesinden son yoruma kadar hızlı immünokromattografik tanı testi (RIDT) ile alan koşullarında hayvan kuduzlarının postmortem tanısı için tam bir protokol salıyoruz. Ayrıca moleküler analiz ve viral genotipleme için cihazı kullanarak daha fazla uygulama açıklar.

Field Postmortem Kuduz Hızlı İmmünromatografik Tanı Testi Kaynak Sınırlı Ayarlar için Diğer Moleküler Uygulamalar ile

Burada, gen tedavisi vektörlerinin klinik gelişimini desteklemek için damlacık dijital polimeraz zincir reaksiyonu ile insan gözyaşlarında adeno ilişkili viral vektörlerin uyumlu tespitinde iyi laboratuvar uygulamalarının geliştirilmesi ve doğrulanması için bir protokol sunuyoruz.

Gözyaşlarının Biyodökülme Çalışmalarında Adeno-İlişkili Viral Vektörlerin Tespiti için Doğrulanabilir Bir Damlacık Dijital Polimeraz Zincir Reaksiyonu Testi

Öğrenin at solunum sıvılarında EHV-2 DNA tespiti için qPCR yöntemi geliştirme ve validasyon sürecini. Bu hassas yöntem veteriner tanı alanında viral yük değerlendirmesi sağlar.

Solunum Sıvılarda equid Herpes-2 Teşhis için bir Nicel PCR Yöntemi Geliştirilmesi ve Validasyonu

Daha fazla video keşfet