Bakteriyel Yüzey Motilite Tahliller hazırlanması, Görüntüleme ve miktarının belirlenmesi

Bu prosedürün genel amacı, swarming olarak adlandırılan bakteriyel yüzey motilitesini standart ve tekrarlanabilir bir şekilde görselleştirmek ve nicelleştirmektir. Bu işlem, öncelikle yüzey motilitesi plaklarının hazırlanması ve kürlenmesiyle gerçekleştirilir. İkinci adım ise, yüzey motilitesi analiz plaklarının bakterilerle inoküle edilmesi ve bu plakların kontrollü bir ortamda inkübe edilmesidir.

Ardından, plak deneylerindeki bakteriyel büyüme modelleri gerçek zamanlı olarak görüntülenir. Prosedürün son adımı, görüntülerin nicelleştirme için işlenmesidir. Nihayetinde bu prosedür, yüzey modal bakterileri için sürü genişleme hızı veya biyoprodukt yoğunluk dağılımı gibi nicel dinamik bilgiler üretmek amacıyla yüzey hareketliliği plak deney hazırlığı için standartlaştırılmış bir protokol sağlar.

Birçok grup yüzey motilitesi analizleri gerçekleştirmektedir. Bu tekniğin temel avantajı, tutarsızlığa yol açabilecek çok sayıda değişkeni minimize eden sistematik bir protokol sunmamızdır. Bu yöntem, bakterilerin farklı yüzey tiyelerini nasıl kolonize ettiği gibi, bakteriyel yüzey motilitesi alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir.

Bu yöntem, bazı modifikasyonlarla pseudomonas sürüm hareketliliği hakkında bilgi sağlayabilse de, diğer yüzey hareketli bakterileri incelemek için de uygulanabilir. Genellikle, bu yöntemde yeni olan kişiler zorluk çekecektir çünkü protokoldeki veya laboratuvar ortamındaki küçük değişiklikler sürüm testi sonuçlarını büyük ölçüde etkileyebilir. Prosedürü, laboratuvarımdan lisansüstü öğrencisi Morganle gösterecektir.

Protokole başlamak için, 200 mililitre amonyum sülfat içermeyen FAB swarm besiyeri, 0,9 gram noble agar ve 0,2 gram caino asidini 500 mililitrelik bir besiyeri şişesinde birleştirerek bir agri karışımı hazırlayın. Besiyerini iyice karıştırmak için bir manyetik karıştırıcı kullanın. Ardından, besiyerini hızlı tahliye seçeneğiyle 121,1 °C'ye ayarlanmış bir otoklavda 22 dakika boyunca sterilize edin.

Sterilizasyondan hemen sonra, su buharlaşmasını önlemek için besiyeri şişesinin kapağını sıkın. Besiyerini bir manyetik karıştırıcı plakaya yerleştirin ve aktif karıştırma ile ortam sıcaklığında AED'yi 50 °C'ye kadar soğutun. Agar daha sonraki bir deney aşamasında kullanılacaksa, aktif karıştırma olmadan 60 °C'lik bir su banyosunda veya inkübatörde 15 saat boyunca sıcak tutulabilir.

Besiyeri iki mililitre filtre sterilize edilmiş glukoz ile yaklaşık 50 °C'ye ulaştığında, standart steril teknikler kullanarak, besiyerinde kabarcık oluşumunu önlemek için manyetik karıştırıcıyla iyice karıştırın. Steril bir sterilizasyon kabininde, steril bir serolojik pipet kullanarak 60 mm'lik Petri kaplarına 7,5 ml besiyeri paylaştırın. Daha geniş bir yayılım alanı isteniyorsa, 100 mm'lik Petri kaplarına 25 ml besiyeri paylaştırın.

Tüm kapları üst üste yığmadan bırakın ve agarın düzgün bir yatay yüzeyde katılaşmasını sağlamak için çekerdeklenci yüzeyini bir su terazisi ile kontrol edin. 60 milimetrelik plakalar için kap kapaklarını kenara ayırın ve açıkta kalan agarı çekerdeklencinin içinde 30 dakika boyunca kürleyin. Daha büyük olan 100 milimetrelik kaplar daha uzun bir kürleme süresi gerektirecektir.

Belirli bir laboratuvarın nemi, hava akışı ve sıcaklığı, bakterinizin optimal şekilde kümelenmesi (swarming) için kürlenme süresinin test edilmesini gerektirebilir. Kurutma işleminden sonra APL'ler, istenen büyüme evresine kadar ayrı olarak önceden büyütülmüş hücrelerle derhal inoküle edilmelidir. Başlamak için, taze bir LB plaklaşmasından izole bir bakteri kolonisi seçin ve altı mililitre kültür ortamına inoküle edin.

Kültürü, yatay çalkalama ile 37 °C'de gece boyunca inkübe edin. Ertesi gün, bakteri suşuna bağlı olarak steril bir kürdan veya tel ekim iğnesi ile agar yüzeyine batırarak, gece boyu büyütülen kültürden bir ila beş µL'yi kurutulmuş swarm agar plaklarına ekleyin; swarm analiz plaklarını sıcaklığı 30 °C, 37 °C veya 42 °C'ye ayarlanmış bir inkübatöre yerleştirin. Fazla nemin agar üzerine değil, plak kapağına yoğunlaşması için plakları ters çevirin; time-lapse görüntülemeden hemen önce bakterileri, suşa özgü sıcaklıklarda iki veya dört saat boyunca dengeleyin.

Ardından, agar yüzeyindeki bakteriler ünitenin ters çevrilmiş kamerasına bakacak şekilde plakaları in vivo görüntüleme ünitesine yerleştirin. Tüm Petri kabı kapaklarını küçük bir miktar suyla doldurun. Daha sonra her bir kapağı, su tarafı yukarı bakacak şekilde ters çevrilmiş AER plakalarının üzerine yerleştirin.

Görüntüleme ünitesinin içinde, sabit bir nem seviyesini korumak için görüntüleme haznesini mühürleyin, görüntüleme ünitesinin görüntüleme ayarlarını düzenleyin ve sürüleme aktivitesinin zamanla seyreden (time-lapse) görüntülemesine başlayın. Gerçek zamanlı görüntülemenin ardından, bakterilerin sürüleme dinamikleri, bir yüzey hareketliliği deneyi kapsamında Image J gibi standart görüntü analizi yöntemleri kullanılarak analiz edilebilir. İnokülasyondan hemen önce agar nem içeriğinin belirlenmesi, başarılı sürüleme sonuçları elde etmek için kritik öneme sahiptir.

Optimal AER plakları, dar bir inokülasyon noktasını kolaylaştıracak ve bakteriyel sürüm (swarming) aktivitesini artıracaktır; buna karşın aşırı kurutulmuş plaklar, yüzey motilitesini baskılayacaktır. Nem içeriğinin yanı sıra, besiyeri katkı maddelerinin varlığı veya yokluğu, lüminesans veya floresan proteinler eksprese eden bakteri suşları kullanılarak, inkübasyon sıcaklığının bir fonksiyonu olarak bakterilerin sürüm aktivitesini etkileyebilir. İki farklı bakteri türü arasındaki sürüm rekabet dinamikleri, bir zaman ayarlı (time-lapse) videoda yakalanabilir. Ayrıca, yerel hücre yoğunluğundaki değişiklikler ve bakteri sürümü içindeki mobiliteyi destekleyen lipidlerin biyosentez hızı da zaman ayarlı floresan mikroskobu ile belirlenebilir ve nicelendirilebilir.

Bu prosedürün ardından, bakteriyel yüzey motilitesinin detaylı, mikroskobik bir analizini oluşturmak ve tekil hücre davranışı hakkındaki soruları yanıtlamak için konfokal mikroskopi gibi diğer yöntemler kullanılabilir. Bu videoyu izledikten sonra; yüzey motilitesi deneylerini hazırlayıp kürleyerek ve inoküle ederek, ayrıca bakteriyel büyüme modellerindeki sonuçları işleyip analiz ederek, standart ve tekrarlanabilir bir swarm analizi nasıl gerçekleştirilir ve bakteriyel yüzey motilitesinin kapsamlı bir analizi nasıl elde edilir konularında iyi bir anlayışa sahip olmanız gerekir.