Gen spesifik ifadesi ile DNA Methylation değişiklikler astrositik transkripsiyonel Aktivite ilişkilendirilmesi

Bu prosedürün genel amacı, zenginleştirilmiş bir astrosit popülasyonundaki KCNJ 10 DNA metilasyon durumunu değerlendirmek ve promotördeki DNA metilasyon değişikliklerini transkripsiyonel opsiyonel aktivite ile ilişkilendirmektir. Bu işlem, öncelikle FACS sıralama yoluyla tüm kemirgen beyninden zenginleştirilmiş bir kortikal astrosit popülasyonunun izole edilmesiyle, ardından bu zenginleştirilmiş astrosit popülasyonundan DNA'nın izole edilmesiyle gerçekleştirilir. Daha sonra, KCNJ 10'un DNA metilasyon durumu, metilasyona duyarlı yüksek çözünürlüklü erime analizi veya MS.HRMA kullanılarak değerlendirilir.

Son olarak, KC J 10 promotörü hipermetile edilmiştir ve promotörün DNA metilasyonundaki değişiklikleri transkripsiyonel aktivite ile ilişkilendirmek için lusiferaz analizi kullanılmıştır. Nihayetinde, KCNJ 10'un DNA metilasyon durumunu ölçmek ve promotörün metilasyonundaki değişiklikler ile genin transkripsiyonel aktivitesi arasındaki ilişkiyi belirlemek için MS.HRMA ve lusiferaz analizi kullanılmıştır. Prosedürün uygulanışı gösterilecektir. Çalışmalar laboratuvarımdan bir doktora sonrası araştırmacı tarafından yürütülmüştür; tüm hayvanlar Ulusal Sağlık Enstitüleri Kılavuzlarına uygun olarak yönetilmiş ve hayvan kullanımı Alabama Üniversitesi Birmingham kampüsü Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi tarafından onaylanmıştır.

Tüm tamponlar ve reaktifler metin protokolüne uygun olarak hazırlandı. Ötenazi uygulanmış bir hayvanın başından korteksler metin protokolüne göre diseke edildikten sonra, tüplerin tüp içine beslenmesine izin vermek için 50 mililitrelik konik bir tüpün üst kısmına bir delik açın veya dremel ile delin. Ardından tüpe papin çözeltisi ekleyin.

Diseke edilmiş korteksleri %95 O2 ve %5 CO2 ile dengelenmiş disosyasyon ortamı içeren 10 milimetrelik bir kültür kabına yerleştirin ve dokuyu 1'er milimetrekarelik parçalar halinde kıymak için temiz bir jilet kullanın. 10 mililitrelik bir pipet ile dokuyu, papain çözeltisi içeren 50 mililitrelik tüpe aktarın. Boşaltmadan önce dokunun transfer pipetinin dibine çökmesini bekleyin.

Pepane çözeltisinde kabarcık oluşturmadan taşınan disosiyasyon ortamı miktarını en aza indirmek için, 37 °C su banyosunda 20 dakika inkübe ederken yüzey gaz değişimi yoluyla %95O2'den %5CO2'ye sabit bir akış uygulayın. İnkübasyonun ardından, dokuyu 10 kez yavaşça tritelerken 10 ml transfer pipeti kullanın; bulanık hücre süspansiyonunu oda sıcaklığında, 300 G'de beş dakika boyunca santrifüjleyin. DNA albumin inhibitör çözeltisini yüzey gaz değişimi ile dengeleyin ve peletlenmiş hücreleri çözeltinin üç ml'lik kısmında yeniden süspande edin.

Ardından, üreticinin talimatlarını izleyerek ticari bir süreksiz yoğunluk gradyanı hazırlayın. Süreksiz yoğunluk gradyanını 70 G'de altı dakika boyunca santrifüjleyin. Daha sonra, medyumu aspire etmek için bir pipet kullanarak ayrışmış hücreleri tüpün dibinden izole edin.

0,02% sığır serum albümini ve mililitre başına bir miligram DNA içeren iki ila üç mililitre DPBS veya tercih edilen besiyerini kullanın. Yeniden kullanmak için, ayrıştırılmış hücreleri süspande edin. FACS ayıklama ve metin protokolüne uygun olarak DNA veya RNA ekstraksiyonu gerçekleştirmeden önce hücreleri 40 µm'lik bir filtreden geçirin.

Bisülfit ile dönüştürülmüş bir DNA dizisine karşı primerler tasarlayıp DNA'yı metin protokolüne göre amplifiye ettikten sonra, tercih edilen bir DNA polimeraz ve 5 µM primerler kullanarak, her örnekten 500 ila 1000 ng DNA'yı ve aynı hayvan türünden %0 ile %100 arasında değişen metillendi DNA standartlarını sülfit ile dönüştürün. Ms HRM amplifikasyonu için 20 µL'lik reaksiyonlar hazırlayın. Bu tabloya göre, faks, DNA ve metillenmiş standartlar dahil tüm örnekleri üç tekrarlı olarak çalıştırın; analiz yazılımı ayarlarına bağlı olarak, erime eğrisi geçişlerinin etrafındaki ön ve son başlangıç ve bitiş parametrelerini belirleyin.

Ön erime başlangıç ve ön erime bitiş parametrelerini ayarlayın. Bu iki değer arasındaki fark 0.2 ile 0.5 °C arasında olmalıdır. Benzer şekilde erime sonrası başlangıç ve bitiş değerlerini ayarlayın ve metillenme yüzdesi standartlarını ve bunlara karşılık gelen pik sıcaklık farklarını kullanarak her örnek için pik sıcaklık farkı verilerini çıkarın.

Bir doğrusal regresyon denklemi oluşturun. İlgilenilen CpG adaları belirlenip metin protokolüne göre CpG adası Luke iki plazmidi amplifiye edilip klonlandıktan sonra, bilinmeyen örneklerin metilasyon durumunu tahmin etmek için bu doğrusal regresyon denklemini kullanın. Çift kesimleri önlemek için restriksiyon sindirimi bölgelerini doğrulamak amacıyla tercih edilen kesici yazılımını kullanın ve örnek uygun enzimlerle sindirildikten sonra 30 µg plazmidi lineerize edin.

50 µL'lik reaksiyonlarda enzimleri uygun sıcaklık ve sürede ısı ile inaktive edin. Metilasyon için beş ünite CPG metilaz kullanın. 700 µg lineerize plazmidi 30 °C'de 13 ila 19 saat boyunca bekletin.

Metin protokolünde belirtildiği şekilde DNA temizleme işlemini tamamladıktan sonra, metillenmiş DNA'nın bir mikrogramlık örneklerini 37 °C'de bir saat boyunca inkübe ederek HPA two restriksiyon sindirimi gerçekleştirin. DNA temizleme işleminden sonra, görselleştirme amacıyla örnekleri %1'lik agroz DNA jelinde 100 volt değerinde 45 dakika boyunca yürütün. Ardından, tam uzunluktaki Luke two vektörü ve CpG ada fragmanlarını serbest bırakmak için metillenmiş ve metillenmemiş plazmidleri uygun restriksiyon enzimleri ile gece boyunca çift sindirime tabi tutun.

Sindirim sonrası enzimleri ısı ile inaktive edin. Vektör ve inserti ayırmak için çift sindirilmiş numuneleri %1'lik DNA agaroz jelinde 100 volt ile bir saat boyunca yürütün; ardından UV ışığına karşı koruma ekipmanları kullanırken, jeli siyah ışık altına yerleştirin ve temiz cerrahi bıçaklar yardımıyla metillenmiş ve metillenmemiş insertleri kesin. DNA'yı metin protokolüne göre jelden ekstrakte ettikten sonra, metillenmiş ve metillenmemiş insertleri metillenmemiş bir vektöre yeniden bağlamak için T4 DNA Ligaz ve bir ila dört oranında vektör-insert karışımı kullanın. Ligasyonun ardından gece boyunca -20 °C'de veya buz üzerinde inkübe edin.

DNA'yı temizleyin ve örnekleri %1'lik DNA agaroz jelinde koşturarak yeniden ligasyonu doğrulayın ve yeniden ligasyonu yapılmış plazmidin konsantrasyonunu değerlendirin. CD 54 hücrelerini 12 kuyucuklu bir plakada kuyucuk başına 140.000 hücre olacak şekilde ekleyin. 24 saat sonra, ticari bir transfeksiyon reaktifi kullanarak hücreleri; ya metillenmemiş CPG loop two plazmidle birlikte RAN vanilla veya diğer kontrol lüsiferaz vektörüyle ya da metillenmiş CPG loop two plazmidle birlikte ELLA veya diğer kontrol lüsiferaz vektörüyle eşit konsantrasyonlarda transfect edin. Lüsiferaz testi gerçekleştirmeden önce hücrelerin 24 saat boyunca transfect olmasına izin verin.

Üretici talimatlarına uygun olarak, her kuyucuğu üç kez okumak için luminometre kullanın. Ateş böceği lusiferaz aktivitesinin ran vanilla veya diğer kontrol lusiferaz aktivitesine oranını hesaplayın.

Metillenmiş ateş böceği kontrol lusiferaz aktivitesini, metillenmiş aktiviteyi metillenmemiş luc aktivitesine bölerek metillenmemiş ateş böceği kontrol lusiferaz aktivitesine normalize edin. Burada gösterildiği gibi, E-G-F-P-S 100 beta transgenik hayvanların fax sorting işlemi ile zenginleştirilmiş bir astrosit popülasyonu elde edilmiştir. İleri ve yan saçılmaya göre belirlenmiş bir popülasyon hedeflenmiş ve bromür ölü hücre indikatörü kullanılarak canlı hücre popülasyonu belirlenmiştir; burada gösterilen gating görüntüleri, dissosiyasyon sonrası ancak sorting öncesi ve sorting sonrası EGFP pozitif astrositlerin temsili görüntüleridir; bu şekil, astrosit spesifik marker için mRNA düzeyinde 40 kat artış gösteren izole edilmiş bir EGFP pozitif hücre popülasyonunu göstermektedir.

Bir LDH bir L bir. Ayrıca, S 100 beta ve NG iki pozitif OPC'ler ve astrositlerin ortak ekspresyonuna rağmen, oligodendrosit öncül hücreleri için bir belirteç olan NG iki mRNA'sında dört katlık bir azalma gözlemlenmiştir; bu durum, zenginleştirilmiş bir astrositik hücre popülasyonunun izole edildiğini göstermektedir. Bu tablo, farklı yaşlardaki ve sayıdaki hayvanlardan izole edilen toplam RNA ve DNA'yı listelemekte olup, takip eden işlemler sonrası beklenen moleküler molekül verimi için referans olarak sunulmuştur.

Son olarak, metillenmiş insertin metillenmemiş bir vektöre aktarılmasının ardından, ilgili genin hipermetillenmiş bölgelerinin transkripsiyonel aktivitesini değerlendirmek için çift lüsiferaz deneyi kullanılmıştır. Plazmidin metilasyon durumunu doğrulamak için yalnızca metillenmemiş DNA'yı sindiren HPA II kullanılmıştır. Bu videoyu izledikten sonra, FACS kullanarak astrositlerin zenginleştirilmiş bir popülasyonunun nasıl izole edileceği ile bir genin DNA metilasyonunun nasıl ölçüleceği ve promotördeki DNA metilasyonundaki değişikliklerin transkripsiyonel aktivite ile nasıl ilişkilendirileceği (sırasıyla metilasyon duyarlı yüksek çözünürlüklü erime analizi ve lüsiferaz deneyi kullanılarak) konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.