Gen spesifik ifadesi ile DNA Methylation değişiklikler astrositik transkripsiyonel Aktivite ilişkilendirilmesi KCNJ10 (Kir4.1)

Bu prosedürün genel amacı, zenginleştirilmiş bir astrosit popülasyonunda KCNJ 10'un DNA metilasyon durumunu değerlendirmek ve promotörün DNA metilasyon değişikliklerini transkripsiyonel isteğe bağlı aktivite ile ilişkilendirmektir. Bu, ilk olarak, zenginleştirilmiş bir kortikal astrosit popülasyonunu tüm kemirgen beyninden izole ederek, bir sonraki DNA'nın zenginleştirilmiş astrosit popülasyonundan izole edildiği gerçekler yoluyla gerçekleştirilir. Daha sonra KC J 10'un DNA metilasyon durumu, metilasyona duyarlı yüksek çözünürlüklü eriyik analizi veya MS kullanılarak değerlendirilir. İnsan Kaynakları Yönetimi.

Son olarak, KC J 10 promotörü hipermetillenir ve promotörün DNA metilasyonundaki değişiklikleri transkripsiyonel aktivite ile ilişkilendirmek için lusifer testi kullanılır. Sonuçta, MS. HRMA ve lusiferaz testi, KCNJ 10'un DNA metilasyon durumunu ölçmek ve promotörün metilasyonundaki değişiklikleri ve genin transkripsiyonel aktivitesini ilişkilendirmek için kullanılır. Laboratuvarımdan doktora sonrası bir araştırmacı, Tüm hayvanlar, Ulusal Sağlık Enstitüleri Yönergeleri, Birmingham'daki Alabama Üniversitesi'ndeki Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi'ne uygun olarak hayvan kullanımını onayladı.

Tüm tamponlar ve reaktifler metin protokolüne göre hazırlandı. Ötenazi uygulanmış bir hayvanın kafasından korteksleri inceledikten sonra, metin protokolüne göre, borunun tüpe beslenmesine izin vermek için 50 mililitrelik konik bir tüpün tepesinde bir delik açın veya dremel edin. Sonra tüpe papin çözeltisi ekleyin.

Diseke korteksleri% 95 O2 ila% 5 CO2'ye dengelenmiş ayrışma ortamı içeren 10 milimetrelik bir kültür kabına yerleştirin ve dokuyu birer birer milimetre karelik parçalar halinde kıymak için temiz bir tıraş bıçağı kullanın. Erkekler 10 mililitrelik bir pipetle dokuyu pepane solüsyonu içeren 50 mililitrelik tüpe aktarırlar. Boşaltmadan önce dokunun transfer pipetinin dibine çökmesine izin verin.

Pepane çözeltisini köpürtmeden taşınan ayrışma ortamı miktarını en aza indirmek için, 37 santigrat derece su banyosunda 20 dakika inkübe ederken yüzey gazı değişimi yoluyla %95 O2 ila %5 CO2 arasında sabit bir akış uygulayın. İnkübasyondan sonra, dokuyu 10 kez yavaşça tavurmak için 10 mililitrelik bir transfer pipeti kullanın, bulanık hücre süspansiyonunu oda sıcaklığında beş dakika boyunca 300 G'de santrifüjleyin. DNA'nın albümin inhibitör çözeltisini yüzey gazı değişimi yoluyla dengeleyin ve peletlenmiş hücreleri üç mililitre çözelti içinde yeniden süspanse edin.

Ardından, üreticinin talimatlarını izleyerek ticari bir süreksiz yoğunluk gradyanı hazırlayın. Süreksiz yoğunluk gradyanını altı dakika boyunca 70 G'de döndürün. Daha sonra, ortamı aspire etmek için bir pipet kullanarak ayrışmış hücreleri tüpün altından izole edin.

% 0.02 sığır serum albümini ve mililitre DNA veya tercih edilen ortam başına bir miligram ile iki ila üç mililitre DPBS kullanın. Yeniden kullanmak için, ayrışmış hücreleri askıya alın. Metin protokolüne göre bilgi sıralaması ve DNA veya RNA ekstraksiyonu gerçekleştirmeden önce hücreleri 40 mikrogramlık bir filtreden geçirin.

Bir bi sülfit dönüştürülmüş DNA dizisine karşı primerler tasarladıktan ve DNA'yı metin protokolüne göre sülfit ile çoğalttıktan sonra, her numunenin 500 ila 1000 nanogram DNA'sını ve tercih edilen bir DNA polimeraz ve beş mikromolar primer kullanarak aynı hayvan türünden sıfır ila %100 arasında değişen metillenmiş DNA standartlarını dönüştürün. Ms HRM amplifikasyonu için 20 mikrolitre reaksiyon ayarlayın. Bu tabloya göre, faks, DNA ve metillenmiş standartlar dahil olmak üzere tüm numuneleri, analiz yazılım setine, başlangıç öncesi ve sonrası başlatma ve durdurma parametrelerine bağlı olarak eriyik eğrisinin geçişleri etrafında üç kopya halinde çalıştırın.

Prem erime, başlatma ve prem erime durdurma parametrelerini ayarlayın. Yani ikisi arasındaki fark 0,2 ila 0,5 santigrat derecedir. Erime sonrasını ayarlayın, benzer şekilde başlatın ve durdurun ve yüzde metillenmiş standartları ve bunlara karşılık gelen tepe sıcaklık farklarını kullanarak her numune için en yüksek sıcaklık farkı verilerini çıkarın.

Doğrusal bir regresyon denklemi oluşturun. İlgilenilen CPG adalarını belirledikten ve CPG adası Luke iki plazmidini metin protokolüne göre çoğaltıp klonladıktan sonra bilinmeyen numunelerin metilasyon durumunu tahmin etmek için bu doğrusal regresyon denklemini kullanın. Çift kesimleri önlemek için kısıtlama sindirimi bölgelerini doğrulamak için tercih edilen kesici yazılımı kullanın ve numune uygun enzimlerle sindirildikten sonra 30 mikrogram plazmidi doğrusallaştırın.

50 mikrolitrelik reaksiyonlarda uygun sıcaklık ve sürede enzimleri ısıtın. Metillemek için beş birim CPG metilat kullanın. 13 ila 19 saat boyunca 30 santigrat derecede 700 mikrogram doğrusallaştırılmış plazmit.

DNA'yı metin protokolünde belirtildiği gibi temizledikten sonra, bir saat boyunca 37 santigrat derecede inkübe ederek bir mikrogram metillenmiş DNA numunesi üzerinde bir HPA iki kısıtlama sindirimi gerçekleştirin. DNA'yı temizledikten sonra, görselleştirme için numuneleri 100 voltta 45 dakika boyunca% 1 agros, DNA jeli üzerinde çalıştırın. Bir sonraki konu, metillenmiş ve metillenmemiş plazmitleri, tam uzunlukta Luke iki vektör ve CPG ada parçalarını serbest bırakmak için gece boyunca uygun kısıtlama enzimleri ile çift sindirime tabi tutar.

Isı, sindirimi takiben enzimleri etkisiz hale getirir. Çift sindirilmiş numuneleri, vektörü ayırmak ve yerleştirmek için bir saat boyunca 100 voltta% 1 DNA agros jeli üzerinde çalıştırın, ardından UV ışığına karşı koruma giyerken, jeli siyah bir ışığa yerleştirin ve temiz cerrahi bıçaklarla, metillenmiş ve metillenmemiş ekleri EKLAYIN DNA'yı metin protokolüne göre jel çıkardıktan sonra, metillenmiş ve metillenmemiş ekleri metillenmemiş bir vektöre dönüştürmek için T dört DNA Ligaz ve bir ila dört vektör oranı kullanın. Ligasyonu takiben eksi 20 santigrat derecede veya gece boyunca buz üzerinde inkübe edin.

DNA'yı temizleyin ve numuneleri% 1'lik bir DNA aros jeli üzerinde çalıştırarak yeniden ligasyonu doğrulayın ve oyuk başına 140.000 hücrede 12 oyuklu bir plaka üzerinde yeniden bağlanmış plazmid CD 54 hücrelerinin konsantrasyonunu değerlendirin. 24 saat sonra. Metillenmemiş CPG döngüsü, iki plazmid artı RAN, vanilya veya diğer kontrol feröz vektörü veya metillenmiş c pg Luke, iki plazmid artı ELLA veya diğer kontrol lusifer vektörü eşit konsantrasyonlarda hücreleri transfekte etmek için ticari bir transfeksiyon reaktifi kullanın.

Üreticinin talimatlarına göre, her bir kuyuyu üç nüsha halinde okumak için luminometre kullanın. Ateşböceği lucifers aktivitesinin vanilya veya başka bir kontrole oranını hesaplayın. Lucifers aktivitesi.

Metillenmiş ateşböceği kontrol lusiferaz aktivitesini, metillenmiş luc aktivitesi ile metillenmiş luc aktivitesine bölerek metillenmemiş ateşböceği kontrol lusiferaz aktivitesine normalleştirin. Burada gösterildiği gibi, zenginleştirilmiş bir astrosit popülasyonu, E-G-F-P-S 100 beta transgenik hayvanın faks sınıflandırması yoluyla elde edildi. İleri ve yan saçılmaya dayalı olarak kapılı bir popülasyon hedeflendi ve bir bromür ölü hücre göstergesi kullanılarak bir canlı hücre popülasyonu belirlendi ve burada gösterilen geçit, ayrışmayı takiben EGFP pozitif astrositlerin temsili görüntüleridir, ancak sıralamadan önce ve sıralamadan sonra, bu şekil, astrosit spesifik belirteç için mRNA'da 40 kat artış gösteren izole bir EGFP pozitif hücre popülasyonunu göstermektedir.

A, LDH, bir, L, bir. Ek olarak, S 100 beta ve NG iki pozitif OPC ve astrositin ortak ekspresyonuna rağmen, NG iki mRNA'da dört kat azalma, zenginleştirilmiş bir astrositik hücre popülasyonunun izolasyonunu gösteren oligodendrosit öncü hücreleri için bir belirteç gözlendi. Bu tablo, farklı yaş ve sayıda hayvandan izole edilen toplam RNA ve DNA'yı listeler ve gerçeklere göre moleküler moleküllerin beklenen verimi için bir referans olarak listelenir.

Son olarak, metillenmiş eki metillenmemiş bir vektöre hareket ettirdikten sonra ilgilenilen genin hipermetillenmiş bölgelerinin transkripsiyonel aktivitesini değerlendirmek için bir ikili lusifer testi kullanıldı. Plazmidin metilasyon durumunu doğrulamak için sadece metillenmemiş DNA'yı sindiren HPA iki kullanıldı. Bu videoyu izledikten sonra, gerçekleri kullanarak zenginleştirilmiş bir astrosit popülasyonunun nasıl izole edileceğinin yanı sıra bir genin DNA metilasyonunu nasıl ölçeceğinizi ve promotörün DNA metilasyonundaki değişiklikleri metilasyona duyarlı yüksek çözünürlüklü eriyik analizi ve lusiferaz testi kullanarak transkripsiyonel aktivite ile nasıl ilişkilendireceğinizi iyi anlamalısınız.