Name: Gen spesifik ifadesi ile DNA Methylation değişiklikler astrositik transkripsiyonel Aktivite ilişkilendirilmesi KCNJ10 (Kir4.1) (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-09-26T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 19 s
Description: Öğrenin, MS.HRMA ve luciferaz analizi kullanarak astrositlerde KCNJ10 geninin DNA metilasyon durumunu değerlendirmeyi ve transkripsiyonel aktivite ile ilişkilendirmeyi. Bu yöntem epigenetik düzenlemeleri incelemek için etkilidir.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma R01NS075062-01A1 tarafından desteklenmiştir. UAB Kapsamlı Akış Sitometrisi Çekirdek tesisinde (P30 AR048311, P30 A1027767) gerçekleştirilen FACS sınıflandırması. UAB Nörobiyoloji Çekirdek tesisinden Dr. Scott Philips ve UAB CDIB'den Dr. Susan Nozell, lusiferaz testinin teknik yönlerine yardımcı oldu.

Tüm hayvanlar Sağlık kurallar National Institutes uyarınca ele alındı. Birmingham&#39;daki Alabama Üniversitesi&#39;nde Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi hayvan kullanımını onayladı. 1. Tüm Beyin Dokusu gelen Astrositler (FACS) Sıralama Floresan Aktif Hücre kullanarak Zenginleştirilmiş Astrositik Populasyonundan RNA ve DNA elde edilmesi <ol><li> 1 dakika boyunca CO2 ve daha sonra hızlı bir decapitate ile oturaklı bir hayvan. Albuquerque ve diğerleri içinde tarif edilen korteks teşrih 26.; Bu meninksleri kaldırmak için gerekli değildir. Not:. S100β altında eGFP (bir astrosit belirteci) promotör ifade transgenik fareler Itakura ve ark 27 tarafından üretilen ve astrositlerde FACS sıralama için kullanılmıştır. </li><li> Üreticinin protokolüne göre, steril olmayan koşullarda papain ayrılma kiti kullanılarak tüm beyin homojenatı hazırlayın. 10 dakika boyunca bir su banyosunda 37 ° C &#39;de papain ısı aktive eder. Not:Papain çözüm üretici tarafından sağlanan ve L-sistein ve EDTA (Malzeme Tablo bakınız) içerir. <ol><li> Kesme veya boru 95,% O 2 taşıyan izin vermek için bir 50 mL konik tüp tepesi içine bir delik dremel:% 5 CO2 kapalı bir konik tüp içine beslenmeleri için (Şekil 1A). Ayrışma ortamı içeren 10 mm kültür kaplarına parçalara korteksleri yerleştirin (20 mM glikoz ve penisilin / streptomisin (500 U / ml) ile desteklenmiş ve% 95 O dengelenmiş MEM 2:% 5 CO2) ve 1 içine dokusunu inceltmek için temiz bir traş makinesi bıçak kullanımı x 1 mm 2 adettir. </li></ol></li><li> Papain çözeltisi içeren 50 ml konik tüp 10 ml manuel pipetman kullanarak doku transferi. Doku taşınan ayrışma ortamı miktarını en aza indirmek için boşaltmadan önce transfer pipeti altına yerleşmek için izin verin. % 95 O 2 dengelenmiş papain çözüm tutun:% 5 CO 2 inkübasyon süresi boyunca yüzey gaz alışverişi yoluyla. Değil kabarcık papain soluti yapınüzerinde. 37 ° C su banyosu içinde 20 dakika boyunca doku inkübe edin. </li><li> Papain çözeltisi içinde İnkübasyonun ardından, çiğnemek dokusu yavaş bir hızda 10 ml transfer pipetle 10 kere. Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 1000 x g&#39;de santrifüjleyin parçalı hücre süspansiyonu. <ol><li> Yüzey gaz değişimi ile (üretici tarafından sağlanan) DNase / albümin önleyicisi çözüm dengelenmesi ve DNaz / albümin, inhibitör çözeltisinin 3 ml pelet hücrelerin yeniden askıya. Üretici talimatları izleyerek ticari kesintili yoğunluk gradiyenti hazırlayın. </li></ol></li><li> 6 dakika boyunca 1.000 xg&#39;de kesintili yoğunluk gradiyenti Spin. Bir pipet kullanılarak taban pelet emme tüpün tabanından ayrışmış hücrelerin izole edin. </li><li> % 0.02 sığır serumu albümini ve 1 mg / ml DNase ve kültür ortamı tamponlu tercih HEPES DPBS 2-3 ml ayrışmış hücrelerin askıya Re. FACS (Şekil 2A) önce 40 um&#39;lik bir filtreden geçirin. Sıralama kadar buz üzerinde hücreleri tutun. <ol><li> FACS 28 gerçekleştirin. &lt;/ li&gt; <li> 4 ° C&#39;de 5 dakika boyunca 2000 x g&#39;de 1,5 ml santrifüj tüplerine Pelet hücreleri. Not: Topak haline getirilen astrositler derhal kullanılan veya DNA ekstraksiyon kadar -80 ° C&#39;de muhafaza edilebilir. </li></ol></li><li> RNA ve DNA izolasyon yöntemi tercih 29 30 kullanarak ayıklayın. Spektrofotometre ve Bioanalyzer 31 üzerinden RNA ve DNA konsantrasyonu ve kalitesini değerlendirmek. Not: sonraki adımlarda sadece yüksek kaliteli RNA ve DNA yararlanın, sırasıyla 260/280 = 2.0-2.2 ve 1.8-1.9. Bioanalyzer analizi RNA veya bozunma kaynaklı DNA fragmantasyonu için değerlendirilmesi esastır. RNA veya DNA, hemen kullanılabilir da -20 ° C, sırasıyla, daha sonraki çalışmalar için C ° -80 saklanabilir. </li></ol> 2. Metilasyona duyarlı Yüksek Çözünürlüklü eritin Analizi (MS-HRMA sayesinde) kullanarak bir Genin DNA Metilasyonu Durumu değerlendirilmesi <ol><li> Geninin herhangi bir CpG adaları tespit edilmesi tercih çevrimiçi metilasyon haritalama yazılımı içine ilgi konusu genin dizisinin girinilgi 32. <ol><li> Bisülfit karşı tasarımı Primerler DNA dizisini 33 dönüştürülür ve üreticinin protokolüne uygun olarak tercih edilen bir DNA polimerazı kullanılarak amplifiye. 45 dakika boyunca 100 V&#39;de bir% 1 agaroz jeli bir DNA çalıştırarak güçlendirilmiş ürün boyutu kontrol edin. -20 ° C&#39;de 20 uM stok konsantrasyonu mağazası primerler. </li></ol></li><li> Bisülfit aynı hayvan türlerinin 34 0-100% arasında değişen, her numune ve metillenmiş DNA standartları DNA 500-1000 ng dönüştürün. Elute numuneler 20 ng / ul konsantrasyon elde edildi. Spektrofotometre 31 üzerinden bisülfitle dönüştürülmüş DNA&#39;nın konsantrasyonu doğrulayın. </li><li> Tablo 1 ve 2&#39;ye göre 5 uM konsantrasyonda tercih edilen bir DNA polimeraz ve primerler kullanılarak MS-İK amplifikasyonu için kurulum 20 ul reaksiyonlar., Üç kez FACS DNA ve metillenmiş standartlar dahil olmak üzere, tüm örnekler, çalıştırın. </li><li> Analiz yazılımına bağlı olarak, önceden ayarlanmış ve başlangıç ​​ve parametreleri durdurmak sonrasıeriyik eğrisinin geçişleri etrafında. Set önceden eriyik başlangıç ​​ve ikisi arasındaki fark 0,2 yani pre-eritme durdurma parametreleri - 0.5 ° C. Post-eriyik başlangıç ​​ve post-eriyiği benzer durdurmak ayarlayın. Her numune için pik sıcaklık farkı verileri ayıklayın. </li><li> Yüzde metilatlı standartları (y-değer) ve bunlara karşılık gelen ortalama pik sıcaklık farkları (x değeri) kullanarak lineer regresyon denklemini (Şekil 3A-B, Tablo 3-4) üretir. Bilinmeyen numunelerin 35 metilasyon durumunu tahmin etmek için bu lineer regresyon denklemini kullanın. </li></ol> 3. Lusiferaz Testi Kullanımı yoluyla Hyper-metillenmiş Promoter Etkinliği değerlendirilmesi <ol><li> Hedef genin (Adım 2.1) CpG adaları tanımlayın. PCR CpG-ada-luc2 plazmidler 37 üretmek için luc2 ateş böceği lusiferaz raportör geninin yukan çıkar 36 ve klon bölgelerin yükseltilmesi. </li><li> Kısıtlaması ile CpG-ada-luc2 plazmidin 30 ug Linearizeenzim sindirimi 38. Kısıtlama sindirmek için siteleri doğrulayın ve tercih edilen kesici yazılımı 38 kullanılarak çift keser kaçının. Üreticinin protokolüne uygun olarak sindirimi takiben uygun sıcaklık ve sürede enzimleri ısı etkisiz hale getirirler. DNA Minimal kaybı doğrusallaştırma adımı sırasında oluşur. </li><li> 30 ° C &#39;de CpG metilaz (M.Sssl) O / N ile veya aşağıdaki ayarlamalar haricinde işlenmemiş aşağıdaki üretici protokolü terk metilat linearize plazmidler. </li><li> 50 ul reaksiyonları gerçekleştirin. </li><li> Lineerleştirilmiş plazmid 700 ng metillenmesi için CpG metilaz 5 birimlerini kullanın. </li><li> 13-19 saat boyunca tepkileri O / N çalıştırın. </li><li> CpG metilaz reaksiyonundan sonra, ticari olarak temin edilebilen silis jel membran üreticinin protokolüne uygun kit temizlemek standardı kullanılarak DNA temizleme gerçekleştirmek. DNA&#39;nın önemli kayıplar CpG metilaz reaksiyonu,% 30-60 kaybı takiben ortaya çıkar. </li><li> Bir Hpa II kısıtlama sindirmek yoluyla Plazmidlerin metilasyon doğrulayın. </li&gt; <li> Metillenmiş ya da olmayan metillenmiş DNA 1 ug al ve sınırlama, 37 ° C&#39;de 1 saat boyunca Hpa II ile sindirmek. Her ug DNA için Hpa II 5-10 birimlerini kullanın. Hpa II sindirim ardından, tercih, ticari olarak mevcut silis jel membran temizlemek kiti kullanılarak DNA temizleme gerçekleştirmek. Görselleştirme için 45 dakika (Şekil 4B) süreyle, 100 V TAE veya çin TBE tamponu içinde bir% 1 agaroz jeli üzerinde, DNA hem de CpG metile olmayan metillenmiş plazmidler çalıştırın. </li><li> Uygun kısıtlayıcı enzimlerle çift sindirim Konu hem metil ve metillenmemiş plazmidler tam uzunlukta luc 2 (vektör) ve CpG ada (insert) 38 fragmanları serbest bırakmak için. Üreticinin protokolüne uygun olarak yumuşatıldıktan sonra uygun sıcaklık ve ısı etkisizleştirilmiş enzimler çift sindirim O / N gerçekleştirin. DNA konsantrasyonu minimum kayıp çift kısıtlama sindirmek sırasında oluşur. </li><li> O ayrılması için izin vermek için 1 saat boyunca 100 V&#39;ta% 1 DNA agaroz jeli üzerinde iki sindirilmiş plazmidler başlatf vektörü ve takın (Şekil 4C). Dikkat. Koruyucu UV yüz siperi giyen, bantları görselleştirmek için bir masa siyah ışık DNA jel yerleştirin. Temiz cerrahi bıçak kullanarak boyutu, tüketim metile ve non-metile insert ve non-metile vektörü dayanarak. </li><li> Doymuş fenol, pH&#39;ı 6.6 kullanılarak jel ekstresi, DNA. Kısaca, vektör ve inserti ihtiva eden bir DNA jel tartın. DNA jel 0,1 gramı başına fenol 100 ul kullanabilir. Cam Dounce homojenleştirici kullanılarak fenol DNA jel homojenize edilir. </li><li> Kloroform (fenol hacminin 1/5 kullanarak) ekleyin ve 20 saniye boyunca numune sallayın. 2-3 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edin. 4 ° C&#39;de maksimum hızda (16.1 x 1000 xg) 15 dakika boyunca santrifüj. </li><li> Sulu çözeltinin çıkarın ve 3 M sodyum asetat ve etanol 2.5X hacminin 0.1x hacmi ekleyin. -80 ° C&#39;de 1 saat süre ile inkübe edin. Bir kuluçkaya yatırmayı takiben, etanolü ortadan kaldırmak ve tercih edilen tampon 30 ul DNA yeniden askıya. DNA&#39;nın önemli bir kayıp ekler ve vektörlerin aşağıdaki izolasyonunu oluşur% 30-50 loss. </li><li> Yeniden bağlanması için metile olmayan metillenmiş uçlar T4 DNA ligazı kullanılarak 38 vektörü metillenmemiş. Ligasyon reaksiyonları için eklemek için vektörün 4 oranında bir 1: kullanın. Üretici talimatlarına göre Kurulum tepki. Reaksiyonları için 50 ul bir toplam hacim kullanma ve C ° veya buz kovası fazla kapaklı buz üzerinde -20 ° C&#39;de O / N inkübe edin. </li><li> Bağlanmasından sonra, tercih edilen, piyasada mevcut silika-jel membran temizlemek kiti kullanılarak DNA temizleme gerçekleştirmek. DNA&#39;nın önemli bir kayıp ligasyonu reaksiyonu, DNA&#39;nın yaklaşık% 30-50 kaybı takiben ortaya çıkar. 45 dakika boyunca 100 V&#39;ta% 1 agaroz jeli üzerinde, DNA çalıştırarak yeniden ligasyonu doğrulamak ve yeniden lige plazmidler (Şekil 4D) konsantrasyonunu değerlendirmek. </li><li> Imalatçının protokolüne göre, ticari bir transfeksiyon ayıracı kullanılarak D54 hücreleri içine metile veya non-metillenmiş plazmidler transfekte. De bir 0.14 x 10 6 hücre / 12-yuvalı bir plaka uzerinde Tohum D54 hücreleri. </li><li> 24 saat sonra, transfekte hücreler, wi(1) non-methyated CpG luc2 plazmid + Renilla veya başka bir kontrol lusiferaz vektörü ya da (2), metile edilmemiş CpG-luc2 plazmid + Renilla veya başka bir kontrol lusiferaz vektörü ya da inci eşit konsantrasyonlarda. </li><li> Hücreler Çift Lusiferaz analiz yapılmadan önce 24 saat boyunca transfekte izin verin. Üretici talimatlarına göre tahlil gerçekleştirin. Bir luminometre kullanılarak okuma gerçekleştirin. Üç kopya halinde her bir okuyun. </li><li> Renilla Firefly lusiferaz aktivitesinin oranının veya başka bir kontrol lusiferaz aktivitesi hesaplayın. Metillenmemiş Firefly kontrol lusiferaz aktivitesi: metillenmiş Firefly normalize kontrol lusiferaz aktivitesi olmayan metile lusiferaz aktivitesi ile metile lusiferaz aktivitesi bölünmesiyle </li></ol>

Yazarların herhangi bir açıklaması yoktur.

Bu protokol, zenginleştirilmiş bir astrosit popülasyonunun FACS yoluyla izolasyonunun yanı sıra DNA metilasyonu ve gen ekspresyonu arasında hem bağıntılı hem de nedensel çalışmalara izin veren çeşitli teknikleri açıklar. Tek başına veya kombinasyon halinde kullanılan bu teknikler, özellikle yüksek hücresel heterojenliğe sahip dokularla çalışan veya belirli bir genin veya gen bölgesinin DNA metilasyon durumuna karşı global DNA metilasyon değişiklikleriyle ilgilenen laboratuvarlar için yararlıdır. CNS'nin epigenomunu incel...

Epigenetik, genomun transkripsiyonel aktivitesini etkileyebilecek kimyasal modifikasyonların incelenmesidir. Esasen, DNA dizisinde bir değişiklik olmadan, DNA metilasyonu, histon asetilasyonu ve histon metilasyonu gibi epigenetik modifikasyonlar, gen ekspresyonu 1'in modellerini geri dönüşümlü olarak değiştirmek için yeterlidir. Gen ekspresyonunun güçlü bir düzenleyicisi olan DNA metilasyonu, en iyi karakterize edilen epigenetik modifikasyondur. DNA metilasyonu, metil gruplarının bir sitozinin C5 pozisyonu üzerinde, tipik olarak bir CpG bölgesi olarak da bilinen bir sitozin-guanin dinükleotidinin sitozininde kovalent bağlanmasıdır. Yüksek yoğunluklu CpG siteleri içeren alanlar, CpG adaları (CGI'ler) olarak bilinir. CGI'lar sıklıkla transkripsiyonel başlangıç bölgeleri (TSS) ve gen promotörleri 1-3 ile ilişkilidir. Bu nedenle, CGI'larda DNA metilasyonundaki değişiklikler her zaman hücresel ekspresyon veya fonksiyondaki değişikliklerle eşzamanlı olmasa da, CGI'lardaki DNA metilasyonundaki değişiklikler transkripsiyonel aktivite 2 üzerinde güçlü bir düzenleme uygulayabilir. 
Tarihsel olarak, DNA metilasyonunun embriyogenez, damgalama ve gelişimde gerekli olduğu gözlemlenmiştir, post-mitotik hücrelerde meydana gelen DNA metilasyon seviyelerinde çok az değişiklik olmuştur (kanserle ilişkili genlerdeki değişiklikler hariç) 4,5. Bununla birlikte, nöroepigenetik alanı, DNA metilasyonu için önemli bir gelişimsel olmayan rolü vurgulamıştır. Spesifik olarak, bilişsel epigenetik, DNA metilasyonunu, öğrenme ve hafıza süreci için gerekli olan genlerin hem transkripsiyonel aktivasyonuna hem de baskılanmasına aracılık etmede ayrılmaz bir rol oynayan oldukça plastik bir mekanizma olarak yeniden tanımlamıştır 6. Bilişsel epigenetiğin yanı sıra, iskemik yaralanma ve nöropatik ağrıyı modelleyen çalışmalar, DNA metilasyonunu çeşitli CNS hakaretlerine hızla yanıt veren kararsız bir mekanizma olarak karakterize eder 7-9. Astrositlerle ilgili olarak, birkaç kanıt dizisi DNA metilasyonunun astrogliogenezde önemli bir rol oynadığını göstermektedir. Fan ve ark., nöral progenitör hücrelerde (NPC'ler) DNMT1'in koşullu KO'sunun, küresel bir hipometilasyon durumu 10 ile uyumlu astrositlerin erken gelişmesine yol açtığını buldu. Ek olarak, Perisic ve ark., GLT-1 promotörünün diferansiyel DNA metilasyon seviyelerinin, korteks ve beyincikteki glutamat taşıyıcısının diferansiyel ekspresyon seviyelerine aracılık ettiği sonucuna vararak, astrositik gen ekspresyonunun beyin bölgesine özgü modellerinin oluşturulmasında DNA metilasyonunda bir rol olduğunu vurguladı 11. Genel olarak, çok sayıda çalışma, çevre, ilaçlar ve yaralanmaların hepsinin DNA metilasyonunu ve sıklıkla gen ekspresyonunu 4,9 değiştirdiği gösterildiğinden, CNS'deki DNA metilasyonunun dinamik ve kararsız doğasının altını çizmektedir. Birlikte, bu nöroepigenetik çalışmalar, çeşitli CNS patolojilerini hafifletme potansiyeline sahip uygun bir terapötik hedef olarak DNA metilasyonuna işaret etmektedir.
Epigenetik alanı, DNA metilasyonunun nörogelişim ve hastalıktaki rolüne ilişkin anlayışını genişlettikçe, DNA metilasyonunu terapötik bir hedefe doğru hareket ettirmenin zorluğu, yalnızca korelasyon değil, aynı zamanda belirli gen hedeflerini ve bölgelerini tanımlayan nedensel çalışmalar gerçekleştirmektedir. Ek olarak, beyin bölgesine ve hücre tipine özgü DNA metilasyonundaki değişiklikleri araştırmak, nöroepigenetik alanına özgü, devam eden ve zamana değer bir zorluk olmaya devam etmektedir. Bu protokol, astrositlerin floresanla aktive edilen hücre sınıflandırması (FACS), metilasyona duyarlı yüksek çözünürlüklü eriyik analizi (MS-HRM) ve Kir4.1'i kodlayan bir gen olan KCNJ10'un DNA metilasyon durumunu araştırmak için bir metilasyon lusiferaz testi dahil olmak üzere çeşitli teknikler kullanır. Kir4.1, CNS 12-16'da hem beyin bölgesini hem de hücreye özgü ekspresyon modellerini gösteren glial spesifik bir potasyum kanalıdır. Kir4.1 ekspresyonu, rostraldan kaudal CNS bölgelerine doğru hareket ederek artar ve en yüksek ekspresyon omurilikte meydana gelir 15. Kanal ependimal hücrelerde, oligodendrositlerde ve bunların öncü hücrelerinde eksprese edilmesine rağmen, Kir4.1 ağırlıklı olarak astrositlerde eksprese edilir ve astrositik dinlenme membran potansiyelini hiperpolarize -80mV'ye ayarlayarak homeostatik potasyum seviyelerini korumak ve glutamat alımını desteklemek için gerekli olduğu düşünülmektedir 12,16-19. Daha da önemlisi, Kir4.1'in ekspresyonu hem gelişim sırasında hem de 20-25 CNS yaralanmasının çoklu formlarını takiben statik değildir. Bu kanalın epigenetik düzenlemesini, özellikle gelişim sırasında astrositlerde incelemek istedik. Kullanılan teknikler, KCNJ10 gen ekspresyonunun düzenlenmesinde DNA metilasyonunun rolü için nedensel kanıt sağlayan gene özgü ve hedeflenmiş CpG bölge analizleri sunar. Bu teknikler diğer genlere de uygulanabilir.

<table><tbody><tr><td>Papain Ayrışma Sistemi</td><td>Worthington Biochemical Corporation</td><td>LK003150</td><td></td></tr><tr><td>AllPrep DNA/RNA Mini Kiti</td><td>Qiagen</td><td>80204</td><td></td></tr><tr><td>Metil Astar</td><td>CpG</td> Adaları EZ DNA metilasyon Kiti <td>yerelleştirmek için Uygulamalı Biyosistemler</td><td>çevrimiçi</td> yazılımı</tr><tr><td></td><td>Zymo Research</td><td>D5001</td><td></td></tr><tr><td>Sıçan Önceden Karıştırılmış Kalibrasyon Standardı</td><td>EpiGenDx</td><td>80-8060R-Premiks</td><td></td></tr><tr><td>CpG Metilaz (M.Sssl)</td> <td>Zymo Research</td><td>E2010</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick Jel Ekstraksiyonu&nbsp;</td><td>QIagen</td><td>28704</td><td>Jel ekstraksiyonu ve DNA temizliği için kullanılır</td></tr><tr><td>Kısıtlama enzimleri</td><td>New England BioLabs</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NEB kesici</td><td>New England BioLabs</td><td>çevrimiçi</td><td>kısıtlama özet sitelerini doğrulayın</td></tr><tr><td>Çift Luciferase Raportör Test Sistemi</td><td>Promega</td><td>E1910</td><td></td></tr><tr><td>Luc2 vektörü, pGL4.10</td><td>Promega</td><td>E6651</td><td></td></tr><tr><td>renilla vektörü, pGL4.74</td><td>Promega</td><td>E2241</td><td></td></tr><tr><td>TD-20/20 Luminometre</td><td>Turner Tasarımları</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lipofektamin LTX ve Artı Reaktif</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>A12621</td><td></td></tr><tr><td>Fenol, doymuş pH 6.6 / 6.9</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP 17501-100</td><td></td></tr><tr><td>Nanodrop 2000 / 2000c Spectrophtometer</td><td>ThermoScientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MeltDoctor Master Mix</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>4415440</td><td></td></tr><tr><td>Yüksek Çözünürlüklü Eriyik (HRM) Yazılımı v2.0</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>4397808</td><td></td></tr><tr><td>AB SDS yazılımı v2.3</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>çevrimiçi</td><td></td></tr><tr><td>AB Yüksek Çözünürlüklü Eritme Başlangıç Kılavuzu&nbsp;</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>online</td><td></td></tr><tr><td>AB 7900HT Hızlı Gerçek Zamanlı Sistem</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

gen spesifik ifadesi ile dna methylation değişiklikler astrositik transkripsiyonel aktivite ilişkilendirilmesi<em&gt; kcnj10</em&gt; (kir4.1)

Correlating Gene-specific DNA Methylation Changes with Expression and Transcriptional Activity of Astrocytic KCNJ10 (Kir4.1)

DNA metilasyonu, bir sitozin-guanin dinükleotidindeki bir sitozinin C5 pozisyonuna bir metil grubunun kovalent bağlanması yoluyla gen ekspresyonunu düzenlemeye hizmet eder. DNA metilasyonu, gen ekspresyonunda uzun süreli ve stabil değişiklikler sağlarken, DNA metilasyonunun kalıpları ve seviyeleri de çeşitli sinyallere ve uyaranlara bağlı olarak değişebilir. Bu nedenle, DNA metilasyonu, gen ekspresyonunun güçlü ve dinamik bir düzenleyicisi olarak işlev görür. Nöroepigenetik çalışması, DNA metilasyonunda hem küresel hem de gene özgü değişikliklerle ilişkili çeşitli fizyolojik ve patolojik durumları ortaya çıkarmıştır. Spesifik olarak, gen ekspresyonundaki değişiklikler ile DNA metilasyonu arasındaki çarpıcı korelasyonlar, nöropsikiyatrik ve nörodejeneratif bozukluklarda, sinaptik plastisite sırasında ve CNS hasarını takiben mevcuttur. Bununla birlikte, nöroepigenetik alanı, DNA metilasyonunun CNS fizyolojisindeki rolüne ilişkin anlayışını genişletmeye devam ettikçe, gen ekspresyonu ve DNA metilasyonundaki değişiklikler açısından nedensel ilişkilerin tanımlanması esastır. Ayrıca, daha geniş sinirbilim alanıyla ilgili olarak, geniş bölge ve hücreye özgü farklılıkların varlığı, transkriptom, proteom ve epigenomu incelerken bu farklılıkları ele alan teknikler gerektirir. Burada, hem RNA transkripsiyonunun hem de DNA metilasyonunun daha sonra incelenmesine izin veren kortikal astrositlerin FACS sıralamasını açıklıyoruz. Ayrıca, DNA metilasyonunu, metilasyona duyarlı yüksek çözünürlüklü eriyik analizini (MS-HRMA) ve ayrıca bir lusiferaz promotör testini incelemek için bir tekniği detaylandırıyoruz. Bu kombine tekniklerin kullanılmasıyla, yalnızca DNA metilasyonu ve gen ekspresyonu arasındaki korelasyon değişikliklerini keşfetmekle kalmaz, aynı zamanda belirli bir gen bölgesinin DNA metilasyon durumundaki değişikliklerin transkripsiyonel aktiviteyi etkilemek için yeterli olup olmadığını doğrudan değerlendirebilir.

Astrositlerde zenginleştirilmiş nüfus eGFP-S100β transgenik hayvanların 27 FACS sıralama yoluyla satın alındı. Nedeniyle p0-p40 yaşlı hücrelerin ve doğum sonrası gün 50 (p50) &#39;den daha büyük hayvanlardan izole edilen molekül moleküllerin, hayvanlar kalitesini düşüren bu tür deneyler için en uygun olan. Kortikal dokusu Bu deneyler için kullanılmıştır. Iki ila altı hayvandan korteks birlikte havuzlandı. FACS UAB Kapsamlı Sitometrisi Çekirdek tesisinde gerçekleştirildi. Sıralama Becton Dickinson FacsAria II ...

DNA metilasyonu, çeşitli uyaranlara yanıt olarak gen ekspresyonunda dinamik değişikliklere izin vermenin yanı sıra, gen ekspresyonunun stabil seviyelerini koruyabilir. DNA metilasyonundaki gene özgü değişikliklerin ve bu değişikliklerin gen ekspresyonu üzerindeki etkisinin incelenmesine izin veren teknikleri detaylandırıyoruz.

Gen spesifik ifadesi ile DNA Methylation değişiklikler astrositik transkripsiyonel Aktivite ilişkilendirilmesi<em&gt; KCNJ10</em&gt; (Kir4.1)

DNA methylation serves to regulate gene expression through the covalent attachment of a methyl group onto the C5 position of a cytosine in a ...

Bu prosedürün genel amacı, zenginleştirilmiş bir astrosit popülasyonundaki KCNJ 10 DNA metilasyon durumunu değerlendirmek ve promotördeki DNA metilasyon değişikliklerini transkripsiyonel opsiyonel aktivite ile ilişkilendirmektir. Bu işlem, öncelikle FACS sıralama yoluyla tüm kemirgen beyninden zenginleştirilmiş bir kortikal astrosit popülasyonunun izole edilmesiyle, ardından bu zenginleştirilmiş astrosit popülasyonundan DNA'nın izole edilmesiyle gerçekleştirilir. Daha sonra, KCNJ 10'un DNA metilasyon durumu, metilasyona duyarlı yüksek çözünürlüklü erime analizi veya MS.HRMA kullanılarak değerlendirilir.Son olarak, KC J 10 promotörü hipermetile edilmiştir ve promotörün DNA metilasyonundaki değişiklikleri transkripsiyonel aktivite ile ilişkilendirmek için lusiferaz analizi kullanılmıştır. Nihayetinde, KCNJ 10'un DNA metilasyon durumunu ölçmek ve promotörün metilasyonundaki değişiklikler ile genin transkripsiyonel aktivitesi arasındaki ilişkiyi belirlemek için MS.HRMA ve lusiferaz analizi kullanılmıştır. Prosedürün uygulanışı gösterilecektir. Çalışmalar laboratuvarımdan bir doktora sonrası araştırmacı tarafından yürütülmüştür; tüm hayvanlar Ulusal Sağlık Enstitüleri Kılavuzlarına uygun olarak yönetilmiş ve hayvan kullanımı Alabama Üniversitesi Birmingham kampüsü Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi tarafından onaylanmıştır.Tüm tamponlar ve reaktifler metin protokolüne uygun olarak hazırlandı. Ötenazi uygulanmış bir hayvanın başından korteksler metin protokolüne göre diseke edildikten sonra, tüplerin tüp içine beslenmesine izin vermek için 50 mililitrelik konik bir tüpün üst kısmına bir delik açın veya dremel ile delin. Ardından tüpe papin çözeltisi ekleyin.Diseke edilmiş korteksleri %95 O2 ve %5 CO2 ile dengelenmiş disosyasyon ortamı içeren 10 milimetrelik bir kültür kabına yerleştirin ve dokuyu 1'er milimetrekarelik parçalar halinde kıymak için temiz bir jilet kullanın. 10 mililitrelik bir pipet ile dokuyu, papain çözeltisi içeren 50 mililitrelik tüpe aktarın. Boşaltmadan önce dokunun transfer pipetinin dibine çökmesini bekleyin.Pepane çözeltisinde kabarcık oluşturmadan taşınan disosiyasyon ortamı miktarını en aza indirmek için, 37 °C su banyosunda 20 dakika inkübe ederken yüzey gaz değişimi yoluyla %95O2'den %5CO2'ye sabit bir akış uygulayın. İnkübasyonun ardından, dokuyu 10 kez yavaşça tritelerken 10 ml transfer pipeti kullanın; bulanık hücre süspansiyonunu oda sıcaklığında, 300 G'de beş dakika boyunca santrifüjleyin. DNA albumin inhibitör çözeltisini yüzey gaz değişimi ile dengeleyin ve peletlenmiş hücreleri çözeltinin üç ml'lik kısmında yeniden süspande edin.Ardından, üreticinin talimatlarını izleyerek ticari bir süreksiz yoğunluk gradyanı hazırlayın. Süreksiz yoğunluk gradyanını 70 G'de altı dakika boyunca santrifüjleyin. Daha sonra, medyumu aspire etmek için bir pipet kullanarak ayrışmış hücreleri tüpün dibinden izole edin.0,02% sığır serum albümini ve mililitre başına bir miligram DNA içeren iki ila üç mililitre DPBS veya tercih edilen besiyerini kullanın. Yeniden kullanmak için, ayrıştırılmış hücreleri süspande edin. FACS ayıklama ve metin protokolüne uygun olarak DNA veya RNA ekstraksiyonu gerçekleştirmeden önce hücreleri 40 µm'lik bir filtreden geçirin.Bisülfit ile dönüştürülmüş bir DNA dizisine karşı primerler tasarlayıp DNA'yı metin protokolüne göre amplifiye ettikten sonra, tercih edilen bir DNA polimeraz ve 5 µM primerler kullanarak, her örnekten 500 ila 1000 ng DNA'yı ve aynı hayvan türünden %0 ile %100 arasında değişen metillendi DNA standartlarını sülfit ile dönüştürün. Ms HRM amplifikasyonu için 20 µL'lik reaksiyonlar hazırlayın. Bu tabloya göre, faks, DNA ve metillenmiş standartlar dahil tüm örnekleri üç tekrarlı olarak çalıştırın; analiz yazılımı ayarlarına bağlı olarak, erime eğrisi geçişlerinin etrafındaki ön ve son başlangıç ve bitiş parametrelerini belirleyin.Ön erime başlangıç ve ön erime bitiş parametrelerini ayarlayın. Bu iki değer arasındaki fark 0.2 ile 0.5 °C arasında olmalıdır. Benzer şekilde erime sonrası başlangıç ve bitiş değerlerini ayarlayın ve metillenme yüzdesi standartlarını ve bunlara karşılık gelen pik sıcaklık farklarını kullanarak her örnek için pik sıcaklık farkı verilerini çıkarın.Bir doğrusal regresyon denklemi oluşturun. İlgilenilen CpG adaları belirlenip metin protokolüne göre CpG adası Luke iki plazmidi amplifiye edilip klonlandıktan sonra, bilinmeyen örneklerin metilasyon durumunu tahmin etmek için bu doğrusal regresyon denklemini kullanın. Çift kesimleri önlemek için restriksiyon sindirimi bölgelerini doğrulamak amacıyla tercih edilen kesici yazılımını kullanın ve örnek uygun enzimlerle sindirildikten sonra 30 µg plazmidi lineerize edin.50 µL'lik reaksiyonlarda enzimleri uygun sıcaklık ve sürede ısı ile inaktive edin. Metilasyon için beş ünite CPG metilaz kullanın. 700 µg lineerize plazmidi 30 °C'de 13 ila 19 saat boyunca bekletin.Metin protokolünde belirtildiği şekilde DNA temizleme işlemini tamamladıktan sonra, metillenmiş DNA'nın bir mikrogramlık örneklerini 37 °C'de bir saat boyunca inkübe ederek HPA two restriksiyon sindirimi gerçekleştirin. DNA temizleme işleminden sonra, görselleştirme amacıyla örnekleri %1'lik agroz DNA jelinde 100 volt değerinde 45 dakika boyunca yürütün. Ardından, tam uzunluktaki Luke two vektörü ve CpG ada fragmanlarını serbest bırakmak için metillenmiş ve metillenmemiş plazmidleri uygun restriksiyon enzimleri ile gece boyunca çift sindirime tabi tutun.Sindirim sonrası enzimleri ısı ile inaktive edin. Vektör ve inserti ayırmak için çift sindirilmiş numuneleri %1'lik DNA agaroz jelinde 100 volt ile bir saat boyunca yürütün; ardından UV ışığına karşı koruma ekipmanları kullanırken, jeli siyah ışık altına yerleştirin ve temiz cerrahi bıçaklar yardımıyla metillenmiş ve metillenmemiş insertleri kesin. DNA'yı metin protokolüne göre jelden ekstrakte ettikten sonra, metillenmiş ve metillenmemiş insertleri metillenmemiş bir vektöre yeniden bağlamak için T4 DNA Ligaz ve bir ila dört oranında vektör-insert karışımı kullanın. Ligasyonun ardından gece boyunca -20 °C'de veya buz üzerinde inkübe edin.DNA'yı temizleyin ve örnekleri %1'lik DNA agaroz jelinde koşturarak yeniden ligasyonu doğrulayın ve yeniden ligasyonu yapılmış plazmidin konsantrasyonunu değerlendirin. CD 54 hücrelerini 12 kuyucuklu bir plakada kuyucuk başına 140.000 hücre olacak şekilde ekleyin. 24 saat sonra, ticari bir transfeksiyon reaktifi kullanarak hücreleri; ya metillenmemiş CPG loop two plazmidle birlikte RAN vanilla veya diğer kontrol lüsiferaz vektörüyle ya da metillenmiş CPG loop two plazmidle birlikte ELLA veya diğer kontrol lüsiferaz vektörüyle eşit konsantrasyonlarda transfect edin. Lüsiferaz testi gerçekleştirmeden önce hücrelerin 24 saat boyunca transfect olmasına izin verin.Üretici talimatlarına uygun olarak, her kuyucuğu üç kez okumak için luminometre kullanın. Ateş böceği lusiferaz aktivitesinin ran vanilla veya diğer kontrol lusiferaz aktivitesine oranını hesaplayın.Metillenmiş ateş böceği kontrol lusiferaz aktivitesini, metillenmiş aktiviteyi metillenmemiş luc aktivitesine bölerek metillenmemiş ateş böceği kontrol lusiferaz aktivitesine normalize edin. Burada gösterildiği gibi, E-G-F-P-S 100 beta transgenik hayvanların fax sorting işlemi ile zenginleştirilmiş bir astrosit popülasyonu elde edilmiştir. İleri ve yan saçılmaya göre belirlenmiş bir popülasyon hedeflenmiş ve bromür ölü hücre indikatörü kullanılarak canlı hücre popülasyonu belirlenmiştir; burada gösterilen gating görüntüleri, dissosiyasyon sonrası ancak sorting öncesi ve sorting sonrası EGFP pozitif astrositlerin temsili görüntüleridir; bu şekil, astrosit spesifik marker için mRNA düzeyinde 40 kat artış gösteren izole edilmiş bir EGFP pozitif hücre popülasyonunu göstermektedir.Bir LDH bir L bir. Ayrıca, S 100 beta ve NG iki pozitif OPC'ler ve astrositlerin ortak ekspresyonuna rağmen, oligodendrosit öncül hücreleri için bir belirteç olan NG iki mRNA'sında dört katlık bir azalma gözlemlenmiştir; bu durum, zenginleştirilmiş bir astrositik hücre popülasyonunun izole edildiğini göstermektedir. Bu tablo, farklı yaşlardaki ve sayıdaki hayvanlardan izole edilen toplam RNA ve DNA'yı listelemekte olup, takip eden işlemler sonrası beklenen moleküler molekül verimi için referans olarak sunulmuştur.Son olarak, metillenmiş insertin metillenmemiş bir vektöre aktarılmasının ardından, ilgili genin hipermetillenmiş bölgelerinin transkripsiyonel aktivitesini değerlendirmek için çift lüsiferaz deneyi kullanılmıştır. Plazmidin metilasyon durumunu doğrulamak için yalnızca metillenmemiş DNA'yı sindiren HPA II kullanılmıştır. Bu videoyu izledikten sonra, FACS kullanarak astrositlerin zenginleştirilmiş bir popülasyonunun nasıl izole edileceği ile bir genin DNA metilasyonunun nasıl ölçüleceği ve promotördeki DNA metilasyonundaki değişikliklerin transkripsiyonel aktivite ile nasıl ilişkilendirileceği (sırasıyla metilasyon duyarlı yüksek çözünürlüklü erime analizi ve lüsiferaz deneyi kullanılarak) konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.

correlating-gene-specific-dna-methylation-changes-with-expression

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Erken yaşam stresinin üzerine DNA metilasyon ve gen ekspresyon değişiklikleri incelemek için bir iş akışı gösterilir. Yeni doğmuş farelerin ve ayrık beyin dokularında izolasyonu anneden ayrılma başlayarak, eş zamanlı olarak izleyen bisülfit sıralama ve RT-PCR analizi için beyin dokusu yumruklar DNA ve RNA izole etmek için bir protokol temsil eder.

Beyin Küçük, Anatomik tanımlı alanları DNA metilasyon ve Gen İfade Optimize Analizi

İzole hipokampi akut beyin kesitleri, hem de astrosit ve nöronların eşzamanlı elektrofizyolojik...

Akut Hipokampal Dilimler içinde Synaptically-uyarılmış astroglial ve Nöronal Cevaplarının İkili Elektrofizyolojik Kayıtlar

Bu çalışma, bir roman nöronal akson ve (astro) glia ko-kültür platformu kurma prosedürleri açıklar. Bu ko-kültür sisteminde, bir tek akson (ve tek bir glial hücre) arasındaki doğrudan etkileşim manipülasyon glial sinyalleşme karşılıklı nöronların mekanik analiz izin veren, uygun olur.

Mikroakışkan Kültür Platformu Glia Etkileşimi (MCP) tabanlı Nöronal Akson ve Glia Co-kültür Sistemi Nöron görüntülenmesi Analizi

Burada astrositik G-protein bağlı reseptörlerin plastisite çalışma için nöronlarda homeostatik plastisite indüklemek için kullanılan protokol bir uyarlama tarif eder. En son astrositik grubu çocuk farelerde I mGluR'leri değişiklikleri incelemek için kullanılan yöntem, in situ ve in vivo olarak erişkin farelerden dokuda çeşitli astrositik GPCRs ölçekleme ölçülmesi ve astrositik reseptörlerinin duyarlılığının daha iyi takdir elde etmek için uygulanabilir nöronal aktivite değişikliklere.

Nöronal Ateşleme Oranlarının Manipülasyon tarafından Astrositik reseptörleri Plastisite Inducing

Striatumdaki astrosit hücre içi Ca2+ sinyallerinin özellikleri ve işlevleri tam olarak araştırılmamıştır. Striatal astrositlerde genetik olarak kodlanmış kalsiyum göstergelerini ifade etme yöntemlerini, adeno-ilişkili serotip 2/5 (AAV2/5) virüslerini ve ayrıca striatal astrositler içindeki Ca2+ sinyallerini yerinde güvenilir bir şekilde görüntüleme prosedürlerini açıklıyoruz.

Görüntüleme hücre içi Ca 2+ Genetik olarak kodlanmış Kalsiyum Göstergelerini Kullanma Yetişkin fareler ile Striatal Astrositler Sinyalleri

Bu protokolün amacı, hücre tipine özgü gen ekspresyonunun, epigenetik belirteçlerin ve/veya protein ekspresyonunun sonraki analizi için belirli nöral hücre tiplerini sıralamak için floresanla aktive edilmiş hücre sıralama (FACS) tekniğini kullanmaktır.

Sıçan beyin dokusunda incelemek için THP kullanılarak hücre-tipi-spesifik gen ifadesi

Bu rapor amacı sağlam immunohistokimyasal algılama epigenetik işaretleri için iletişim kuralı tanımlamak için fare retina 5-metilsitozin (5mC) ve 5 arasında bakterilerde görülen (5hmC) gelişmekte olan ve postmitotic.

5-metilsitozin ve gelişmekte olan 5-arasında bakterilerde görülen immunohistokimyasal tespiti ve Postmitotic fare Retina

Astrositler serebral korteksi düzgün bir şekilde döşer ve karmaşık morfolojilerinin analizini hücresel düzeyde zorlaştırır. Burada sağlanan protokol, kortikal astrositleri ayırmak ve hacimlerini ve morfolojilerini kullanıcı dostu bir görüntü analizi ardışık düzeni ile analiz etmek için rahim elektroporasyonunu temel alan çok renkli etiketleme kullanır.

Kortikal Fare Astrositlerini Bireyselleştirmek için Çok Elbiseli Genom Bütünleştirici Renk (MAGIC) İşaretçilerinin Utero Elektroporasyonunda

Bu makale, uzamsal transkriptomik için dinamik, etkileşimli bir veritabanı olan DeepSpaceDB'yi kullanmak için bir protokol sunar ve doku organizasyonunu ve hastalıkla ilgili gen ekspresyonunu keşfetmek için analiz iş akışları ve örnekler sunar.

DeepSpaceDB kullanarak Uzamsal Transkriptomik Veri Kümelerinin Madenciliği

Bu protokol, birden fazla hafıza ile ilgili beyin bölgesinde nöronlardan ve astrositlerden gelen kalsiyum sinyallerinin eşzamanlı kaydı için kapsamlı bir yöntem tanımı sunar ve öğrenme ve hafıza davranışı paradigmasında uygulanmasını gösterir.

Öğrenme ve Hafıza Davranışları sırasında Astrosit-Nöron Aktivitesini Birden Fazla Beyin Bölgesinde KaydEtmek İçin İki Renkli Lif Fotometri Yöntemi

Öğrenin, MS.HRMA ve luciferaz analizi kullanarak astrositlerde KCNJ10 geninin DNA metilasyon durumunu değerlendirmeyi ve transkripsiyonel aktivite ile ilişkilendirmeyi. Bu yöntem epigenetik düzenlemeleri incelemek için etkilidir.

Gen spesifik ifadesi ile DNA Methylation değişiklikler astrositik transkripsiyonel Aktivite ilişkilendirilmesi

Daha fazla video keşfet