5-metilsitozin ve gelişmekte olan 5-arasında bakterilerde görülen immunohistokimyasal tespiti ve Postmitotic fare Retina

Bu yöntem, postmitotik retinada retina gelişimi sırasında kromatindeki değişiklikler gibi DNA metilasyon alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, benzer bir yaklaşımla işlenen 5-metilsitozin, 5-hidroksimetilsitozin dağılımı taşıyan tüm fare retina dokularından herhangi bir kesitte sağlam bir şekilde kullanılabilmesidir. Bu yöntemin görsel gösterimi, doku hazırlama ve boyama adımlarının öğrenilmesi zor olduğu için kritiktir, çünkü donmuş histolojik preparatlar kullanılıyorsa, değerli organizasyonel ve orijinal doku kaybolabilir.

Prosedürün geri kalanını göstermek, laboratuvarımızdan araştırma görevlisi Pablo Diaz olacak. Bu prosedürü başlatmak için, gözlerin sırt tarafında başı kesilmiş ötenazi uygulanmış bir farenin gözlerini delmek için 29 gauge bir yarım inçlik bir iğne kullanın. Göz kapları elde etmek için, korneayı ve lensi çıkarmak için skleranın etrafını ince oftalmik makasla keserek gözleri hemen enüklee edin.

Göz kaplarını ve E16 tüm gözleri oda sıcaklığında 20 dakika boyunca 1xPBS pH 8.0'da %4 paraformaldehit veya PFA'ya sabitleyin. Oda sıcaklığında 10 dakika boyunca bir mililitre 1xPBS'de iki kez yıkayın. Göz kaplarını ve tüm gözleri kriyoproteksiyonla korumak için, oda sıcaklığında bir saat boyunca %10 sükroz içeren 1xPBS pH 8.0'da inkübe edin.

Daha sonra bir saat boyunca 1xPBS'de% 20 sükrozda. Ve son olarak, gece boyunca 30 santigrat derecede 1xPBS'de% 4 sükroz. Ertesi gün, göz kaplarını ve gözleri kriyo kalıplarda optimum kesme sıcaklığı bileşiğine veya OCT'ye gömün.

Daha sonra kuru buz etanol banyosunda dondurun ve 80 santigrat derecede tutun. Kriyoseksiyona başlamadan önce, gömülü göz kapakları ve gözleri olan kalıpları 80 santigrat dereceden çıkarın. Bunları bir kriyostat tutucusuna yerleştirin ve bir saat boyunca 20 santigrat dereceye kadar dengelenmelerine izin verin.

20 santigrat derecede bir kriyostat kullanarak, optik sinir başından temporonazal eksene paralel 12 mikrometre kalınlığında retina kesitleri kesin. Bölümleri mikroskop slaytlarına monte edin ve 80 santigrat derecede saklayın. İmmün boyamaya başlamak için, slaytlara monte edilmiş retina bölümlerini çevrelemek için hidrofobik bir bariyer kalemi kullanın.

Bölümleri 200 mikrolitre 1xPBS ile 10 dakika boyunca bir kez yıkayın. Bölümleri 200 mikrolitre PBST ile oda sıcaklığında 10 dakika geçirgen hale getirin. Daha sonra, 5mC sinyalini optimize etmek için 37 santigrat derecede 45 dakika boyunca 1xPBS'de 200 mikrolitre taze yapılmış, dikkatlice titre edilmiş 2 Normal hidroklorik asit ile denatüre edin.

Denatürasyondan sonra, retina bölümlerine 100 mikrolitre 0.1 Tris-HCl pH 8.3 ekleyin ve nötralize etmek için oda sıcaklığında 10 dakika inkübe edin. Ardından 500 mikrolitre engelleme solüsyonu ekleyin. Ve bölümleri bir saat boyunca oda sıcaklığında bir nem odasında inkübe edin.

Bloke edici çözelti içinde bir ila 500 oranında seyreltilmiş uygun antikorları bölümlere ekleyin ve gece boyunca dört santigrat derecede inkübe edin. Ertesi gün, bölümleri her biri% 0.1 PBST ile 10 ila 15 dakika boyunca üç kez yıkayın. Bir saat boyunca oda sıcaklığında DAPI çözeltisi içeren bloke edici çözeltide bir ila 1000 oranında seyreltilmiş uygun ikincil antikorlar ekleyin.

Ardından, slaytları her biri 10 dakika boyunca bir mililitre% 0.1 PBST ile üç kez yıkayın. Son yıkamadan sonra sulu montaj ortamı ekleyin. Bir lamel ile örtün.

Ve sonra konfokal mikroskopi ile devam edin. E16'da retinal immün boyamadan sonra, 5mC sinyali hücre çekirdeğinin kromozomerkezlerinde güçlüydü ve tüm hücre çekirdeğinde çok daha düşük bir seviyede mevcuttu. 5hmC boyaması sadece hücre çekirdeğinde bulundu ve kromozomerkezlerde yoktu.

P0 retinada hem 5mC hem de 5hmC sinyalleri dış nöroblast tabakasında ve iç nöroblast tabakasında mevcuttu. 5mC sinyali, hücre çekirdeğinin kromomerkezlerinde ve nükleer çevresinde güçlüydü ve hücre çekirdeğinin kromomerkezleri arasında daha zayıftı. 5hmC boyaması hücre çekirdeği ile sınırlıydı.

P15 retinada, dış nükleer tabakada, hücre çekirdeğinin kromozantratörlerinde ve nükleer periferde 5mC sinyali tespit edildi. Oysa 5hmC sinyali, kromomerkezler hariç tüm hücre çekirdeğindeydi. İç nükleer ve ganglion hücre tabakasında, 5mC sinyali hücre çekirdeğinin kromozomerkezlerinde güçlü ve tüm hücre çekirdeğinde zayıftı.

Oysa 5hmC sinyali, kromomerkezler hariç tüm hücre çekirdeğinde bulundu. Yetişkin çubuk fotoreseptörlerinde, 5mC sinyali kromozomerkez ve nükleer çevre ile sınırlıyken, 5hmC sinyali nükleer çevre ile sınırlıydı. Bu prosedürü denerken, histolojik bölümleri 30 dakika olan optimal HCl maruziyeti ile tedavi etmeyi unutmamak önemlidir.

Maruz kalma daha az veya daha fazla ise, optimal sonuçlar tekrarlanabilir olamaz. Bu prosedürü takiben, 5-metilsitozin ve 5-hidroksimetilsitozin ölçümündeki değişikliklerin miktarının belirlenmesi gibi ek soruları yanıtlamak için yüksek basınçlı sıvı kromatografisi, kütle spektrometresi gibi diğer yöntemler gerçekleştirilebilir. Geliştirilmesinden sonra, bu teknik, nöral gelişim alanındaki araştırmacıların kromatindeki epigenetik değişiklikleri keşfetmelerinin yolunu açtı.

HCl ve PFA ile çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini ve bu prosedürü gerçekleştirirken her zaman uygun imha gibi önlemlerin alınması gerektiğini unutmayın.