Beyin Küçük, Anatomik tanımlı alanları DNA metilasyon ve Gen İfade Optimize Analizi

Bu prosedürün genel amacı DNA'yı incelemektir. Metilasyon ve gen ekspresyonu erken yaşam stresi üzerine değişir. Bu, ikinci adım olarak erken yaşam stresini indüklemek için önce yeni doğan fare yavrularının anne ayrılığına tabi tutulmasıyla gerçekleştirilir, burada beynin ilgi alanları, PVN in loco mikro diseksiyon ile elde edilir ve DNA ve RNA aynı anda tek bir doku punchından izole edilir.

Daha sonra, elde edilen DNA sülfit ile muamele edilir ve ilgilenilen bölge bi sülfit PCR ile amplifiye edilir. Bu daha sonra bir vektöre bağlanır ve bakterilere dönüştürülür. Başarılı dönüşümler, işaretleyici ekspresyonu ve PCR fragman boyutu ile tanımlanır.

Ve son olarak, metilasyon durumunu değerlendirmek için bi sülfür dizilimi kullanılır. Bu iş akışının ana avantajı, çevresel uyaranlara yanıt olarak epigenetik programlamanın uygun şekilde analizine izin vermesidir. Bu yöntem, erken yaşam sıkıntılarına göre epigenetik programlama hakkında fikir verebilir.

Diğer sistemlere de uygulanabilir. Metilasyon ve gen ekspresyonunun yüksek oranda dokuya özgü ortamda analiz edildiği ve doku mevcudiyetinin sınırlı olduğu her yerde erken yaşam stresini indüklemek için. Anne ayrımını etkilemek için zamanlanmış gebe C 57 siyah altı N barajından yavrulara anne ayırma işlemi yapılır.

Her bir çöpü, doğum sonrası bir ila 10. günler arasında günde üç saat boyunca ısıtılmış temiz bir kafese aktarın, stressiz kontrol yavrularını rahatsız etmeden bırakın. Üç saatlik ayrılık dışında, tüm yavrular doğum sonrası 21. günde sütten kesilene kadar anneleriyle birlikte bırakılır. Daha sonra yavrular, beyin dokusunun toplanmasını başlatmak için standart barınma koşulları altında kafes başına üç ila beş fare olmak üzere cinsiyete uygun gruplar halinde barındırılır, fare beyinleri kafataslarından çıkarılır ve hemen isop kuru buzda dondurulur ve eksi 80 santigrat derecede saklanır.

Doku zımbalarını toplamaya hazır olduğunuzda, beyinleri eksi 80 derecelik dondurucudan çıkarın ve kuru buzun üzerine koyun. Beyinleri rostraldan coddle'a kadar 10 mikronluk koronal bölümlere kriyoseksiyonla başlayın. Bölümleri süper don cam slaytlara monte edin ve tepe menekşe lekesi için kurutun.

Yerinde iki hibridizasyon gibi daha ileri analizler için ek slaytlar alınabilir ve eksi 20 derecede saklanabilir. Yumruk atmaya hazır olduğunuzda, ilgilenilen beyin yapılarını belirlemek için slaytları krestal menekşe ile boyayın. Daha sonra bir delme iğnesi kullanarak, in loco mikrodiseksiyon kullanarak ilgilenilen bölgelerden 0,8 milimetrelik zımbalar alın.

Zımbalar eksi 80 santigrat derecede saklanmalıdır. Gen ekspresyonu ve metilasyon yüksek oranda dokuya özgü olduğu için mikro zımbalamanın standart bir şekilde yapılması kritik öneme sahiptir. Zımbaları bir pipet kullanarak 400 mikrolitre qadium tiyosiyanat tamponunda homojenize edin, ardından oda sıcaklığında girdap yapın.

Ardından, elde edilen lizatı 29 gauge bir şırıngadan geçirin. Birkaç kez yumruk artık görünmemelidir. Lizatı eşit parçalara bölün.

Biri önce yapılması gereken RNA'yı işlemek için, diğeri ise RNA'nın RNA saflaştırması için 10'da bir sodyum asetat, bir hacim aqua fenol ve yarım hacim 24 ila bir kloroformdan izoamil AML girdabına işlenene kadar oda sıcaklığında saklanabilen DNA'yı işlemek için. Karışımı her ilaveden sonra kuvvetlice karıştırın ve son karışımı buz üzerinde 10 dakika inkübe edin. Sonra karışımı santrifüjleyin.

Sulu fazı toplayın ve buna eşit hacimde% 70 etanol ekleyin. Bir RNA spin kolon kiti kullanarak. Sütun üzerinde bir DNA sindirimi gerçekleştirin ve RNA'yı 25 mikrolitre suda yıkayın.

Şimdi, bir RN a'nın sindiriminin eklenmesini içerecek şekilde modifiye edilmiş bir kit protokolü kullanarak DNA'yı saflaştırın ve elucian tamponunu ve elucian sütununu kullanımdan önce 70 santigrat dereceye kadar ısıtın. Sütunlar için 70 santigrat derecede 10 dakika yeterlidir. Son olarak, DNA ve RNA konsantrasyonlarını belirlemek için bir spektrofotometre kullanın.

Tipik bir PVN zımbası, sülfit ile amplifikasyondan önce kantitatif PCR ile gen ekspresyonu analizi için yaklaşık 600 nanogram DNA ve bir kenara bırakılmış yaklaşık 400 nanogram RA verir. İzole edilmiş DNA'nın 200 nanogramını, metillenmiş bölgelerden DNA'yı çoğaltmak için ticari olarak temin edilebilen bir kit ile tedavi edin. Bisülfite dönüştürülmüş DNA için özel olarak tasarlanmış primerler sipariş edin PCR amplikonunun kalitesi ve özgüllüğü aşağıdaki adımların başarısını belirlediğinden, bi PCR'de optimal primer tasarımı çok önemlidir.

Primerler geldiğinde, pilot deneylerle optimum ve diz çökme sıcaklıklarını belirleyin. Her 25 mikrolitre için şablon olarak iki mikrolitre bis sülfit ile muamele edilmiş DNA kullanın. PCR karışımı.

Karışımı, 95 santigrat derecede altı dakikalık bir denatüre etme ile başlayarak, ardından 72 santigrat derecede son beş dakikalık bir uzamadan önce 45 ila 50 amplifikasyon döngüsü ile güçlendirin. Amplikonun boyutunu doğrulamak için PCR ürününün yedi mikrolitresini Agros jel elektroforezi ile analiz edin. Kalan PCR ürününü, piyasada bulunan bir PCR temizleme kiti kullanarak sonraki ligasyon için saflaştırın.

İstenmeyen PCR ürünleri elde edilirse, bu protokol için ilgilenilen ürünü izole etmek için jel saflaştırması kullanın. Ticari bir klonlama kiti kullanılır. Klonlama verimliliği kritik olarak kesici uca bağlıdır.

Bu nedenle, düşük sayıda rekombinant klon tekrar tekrar elde edilirse, farklı bir klonlama vektörü deneyin. Bir mikrolitre vektör ve üç mikrolitre temizlenmiş PCR ürünü ile 10 mikrolitrelik bir ligasyon reaksiyonu ayarlayın. Reaksiyonu pipetleyerek karıştırın ve ertesi gün gece boyunca dört santigrat derecede inkübe edin.

Klasik etanol çökeltme ile ligasyon reaksiyonunu temizleyin ve bakterileri ürünle dönüştürün. Darbe dağıtımından hemen sonra bir mililitre ön ısıtma SOB ortamı ekleyin ve dönüştürülmüş bakterileri bir reaksiyon tüpüne aktarın. Bakterileri 37 santigrat derecede bir saat boyunca geri kazandıktan sonra, her süspansiyonun 100 mikrolitresini IPTG ile kaplanmış bir LB ampisilin plakasına yayın.

Xal, koloniler toplandıktan sonra plakaları gece boyunca inkübe eder. Her reaksiyonda üç mikrolitre 2.5 milimolar magnezyum klorür kullanarak 96 oyuklu bir plakada 25 mikrolitre koloni PCR reaksiyonu ayarlayın. Bir pipet ucu ile pozitif beyaz klonları seçin ve bunları basit bir daldırma ile bir PCR karışımına aktarın.

PCR'ye dört dakikalık bir erime döngüsü ile başlayın. Bunu, 56 santigrat derece ling sıcaklığına sahip 10 amplifikasyon döngüsü ile takip edin. Bu döngülerin her adımı 30 saniyedir.

Ardından, 30 daha amplifikasyon döngüsü için ealing sıcaklığını 48 santigrat dereceye düşürün. Beş dakikalık bir uzama döngüsü ile bitirin. Şimdi her üründen beş mikrolitreyi bir aros jeli üzerine yükleyin ve doğru boyutta ek parça içeren reaksiyonları belirleyin.

İlgilenilen PCR ürünlerini temizlemek için ticari olarak temin edilebilen bir kit kullanın, böylece büyük boya sonlandırıcı döngü dizilimi kullanılarak sıralanabilirler. 96 oyuklu bir plakada, üç mikrolitre büyük DI reaksiyon ana karışımı ve ardından iki mikrolitre temizlenmiş koloni PCR ürünü ile kuyuları yükleyin. Reaksiyonu 96 santigrat derecede bir dakika ile başlayarak, ardından 96 santigrat derecede 10 saniyelik, 50 santigrat derecede beş saniye ve 60 santigrat derecede dört dakika olan 35 döngü üzerinde çalıştırın.

Büyük kalıp reaksiyonu bittikten sonra, büyük bir kalıp saflaştırma plakası kullanarak reaksiyonu temizleyin. Dizileri elde ettikten sonra, erken yaşam stresinin veya ELS'nin bir VP ekspresyonu ve metilasyon durumu üzerindeki etkisi hakkında fikir edinmek için araştırılan DNA bölgesinin metilasyon modelini türetmek için çevrimiçi büyük analizörü veya B-I-S-M-A aracını kullanarak bunları analiz edin. C 57 siyah çubuk ve fareler tarif edilen protokole göre işlendi, paraventriküler çekirdek ve supraoptik çekirdek DNA'yı izole etmek için delindi ve R-N-A-D-N-A bi sülfit ile muamele edildi, a VP arttırıcıya özgü primerlerle amplifiye edildi ve PCR ürünleri klonlandı ve her fareden en az 20 rekombinant klon dizilendi.

P-V-N-E-L-S'den alınan dokuda PCR amplikonunda bulunan CPG'lerin metilasyon frekanslarını belirlemek için PCR, A VP arttırıcı üzerinde dört yerde önemli bir hipometilasyona neden oldu ve bu düzenleyici bölgenin erken yaşam deneyimleri yoluyla epigenetik olarak işaretlendiğini düşündürdü. A VP arttırıcının PVN metilasyonunun aksine, kontrol hayvanlarında epigenetik etkinin doku özgüllüğünü gösteren SON'daki ELS'den etkilenmedi, CPG 10'daki DNA metilasyon durumu, bir VP gen ekspresyonunun ince ayarında DNA metilasyonunun rolüne işaret eden bir VP gen ekspresyonu ile negatif korelasyon gösterdi. Bu prosedürü takiben, analiz edilen dokudaki gen ekspresyonu değişiklikleri gibi ek soruları yanıtlamak için izole edilen RNA üzerinde UPCR gibi diğer yöntemler kolayca gerçekleştirilebilir.

Bu videoyu izledikten sonra, çevresel veya deneyimlenen bağımlı uyaranlara yanıt olarak DNA metilasyon değişikliklerini nasıl inceleyeceğinizi iyi anlamış olmalısınız.