Beyin Küçük, Anatomik tanımlı alanları DNA metilasyon ve Gen İfade Optimize Analizi

Bu prosedürün genel amacı, erken yaşam stresinin ardından DNA metilasyonu ve gen ekspresyonu değişikliklerini incelemektir. Bu, öncelikle yeni doğan fare yavrularına erken yaşam stresini tetiklemek için maternal separasyon uygulanarak; ikinci adımda ise ilgi duyulan beyin bölgeleri olan PVN'nin in loco mikrodiseksiyon ile elde edilmesi ve tek bir doku örneğinden DNA ve RNA'nın eş zamanlı olarak izole edilmesiyle gerçekleştirilir.

Ardından, elde edilen DNA sülfit ile işleme tabi tutulur ve ilgi duyulan bölge bisülfit PCR ile amplifiye edilir. Bu ürün daha sonra bir vektöre ligaze edilir ve bakterilere transforme edilir. Başarılı transformasyonlar, marker ekspresyonu ve PCR fragman boyutu ile belirlenir.

Ve son olarak, metilasyon durumunu değerlendirmek için bisülfit sekanslama kullanılır. Bu iş akışının temel avantajı, çevresel uyaranlara yanıt olarak epigenetik programlamanın kolayca analiz edilmesine olanak tanımasıdır. Bu yöntem, erken yaşam zorluklarının neden olduğu epigenetik programlama hakkında bilgi sağlayabilir.

Bu yöntem diğer sistemler için de uygulanabilir. Metilasyon ve gen ifadesinin yüksek derecede dokuya özgü ortamlarda analiz edildiği ve doku erişiminin sınırlı olduğu her durumda kullanılabilir. Erken yaşam stresini tetiklemek için, maternal ayrılık işlemi, maternal ayrılığın etkilerini incelemek amacıyla zamanlanmış gebeliğe sahip C 57 black six N diş farelerin yavrularına uygulanır.

Postnatal 1. günden 10. güne kadar her batın, günde üç saat boyunca ısıtılmış temiz bir kafese aktarılır; stres uygulanmamış kontrol yavruları ise rahatsız edilmeden bırakılır. Üç saatlik ayrılma süreci dışında, tüm batınlar postnatal 21. gündeki sütten kesilme dönemine kadar anneleriyle birlikte tutulur. Ardından yavrular, standart barındırma koşulları altında, her kafeste üç ila beş fare olacak şekilde cinsiyete göre eşleştirilmiş gruplarda barındırılır. Beyin dokusu toplamasına başlanması için fare beyinleri kafatasından çıkarılır, derhal kuru buzda dondurulur ve -80 °C'de saklanır.

Doku örneklerini toplamaya hazır olduğunuzda, beyinleri -80 °C dondurucudan çıkarın ve kuru buz üzerine yerleştirin. Beyinleri rostralden caudal yöne doğru 10 mikronluk koronal kesitler halinde kriyoseksiyonla kesmeye başlayın. Kesitleri super frost cam lamlara monte edin ve kristal viyole boyama işlemi için kurutun.

İn situ hibridizasyon gibi daha ileri analizler için ek lamlar alınabilir ve -20 °C'de saklanabilir. Punch örnekleri almaya hazır olduğunuzda, ilgilenilen beyin yapılarını belirlemek için lamları kristal viyole ile boyayın. Ardından bir punching iğnesi kullanarak, in loco mikrodiseksiyon yöntemiyle ilgilenilen bölgelerden 0,8 mm'lik punch örnekleri alın.

Punchlar -80 °C'de saklanmalıdır. Gen ekspresyonu ve metilasyonun dokuya oldukça özgü olması nedeniyle, mikro punch işleminin standart bir şekilde gerçekleştirilmesi kritik öneme sahiptir. Punchları, bir pipet kullanarak 400 µL guandinyum tiyosiyanat tamponu içinde homojenize edin ve ardından oda sıcaklığında vortekslenmesine tabi tutun.

Ardından, elde edilen lizatı 29 gauge bir şırıngadan geçirin. Delik izleri görünmeyene kadar bu işlemi birkaç kez tekrarlayın. Lizatı eşit kısımlara ayırın.

Birincisi RNA işleme için kullanılmalı ve önce yapılmalıdır; diğeri ise DNA işleme içindir ve RNA işlenene kadar oda sıcaklığında saklanabilir. RNA saflaştırması için 1/10 hacim sodyum asetat, bir hacim aqua fenol ve yarım hacim 24:1 kloroform/izoamil alkol ekleyiniz. Her eklemeden sonra karışımı kuvvetlice vorteksleyiniz ve son karışımı 10 dakika boyunca buz üzerinde inkübe ediniz. Ardından karışımı santrifüjleyiniz.

Sulu fazı toplayın ve üzerine eşit hacimde %70 etanol ekleyin. Bir RNA spin kolon kiti kullanarak, kolon üzerinde DNA sindirimi gerçekleştirin; ardından yıkama işlemini yapın ve RNA'yı 25 µL su içerisinde elüe edin.

Şimdi, RNA sindirimi eklemek üzere modifiye edilmiş bir kit protokolünü kullanarak DNA'yı saflaştırın ve elüsyon tamponu ile elüsyon kolonunu kullanmadan önce 70 °C'ye ısıtın. Kolonlar için 70 °C'de 10 dakika yeterlidir. Son olarak, DNA ve RNA konsantrasyonlarını belirlemek için bir spektrofotometre kullanın.

Tipik bir PVN punch işlemi, yaklaşık 600 nanogram DNA ve yaklaşık 400 nanogram RNA sağlar; bunun yaklaşık 100 nanogramı, sülfit ile amplifikasyon öncesinde kantitatif PCR ile gen ekspresyon analizi için ayrılır. İzole edilen DNA'nın 200 nanogramını, metillenmiş bölgelerden DNA amplifiye etmek için ticari olarak mevcut bir kit ile işleyin. Bisülfit dönüştürülmüş DNA için özel olarak tasarlanmış primerler sipariş edin. Bisülfit PCR'da optimal primer tasarımı esastır, çünkü PCR amplikonunun kalitesi ve özgüllüğü, sonraki adımların başarısını belirler.

Primerler geldiğinde, pilot deneylerle optimal ve bağlanma sıcaklıklarını belirleyin. Her 25 µL'lik PCR karışımı için kalıp olarak 2 µL bisülfit ile işlem görmüş DNA kullanın.

Karışımı, 95 °C'de altı dakikalık denatürasyonla başlayarak, ardından 45 ila 50 amplifikasyon döngüsü ve son olarak 72 °C'de beş dakikalık elongasyonla amplifiye edin. Amplikon boyutunu doğrulamak için PCR ürününün yedi µL'sini Agros jel elektroforezi ile analiz edin. Geriye kalan PCR ürününü, sonraki ligasyon işlemi için ticari olarak satılan bir PCR temizleme kiti kullanarak saflaştırın.

İstenmeyen PCR ürünleri elde edilirse, bu protokol için ilgili ürünü izole etmek amacıyla jel saflaştırma yöntemini kullanın. Ticari bir klonlama kiti kullanılır. Klonlama verimliliği, kritik düzeyde insert'e bağlıdır.

Bu nedenle, tekrar tekrar düşük sayıda rekombinant klon elde edilirse, farklı bir klonlama vektörü deneyin. Bir mikrolitre vektör ve üç mikrolitre temizlenmiş PCR ürünü ile 10 µL'lik bir ligasyon reaksiyonu hazırlayın. Reaksiyonu pipetleme yoluyla karıştırın ve dört °C'de gece boyunca inkübe edip ertesi gün işleme devam edin.

Ligasyon reaksiyonunu klasik etanol çöktürme yöntemiyle temizleyin ve ürünü bakterilere transforme edin. Puls uygulamasının hemen ardından bir mililitre önceden ısıtılmış SOB besiyeri ekleyin ve transforme edilen bakterileri bir reaksiyon tüpüne aktarın. Bakterileri 37 °C'de bir saat boyunca inkübe ederek geri kazanım sağladıktan sonra, her süspansiyondan 100 µL'yi IPTG ile kaplanmış LB ampicillin plağına yayın.

Koloniler seçilebilir hale gelene kadar plakları gece boyunca inkübe edin. Her reaksiyonda 3 µL 2.5 mM magnezyum klorür kullanarak 96 kuyucuklu bir plakta 25 µL koloni PCR reaksiyonları hazırlayın. Pozitif beyaz klonları bir pipet ucuyla seçin ve basit bir daldırma işlemiyle PCR karışımına aktarın.

PCR'ye dört dakikalık bir eritme döngüsü ile başlayın. Bunu, 56 °C bağlanma sıcaklığında 10 amplifikasyon döngüsü ile takip edin. Bu döngülerin her bir adımı 30 saniyedir.

Ardından, 30 amplifikasyon döngüsü daha için tavlama sıcaklığını 48 °C'ye düşürün. Beş dakikalık bir uzama döngüsü ile işlemi tamamlayın. Şimdi, her bir üründen 5 µL'yi agaroz jele yükleyin ve doğru boyutlu insert içeren reaksiyonları belirleyin.

İlgili PCR ürünlerini, big dye terminator döngüsel sekanslama ile sekanslanabilecek hale getirmek için ticari olarak satılan bir kit kullanarak temizleyin. 96 kuyucuklu bir plakadaki kuyucuklara önce üç mikrolitre big DI reaksiyon master mix'i, ardından iki mikrolitre temizlenmiş koloni PCR ürünü yükleyin. Reaksiyonu bir termosikletörde, 96 °C'de bir dakika ile başlayıp ardından 96 °C'de 10 saniye, 50 °C'de beş saniye ve 60 °C'de dört dakikadan oluşan 35 döngü şeklinde çalıştırın.

Bisülfit reaksiyonu tamamlandıktan sonra, reaksiyonu bir bisülfit saflaştırma plakası kullanarak temizleyin. Sekanslar elde edildikten sonra, erken yaşam stresinin (ELS) avp ekspresyonu ve metilasyon durumu üzerindeki etkisini anlamak amacıyla, incelenen DNA bölgesinin metilasyon paternini belirlemek için çevrimiçi bisülfit analizörü veya B-I-S-M-A aracı ile analiz yapın. C57BL/6 fareler tanımlanan protokole göre işlendi; DNA ve RNA izole etmek için paraventriküler çekirdek ve supraoptik çekirdek punch yöntemiyle alındı, DNA bisülfit işlemine tabi tutuldu, avp enhancer bölgesine özgü primerlerle amplifiye edildi ve PCR ürünleri klonlandı; her fareden en az 20 rekombinant klon sekanslandı.

P-V-N-E-L-S'nin indüklediği dokulardaki PCR amplikonunda bulunan CPG'lerin metilasyon frekanslarını belirlemek için PCR analizleri yapılmıştır; bu durum A VP enhancer bölgesindeki dört konumda belirgin bir hipometilasyon olduğunu ve erken yaşam deneyimleri aracılığıyla bu düzenleyici bölgenin epigenetik olarak işaretlendiğini göstermektedir. PVN'nin aksine, SON'daki A VP enhancer metilasyonu ELS'den etkilenmemiştir; bu da epigenetik etkinin doku özgüllüğünü ortaya koymaktadır. Kontrol hayvanlarında, CPG 10'daki DNA metilasyon durumu a VP gen ekspresyonu ile negatif korelasyon göstermiştir, bu da DNA metilasyonunun a VP gen ekspresyonunun hassas ayarlanmasında bir rol oynadığına işaret etmektedir. Bu prosedürün ardından, analiz edilen dokudaki gen ekspresyon değişiklikleri gibi ek soruları yanıtlamak amacıyla, izole edilen RNA üzerinde UPCR gibi diğer yöntemler kolaylıkla uygulanabilir.

Bu videoyu izledikten sonra, çevresel veya deneyime bağlı uyarılara yanıt olarak DNA metilasyon değişikliklerinin nasıl inceleneceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.