Sıçan beyin dokusunda incelemek için THP kullanılarak hücre-tipi-spesifik gen ifadesi

Bu prosedürün genel amacı, sonraki analizler için beyin dokusundan münferit nöral hücre tiplerini izole etmektir. Bu işlem, öncelikle nöral dokunun tek hücreli bir süspansiyona ayrıştırılmasıyla gerçekleştirilir. İkinci adımda, süspansiyondaki miyelin uzaklaştırılır ve ardından hücreler, hücre tipine özgü antikorlar için boyanır.

Son adımda, bireysel hücre popülasyonları akış sitometrisi ile ayrıştırılır. Nihayetinde, bu hücre tipine özgü izolasyon yöntemi, kullanıcıların gen veya protein ekspresyonundaki değişimleri veya epigenetik modifikasyonları hücre tipine özgü bir şekilde analiz etmelerine olanak tanıyacaktır. Bu yöntem; hangi hücre tiplerinin belirli reseptörleri, belirli proteinleri veya belirli epigenetik modifikasyonları eksprese ettiğini belirleyerek, beyindeki hücre tipine özgü mekanizmaları daha iyi anlamamızı sağlayacak ve nörobilim alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olacaktır.

Yetişkin beyin dokularından alınan her bir örneği, altı kuyucuklu bir kültür plakası kapağı üzerinde steril jiletler kullanarak 30 ila 400 miligramlık küçük parçalara bölerek nöral disosiasyona başlayın. Ardından dokuları bir mililitre kalsiyum ve magnezyum içermeyen HBSS içine daldırın ve tüm dokular toplandıktan sonra örnekleri steril iki mililitrelik santrifüj tüplerine aktarmak için bir pipet kullanın. Örnekleri santrifüjleyin ve süpernatantları aspire edin.

1.900 µL ılık enzim ekleyin. Karıştırın ve örnekleri 15 dakika boyunca inkübe edin. Çöken doku parçalarını tekrar süspansiyon haline getirmek için tüpü her beş dakikada bir birkaç kez tersyüz ederek 37 °C'lik bir su banyosunda bekletin.

İnkübasyonun sonunda, taze hazırlanmış enzimden 30 µL ekleyin. Her örneğe iki kez karıştırın ve tüpleri nazikçe ters çevirin. Ardından, bir olarak etiketlenmiş bir pest pipet kullanarak, her bir örneği 30 kez yukarı-aşağı hareketle çözün.

Kabarcık oluşmamasına dikkat ederek, örnekleri 37 °C'de beşer dakikada bir ters çevirerek 15 dakika daha inkübe edin; ardından az önce gösterildiği gibi, iki numaralı pest pipet ile örneklerin disosiasyonunu gerçekleştirin.

Ardından üç numaralı pipete geçin, disosiasyon işlemini tekrarlayın ve örnekleri 10 dakika daha inkübe edin. Beş dakikada bir tersyüz ederek su banyosunda inkübe edin; inkübasyon sonunda tek hücre süspansiyonlarını 80 micron hücre süzgeçlerinden geçirerek 15 milliliter Falcon tüplerine filtreleyin. Enzimatik reaksiyonları durdurmak için her süzgeci 10 milliliters kalsiyum ve magnezyum içermeyen HBSS ile yıkayın; son örnek filtrelendiğinde tüpleri santrifüjleyin ve hücrelerden myelini uzaklaştırmak için süpernatantları aspire edin.

Süspansiyonlar için peletleri 400 µL miyelin uzaklaştırma tamponunda tamamen yeniden süspande edin ve her tüpe uygun miktarda miyelin uzaklaştırma boncuğu ekleyin. Hücreler ve boncuklar tamamen karışana kadar solüsyonları pipetle aşağı yukarı çekin. Ardından örneği 4 °C'de 15 dakika boyunca inkübe edin.

İnkübasyon sonrası, hücreler santrifüj edilirken her bir örneği beş mililitre myelin removal buffer ile yıkayın; her bir örnek için bir kolonu bir manyetik ayırıcının manyetik alanına yerleştirin ve her kolonun üzerine temiz bir 80 mikron filtre koyun. Her filtreyi ve kolonu, tüm akış sıvısını bir atık kabında toplayarak, bir mililitre myelin removal buffer ile üç kez durulayın. Son durulamadan sonra, elüatı toplamak için her kolonun altına doğrudan beş mililitrelik polistiren yuvarlak tabanlı tüpler yerleştirin.

Ardından örneklerdeki süpernatantı aspire edin ve peletleri 500 µL miyelin giderme tamponu içerisinde yeniden süspanse edin. Hücre süspansiyonlarını hemen kolonlara uygulayarak hücreleri aşağıdaki tüplere toplayın. Daha sonra, her bir filtreyi ve kolonu, yıkama başına 1 mL miyelin giderme tamponu kullanarak dört kez durulayın.

Son yıkamadan sonra, akış sitometrisi ile ayırma işlemi için hücreleri boyamak üzere hücreleri santrifüjle çöktürün ve süpernatantları aspire edin. Peletleri dağıtmak için her örneği yaklaşık iki saniye boyunca vorteksleyin ve her tüpten bir mikrolitre hücreyi ayrı tüplere aktarın. Boyama kontrolleri için, boyama kontrolleri de dahil olmak üzere her tüpe derhal beş mikrolitre FC blok ekleyin.

Ardından örnekleri tekrar vorteksleyin ve 4 °C'de inkübe edin. Beş dakika sonra, 100 µL uygun primer antikor kokteyli ekleyin. Antikorları ışık altında korumak için tüplerin üzerini kapatın ve hücreleri 4 °C'de 20 dakika boyunca inkübe edin.

İnkübasyon sonunda, örnekleri iki mililitre yıkama tamponu ile yıkayın, ardından süpernatanları aspire edin ve her örneği 100 mikrolitre uygun sekonder antikor ile etiketleyin. Tüplerin ağzını kapatın ve 15 dakika boyunca dört santigrat derecede bekletin. Ardından örnekleri iki mililitre yıkama tamponu ile yıkayın, örnekleri santrifüjleyin ve son olarak aspire ederek uzaklaştırın.

Süpernatantlar Resus, peletleri 250 µL steril PBS içinde süspande edin ve hücreleri ayırın; burada tek bir erkek hipokampusundan elde edilen nöral hücrelerin temsili akış sitometrisi ile ayrılmış popülasyonları gösterilmektedir; hücreler önce ileri ve yan saçılım özelliklerine göre tüm olası olaylar arasından seçilmiştir. Ardından, bireysel hücre tiplerinin doğru şekilde ayrılmasını sağlamak için tek hücreler veya singletler, boyutlarına göre çiftletlerden veya daha büyük hücre kümelerinden ayrılmıştır; ardından tek hücreler CD 11 B pozitif ve CD 11 B negatif hücre popülasyonlarına ayrılmış, CD 11 B negatif hücreler ise daha sonra GT1 ve TH1 pozitif hücrelere ayrılmıştır. Ayrılan hücrelerin saflığını doğrulamak için, her bir popülasyondaki toplam olay sayısı ve ana popülasyonlara olan yüzdeleri belirlenmek üzere analiz programı kullanılmıştır.

Bu özel örnekte, alternatif hücre tipi spesifik genlerin göreli gen ekspresyonu real-time PCR ile analiz edilmiştir. Beklendiği üzere bu veriler, sıralanan hücrelerin saflığını doğrulamış ve ayrıca incelenen beyin bölgeleri arasında bazı ilgi çekici farklar ortaya koymuştur. Sıralama saflığının doğrulanmasının ardından, ilgilenilen diğer genlerin ekspresyonu, hangi spesifik hücre tipinde eksprese edildiklerini veya ekspresyonlarının tedavi sonrası hücre tipi spesifik bir şekilde değişip değişmediğini belirlemek için ölçülebilir.

Örneğin burada, hipokampus ve serebellumdaki nöronları tanımlamak için sıklıkla kullanılan bir kalsiyum bağlayıcı protein olan cow binding ekspresyonu incelenmiştir. Bu videoyu izledikten sonra, uygun hücre yüzeyi antikorlarını kullanarak burada gösterilen nöral hücre gibi ilgilenilen spesifik nöral hücre tiplerinin nasıl izole edileceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.