Sıçan beyin dokusunda incelemek için THP kullanılarak hücre-tipi-spesifik gen ifadesi

Bu prosedürün genel amacı, sonraki analizler için bireysel nöral hücre tiplerini beyin dokusundan izole etmektir. Bu, önce nöral dokunun tek hücreli bir süspansiyona ayrılmasıyla gerçekleştirilir. İkinci adımda, miyelin süspansiyondan çıkarılır ve daha sonra hücreler, hücre tipine özgü antikorlar için boyanır.

Son adımda, tek tek hücre popülasyonları akış sitometrisi ile sıralanır. Sonuç olarak, bu hücre tipine özgü izolasyon yöntemi, kullanıcıların gen veya protein ekspresyonundaki değişiklikleri veya epigenetik modifikasyonları hücre tipine özgü bir şekilde test etmelerine izin verecektir. Bu yöntem, beyindeki hücre tipine özgü mekanizmaları daha iyi anlayabilmemiz için hangi hücre tiplerinin belirli reseptörleri ifade ettiği, hangilerinin belirli proteinleri ifade ettiği ve hangilerinin belirli epigenetik modifikasyonları ifade ettiği gibi sinirbilim alanındaki temel soruları yanıtlamaya yardımcı olabilir.

Yetişkin beyin dokularından toplanan her numuneyi altı Kuyulu kültür plakasının kapağında 30 ila 400 miligramlık küçük parçalara ayırmak için steril tıraş bıçakları kullanarak nöral ayrışmaya başlayın. Daha sonra dokuyu bir mililitre kalsiyum ve magnezyum içermeyen HBSS'ye daldırın ve tüm dokular toplandığında numuneleri steril iki mililitrelik santrifüj tüplerine aktarmak için bir pipet kullanın. Numuneleri santrifüjleyin ve süpernatanları aspire edin.

1.900 mikrolitre ılık enzim ekleyin. Birini karıştırın ve numuneleri 15 dakika inkübe edin. 37 santigrat derecelik bir su banyosunda, çöken doku parçalarını yeniden süspanse etmek için tüpü her beş dakikada bir birkaç kez ters çevirin.

Kuluçka süresinin sonunda 30 mikrolitre taze hazırlanmış enzim ekleyin. Her numuneye iki tane karıştırın ve tüpleri yavaşça ters çevirin. Ardından, bir etiketli bir haşere pipeti kullanarak, her numuneyi 30 yukarı ve aşağı yinelemeyle ayırın.

Kabarcık oluşturmamaya dikkat edin. Numuneleri her beş dakikada bir ters çevirerek 37 santigrat derecede 15 dakika daha inkübe edin, ardından numunelerin haşere pipeti ile ayrışmasını izleyin. İki numara, az önce gösterildiği gibi.

Ardından üç numaralı pipete geçin, ayrışmayı tekrarlayın ve numuneleri 10 dakika daha inkübe edin. İnkübasyon sonunda her beş dakikada bir inversiyon yapılan su banyosunda, tek hücreli süspansiyonlar 80 mikron hücre süzgeçlerinden geçirilerek 15 mililitrelik Falcon tüplerine filtrelenir. Son numune filtrelendiğinde enzimatik reaksiyonları durdurmak için her süzgeci 10 mililitre kalsiyum ve magnezyum içermeyen HBSS ile yıkayın, tüpleri aşağı doğru döndürün ve miyelini hücreden tüketmek için süpernatanları aspire edin.

Süspansiyonlar, peletleri 400 mikrolitre miyelin uzaklaştırma tamponunda iyice yeniden süspanse eder ve her tüpe uygun miktarda miyelin çıkarma boncuğu ekler. Hücreler ve boncuklar iyice karışana kadar çözeltileri yukarı ve aşağı pipetleyin. Daha sonra numuneyi dört santigrat derecede 15 dakika inkübe edin.

İnkübasyondan sonra, hücreler dönerken her bir numuneyi beş mililitre miyelin uzaklaştırma tamponunda yıkayın, her numune için bir sütunu manyetik bir sıralayıcının manyetik alanına yerleştirin ve her sütunun üzerine temiz bir 80 mikron filtre yerleştirin. Her filtreyi ve sütunu bir mililitre miyelin giderme tamponu ile üç kez durulayın, tüm akışı bir atık kabında toplayın. Son durulamadan sonra, elüatı toplamak için her sütunun hemen altına beş mililitre polistiren yuvarlak tabanlı tüp yerleştirin.

Daha sonra numunelerden süper adlandırılmış olanı aspire edin ve peletleri 500 mikrolitre miyelin giderme tamponunda yeniden süspanse edin. Hücre süspansiyonlarını hemen sütunlara uygulayın ve hücreleri aşağıdaki tüplerde toplayın. Daha sonra her bir filtreyi ve sütunu bir mililitre miyelin uzaklaştırma ile dört kez durulayın, yıkama başına tamponlayın.

Son yıkamadan sonra, hücreleri aşağı doğru döndürün ve hücreleri akış sitometrisi ile sıralamak üzere boyamak için süpernatanları aspire edin. Peletleri ayırmak için her numuneyi yaklaşık iki saniye vorteksleyin ve her tüpten bir mikrolitre hücreyi ayrı tüplere aktarın. Boyama kontrolleri için, boyama kontrolleri de dahil olmak üzere her tüpe hemen beş mikrolitre FC bloğu ekleyin.

Daha sonra numuneleri tekrar girdaplayın ve dört santigrat derecede inkübe edin. Beş dakika sonra, uygun birincil antikor kokteylinden 100 mikrolitre ekleyin. Antikorları ışıktan korumak için tüpleri kapatın ve hücreleri 20 dakika boyunca dört santigrat derecede inkübe edin.

İnkübasyonun sonunda, numuneleri iki mililitre yıkama tamponunda yıkayın, ardından süpernatanları aspire edin ve her numuneyi 100 mikrolitre uygun ikincil antikor ile etiketleyin. Tüpleri örtün ve 15 dakika boyunca dört santigrat dereceye yerleştirin. Daha sonra numuneleri iki mililitre yıkama tamponunda yıkayın, santrifüjleyin ve ardından aspire edin.

Süpernatanlar Resus, peletleri 250 mikrolitre steril PBS'de askıya alır ve hücreleri burada sıralar, temsili akış, tek bir erkek hipokampustan sıralanmış nöral hücre popülasyonları, hücrelerin ileri ve yan saçılma özelliklerine dayalı olarak tüm olası olaylardan önce kapılı olduğu gösterilmiştir. Daha sonra, tek hücreler veya tekiller, tek tek hücre tiplerinin doğru bir şekilde sıralanmasına izin vermek için boyutlarına göre herhangi bir çiftten veya daha büyük hücre kümelerinden geçitlendi, tek hücreler daha sonra CD 11, B pozitif ve CD 11 B negatif hücre popülasyonlarına ayrıldı ve CD 11 B negatif hücrelerin GT bir ve TH bir pozitif hücrelere daha fazla sıralanması. Analiz programı daha sonra, sıralanan hücrelerin saflığını doğrulamak için her bir popülasyondaki toplam olay sayısını ve ana popülasyonların yüzdesini belirlemek için kullanıldı.

Bu özel örnekte, alternatif hücre tipine özgü genlerin nispi gen ekspresyonu gerçek zamanlı PCR ile analiz edildi. Beklendiği gibi, bu veriler sıralanan hücrelerin saflığını doğruladı ve araştırılan beyin bölgeleri arasında bazı ilginç farklılıklar tespit etti. Türdeki saflığın doğrulanmasını takiben, ilgilenilen diğer genlerin ekspresyonu, eksprese edildikleri spesifik hücre tipini belirlemek için ölçülebilir veya hücre tipine özgü bir şekilde tedaviyi takiben ekspresyonlarının değişip değişmediğini belirleyebilir.

Örneğin, burada, hipokampus ve beyincikteki nöronları tanımlamak için sıklıkla kullanılan bir kalsiyum bağlayıcı protein olan bağlanmasının ifadesi araştırıldı. Bu videoyu izledikten sonra, burada gösterilen nöral hücre gibi belirli nöral hücre tiplerini uygun hücre yüzeyi antikorları kullanarak nasıl izole edeceğinizi iyi anlamış olmalısınız.