Zebra balığı Embriyolar kullanılarak Yüksek verim Yaklaşıyor A Manuel Küçük Molekül Ekran

Aşağıdaki deneyin genel amacı, manuel numune işleme kullanarak zebra balığı embriyolarında kimyasal bir tarama yapmaktır. Bu, önce yetişkin zebra balıklarını gece boyunca bir bölücü ile çiftleşme odalarına yerleştirerek ve ardından embriyoları toplamak için ertesi sabah bölücüyü çıkararak elde edilir. Daha sonraki zebra balığı embriyo grupları 96 oyuklu plakaya dizilir ve daha sonra istenen gelişim aşamasında bir ilaçla tedavi edilir.

Daha sonra embriyoların %4 paraldehit ile sabitlenmiş olarak gelişmesine izin verilir ve küçük moleküllerin ilgilenilen gelişim süreci üzerindeki etkilerini ölçmek için tahlil edilir. Sonuçlar, sorgulanan küçük moleküllerin neden olduğu sülfat veya doku morfogenezindeki değişiklikleri gösterebilen gen ekspresyon alanlarının kazanımı veya kaybı gibi gelişimsel değişiklikleri göstermektedir. Bu tekniğin etkileri, potansiyel olarak terapötik bileşikleri tanımlama yeteneği nedeniyle çeşitli hastalıklar için klinik tedaviye doğru uzanır.

Genel olarak, bu tekniğe yeni olan bireyler, embriyolarla çalışmak için gerekli el becerisini edinmeleri gerektiğinden, örneğin onları çok kuyulu plakalar arasında zarar görmeden transfer etmek gibi mücadele edebilirler. Prosedürü göstermek ben ve laboratuvarda lisans araştırmacısı olan Eric Donahue olacak Zebra balığı çiftleşmelerini kurmak için. Bölücülü çiftleşme odaları kullanın, yetişkin erkek zebra balıklarını bölücünün bir tarafına ve yetişkin dişi zebra balıklarını diğer tarafına yerleştirin.

Test edilecek her 96 kuyulu küçük molekül plakası için. 25 çiftleşme tankı kurun ve gece boyunca bırakın. Ertesi gün, her bir balık çiftini ayıran hazneyi çıkarın ve bir saat sonra, embriyoları bir transfer pipeti ile E üç besiyeri içeren Petri kaplarına yerleştirmeden önce toplamak için ince gözenekli bir süzgeç kullanın.

Plakalardaki ve bir stereoskop altındaki kalıntıları temizleyin. Her bir embriyo kavramasını gözlemleyin ve döllenmemiş yumurtaları çıkarın. E üç ortamını boşaltın ve taze E üç ile değiştirin.

Daha sonra her bir embriyo tabağını iki saat boyunca 28,5 santigrat derecelik bir inkübatöre yerleştirin. Plakaları tekrar kontrol edin ve döllenmemiş yumurtaları atın. Embriyoları %40 eely aşamasına kadar inkübe etmeye devam edin.

Kimyasal kitaplık plakasını eksi 80 santigrat dereceden çıkarın. Üzerini örtmek için alüminyum folyo kullanın ve sekiz kanallı bir pipetle oda sıcaklığında çözülmesine izin verin. 96 oyuklu bir plakanın iki ila 12 numaralı sütunlarına 99 mikrolitre E üç ekleyin.

Daha sonra, burada deney numuneleri olarak belirtilen, iki ila 11 numaralı sütunlardaki kuyucuklara uygun bileşiklerden bir mikrolitre ekleyin: Burada sütun 12 olacak şekilde tasarlanmış kontrol sütununa bir mikrolitre DMSO pipetleyin. Seyreltme plakasını kapatmak için alüminyum folyo kullanın ve stok kimyasal kitaplığını dondurucuya geri koyun. Daha sonra,% 40 epi aşamasında embriyolar içeren bir Petri kabı seçtikten sonra, 96'nın iki ila 12 numaralı sütunlarına oyuk başına yaklaşık 10 embriyoyu dikkatlice yerleştirmek için bir transfer pipeti kullanın.

Kuyu plakası. Her bir kuyucuktan fazla E üçünü çıkarmak için bir cam transfer pipeti kullanın ve bir sıvı atık kabına atın. Embriyoları kimyasal olarak tedavi etmek için, her bir kimyasal seyreltmenin 100 mikrolitresini 96 oyuklu plakadan ilgili embriyo kuyucuğuna aktarın ve bir kağıt havluyla nemli bir oda oluşturun ve ışığa duyarlı bir kaba yerleştirin.

96 kuyulu bir plakayı tutacak kadar büyük. Ardından plakayı kapatmak için bir tavan paspası kullanın. Işığa duyarlı kaba koyun ve istenen süre boyunca 28,5 santigrat derecede inkübe edin.

Kimyasalları çıkarmak için, ilaçla tedavi edilen kuyucukların her sırasına 300 mikrolitre E üç ekleyin. Daha sonra, embriyoları sabitlemek için embriyoları üç kez yıkamak için E üçünü kullanmadan önce ortamı çekin, pipeti koyu bir arka planın önüne yerleştirerek dört etiketli 24 oyuklu plakaya aktarın. Pipette kalan embriyoları tanımlamak ve çaprazlamayı önlemek için her kuyu transferinden sonra ölü embriyoları çıkarın.

Embriyolar zar zor sıvıya batırılacak şekilde E üçünü çekin. Ardından, her birine mililitre pronaz başına iki damla 50 miligram eklemek için bir cam pipet kullanın. Corian'ın parçalanmasına neden olmak için kuyuları çalkalamadan önce embriyoları beş dakika boyunca inkübe edin.

Embriyoları iki kez yıkamak için E üçünü kullandıktan sonra, kalan E üçünü çekin ve atın. Her oyuğa% 4 P-F-A-P-B-S ekleyin ve embriyoları gece boyunca dört santigrat derecede inkübe edin. Daha sonra, embriyoları kimyasal ekrandan puanlamak için metin protokolünde belirtildiği gibi bir delik montajı, in situ hibridizasyon veya dilek gibi bir ilgi ekranı gerçekleştirin.

Bu şemada belirtildiği gibi gözlemlemek için bir stereo mikroskop kullanmadan önce bunları etiketli 12 kuyulu plakalara aktarın. Tek bir kişinin, dokuz haftalık özel çaba boyunca yaklaşık 600 bileşik üzerinde kimyasal bir genetik tarama yapması pratiktir ve bu süre üç kişi tarafından gerçekleştirilirse üç haftaya düşürülebilir. Böylece, bir veya birkaç kişinin tezgahta geçirdiği süre, otomatik sistemler gibi yüksek kaynak gerektiren ekipmanlara olan ihtiyacı ortadan kaldırabilir.

Burada gösterildiği gibi, zebra balığı embriyoları, insanların %50'sinden 24 HPF'ye kadar biyoaktif bir kütüphaneden bireysel bileşiklere tabi tutuldu ve daha sonra nefron segmentlerini tespit etmek için üç ribo probundan oluşan bir kokteyl kullanılarak dilek üzerine test edildi. Örnek olarak, derecelendirme sistemi, dramatik bir şekilde genişlemiş proksimal kıvrımlı tübül veya PCT ile sonuçlanan bir bileşik, gözlemlenen fenotipte en ciddi kusur ve en yüksek güven seviyesi ile ilişkili sınıfı temsil eden birinci sınıf olarak kategorize edilecektir. Bileşik daha sonra birinci sınıf PCT olarak açıklanacaktır.

Ayrıca, bu sınıflandırma, organizma üzerindeki etkisinin ciddiyeti, ilacın etkilendiği bölge ve bölgenin etkilenme şekli de dahil olmak üzere, ilgilenilen küçük bir molekülü tanımlamak için basit ve hızlı bir yol sağlar. Bu prosedürü denerken, embriyolarınızı doğru gelişimsel zaman noktasında evrelemeyi unutmamak önemlidir. Bu videoyu izledikten sonra, zebra balığı embriyoları ile manuel bir kimyasal taramanın nasıl yapıldığını iyi anlamış olmalısınız.