Bir taranabilir İn Vivo Transjenik biyolojik olarak ışık veren kullanarak Mitokondriyal Modülatörleri için tahlil Caenorhabditis elegans

Aşağıdaki deneyin genel amacı, model organizmayı kullanarak ilaçların mitokondriyal toksisitesini veya faydalı etkilerini belirlemektir. C zarafet. Bu, yeşil floresan proteine kaynaşmış ateşböceği turpgil enzimini eksprese eden transgenik deniz elgan suşlarında bir TP seviyelerinin in vivo olarak ölçülmesiyle elde edilir.

Füzyon geni, nematodlara iki farklı özellik kazandırır. Birincisi, substrat Lucifer verildiğinde, nematodların hücresel A TP rezervleriyle orantılı olarak görünür aralıkta ışık yaymasıdır. İkincisi ise, uygun dalga boyu ile aydınlatıldıklarında güçlü yeşil floresan sergileyecek olmalarıdır.

Floresan, nematodların a TP seviyelerinden bağımsızdır ve kütleleri veya sayıları ile orantılıdır. Bu nedenle, biyolüminesans ölçümlerini normalleştirmek için kullanılabilir. Tipik bir tahlil sırasında, gelişimsel olarak senkronize edilmiş bir solucan popülasyonu, L dört larva aşamasına kadar büyütülür.

Nematodlar daha sonra hem floresan hem de biyolüminesans ölçümünden önce bir süre boyunca test ilacı bileşikleri ile muamele edilir. Sonuçlar potansiyel ilaç toksisitesini göstermektedir. Biyolüminesans azaldığında, gelişmiş bir sinyal, mitokondriyal fonksiyon üzerindeki yararlı etkiler için daha fazla test için bir isabeti gösterir.

Bu tekniğin, kültürlenmiş hücreler üzerinde ilaç taraması gibi mevcut yöntemlere göre en büyük avantajı, taramanın insanlara %50'ye yakın genetik oftalmolojiye sahip bütün canlı çok hücreli bir organizmanın fizyolojik bağlamında gerçekleştirilmesidir. Ve insanlar gibi, zarafet aslında yetişkinliğe dönüşmek için bir mitokondriyal oksidatif fosforilasyon gerektirir ve mitokondrileri de memeli mitokondrileri ile yapıları, işlevleri, biyoenerjetik özellikleri açısından birçok özelliği paylaşır Protokol içindeki kritik parametreler, maruziyetlerin nematodun maruz kalma süresini başlattığı gelişim aşamasını içerir, İlgilenilen ilaca ve kuyucukların her birine benzer sayıda nematod tohumlanmasına ve tabii ki kontaminasyondan kaçınmaya Birinci gün. Steril koşullar altında, nematodları altı santimetrelik bir nematod büyüme ortamı plakasından iki mililitre S tam ortamında, litre başına 30 gram e coli içeren bir şişeye aktarın.

S tam ortamda OP 50, daha sonra şişeyi dördüncü gün çalkalayarak inkübe edin, yumurtaları hasat etmek ve solucan popülasyonunu senkronize etmek için GR nematod kültürünü ağartın. Daha sonra yumurtaları gece boyunca 15 mililitre S tam ortam içeren bir cam şişede ertesi gün, beşinci gün çalkalanarak kuluçkaya yatırın, nematodlar aynı büyüme aşamasında olacaktır. Her seferinde temiz bir uç kullanarak yumurtadan çıkan solucanların sayısını belirlemek için, üç adet 100 mikrolitrelik nematod alikotunu 900 mikrolitre ortam içeren ayrı mikro tüplere aktarın ve uca yapışan solucanları serbest bırakmak için birkaç kez yukarı ve aşağı pipetleme ile desteklenmiş %0,01 ara 20 pipetleme ile desteklenedin.

Daha sonra, üçlü seyreltme tüplerinin her birinden dört ayrı 10 mikrolitrelik damlacıktaki nematodları sayın ve 10 mikrolitre başına 10 nematod içeren iki adet 20 mililitrelik kültür oluşturmak için gereken nematod süspansiyonunun hacmini hesaplayın, yaklaşık hacimleri iki önceden tartılmış 15 mililitre konik tüpe boşaltın. Dağıtılan gerçek hacmi belirlemek için tüpleri tartın. Ardından hedef hacimleri ayarlamak için hafifçe girdap yapın ve fazla hacmi çıkarın.

Şimdi, nematodları toplam 14 mililitre taze S, tüp başına tam ortam içinde yıkayın ve peletleri litre başına 30 gram equali ile beş mililitre S tam ortamda tekrar askıya alın. OP 50. Nematodları, litre başına 30 gram equali ile tamamlanan 15 mililitre S içeren konik cam şişelere aktarın.

OP 50 şişe başına toplam 20 mililitre hacme kadar ve besleme süresini kaydedin. Kültürlerin 10 mikrolitre başına 10 nematodlara seyreltildiğini doğrulamak için dokuz adet 10 mikrolitrelik damlacıktaki nematod sayısının ortalamasını alın. Kültürleri 42 ila 44 saat boyunca inkübatöre yerleştirin.

Yedinci günde, nematod kültürlerini sürekli yumuşak döndürme ile tek bir şişeye çekin. Daha sonra üç, dört mililitrelik nematod alikotlarını tek bir 60 mililitrelik steril oluğa aktarın. Eloqua'ya sekiz kanallı bir pipet kullanın, 96'ya kadar kuyucuk başına 25 mikrolitre asılı nematod kullanın.

Düz, şeffaf tabanlı siyah mikrotitre plakaları. Ardından kapakları plakalara geri koyun ve plakaları bir kenara koyun. Her iki plaka tohumlandığında, kaybedilen hacmi yerine koymak için oluğa iki adet 2,5 mililitrelik nematod alikotu aktarın.

Nematodlarla 13 ila 14 plaka ekildikten sonra, her bir oyuğa 74 mikrolitre S tam ortam ekleyin ve plakalar çalkalanırken plakaları nemli bir odaya ve ilaç uygulanana kadar çalkalama inkübatörüne aktarın. Test için 2 96 kaynak ilaç plakasını çözün. Ardından çok kanallı bir pipet kullanın ve her seferinde uçları değiştirin.

İlk ilaç plakasının ilk sütunundan bir mikrolitreyi bir nematod plakasının bir ila beşinci sütunlarına aktarın. İlaç plakasının ikinci sütunundan nematod plakasının sekiz ila 12 numaralı sütunlarına başka bir mikrolitre aktarın. Daha sonra nematod plakasının altıncı ve yedinci sütunlarına bir mikrolitre araç ekleyin.

Nematod plakalarının geri kalanını da aynı şekilde tedavi etmek için ilaç plakasındaki kalan sütunları kullanın ve tüm araçlarla tedavi edilen iki plakayı da dahil ettiğinizden emin olun. Daha sonra tüm plakaları, sekizinci günde 20 ila 22 saat daha çalkalama inkübatörindeki nemli odalara geri koyun. Floresan okumaları için bir arka plan kontrol plakası hazırlamak için, kuyu içeriğini tüm araçla işlenmiş bir nematod plakasından birleştirin ve nematodların iki ila üç dakika oturmasına izin verin.

Daha sonra snat içeren bakterileri toplayın ve şeffaf bir tabana sahip siyah bir mikroplakanın her bir oyuğuna 100 mikrolitre numune yükleyin. Plakayı bir mikroskop altında gözlemleyin ve bu kuyucukların floresan arka plan tahmininden hariç tutulmasına izin vermek için nematodların görülebileceği kuyucuklara dikkat edin. Ardından, her bir plaka için biyolüminesansı ölçmek için son olarak floresansı okuyun.

Sırasıyla, her birine 50 mikrolitre taze hazırlanmış lüminesans tamponu dağıtın, plakayı sallanan bir platforma iyice yerleştirin ve zamanlayıcıyı üç dakika sonra başlatın. Lüminesansı ölçüm başına bir saniyede okuyun. Bu ilk temsili deneyde, bir mitokondriyal kompleks olan çürük, bir inhibitör, bir dizi konsantrasyonda hem nispeten kısa hem de daha uzun maruziyetlerden sonra nematodların ışık çıkışını azalttı.

Bu deneyde, herbisit parakuatının, C suşu PE 2 54'ün biyolüminesans GFP floresansını ve normalleştirilmiş biyolüminesansını önemli ölçüde azalttığı gösterilmiştir. Ayrıca, biyolüminesans düşüşü, azalmış mitokondriyal fonksiyonun bilinen etkileri ile tutarlı olarak floresandan daha büyüktü ve ilacın ortaya çıkardığı bir TP üretimini azalttı. Bu grafik, nematod biyolüminesansını, sitrik asit döngüsü ara ürünü oksaloasetatı sekiz milimolar tek bir konsantrasyonda artıran bir bileşik örneğini göstermektedir.

Bu yineleme çalışmaları arasında görülen deneysel değişkenliğin Lucifer tabanlı deneyler için olağandışı olmadığını unutmayın. Burada, Firefly lusiferaz inhibitör bileşiklerinin, DDD bileşiği tarafından aktivitenin neredeyse tamamen zayıflaması ile 25 mikromolar ve 100 mikromolar'da in vitro lusifer aktivitesini etkilediği gözlenmiştir. 1, 4 3 4, doğrudan karşılaştırılabilir olmasa da, in vivo olarak Lucifer inhibitör bileşik tedavisinden sonra biyolüminesansta önemli bir azalma gözlenmiştir.

Biyolüminesanstaki değişikliklerin, in vivo A TP seviyelerindeki değişikliklerden ziyade Lucifer enzim inhibitörlerinin etkisinden kaynaklanabileceğini göstermek. Bu prosedürü gerçekleştirirken, bileşiklerin solucanın enerji durumunu etkilemekten ziyade ateşböceği lusiferaz enziminin aktivitesini doğrudan etkileyebileceğini göz önünde bulundurmak önemlidir. Ve bu nedenle, alt ısılar, mitokondriyal fonksiyonu değerlendirmek için, örneğin oksijen tüketiminin belirlenmesi, reaktif oksijen türlerinin mitokondriyal membran potansiyelinin belirlenmesi veya deniz zarifliği suşlarında mitokondrinin görselleştirilmesi gibi birçok teknik kullanılarak doğrulanabilir.

GFP etiketi ile mitokondri.