Name: Çok renkli Floresan Reporter Fare kullanma Kornea Hücre Lineage İzleme Bir Yöntem (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-12-18T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 48 s
Description: Öğrenin kornea epitel hücre soy izleme yöntemini R26R-Confetti fare modeli kullanarak. Bu teknik kök hücre göçünü ve rejenerasyon dinamiklerini invaziv olmayan şekilde izlemenizi sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

RSF, Avrupa Birliği'nin - Yedinci Çerçeve Programından (FP7/2007-2013]) 618432 n° – MC—Epi-Patho-Stem hibe sözleşmesi kapsamında ve İsrail Bilim Vakfı (218/14) tarafından fon almıştır.

Etik Beyanı: Bu çalışmada hayvan bakımı ve kullanımında Oftalmik ve Vizyon Araştırma Hayvanların Kullanım ARVO tablosuna conformed bulundu. Tüm deneyler, yerel etik kurul tarafından onaylanmıştır. Fare ve Strain ifade bir Uygun Cre-recombinase seçin 1. <ol><li> Araştırılması için satın alma 26 ve hedeflenen dokuya bağlı olarak kullanılabilir Cre transgenik hatların çok çeşitli dışında, Cre rekombinaz gen, ilgi konusu doku için spesifik olan bir promoter tarafından kontrol edildiği bir transjenik fare suşu Cre seçin. Olgu zamansal kontrol gereklidir ise, indüklenebilir Cre satırını seçin. Not: Biz özellikle limbal ve kornea epitel kök / progenitör hücreler 24 etiket tamoksifen indüklenebilir K14-Cre ERT transgen seçti. Di Girolamo ve arkadaşları onların K1 için kornea ifade ile limbal özgüllük bildirdiği gibi, suşları arasında farklılıklar olabileceğini unutmayın4-Cre ERT 22. Indüklenebilir transgenik fareler Cre kullanarak bir avantajı çok yönlü zaman dilimlerinde de izleme soy uyarılmasını izin vermesidir. </li></ol> 2. Uygun Br Fare Gerinim seçin <ol><li> Araştırma sorusu ve mevcut Cre hat 16,18,20 bağlı olarak uygun Br kasetini seçin. <ol><li> Olmayan bir uyarılabilir Cre fare suşu kullanıldığında, sürekli bir DNA inversiyon / eksizyon izin ve böylece 16 (örneğin Br1.0 ya Br1.1 için) kör uçlu ürünlere neden olmayan bir Br kaseti seçin. </li></ol></li></ol> 3. İlgi Transgenik Hatları Çapraz <ol><li> Burada gösterilen protokolü için, hemizigot Yavrularda elde etmek için homozigot Cre ERT suşu (Cre ERT / Cre ERT) ile homozigot R26R-Konfeti zorlanma (Br2.1 / Br2.1) çapraz (Br2.1 / +; Cre / +) mono-allelik hepsi tek bir Br2.1 alel ihtiva olarak izleme soy ve hazır olduklarınıTek Cre alel. Not: bir iki Cre allel (Br2.1 / +; Cre / Cre) içerebilir fareler yaratacaktır etiketleme verimliliğini artırmak için, süre iki Br2.1 aleli (Br2.1 / Br2.1; Cre / +) olur (22 ayrıntılı olarak) renk kombinasyonları artar. </li></ol> 4. kre-rekombinazı İndüksiyon Not: Bu deneylerde Tamoksifen uygulanması limbal ve korneal bazal K14 pozitif kök / progenitor çekirdeği içine Cre rekombinazın ERT translokasyonunu teşvik etmek için, 3-4 günlük bir süre için, günlük intraperitoneal enjeksiyon ile gerçekleştirilmiştir epitel hücreleri. Aşağıdaki protokol dört fareden enjeksiyonu için kullanılabilir. Alternatif olarak, oküler yüzeye Tamoksifen topikal uygulama daha yüksek verim verir. Tamoksifen Çözelti bir haftaya kadar 4 ° C&#39;de karanlıkta muhafaza edilebilir. Kullanmadan önce çözüm ısıtın. <ol><li> Tamoksifen 100 mg tartılır ve mısır yağı, 5 ml kadar içeri çözülür20 mg / ml tamoksifen çözelti oluşturmak. </li><li> Intraperitonal 3-4 ardışık gün boyunca 8 haftalık farelere Tamoksifen (4 mg) çözeltisi 200 ul enjekte edilir. Not: Tamoksifen çözeltisi bir haftaya kadar 4 ° C&#39;de karanlıkta muhafaza edilebilir. Kullanmadan önce çözüm ısıtın. </li><li> Topikal uygulama için: Tamoksifen 60 mg ağırlığında ve 60 mg / ml tamoksifen çözelti oluşturmak için mısır yağı, 1 ml içinde çözülür. Vorteks ve 65 ° C&#39;de muhafaza edilen bir sallanan sulu banyo içindeki çözümü ayarlamak ° C kullanımda kadar banyosunda açık bırakın onu oluncaya kadar. <ol><li> Dikkatle fare her göz yüzeyine Tamoksifen çözeltisi 100 ul uygulayın. </li></ol></li></ol> Görüntüleme için 5. Doku Hazırlanması <ol><li> Izofluran kullanarak Kurban hayvanlar Tamoksifen enjeksiyonu ve col aşağıdaki uygun zaman noktalarında CO 2 inhalasyon ardından anestezi (refleksleri eksikliği tarafından uygun anesthetization onaylayın) (% 2 oksijen buharlaşmış)İlgili doku Öğr. <ol><li> Bu deneyler için, aşağıdaki zaman noktalarında, gözler enükleasyonu: 1, 4, 8, 12 ve 16 hafta sonra Tamoksifen enjeksiyon. Kavisli bir forseps kullanarak enükleasyon ulaşmak. Göz küresi, göz soket dışına pop neden göz kapaklarını basın. Optik siniri tutan göz küresi arkasında forseps yerleştirin. Yavaşça göz küresi çekin ve çıkartın. Not: Aşağıda tarif edildiği gibi, bu aşamada, dokular işaretli hücrelerin wholemount analiz için hazırlanabilir. Normal dondurulmuş doku bölümleri de PFA sabit ve aşağıda tarif edildiği gibi (bakınız bölüm 6 ve 22) görüntülü hazırlanabilir. </li></ol></li><li> PBS ile doldurulmuş bir 60 mm çanak her göze yerleştirin. </li><li> Stereo-mikroskop altında kullanarak forseps aşağı bakacak kornea ile optik sinir yakınında göz tutun ve optik sinir, kas ve bağ dokusu kaldırmak ve gözün arka kısmında küçük bir kesi yapmak için bir neşter kullanabilirsiniz. </li><li> Yaylı makas kullanma dikkatle büyütmekObjektif dışarı pop ve forseps kullanarak iris kaldırmak icar kesti. </li><li> Bir neşter kullanılarak çevreye doğru merkezden başlayarak 4-5 radyal kesiler yaparak kornea düzleştirin. </li><li> Limbusun ötesinde aşırı periferik dokuyu kesmek için bir neşter kullanın. </li><li> Daha sonra kısa bir süre PBS ile yıkayın, 10 dakika boyunca% 4 PFA korneaları sabitleyin. </li><li> 10 dakika boyunca DAPI ile inkübe örnekleri ve kısaca PBS ile yıkayın. </li><li> Epitel tarafı yukarı bakacak şekilde cam slaytlar Dağı kornealar. Bir kapak camı ile kornea ve kapağın üstüne montaj medya bir damla yerleştirin. Slaytlar RT O / N kurumasını bekleyin. 4 ° C &#39;de slaytlar tutun. </li></ol> 6. Konfokal Mikroskopi ve Görüntüleme Analizi <ol><li> YFP / GFP / OBP emisyonlarının ayrılmasını sağlayan bir spektral konfokal sistemi kullanın. Set flüoresan uyarma ve Br&#39;dir kasetinin floresan proteinleri bağlı olarak emisyon dalga boylarında. Minimize haç amaçlayan her protein için en uygun dalgaboyu seçinuyarım. Farklı protein gelen sinyallerin sızıntısı en aza indirmek için, dar emisyon aralıkları seçin. <ol><li> Br2.1 kaset için bir başlangıç ​​noktası olarak floresan uyarma (eski) ve emisyon (em) arasında kurulan aşağıdaki kullanın: - CFP ex 405 nm / em 420-480 nm - DAPI ex 458 nm / em 470-500 nm, GFP - ex 488 nm / em 497-508 nm, YFP - ex 514 nm / em 529-540 nm ve RFP - ex 561 nm / em 575-615 nm. </li></ol></li><li> Yüksek çözünürlüklü geniş doku alanları görselleştirmek için, kiremit görüntüleme kazanır. Yani Şekil 2A-B, görüntünün 12 x 12 görüntülerin bir dizi alarak tüm kornea, gösterilen sonuçlar için, her alanda 4 floresan kanalları kullanarak 144 alanları (512 x 512) kazanır. Toplamda 576 görüntüleri toplamak ve daha sonra birleştirme. </li><li> Farklı derinliklerde ve doku yapılarına etiketlenmiş hücrelerin lokalizasyonu keşfetmek için, farklı ilgi bölgelerin Z-yığını görüntüler elde. Sipariş to görüntü korneanın tam derinliği, 3 mikron aralıklarla 8 optik bölümleri kazanır. Maksimum şiddeti göre resim çıkıntılar olarak da toplanmıştır bölümlerin Ortogonal incelemeler geleneksel görüntüleme yazılımları 24 kullanılarak inşa edilebilir. </li></ol> Tamoksifen İndüksiyon 7. Kornea Yaralanma Kombine <ol><li> Izofluran ile fareler (oksijen buharlaşmış% 2) anestezisi ve yönetimi analjezikler (10 mg / kg Carpofen, deri altından enjekte). Ayak tutam yanıtsızlık tarafından uygun anesthetization onaylayın. </li><li> Tamoksifen tozu, 1 g tartılır ve 200 mg / ml konsantrasyon solüsyonu elde etmek için, steril DMSO, 5 ml içinde çözülür. </li><li> Çözelti berrak hale gelinceye kadar bir su banyosu içinde 65 ° C&#39;ye kadar Tamoksifen çözeltisi ısıtın. Kullanılıncaya kadar banyosunda çözüm tutun. </li><li> Anestezi sırasında su kaybını önlemek için tedavi edilmeyen kontralateral göze göz merhemi sürün. Yeterli con kazanmış olan gözetimsiz kadar bir hayvan bırakmayınsternal yatma korumak için bilinç. Tamamen iyileşene kadar diğer farelerin şirkete yaralama göz geçirmiş fareler iade etmeyin. Fareler yakın yaralanmadan sonra izlenmelidir. Onların vücut ağırlığının% 10&#39;undan fazlasını kaybetmek durumda, kornea erozyonu veya rahatsızlık muzdarip, deney durdurulmalıdır. Tekrarlama analjezikler idaresi bütün deney boyunca her 24 saatte. </li><li> Buna bağlı bir iğne olmadan Steril bir şırıngayı kullanarak, topikal her fare tek gözün tüm kornea yüzeyinde 200 ul Tamoksifen çözümü uygulayın. Not: Sıvı çözelti, oda sıcaklığında göz yüzeyine hızlı bir şekilde katılaşır. Kornea hasarı etkisi yara şiddetine bağlıdır. Tamoksifen / DMSO çözeltisi bir uygulamasında sonra hiçbir yan etki farelerde gözlenmiştir. Tekrarlı uygulamalar durumunda kornea opasitesi gözlenebilir. </li><li> Mezhep (bkz doku hazırlama ve görüntüleme ile devamiyonlar 5 ve ilgili zaman noktalarında 6). Bir hafta sonrası yaralama (Şekil 2 ve 24) (evre 5.1 ayrıntılı olarak) Burada gösterilen sonuçlar, fareler kurban için. </li></ol>

<ol><li>Buckingham, M. E., Meilhac, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tracing+cells+for+tracking+cell+lineage+and+clonal+behavior%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">Tracing cells for tracking cell lineage and clonal behavior.</a> Dev Cell. 21, 394-409 (2011).</li>
<li>Kretzschmar, K., Watt, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lineage+tracing%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Lineage tracing.</a> Cell. 148, 33-45 (2012).</li>
<li>Blanpain, C., Simons, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unravelling+stem+cell+dynamics+by+lineage+tracing%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Unravelling stem cell dynamics by lineage tracing.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 14, 489-502 (2013).</li>
<li>Beck, B., Blanpain, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unravelling+cancer+stem+cell+potential%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Cancer%22%5BJournal%5D)">Unravelling cancer stem cell potential.</a> Nat Rev Cancer. 13, 727-738 (2013).</li>
<li>Serbedzija, G. N., Bronner-Fraser, M., Fraser, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+vital+dye+analysis+of+the+timing+and+pathways+of+avian+trunk+neural+crest+cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">A vital dye analysis of the timing and pathways of avian trunk neural crest cell migration.</a> Development. 106, 809-816 (1989).</li>
<li>Eagleson, G. W., Harris, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+of+the+presumptive+brain+regions+in+the+neural+plate+of+Xenopus+laevis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Mapping of the presumptive brain regions in the neural plate of Xenopus laevis.</a> J Neurobiol. 21, 427-440 (1990).</li>
<li>Cotsarelis, G., Cheng, S. Z., Dong, G., Sun, T. T., Lavker, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Existence+of+slow-cycling+limbal+epithelial+basal+cells+that+can+be+preferentially+stimulated+to+proliferate%3A+implications+on+epithelial+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Existence of slow-cycling limbal epithelial basal cells that can be preferentially stimulated to proliferate: implications on epithelial stem cells.</a> Cell. 57, 201-209 (1989).</li>
<li>Zhang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+the+haematopoietic+stem+cell+niche+and+control+of+the+niche+size%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Identification of the haematopoietic stem cell niche and control of the niche size.</a> Nature. 425, 836-841 (2003).</li>
<li>Snippert, H. J., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tracking+adult+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Rep%22%5BJournal%5D)">Tracking adult stem cells.</a> EMBO Rep. 12, 113-122 (2011).</li>
<li>Snippert, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lgr6+marks+stem+cells+in+the+hair+follicle+that+generate+all+cell+lineages+of+the+skin%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Lgr6 marks stem cells in the hair follicle that generate all cell lineages of the skin.</a> Science. 327, 1385-1389 (2010).</li>
<li>Morris, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Capturing+and+profiling+adult+hair+follicle+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Capturing and profiling adult hair follicle stem cells.</a> Nat Biotechnol. 22, 411-417 (2004).</li>
<li>Barker, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lgr5%28%2Bve%29+stem+cells+drive+self-renewal+in+the+stomach+and+build+long-lived+gastric+units+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Lgr5(+ve) stem cells drive self-renewal in the stomach and build long-lived gastric units in vitro.</a> Cell Stem Cell. 6, 25-36 (2010).</li>
<li>Jaks, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lgr5+marks+cycling%2C+yet+long-lived%2C+hair+follicle+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Lgr5 marks cycling, yet long-lived, hair follicle stem cells.</a> Nat Genet. 40, 1291-1299 (2008).</li>
<li>Rinkevich, Y., Lindau, P., Ueno, H., Longaker, M. T., Weissman, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Germ-layer+and+lineage-restricted+stem%2Fprogenitors+regenerate+the+mouse+digit+tip%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Germ-layer and lineage-restricted stem/progenitors regenerate the mouse digit tip.</a> Nature. 476, 409-413 (2011).</li>
<li>Rios, A. C., Fu, N. Y., Lindeman, G. J., Visvader, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+identification+of+bipotent+stem+cells+in+the+mammary+gland%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">In situ identification of bipotent stem cells in the mammary gland.</a> Nature. 506, 322-327 (2014).</li>
<li>Livet, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgenic+strategies+for+combinatorial+expression+of+fluorescent+proteins+in+the+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Transgenic strategies for combinatorial expression of fluorescent proteins in the nervous system.</a> Nature. 450, 56-62 (2007).</li>
<li>Tao, J., Polumbo, C., Reidy, K., Sweetwyne, M., Susztak, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+multicolor+podocyte+reporter+highlights+heterogeneous+podocyte+changes+in+focal+segmental+glomerulosclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Kidney+Int%22%5BJournal%5D)">A multicolor podocyte reporter highlights heterogeneous podocyte changes in focal segmental glomerulosclerosis.</a> Kidney Int. 85, 972-980 (2014).</li>
<li>Weissman, T. A., Sanes, J. R., Lichtman, J. W., Livet, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generating+and+imaging+multicolor+Brainbow+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Protoc%22%5BJournal%5D)">Generating and imaging multicolor Brainbow mice.</a> Cold Spring Harb Protoc. , 763-769 (2011).</li>
<li>Weissman, T. A., Pan, Y. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brainbow%3A+new+resources+and+emerging+biological+applications+for+multicolor+genetic+labeling+and+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Brainbow: new resources and emerging biological applications for multicolor genetic labeling and analysis.</a> Genetics. 199, 293-306 (2015).</li>
<li>Cai, D., Cohen, K. B., Luo, T., Lichtman, J. W., Sanes, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+tools+for+the+Brainbow+toolbox%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Improved tools for the Brainbow toolbox.</a> Nat Methods. 10, 540-547 (2013).</li>
<li>Snippert, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intestinal+crypt+homeostasis+results+from+neutral+competition+between+symmetrically+dividing+Lgr5+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Intestinal crypt homeostasis results from neutral competition between symmetrically dividing Lgr5 stem cells.</a> Cell. 143, 134-144 (2010).</li>
<li>Di Girolamo, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tracing+the+fate+of+limbal+epithelial+progenitor+cells+in+the+murine+cornea%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Tracing the fate of limbal epithelial progenitor cells in the murine cornea.</a> Stem Cells. 33, 157-169 (2015).</li>
<li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Paneth+cells+constitute+the+niche+for+Lgr5+stem+cells+in+intestinal+crypts%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Paneth cells constitute the niche for Lgr5 stem cells in intestinal crypts.</a> Nature. 469, 415-418 (2011).</li>
<li>Amitai-Lange, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lineage+tracing+of+stem+and+progenitor+cells+of+the+murine+corneal+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Lineage tracing of stem and progenitor cells of the murine corneal epithelium.</a> Stem Cells. 33, 230-239 (2015).</li>
<li>Schepers, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lineage+tracing+reveals+Lgr5%2B+stem+cell+activity+in+mouse+intestinal+adenomas%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Lineage tracing reveals Lgr5+ stem cell activity in mouse intestinal adenomas.</a> Science. 337, 730-735 (2012).</li>
<li>Feil, S., Valtcheva, N., Feil, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inducible+Cre+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Inducible Cre mice.</a> Methods Mol Biol. 530, 343-363 (2009).</li>
<li>Collinson, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clonal+analysis+of+patterns+of+growth%2C+stem+cell+activity%2C+and+cell+movement+during+the+development+and+maintenance+of+the+murine+corneal+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dyn%22%5BJournal%5D)">Clonal analysis of patterns of growth, stem cell activity, and cell movement during the development and maintenance of the murine corneal epithelium.</a> Dev Dyn. 224, 432-440 (2002).</li>
<li>Buck, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+centripetal+migration+of+normal+corneal+epithelial+cells+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Measurement of centripetal migration of normal corneal epithelial cells in the mouse.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 26, 1296-1299 (1985).</li>
<li>Nagasaki, T., Zhao, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Centripetal+movement+of+corneal+epithelial+cells+in+the+normal+adult+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Centripetal movement of corneal epithelial cells in the normal adult mouse.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 44, 558-566 (2003).</li>
<li>Majo, F., Rochat, A., Nicolas, M., Jaoude, G. A., Barrandon, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oligopotent+stem+cells+are+distributed+throughout+the+mammalian+ocular+surface%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Oligopotent stem cells are distributed throughout the mammalian ocular surface.</a> Nature. 456, 250-254 (2008).</li>
<li>Pan, Y. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrabow%3A+multispectral+cell+labeling+for+cell+tracing+and+lineage+analysis+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Zebrabow: multispectral cell labeling for cell tracing and lineage analysis in zebrafish.</a> Development. 140, 2835-2846 (2013).</li>
<li>Chung, K., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CLARITY+for+mapping+the+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">CLARITY for mapping the nervous system.</a> Nat Methods. 10, 508-513 (2013).</li>
<li>Tomer, R., Ye, L., Hsueh, B., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advanced+CLARITY+for+rapid+and+high-resolution+imaging+of+intact+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Advanced CLARITY for rapid and high-resolution imaging of intact tissues.</a> Nat Protoc. 9, 1682-1697 (2014).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

Köken izleme deneyler yıllardır gerçekleştirilmiştir. Son teknolojik gelişmeler ve Confetti fare suşlarının ortaya çıkması araştırma için yeni yollar açtı. Günümüzde, ticari olarak temin edilebilen araştırmacılar dokuya-özgü Cre hatları nakavt fareler ve transjenik farelerin çok sayıda yararlanabilir. Bu sağlam ve güvenilir veri sağlarken, zahmetli uygulama kaçınarak, temel uzmanlık bilimsel sorulara yanıt için çok yönlü deneysel sistemler tasarlamak için bir fırsat sağlar. R26R-Konfeti fareler verimli izleme ve canlı bir organizmada hücrelerin yapısını ve davranışlarını incelemek için şık bir araçtır. Sistem kurmak kolaydır ve, embriyogenez sırasında tek hücre non-invaziv soy izleme izin verir kök hücre yenilenmesini homeostazında altında, ya da yaralanma, enflamasyon ve kanser gibi farklı koşullarda. Elde veriler sağlam descript sağlarölçülebilir bir şekilde hedeflenen hücrelerin konumunun, klonal hücre genişlemesi ve hücre göçü hayatta kalma, iyonu. Bir kritik bir adım güvenilir bir kesin gelişim aşamasında etkin doku spesifik etiketleme izin verebilir uygun genetik fare zorlanma seçmek olacaktır. Bu sistemin bir sınırlama canlı bir organizmaya izlenmesi için, doku erişilebilir ve şeffaf olmasıdır. Benzer şekilde, bir canlı hayvan içinde kalın bir doku izlemenin yalnızca iki foton veya çoklu foton mikroskobu ile kolaylaştırılabilir. Ancak, hücre izleme postmortem doku bölümleri mevcuttur ve CLARITY yöntemiyle 32,33 ile şeffaf olmak dönüştürülmüştür sonra belki sağlam doku incelenebilir. Dikkate alınması gereken bir başka sınırlama, aynı fluorofor ifade komşu hücreler, büyük olasılıkla aynı klonal soy ait olsa da, bu rastgele kişi aynı flüoresan gen ifade bağımsız hücre kökenli türetilebilir da mümkündür olmasıdır. Bu possibiliÇok sayıda renk kombinasyonları izin birden Br allelleri kullanırken ty çok olası hale gelir. Gelecekte, genlerin ve sağlık ve patoloji kendi mutasyonların çalışma izin verecektir mevcut genetik araçlar (yani, nakavt, knockin ve transgenik fare modelleri) ile Confetti sistemini birleştirerek. Aynı şekilde, soy hücre kaderinin kararları sinyal yolları katılımı üzerine yeni anlayışlar getirecektir farklı sistem pertürbasyonlar (yani, hücre yıkımını niş, lazer aracılı hücre ablasyon, ilaç tedavisi kök) kapsamında izleme. Sonuçta, floresan ve biyoışıldama etiketleme kombinasyon kullanımı, kenar mikroskopi sinyal yollarının ve kesme genetik gazetecilere araştırmacılara onların kendi doğal ortamında çevredeki nasıl tepki tek hücre öğrenmek için sağlam bir sistem sağlayacaktır.

Embriyo gelişimi sırasında, doku ve organ morfogenez hücre proliferasyonu, hücre göçü ve soy tarifnamede 1-4 cinsinden tanımlanabilir kesin bir program sayesinde yer almaktadır. Bu biyolojik süreçler de hücre yenilenmesini kök gerektirir yetişkin doku homeostazını, muhafaza katılmaktadırlar. Lineage izleme, kimlik ve hücre popülasyonunun belirli bir tip soyu takibi, embriyojenezi okuyan ve hücre homeostazı kök için önemli bir araç sunmaktadır. Gerçekten de, giderek araştırmanın pek çok alanında kullanılmaktadır. Özellikle, soy izleme homeostasis ve kanser gelişiminde kökeni ve kök hücrelerin kaderini belirlemede önemli bir araç haline geldi. Hücre izolasyonu ve in vitro kültürü veya transplantati içinde aksine minimal deneysel müdahale ile hücre sağlam doku veya organizmanın bağlamında nasıl davranacağını hakkında önemli bilgiler sağlayabilir Bunun nedeniBu istenmeyen önyargı neden olabilir. Geleneksel olarak, hücrelerin plazma zarına dahil, lipid çözünür karbosiyanin boya olarak, soy izleme için kullanıldı. Deneylerde bu tür başarılı gelişim biyolojisi 5,6 önemli keşifler ve şekilli seminal kavramlara yol açmıştır rağmen, hedeflenen hücrelerin özgünlüğünü kontrol etmek için zorluk, hücre davranışı üzerindeki boyanın istenmeyen etkisi ve seyreltme dahil bazı sınırlamalar var zaman etiketi. Nükleotid analog etiketleme yaklaşımları muhtemelen kök hücreleri 7,8 sakin koşullarda uygun &quot;etiket istinat hücreler&quot; yavaş bisiklet varlığını belgeleyen sağlamıştır. Bu tekniğin sınırlı bir süre boyunca çoğalma kinetiği dayalı yavaş bisiklet hücrelerinin varlığını göstermek olabilir Bununla birlikte, bu kök hücrelerin işlevselliğini ilgili önemli anlayışlar temin edemedik. Optimal soy izleme metduğu işaretli hücrenin kendi döl veya komşularının özelliklerine etiketleme etkisini en aza indirmek gerekir. Ayrıca, bir sahne ve zamana bağlı bir şekilde de yanı sıra tek bir hücre (klonal) şekilde ilgi hücre popülasyonu etiketlemek yeteneğine sahip, yani etiketleme indüksiyon kontrole sahip yararlı olacaktır. Etiket zamanla muhafaza ve komşu hücrelere transfer değil olacağını, böylece kurucu hücrenin tüm soyu aktarılır İstikrarlı ve geri dönüşümsüz etiketleme yöntemi çok önemlidir. Daha yakın zamanlarda, hücre etiketleme genetik yaklaşımlar geliştirilmiştir. Bu sistemlerde, hücre spesifik promotörler, yeşil fluoresan protein ya da Β-galaktosidaz raportör genler gibi muhabir 9-13 genlerinin ifadesinin loxP-çevrili barikat çıkarın ve izin vermek için, Cre rekombinazın ifadesinin tetiklemek için kullanılabilir. Bu yaklaşım, sadece hücreler ve onların döl takibini mümkün kılan, aynı zamanda hücre izinolation ve moleküler karakterizasyonu. Tek hücre düzeyinde hücre takibi, tek bir floresan haberci genin ifadesinin indüksiyonu yoluyla mümkün hale geldi. Bu sistemin önemli bir sınırlama hücrelerinin çok düşük bir yüzde, ayrı ve tek tek klonlar izlemek mümkündür etiketli tek bir gerçektir. Renkli gazetecilere kullanılabilecek bu sınırlamayı aşmak için. Renkli etiketleme kullanırken, aynı niş komşu hücrelerin diferansiyel kaderin izleme verimli 14-17 elde edilebilir. Son zamanlarda, Brainbow (Br) alel çeşitli Cre / lox sistemi kullanılarak birden çok flüoresan raportör genlerin stokastik ifadesine imkan tanır, soy izleme deneyleri için geliştirilmiştir. Cre / lox sistemi algılar ve loxP sitelerinin gibi özel DNA dizilerine bağlanan Cre rekombinaz enzimin oluşur. Aşağıdaki Cre rekombinazın bağlanması site spesifik rekombinasyon oluşur loxP çıkarılması çevrili dizileri yolaçan neden olanFarklı floresan proteinleri rastgele ifadedeki g (mekanizması, aşağıda tarif edilmiştir) hazırlandı. Br hatlarının çeşitli (Değerlendirmeler 16,18,19 bakınız) kullanım için mevcuttur. Br suşları arasında büyük farklar 2 (Br 2,0), 3 (Br1.0) 4 (Br1.1, Br2.1) flüoresan genler arasında değişen, kaset dahil flüoresan genlerin sayısı (i) farklılıklar, , (ii) karşılıklı yönlendirilmiş lox mevkisi varlığı kullanılan lox mevkisi (iii) tipi, ve (iv) sentezleme veya floresan gen ekspresyonunun sessizlik önce Cre aktivasyonuna gen inversiyon (Br2.0-2.1) izin vermek. Yeni kurulan Br3 nöronların renkli görüntüleme için geliştirilmiş bir yöntem sunmaktadır. Bu transkript ana özelliklerinden biri en iyi nöronal eşit bir boyama 20 süreçleri sağlayan ışığa farnesillenmiş floresan proteinleri, bir dizi yeni içermesidir. Önemlisi, Br kasetlerinin farklı sürümleri Thy1 pr nöronal özgü içerebiliromoter veya ubiquitously CAG (CMV) promoteri dile getirdi. Br transgenik farelerin bazıları tek Br transgen içerebilirken Son olarak, diğerleri, böylece, her hücrede eksprese edilecek renk kombinasyonları olasılıklarının muazzam sayıda üretilmesini sağlayan, birden fazla transgen kopya içerebilir (örneğin 16). Çalışmamızda, biz Br 2.1 kaset 21 içeren R26R-Konfeti fare kullanıldı. Br2.1 benzersiz Cre-aracılı DNA inversiyon nedeniyle loxP sitelerinin (Şekil 1) karşılıklı doğrultuda değil, sadece eksizyon izin verecek şekilde tasarlanmıştır. Böylece, renk değişikliğine yol bu inversiyon / eksizyon olayları sürece Cre 16 mevcut olduğu gibi devam edebilirsiniz. Bu nedenle, bir indüklenebilir zamansal Cre sentezleme sistemi güvenilir hücre izleme Br2.1 kullanmak için gereklidir. Şekilde gösterildiği gibi,. 1, Br2.1 loxP-çevrili Neo R -casse ardından her yerde bulunan bir CAG promotörünü içerirbir transkripsiyon birlikte gösterim olarak hareket tte, iki tandem konumlandırılmış san bir yeşil için 4 flüoresan raportör genlerin kodlama (GFP), (YFP), kırmızı (RFP) ve mavi (CFP) floresan proteinleri takip eder. Resim floresans Cre aktivasyonu öncesinde ifade edilir. Cre rekombinazın indüksiyonu, belirli bir hücre içinde 4 floresan proteinleri bir rastgele ekspresyonunu sağlayan Neo-R kasetinin giderilmesini de sağlar. İkinci bölüm loxP-çevrili RFP ve ters CFP içerirken ilk parça, loxP-çevrili GFP ve ters YFP içerir. Bu DNA segmentleri sürekli sürece, Cre rekombinaz mevcut olduğu, (ters yönlenmede olduğunda loxP kullanılarak) ters veya çıkarılabilir. Bu nedenle, geçici ve kontrollü Cre transgen kullanılmalıdır. YFP ekspresyonunu ve RFP sitoplazmiktir, GFP, nükleer ve CFP hücre membranına bağlanır: Br2.1 kaseti sinyal konumuna bağlı örtüşen emisyonlar arasında ayırt etmeye yönelik mükemmel bir sistem sağlar. GFPve RFP emisyon kolayca geleneksel fluoresan mikroskobu ile ayrılır. YFP / GFP / CFP emisyon ayırmak amacıyla, bir spektral konfokal görüntüleme sistemi gereklidir. Toplamda, Br2.1 kaset hedeflenen her hücrede dört takım farklı floresan genlerin rastgele indüklenebilir ve doku spesifik ifadesini verir. Renk kombinasyonları daha büyük bir sayı gerektiğinde Aslında, bir bu şekilde her hücre için 2 renkli etiketleri sentezlenmesi ve 10 olası renk kombinasyonların sayısını artırmak sonuçlanan Br2.1 2 alellerini içeren homozigot fareler üretebilir Kasetin birden çok kopyası genomları 16 entegre çünkü 22. Br fare suşlarının bazı olası renk kombinasyonları çok daha büyük bir sayısının ifadesini mümkün kılar. Bununla birlikte, çoğu durumda, tek bir Br2.1 alel tarafından temin edilen, dört renk kombinasyonları yeterlidir. Burada sağlanan protokol izlenerek, tek bir spectr nispeten basit bir düzeneği kullanılarak, bu yöntem kurabilirKalibrasyon için çok az, eğer herhangi bir ihtiyacı ile al mikroskopi. Burada korneal epitelyumun soyu takip deneyler için, tek bir Br2.1 alel ihtiva R26R-Konfeti farelerin kullanım için uyarlanabilir bir protokol sağlar. Bu transgenik fare suşu kolon 21,23 ve kornea epitel kök hücrelerin 22,24 kökeni ve kaderi çalışmak için kullanılır olmuştur, ve fokal segmental glomerüloskleroz böbrek Podosit vasıflandırılması için bağırsak kanserine 25 kök hücre aktivitesinin varlığı (FSGS) 17.

<table><tbody><tr><td>Brainbow 2.1 kaseti için R26R-Konfeti transgenik fareler</td><td>Jackson</td><td>suşu #013731</td><td></td></tr><tr><td>K14-CreERT</td><td>fareler Jackson</td><td>suşu #005107</td><td></td></tr><tr><td>tamoksifen</td><td>Sigma</td><td>T5648</td><td></td></tr><tr><td>izofluran USP Terrell</td><td>Piramal Yoğun Bakım</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Carprieve 30</td><td>b.wt</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma</td><td>D9542</td>, <td>4 & # 160 konsantrasyonda kullanılır; &mikro; g/ml</td></tr><tr><td>Immu Mount</td><td>Thermo Scientific</td><td>9990402</td><td></td></tr><tr><td>LSM 510 Motorlu bir sahne Zeiss ile donatılmış ters motorlu bir mikroskoba (Axiovert 200M) bağlı meta lazer tarama konfokal sistemi</td><td></td> GFP, YFP ve CFG arasındaki spektral örtüşme, floresan proteinlerin emisyon spektrumlarının ayrılmasına izin veren spektral görüntülemenin kullanılmasını gerektirir.<td></td><td> Burada Zeiss LSM 510 Meta spektral konfokal mikroskobu kullanıyoruz. Bu sistemde yer alan Meta dedektör, her biri 10 nanometrelik bir dalga bandından emisyon toplayan 32 dedektör elemanına sahiptir. "Spektral parmak izi" olarak adlandırılan bu teknik, kullanıcının dalga bandı filtrelemesi için en uygun limitleri belirlemesini sağlar. Leica SP5 (ref # 21), SP8, Zeiss LSM 780 (ref # 22) dahil olmak üzere kullanılabilecek çeşitli spektral konfokal sistemler vardır.</td></tr><tr><td>Zen 2009 Görüntüleme Yazılımı</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Duratears-göz merhemi</td><td>Alcon</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

Çok renkli floresan reporter fare kullanma kornea hücre lineage İzleme bir yöntem

A Method for Lineage Tracing of Corneal Cells Using Multi-color Fluorescent Reporter Mice

Soy izleme deneyleri, belirli bir doku veya organizmadaki hücrelerin kökenini, kaderini ve davranışını tanımlar. Bu teknik, onlarca yıldır başarıyla uygulanmakta ve gelişim biyolojisinde ufuk açıcı bulguları ortaya koymaktadır. Daha yakın zamanlarda, kök hücre biyologları tarafından minimum deneysel müdahale ile farklı kök hücre popülasyonlarını tanımlamak ve izlemek için benimsendi. Fare genetiğindeki son gelişmeler, çok sayıda fare suşunun mevcudiyeti ve floresan mikroskobundaki gelişmeler, ticari olarak mevcut araçları kullanarak, temel uzmanlığa sahip çeşitli dokular için güçlü soy izleme sistemlerinin basit bir şekilde tasarlanmasına olanak tanır. Yakın zamanda, R26R-Confetti faresi kullanarak oküler yüzeydeki kök hücrelerin kökenini ve kaderini keşfetmek için bu güçlü metodolojiden yararlandık. Bu model, 4 floresan genin rastgele bir şekilde ekspresyonu için çok renkli bir genetik sistem sunar. Burada, bu metodolojinin ilkelerini açıklıyoruz ve soy izleme deneyleri tasarlamak için uyarlanabilir bir protokol sağlıyoruz; özellikle kornea epiteli ve diğer dokular için.

Son zamanlarda, biz kök hücre ve kornea epitelinin 24 progenitör hücrelerin köken, hayatta kalma ve göç belirlenmesi amaçlanmıştır. Biriken deliller kornea epitel limbal niş, kornea periferinde bir halka şeklinde bölgede münhasıran bulunan kök hücreler tarafından yenilenir dogma destekler. Bu teori, in vitro ve in vivo verilerin ve başarılı öncü limbal kök hücre tedavisi 27-29 temelini sağlanan klinik kanıtlarla desteklenmektedir. Ancak, bu konu son derece bağlı fare limbus korneal yenileme 30 katılmaz önerdi limbal aşılama deneyleri dayalı bir çalışmaya son yıllarda tartışılan kaldı. Bu ilginç hipotezi test etmek için, R26R-Konfeti fareler yapıldı kullanarak soy izleme deneyleri 120 gün 24 için kararlı hal koşulları altında limbal ve kornea epitel kök / progenitör hücrelerin kaderini takip etmek.Gözler enüklee ve düz monte kornealar 10 ve 120 gün Tamoksifen enjeksiyon sonrası spektral konfokal lazer tarama floresan mikroskop ile analiz edilmiştir. Beklendiği gibi kornea merkezine doğru limbus uzanan 1-4 ay sonra (Şekil 2B ve 24), uzunlamasına çizgiler yavaş geliştirilmiş olup, küçük flöresanlı hücre kümeleri ara sıra, 10 gün sonra aynı oküler yüzey boyunca gözlenmiştir. Bu sonuç kornea kornea merkezine doğru limbustan göç hücreleri tarafından yeniden düşündürmektedir. Sonra, yaralama koşullarda kornea rejenerasyon incelenmiştir. Etkin hücre izleme indüklerken koşullar altında yaralama K14 pozitif limbal / kornea hücrelerin kaderini test etmek için, biz, topikal uygulamaya bağlı kornea yaralanması neden dimetil sülfoksitte Tamoksifen (DMSO), eritilir. Tek bir topikal uygulaması (Şekil 2C), mo uygulandı Bu şekilde biz hafif yaralama ikna etmek için başardı<html> Ek DMSO yalnız tedavi Tamoxifen indüksiyon veya DMSO yalnız topikal Tamoksifen indüksiyon öncesinde 2 ardışık günlerde uygulanan ağır yara gün önce uygulandı ise yaralama yükünü azaltır. Yavaş geliştirilen ve durağan hal koşulları altında 4 ay içinde kornea merkezine ulaştığı ince limbal çizgili aksine, yaralanmadan sonra hücre göçü hızlıydı. Dikkate değer, uzun ve kalın çizgili limbal zaten 7 gün içinde bu koşullar altında geliştirilmiştir. İlginç bir şekilde, renk çeşitliliği, bazen çok az (Şekil 2B) idi. Bizim ellerde, bazen, özellikle kırmızı kan hücrelerinin spesifik fluorophores karşı önyargılı olabilir renk çeşitliliği gösteren tüm kornea tespit edilmiştir. Br1.0L 31 ve Br2.1 21&#39;de daha önce bildirildiği gibi, istenmeyen bu eğilim doz tepki deneyleri ile kalibre edilebilir. les / ftp_upload / 53370 / 53370fig1.jpg &quot;/&gt; R26R-Konfeti yapısının Şekil 1. şematik gösterimi. (A) R26R-konfeti yapı yüksek ekspresyon düzeyleri için bir CAG destekçisi içeren bir loxP (siyah üçgen) Neo R -roadblock ve Rosa26 lokus 16,21 at Brainbow2.1 kaseti -flanked. Brainbow2.1 kaset, iki baş-kuyruk loxP-flanked dimerlerini içerir. Bir dimer nükleer lokalize yeşil floresan proteini (GFP) ve bir geri odaklı sitoplazmik sarı floresan proteini (- olması yoluna götürdü ters çevrilmiş yönlenme belirlenmiş YFP) oluşur. 16 - İkinci dimer sitoplazmik RFP ve bir ters dönük, zara bağlı mavi floresan proteinin (PFC ters çevrilmiş yönlenme belirlenmiş CFP) içerir. (B - E) Cre-rekombinaz aktivasyonu üzerine, farklı eksizyon ve inversiyon olaylar meydana gelebilir; Olası sonuçlar exemplifi vardırB ed - E. Cre aktivite ve böylece gen taşınma ve / veya inversiyon ve dört floresan proteinleri birinin rastgele ifadesi sonuçlar giden kasetin stokastik yeniden düzenlenmesine neden olur. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53370/53370fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 2," src="/files/ftp_upload/53370/53370fig2.jpg" /> Şekil 2. Homeostaz ve yaralanma altında izleme Kornea soyu. R26R-confetti / protokol ayrıntılı olarak K14-Cre farenin 4 mg Tamoksifen enjekte edilmiştir. (- B A) puan sonrası belirtilen süre içinde endüksiyon kornealar görüntülenmiştir basık. Cre indüksiyonu ile birleştiğinde Kornea yaralama DMSO içinde çözülmüş Tamoksifen topik uygulama ile elde edilmiştir (Cı - D). Mozaik görüntüler eldespektral konfokal mikroskopi fayans kanallı gösterilmektedir (A - D). Homeostazındaki yavaş göç hücrelerin radyal limbal çizgili limbus ve kornea merkezi arasında uzanıyordu. Bu şeritler 4-5 ay (B) içinde kornea merkezine ulaşan yavaş gelişti. Kornea hücre kümeleri de (beyaz oklar, B) belirgindi. Buna karşılık, büyük limbal çizgiler yaralama koşullarında (C) altında, tek bir hafta içinde ortaya çıktı. Kırmızı hücrelerin (D) doğru renk çeşitliliğinin önyargı bir örnek. Limbal-kornea sınır kesik çizgi ile açıklamalı. Ölçek çubuğu 500 mikron olduğunu. Kısaltmalar: CFP, mavi floresan proteini; GFP, yeşil flüoresan proteini; RFP, kırmızı floresan proteini; YFP, sarı floresan protein. Bu rakam 24 modifiye edilmiştir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53370/53370fig2large.jpg" target="_blank">Büyük halini görmek için tıklayınız</a>Bu rakam.

Bu makalede, R26R-Confetti fareleri kullanarak çok renkli bir soy izleme deneyi tasarlama ve gerçekleştirme ilkelerini açıklıyoruz. İlgilenilen diğer dokular için modifiye edilebilen kornea epitel hücrelerinin izlenmesi için özel bir protokol sunuyoruz.

Çok renkli Floresan Reporter Fare kullanma Kornea Hücre Lineage İzleme Bir Yöntem

Lineage tracing experiments define the origin, fate and behavior of cells in a specific tissue or organism. This technique has been successfully applied ...

Bu yöntemin genel amacı, kornea epitelyumundaki kök hücrelerin ve progenitör hücrelerin göçünü, genişlemesini ve sağkalımını belirlemek ve takip etmektir. Bu yöntem; homeostaz, doku onarımı, yaşlanma ve patoloji ile ilgili kornea epitelyal hücre biyolojisi alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, kurulumunun kolay olması ve hücrelerin klonal bir şekilde non-invaziv soy takibine olanak sağlamasıdır.Başlamak için, öncelikle limbal ve kornea epitel progenitor hücrelerini ve kök hücrelerini işaretlemek için indüklenebilir dokuya özgü bir promotöre sahip bir Cree transgenik fare suşu seçin. Tamoxifen İndüklenebilir K 14 Cree ERT hattı kullanılır. Ardından, araştırma sorusuna ve mevcut Cree hattına bağlı olarak uygun brainbow kaseti seçin.Bu vakada, Brainbow 2.1 hattı kullanılmıştır. Dört renkli K 14 pozitif hücrelere sahip fareler üretmek için homozigot R 26 R confetti suşu ile homozigot K 14 Cree ERT suşunu çaprazlayın. Transgenik farelerde rekombinasyonu indüklemek için öncelikle 80 miligram Tamoksifen tartın ve Vortexleyerek bir mililitre mısır yağında çözün.Çözeltiyi, tamamen çözünene kadar 65 °C'de tutulan çalkalamalı bir su banyosuna yerleştirin ve bir sonraki anestezi işlemine kadar banyoda bırakın. Sekiz haftalık heterozigot bir Brainbow 2.1 Cree ERT faresini kullanın ve anestezi derinliğini ayak parmağı sıkıştırma testiyle kontrol edin; ardından farenin her bir göz yüzeyine 100 µL Tamoxifen çözeltisini dikkatlice uygulayın. Tamoxifen'in doğrudan uygulanması, yüksek bir Cree indüksiyon verimliliği sağlar. Artan Tamoxifen çözeltisini, ışıktan korunmuş şekilde 4 °C'de bir haftaya kadar saklayın.Her fare için üç ardışık gün boyunca tekrarlanan uygulama öncesinde solüsyonu ısıtın. İlk olarak, bir gram Tamoxifen tozunu beş mililitre steril dimetil sülfokside çözün. 200 mg/mL konsantrasyonunda bir solüsyon elde etmek için, solüsyonu berraklaşana kadar 65 °C'de tutulan çalkalamalı bir su banyosuna yerleştirin ve kullanıma kadar banyoda bırakın.Ardından fareyi anesteziye alın ve ayak parmağı sıkıştırma yöntemiyle anestezinin derinliğini kontrol edin, işlem sırasında kurumayı önlemek için farenin tedavi edilmeyen gözüne göz pomadı sürün ve yeterli miktarda analjezik uygulayın. Sonra, iğnesiz bir şırıngaya 200 microliters Tamoxifen çözeltisi çekin ve bunu gözün tüm kornea tabakasına topikal olarak uygulayın. Sıvı, oda sıcaklığında doku üzerinde katılaşır.Fare, sternal recumbent (sternal yatış) pozisyonunu koruyana kadar takip edilmeli ve yalnızca tamamen bilinci yerine geldiğinde diğerlerinin yanına döndürülmelidir. İndüksiyon sonrası uygun zaman noktalarında fareler sakrifiye edildikten sonra, metin protokolünde açıklanan şekilde göz yaralaması uygulanır. Göz kapağına bastırarak göz küresini soketten dışarı çıkartarak gözü nükle edin.Optik siniri tutmak için kavisli pensi göz küresinin arkasına kaydırın ve göz küresini ayırmak için yukarı doğru çekin. Her bir göz küresini PBS içeren 60 milimetrelik bir kaba yerleştirin. Göz içeren plakayı cerrahi bir stereo mikroskobun altına yerleştirin.Gözün temel yapısını, korneayı, limbusu ve optik siniri tanıdığınızdan emin olun. Optik siniri, kası ve göz çevresindeki bağ dokusunu temizleyin. Gözü, kornea aşağı bakacak şekilde arka kısmından tutun ve yaylı makas kullanarak göz küresinin arkasındaki sklera kısmına bir insizyon yapın.Lensin dışarı çıkmasını sağlamak için kesiyi genişletin ve irisi pensetle çıkarın. Ardından, korneayı düzleştirmek için merkezden çevreye doğru dört ila beş adet radyal insizyon yapın ve ardından irisin kalan kısımlarını ince düz bir spatula ile temizleyin. Son olarak, korneayı sabitlemek için limbusu çevreleyen fazla periferik dokuyu kesin.Diseke edilen dokuyu 12 kuyucuklu bir kaba aktarın ve %4'lük paraformaldehit içerisinde 10 dakika boyunca inkübe edin. Ardından, hücre çekirdeklerini boyamak için dokuyu PBS ile kısaca yıkayın. Korneayı 2 µg/mL DPI çözeltisinde 10 dakika boyunca inkübe edin ve ardından PBS ile kısaca yıkayın.Ardından, korneayı epitel tarafı yukarı bakacak şekilde bir lam üzerine yerleştirin. Daha sonra korneanın üzerine bir damla bağlama ortamı damlatın ve üzerini bir lamelle kapatın. Lamların oda sıcaklığında gece boyunca kurumasına izin verin ve dört derece Celsius'ta saklayın.Kornea görüntüleme için R-F-P-Y-F-P-G-F-P ve CFP emisyonlarının ayrımına olanak tanıyan spektral konfokal bir sistem kullanın. İlk olarak, çapraz eksitasyonu veya emisyon sinyallerinin örtüşmesini önlemeye dikkat ederek, beyindeki floresan proteinlere bağlı olarak floresans, eksitasyon ve emisyon dalga boylarını ayarlayın. Bo kaseti.Ardından, tüm korneayı yüksek çözünürlükte görüntülemek için döşemeli (tiled) görüntüler elde edin. Burada, dört floresan kanalının tamamında 12'ye 12'lik bir görüntü dizisi edinin. Son olarak, kompozit bir soy ağacı oluşturmak için görüntüleri birleştirin.Limbal ve korneal epitelyal progenitör hücrelerin akıbetini takip etmek için R 26 R konfeti fareler kullanılarak izleme deneyleri gerçekleştirilmiştir. Kararlı durum koşulları altında, beklendiği üzere indüksiyondan 10 gün sonra küçük floresan hücre kümeleri gözlemlenmiştir. Dört ay sonra, limbustan korneanın merkezine doğru uzanan çizgiler gelişmiş olup, bu durum kornea yaralanmasının ardından hücrelerin korneayı yeniden oluşturmak için limbustan göç ettiğini göstermektedir.Limbus'tan göç hızla gerçekleşti ve yedi gün içinde uzun, kalın limbal şeritler gelişti. Bu model, farklı koşullar altında kornea kök ve öncül hücrelerinin takibi ve incelenmesi için değerlidir. Gelecekte; klonal hücre genişlemesinin, sağkalımın ve göçün kararlı durumla birlikte yaralanma, kimyasal yanık mutasyonu ve benzeri stres koşulları altında araştırılmasına olanak sağlayacaktır.Bu model, normal ve patolojik kornea rejenerasyonunun altında yatan moleküler mekanizmaları incelemek için de kullanılabilir. Bu teknik; kornea distrofileri, yanıklar ve kornea travmaları gibi farklı patolojik durumların anlaşılmasına ve ayrıca farklı tedavilerin kornea rejenerasyonu, hücre ekspansiyonu ve migrasyonu üzerindeki etkilerinin değerlendirilmesine katkıda bulunabilir.

a-method-for-lineage-tracing-corneal-cells-using-multi-color

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Gelişim Biyolojisi

Ex vivo Fare neuroepithelium Tek Hücre Bölümler Canlı Görüntüleme

Kaynak: Laboissonniere, et. al. Retinal Ganglion Hücrelerinin Tanımlanmış Alt Kümelerinin Tek Hücreli RNA-Seq'i. J. Vis. Uzm.  (2017).  Bu video, transgenik bir fare retinasındaki retinal ganglion hücresi (RGC) alt tiplerini tanımlamak için bir floresan izleme tekniğini göstermektedir. İşlem, izole retinanın bir kayıt odasında sabitlenmesini, oksijenli perfüzyon ile hücre canlılığının korunmasını ve izleyicili bir pipet kullanılarak floresan olarak etiketlenmiş RGC'lerin hedeflenmesini içerir.

Fare Retinal Ganglion Hücre Alt Tiplerinin Floresan İzleme ile Tanımlanması

Kraniyofasiyal kemiklerin Hücre organizasyonu uzun öne sürülmüştür ancak doğrudan görüntülenmiştir olmamıştı. Çok spektral hücre etiketleme ve in vivo canlı olarak   Görüntüleme Zebra balığı alt çene dinamik hücre davranışı görselleştirme sağlar. Burada, biz detay protokolü Zebrabow transgenik balık işlemek için doğrudan hücre ardalanması ve Meckel kıkırdak kondrosit morfolojik değişiklikleri gözlemek.

Embriyonik Meckel Kıkırdak içinde Zebrabow klonal Hücre Analizi aracılığıyla Kondrosit interkalasyonu ve Yön Yayılması Görselleştirme

Burada, farklı fare dokuları içindeki IL-22 üreten hücreleri görselleştirmek için bir transgenik raportör fare modelini açıklıyoruz. Bu yöntem, faredeki diğer sitokinlerin veya salgı proteinlerinin yerini izlemek için kullanılabilir.

Raportör fareler kullanılarak IL-22 eksprese eden lenfositlerin Görselleştirme

Burada, iki ayrı renk ortak bir progenitör hücreden türetilen nöron görselleştirme izin veren bir mozaik etiketleme tekniği için bir protokol mevcut. Bu, farklı bireylerin aynı nöronlarda doğum kalma bireysel nöronların kapasitesi ve eğitim gen fonksiyonu ile sinir soy analizi kolaylaştırır.

Çift nokta MARCM kullanılması Hücre Lineage Analizleri ve Gen Fonksiyonu Çalışmaları

Bu yöntem, r26R-Konfeti (Konfeti) fare modelinin mineralize dokuları incelemek için kullanımını açıklar ve üreme stratejisinden görüntü edinimiiçin tüm adımları kapsamaktadır. Dahil tüm yumuşak dokulara uygulanabilir genel bir protokol ve mineralize dokulara uygulanabilir değiştirilmiş bir protokoldür.

Mineralize Dokuları Incelemek için Konfeti Faresini Kullanarak Klonal Genetik İzleme

Burada sunulan canlı fare oküler yüzey görüntüleme için bir multifoton mikroskobik platformdur. Floresan transgenik fare hücre çekirdekleri, hücre zarları, sinir lifleri ve oküler yüzey içinde kılcal damarların görüntülenmesi sağlar. Kolaj nasyonal yapılardan elde edilen doğrusal olmayan ikinci harmonik nesil sinyalleri stromal mimariler için etiketsiz görüntüleme sağlar.

Fare Kornea ve Konjonktiva Canlı Görüntüleme için Özel Multifoton Mikroskop platformu

Çift belirteçli (MADM) ile mozaik analizi kullanılarak aday genlerin tek bir hücre düzeyinde soy izleme ve fonksiyonel genetik analizini yapmak için bir protokol sunulmuştur. MADM klonal analizi, bireysel ataların ve kız hücrelerinin proliferatif davranışını, hücresel çıktısını ve soy ilişkisini ölçmek için nicel bir çerçeve sağlar.

Çift Marker (MADM) ile Mozaik Analizi Kullanarak Serebral Korteks Geliştirilmesinde Soy İzleme ve Klonal Analizi

İndüklenebilir bir transgenik soy izleme fare çizgisi kullanarak kök hücreleri ve soylarını bir florofor ile kalıcı olarak işaretleme yeteneği, in vivo aktivasyon, proliferasyon, göç ve / veya farklılaşmanın mekansal ve zamansal analizine izin verir. Soy izleme, soy bağlılığı, müdahaleye yanıt ve çok potansiyelli hakkında yeni bilgiler ortaya çıkarabilir.

Yetişkin Fare Beynindeki İndüklenebilir Floresan Etiketli Kök Hücrelerin Soy İzi

Burada, korneayı innerve eden duyu liflerine zarar vermek için üç farklı yöntem öneriyoruz. Bu yöntemler, farelerde akson rejenerasyonunun incelenmesini kolaylaştırır. Diğer hayvan modellerine uyarlanabilen bu üç yöntem, kornea innervasyon fizyolojisi ve rejenerasyonunun incelenmesi için idealdir.

Murin Korneasında Nörotrofik Keratit ve Sinir Rejenerasyonunu İndüklemek için Üç Strateji

Öğrenin kornea epitel hücre soy izleme yöntemini R26R-Confetti fare modeli kullanarak. Bu teknik kök hücre göçünü ve rejenerasyon dinamiklerini invaziv olmayan şekilde izlemenizi sağlar.

Çok renkli Floresan Reporter Fare kullanma Kornea Hücre Lineage İzleme Bir Yöntem

Daha fazla video keşfet