Çok renkli Floresan Reporter Fare kullanma Kornea Hücre Lineage İzleme Bir Yöntem

Bu yöntemin genel amacı, kornea epitelyumundaki kök hücrelerin ve progenitör hücrelerin göçünü, genişlemesini ve sağkalımını belirlemek ve takip etmektir. Bu yöntem; homeostaz, doku onarımı, yaşlanma ve patoloji ile ilgili kornea epitelyal hücre biyolojisi alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, kurulumunun kolay olması ve hücrelerin klonal bir şekilde non-invaziv soy takibine olanak sağlamasıdır.

Başlamak için, öncelikle limbal ve kornea epitel progenitor hücrelerini ve kök hücrelerini işaretlemek için indüklenebilir dokuya özgü bir promotöre sahip bir Cree transgenik fare suşu seçin. Tamoxifen İndüklenebilir K 14 Cree ERT hattı kullanılır. Ardından, araştırma sorusuna ve mevcut Cree hattına bağlı olarak uygun brainbow kaseti seçin.

Bu vakada, Brainbow 2.1 hattı kullanılmıştır. Dört renkli K 14 pozitif hücrelere sahip fareler üretmek için homozigot R 26 R confetti suşu ile homozigot K 14 Cree ERT suşunu çaprazlayın. Transgenik farelerde rekombinasyonu indüklemek için öncelikle 80 miligram Tamoksifen tartın ve Vortexleyerek bir mililitre mısır yağında çözün.

Çözeltiyi, tamamen çözünene kadar 65 °C'de tutulan çalkalamalı bir su banyosuna yerleştirin ve bir sonraki anestezi işlemine kadar banyoda bırakın. Sekiz haftalık heterozigot bir Brainbow 2.1 Cree ERT faresini kullanın ve anestezi derinliğini ayak parmağı sıkıştırma testiyle kontrol edin; ardından farenin her bir göz yüzeyine 100 µL Tamoxifen çözeltisini dikkatlice uygulayın. Tamoxifen'in doğrudan uygulanması, yüksek bir Cree indüksiyon verimliliği sağlar. Artan Tamoxifen çözeltisini, ışıktan korunmuş şekilde 4 °C'de bir haftaya kadar saklayın.

Her fare için üç ardışık gün boyunca tekrarlanan uygulama öncesinde solüsyonu ısıtın. İlk olarak, bir gram Tamoxifen tozunu beş mililitre steril dimetil sülfokside çözün. 200 mg/mL konsantrasyonunda bir solüsyon elde etmek için, solüsyonu berraklaşana kadar 65 °C'de tutulan çalkalamalı bir su banyosuna yerleştirin ve kullanıma kadar banyoda bırakın.

Ardından fareyi anesteziye alın ve ayak parmağı sıkıştırma yöntemiyle anestezinin derinliğini kontrol edin, işlem sırasında kurumayı önlemek için farenin tedavi edilmeyen gözüne göz pomadı sürün ve yeterli miktarda analjezik uygulayın. Sonra, iğnesiz bir şırıngaya 200 microliters Tamoxifen çözeltisi çekin ve bunu gözün tüm kornea tabakasına topikal olarak uygulayın. Sıvı, oda sıcaklığında doku üzerinde katılaşır.

Fare, sternal recumbent (sternal yatış) pozisyonunu koruyana kadar takip edilmeli ve yalnızca tamamen bilinci yerine geldiğinde diğerlerinin yanına döndürülmelidir. İndüksiyon sonrası uygun zaman noktalarında fareler sakrifiye edildikten sonra, metin protokolünde açıklanan şekilde göz yaralaması uygulanır. Göz kapağına bastırarak göz küresini soketten dışarı çıkartarak gözü nükle edin.

Optik siniri tutmak için kavisli pensi göz küresinin arkasına kaydırın ve göz küresini ayırmak için yukarı doğru çekin. Her bir göz küresini PBS içeren 60 milimetrelik bir kaba yerleştirin. Göz içeren plakayı cerrahi bir stereo mikroskobun altına yerleştirin.

Gözün temel yapısını, korneayı, limbusu ve optik siniri tanıdığınızdan emin olun. Optik siniri, kası ve göz çevresindeki bağ dokusunu temizleyin. Gözü, kornea aşağı bakacak şekilde arka kısmından tutun ve yaylı makas kullanarak göz küresinin arkasındaki sklera kısmına bir insizyon yapın.

Lensin dışarı çıkmasını sağlamak için kesiyi genişletin ve irisi pensetle çıkarın. Ardından, korneayı düzleştirmek için merkezden çevreye doğru dört ila beş adet radyal insizyon yapın ve ardından irisin kalan kısımlarını ince düz bir spatula ile temizleyin. Son olarak, korneayı sabitlemek için limbusu çevreleyen fazla periferik dokuyu kesin.

Diseke edilen dokuyu 12 kuyucuklu bir kaba aktarın ve %4'lük paraformaldehit içerisinde 10 dakika boyunca inkübe edin. Ardından, hücre çekirdeklerini boyamak için dokuyu PBS ile kısaca yıkayın. Korneayı 2 µg/mL DPI çözeltisinde 10 dakika boyunca inkübe edin ve ardından PBS ile kısaca yıkayın.

Ardından, korneayı epitel tarafı yukarı bakacak şekilde bir lam üzerine yerleştirin. Daha sonra korneanın üzerine bir damla bağlama ortamı damlatın ve üzerini bir lamelle kapatın. Lamların oda sıcaklığında gece boyunca kurumasına izin verin ve dört derece Celsius'ta saklayın.

Kornea görüntüleme için R-F-P-Y-F-P-G-F-P ve CFP emisyonlarının ayrımına olanak tanıyan spektral konfokal bir sistem kullanın. İlk olarak, çapraz eksitasyonu veya emisyon sinyallerinin örtüşmesini önlemeye dikkat ederek, beyindeki floresan proteinlere bağlı olarak floresans, eksitasyon ve emisyon dalga boylarını ayarlayın. Bo kaseti.

Ardından, tüm korneayı yüksek çözünürlükte görüntülemek için döşemeli (tiled) görüntüler elde edin. Burada, dört floresan kanalının tamamında 12'ye 12'lik bir görüntü dizisi edinin. Son olarak, kompozit bir soy ağacı oluşturmak için görüntüleri birleştirin.

Limbal ve korneal epitelyal progenitör hücrelerin akıbetini takip etmek için R 26 R konfeti fareler kullanılarak izleme deneyleri gerçekleştirilmiştir. Kararlı durum koşulları altında, beklendiği üzere indüksiyondan 10 gün sonra küçük floresan hücre kümeleri gözlemlenmiştir. Dört ay sonra, limbustan korneanın merkezine doğru uzanan çizgiler gelişmiş olup, bu durum kornea yaralanmasının ardından hücrelerin korneayı yeniden oluşturmak için limbustan göç ettiğini göstermektedir.

Limbus'tan göç hızla gerçekleşti ve yedi gün içinde uzun, kalın limbal şeritler gelişti. Bu model, farklı koşullar altında kornea kök ve öncül hücrelerinin takibi ve incelenmesi için değerlidir. Gelecekte; klonal hücre genişlemesinin, sağkalımın ve göçün kararlı durumla birlikte yaralanma, kimyasal yanık mutasyonu ve benzeri stres koşulları altında araştırılmasına olanak sağlayacaktır.

Bu model, normal ve patolojik kornea rejenerasyonunun altında yatan moleküler mekanizmaları incelemek için de kullanılabilir. Bu teknik; kornea distrofileri, yanıklar ve kornea travmaları gibi farklı patolojik durumların anlaşılmasına ve ayrıca farklı tedavilerin kornea rejenerasyonu, hücre ekspansiyonu ve migrasyonu üzerindeki etkilerinin değerlendirilmesine katkıda bulunabilir.