Çok renkli Floresan Reporter Fare kullanma Kornea Hücre Lineage İzleme Bir Yöntem

Bu yöntemin genel amacı, kornea epitelinde kök hücrelerin ve progenitör hücrelerin göçünü, genişlemesini ve hayatta kalmasını bulmak ve izlemektir. Bu yöntem, kornea epitel hücre biyolojisi alanında homeostaz, doku onarımı, yaşlanma ve Patoloji ile ilgili temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, kurulmasının kolay olması ve hücrelerin klonal bir şekilde non-invaziv soy takibine izin vermesidir.

Başlamak için, önce limbal ve kornea epitelyal progenitör hücrelerini ve kök hücreleri etiketlemek için indüklenebilir bir dokuya özgü promotöre sahip bir Cree transgenik fare suşu seçin. Tamoksifen ile İndüklenebilir K 14 Cree ERT hattı kullanılır. Ardından, araştırma sorusuna ve mevcut Cree hattına bağlı olarak uygun brainbow kasetini seçin.

Bu durumda, Brainbow 2.1 hattı kullanılır. Transgenik farelerde rekombinasyonu indüklemek için dört renkli K 14 pozitif hücreli fareler oluşturmak için homozigot R 26 R konfeti suşunu homozigot K 14 Cree ERT suşu ile çaprazlayın. Önce 80 miligram Tamoksifen'i tartın ve Vorteksleme ile bir mililitre mısır yağında çözün.

Solüsyonu, tamamen eriyene kadar 65 santigrat derecede tutulan çalkalanan bir su banyosuna yerleştirin ve bir sonraki anesteziyi kullanana kadar banyoda bırakın. Sekiz haftalık bir Brainbow 2.1 Cree ERT heterozigot fare ve ayak parmağı tutamıyla anestezi derinliğini kontrol edin, farenin her oküler yüzeyine 100 mikrolitre Tamoksifen solüsyonunu dikkatlice uygulayın. Tamoksifen'in doğrudan uygulanması, Cree indüksiyonunun yüksek verimliliğini sağlar Işıktan korunan herhangi bir kalıntı Tamoksifen çözeltisini bir haftaya kadar dört santigrat derecede saklayın.

Uygulamadan önce çözeltiyi ısıtın, bu her fare için art arda üç gün tekrarlanır. İlk önce bir gram Tamoksifen tozunu beş mililitre steril dimetil sülfoksit içinde çözün. Mililitre başına 200 miligramlık bir çözelti üretmek için, çözeltiyi çalkalayan bir su banyosuna koyun, berraklaşana kadar 65 santigrat dereceyi koruyun ve kullanılana kadar banyoda bırakın.

Daha sonra fareyi uyuşturun ve bir ayak parmağı tutamağı kullanarak anestezi derinliğini kontrol edin, işlem sırasında dehidrasyondan korumak için farenin tedavi edilmemiş gözüne göz merhemi sürün ve yeterli analjezikler uygulayın. Daha sonra, 200 mikrolitre Tamoksifen solüsyonunu herhangi bir iğne takılı olmadan bir şırıngaya çekin ve gözün tüm korneasına topikal olarak uygulayın. Sıvı, oda sıcaklığında doku üzerinde katılaşır.

Sternal yaslanmaya devam edene kadar fareye katılın ve yalnızca tamamen bilinçli olduğunda başkalarının şirketine geri dönün. İndüksiyondan sonra uygun zaman noktalarında fareler kurban edildikten sonra, metin protokolünde anlatıldığı gibi bir göz yarası. Göz küresini yuvadan çıkarmak için önce göz kapağına bastırarak gözü çekirdeklendirin.

Optik siniri tutmak için kavisli forsepsleri göz küresinin arkasına kaydırın ve çıkarmak için göz küresini yukarı çekin. Her bir göz küresini PBS içeren 60 milimetrelik bir tabağa yerleştirin. Göz içeren plakayı cerrahi stereo mikroskop altına yerleştirin.

Gözün, korneanın, limbusun ve optik sinirin temel yapısını tanıdığınızdan emin olun. Göz çevresindeki optik siniri, kası ve bağ dokusunu çıkarın. Kornea aşağı bakacak şekilde gözü arka kısımda tutun ve yaylı makas kullanarak göz küresinin arkasındaki sklerada bir kesi yapın.

Lensin dışarı çıkmasına izin vermek için kesimi büyütün ve irisi forseps ile çıkarın. Daha sonra, korneayı düzleştirmek için merkezden çevreye doğru keserek dört ila beş radyal kesi yapın ve ardından irisin kalan kısımlarını ince düz bir spatula ile çıkarın. Son olarak, korneayı sabitlemek için limbusu çevreleyen fazla periferik dokuyu kesin.

Diseke edilen dokuyu 12 oyuklu bir tabağa aktarın ve 10 dakika boyunca% 4 para formaldehit içinde inkübe edin. Daha sonra hücre çekirdeğini boyamak için dokuyu PBS'de kısaca yıkayın. Korneayı mililitre DPI çözeltisi başına iki mikrogram içinde 10 dakika inkübe edin, ardından PBS'de kısa bir yıkama yapın.

Daha sonra, korneayı epitel tarafı yukarı bakacak şekilde bir cam slayt üzerine yerleştirin. Daha sonra korneanın üzerine bir damla montaj ortamı yerleştirin ve üzerini bir kapak fişi ile örtün. Slaytları gece boyunca oda sıcaklığında kurumaya bırakın ve dört santigrat derecede saklayın.

Kornea görüntüleme için, R-F-P-Y-F-P-G-F-P ve CFP emisyonlarının ayrılmasını sağlayan spektral bir konfokal sistem kullanın. İlk önce beynin floresan proteinlerine bağlı olarak floresan, uyarma ve emisyon dalga boylarını ayarlayın. Bo kaseti, emisyon sinyallerinin çapraz uyarılmasını veya üst üste binmesini önlemeye özen gösterir.

Ardından, tüm korneayı yüksek çözünürlükte görselleştirmek için döşenmiş görüntüler elde edin. Burada, dört floresan kanalının tümünde 12'ye 12 görüntüden oluşan bir dizi elde edin. Son olarak, bileşik bir köken oluşturmak için görüntüleri birleştirin.

Limbal ve kornea epitelyal progenitör hücrelerinin kaderini takip etmek için R 26 R konfeti fareleri kullanılarak izleme deneyleri yapıldı. Kararlı durum koşulları altında, beklendiği gibi indüksiyondan 10 gün sonra küçük floresan hücre kümeleri gözlendi. Dört ay sonra, limbustan korneanın merkezine doğru çizgiler gelişti, bu da hücrelerin kornea yaralanmasını takiben korneayı yenilemek için limbustan göç ettiğini düşündürdü.

Limbustan testere göçü, yedi gün içinde gelişen uzun, kalın limbal çizgilerle hızlı bir şekilde gerçekleşti. Bu model, farklı koşullar altında kornea sapı ve progenitör hücrelerin izlenmesi ve incelenmesi için değerlidir. Klonal hücre genişlemesi, hayatta kalma ve göçün kararlı durumda ve yaralanma, kimyasal yanık mutasyonu ve daha fazlası gibi stres koşulları altında araştırılmasına izin verecektir.

Bu model aynı zamanda normal ve patolojik kornea rejenerasyonunun altında yatan moleküler mekanizmaları incelemek için de kullanılabilir. Bu teknik, kornea distrofileri, yanıklar ve kornea travması gibi farklı patolojik durumları anlamamıza ve ayrıca farklı tedavilerin kornea rejenerasyonu, hücre genişlemesi ve göçü üzerindeki etkisinin değerlendirilmesine katkıda bulunabilir.