Dijital Çizgi-kodlama Platform'u kullanarak bulaşmasını Mikroplar Gen İfadesi profil

Bu deneyin genel amacı, bir patojenin bulaşıcı ortama nasıl adapte olduğuna ve konakçısına nasıl zarar verdiğine ışık tutmak için patojen gen ekspresyonunu in vivo olarak doğru bir şekilde ölçmektir. Bu teknik, bulaşıcı hastalıklar alanındaki araştırmacıların, çeşitli doku tiplerinde ve birden fazla zaman noktasında gerçek bir enfeksiyon sırasında patojen gen ekspresyon dinamiklerini keşfetmelerinin yolunu açtı. Bu yöntemin temel avantajı, oldukça hassas ve son derece tekrarlanabilir olmasıdır.

Bu yöntem, gerçek hayattaki bir enfeksiyondan elde edilen küçük miktarda dokudan patojen gen ekspresyonunu ölçmeyi mümkün kılar. Reaktifleri hazırlamaya başlamak için, RLT'yi tamponlamak için 2-Merkaptoetanol ekleyin ve iyice karıştırın. 25:24:1 fenol-kloroform izoamil alkol çözeltisi karışımı hazırlayın.

M tipi homojenizasyon tüplerini etiketleyin ve buz üzerinde soğutun. İki mililitrelik vidalı kapaklı tüpleri etiketleyin ve her tüpe yaklaşık 300 mikrolitre zirkonya boncuk ekleyin. Bir doku ayrıştırıcı, bir boncuk çırpıcı, 50 mililitrelik tüpler ve 96 kuyulu plakalar için adaptörlü bir masa üstü santrifüj ve bir fotometre dahil olmak üzere aşağıdaki aletleri kullanıma hazır bulundurun.

C.albicans ile enfekte olmuş farelerden izole edilen önceden donmuş böbrekleri 80 derecelik bir dondurucudan çıkarın ve buzun üzerine koyun. Her böbreğe 1.2 mililitre tampon RLT ekleyin. Daha sonra her bir böbreği tamponla M tipi bir homojenizasyon tüpüne boşaltın.

Kullanılan tampon RLT miktarı ampirik olarak belirlenir. Çok fazla tampon RLT numune konsantrasyonunu seyreltirken, çok azı homojenatı çok viskoz ve işlenmesi son derece zor hale getirecektir. Daha sonra, önceden yüklenmiş ayar RNA 2.01'de bir doku ayrıştırıcı kullanarak böbrekleri homojenize edin.

Ardından, bir dakika boyunca 1000 x G'de santrifüjleyin. Her bir homojenattan 600 mikrolitreyi zirkonya boncukları içeren vidalı kapaklı bir tüpe aktarın ve kalan homojenatı buz üzerinde saklayın. Her tüpe 600 mikrolitre fenol-kloroform izoamil alkol ekleyin, kapakları sıkıca kapatın ve boncuk çırpıcıda dört santigrat derecede üç dakika boyunca girdap yapın.

Dört santigrat derecede beş dakika boyunca 15.000 G'de santrifüjleyin. Sulu fazı dikkatlice yeni bir 1.5 mililitrelik mikrofüj tüpüne aktarın ve eşit hacimde% 70 etanol ekleyin. Daha sonra sıkma kolonuna yükleyin ve 8.000 x G'de döndürün.700 mikrolitre tampon RW ile, her sıkma kolonunu bir kez yıkayın, ardından 500 mikrolitre tampon RPE ile iki yıkama yapın.

Sütunları kuru toplama tüplerine aktarın ve kalan sıvıyı çıkarmak için bir dakika daha döndürün. Son olarak, RNA'yı çıkarmak için 50 mikrolitre su kullanın. Daha sonra RNA konsantrasyonunu ölçmek için OD 216 milimetrede bir spektrofotometre kullanın.

Dijital barkod kullanarak gen ekspresyonu profili oluşturmak için, raportör kod setini ve yakalama kod setini buz üzerinde çözerek başlayın. Raportör kod setine 130 mikrolitre hibridizasyon tamponu ekleyin. Karıştırmak ve döndürmek için ters çevirin.

Daha sonra, 12 reaksiyon tüpünün her birine 20 mikrolitre karışım ekleyin. Daha sonra her tüpe 10 mikrogram toplam doku RNA'sı ekleyin ve pipetleyerek karıştırın. Enfeksiyon modeline, aşı boyutuna ve kullanılan patojen suşuna bağlı olarak, toplam RNA içindeki patojen RNA yüzdesi %0 2 arasında değişirBu nedenle, her biri için eklenmesi gereken toplam RNA miktarı ampirik olarak optimize edilmelidir.

Şimdi her tüpe ayarlanmış beş mikrolitre yakalama kodu ekleyin. Tüpleri çevirerek karıştırın ve hızla aşağı döndürün. Daha sonra reaksiyonları yaklaşık 18 saat boyunca ısıtılmış bir kapakla 65 santigrat derecede bir termal döngüleyicide inkübe edin.

20 santigrat dereceden bir numune kartuşunu çıkarın ve oda sıcaklığına ısınmasını bekleyin. Dört santigrat dereceden iki reaktif plakasını çıkarın ve iki dakika boyunca 670 x G'de bir masa üstü santrifüjde döndürün. Ardından, yüksek hassasiyet seçeneğini seçerek ekrandaki adım adım talimatları izleyerek hazırlık istasyonunu kurun.

Ardından reaksiyonları termal döngüleyiciden çıkarın ve hemen hazırlık istasyonuna yükleyin. Üç saatlik yüksek hassasiyet programını çalıştırdıktan sonra, kartuşu çıkarın ve şeritleri kapatmak için şeffaf bant kullanın. Gerekirse kartuşun altına mineral yağ sürün.

Ardından kartuşu dijital analizöre yükleyin. Yüksek çözünürlüklü tarama seçeneğini seçerek ekrandaki adım adım talimatları izleyerek dijital analizörü kurun. Tarama programını çalıştırdıktan sonra, sonuçları indirin veya e-posta ile almayı seçin ve ham verileri üreticinin yazılımına aktarın.

Verileri metin protokolüne göre analiz edin. Bu videoda gösterilen protokol, özgüllüğü artırmak ve konakçı RNA'dan gelen gürültüyü azaltmak için hem bir yakalama probu hem de bir rapor probu kullanması bakımından benzersiz bir avantaja sahiptir. Burada gösterildiği gibi, enfekte olmamış bir doku örneğinden alınan arka plan ham sayımlarının tümü 10'un altındayken, iki enfekte doku örneğinden alınan ham sayımların tümü 10'un üzerindeydi.

İki biyolojik örnekten elde edilen ham sayımlar, 0.945'lik bir R kare değeri ile çok iyi bir korelasyona sahipti. Platform ayrıca doğal biyolojik ifade seviyelerini kapsayacak yeterli dinamik aralık sağlar. 248 çevresel yanıt genini belirten bir prob seti kullanılarak, patojen gen ekspresyonunun iki fazı belirlendi.

Erken bir gen ekspresyon yanıtı, aşı ve enfeksiyon sonrası 12 saatlik numuneler arasında önemli ölçüde farklı RNA seviyelerine sahip genleri içerir. 12 saatlik nokta ile enfeksiyon sonrası 48 saatlik numuneler arasında önemli ölçüde farklı olan RNA seviyelerine sahip genleri içeren geç bir gen ekspresyonu yanıtı da keşfedildi. Bu sonuçlar, C. albicans gen ekspresyonunun bir memeli konakçının invaziv enfeksiyonu sırasında dinamik olarak düzenlendiğini göstermektedir.

Bu yöntem kolay ve hızlıdır. Doku toplamadan veri ifade etmeye kadar tüm prosedür 48 saatten az sürer. Uygulamalı süre 12 numune için yaklaşık dört saattir.

Bu yöntem, in vivo olarak patojen gen ekspresyonunu yakalamak için geliştirilirken, aynısı konakçı gen ekspresyonunu yanıtlamak için de kullanılabilir. Bu nedenle, araştırmacılar bir enfeksiyonun her iki tarafından aynı anda yararlı bilgiler alabilirler.