Dijital Çizgi-kodlama Platform'u kullanarak bulaşmasını Mikroplar Gen İfadesi profil

Bu deneyin genel amacı, bir patojenin enfeksiyöz ortama nasıl adapte olduğunu ve konakçısına nasıl zarar verdiğini aydınlatmak için in vivo patojen gen ekspresyonunu doğru bir şekilde ölçmektir. Bu teknik, enfeksiyöz hastalıklar alanındaki araştırmacıların, gerçek bir enfeksiyon sırasında çeşitli doku tiplerinde ve birden fazla zaman noktasında patojen gen ekspresyon dinamiklerini incelemelerinin önünü açmıştır. Bu yöntemin temel avantajı, yüksek hassasiyete sahip ve son derece tekrarlanabilir olmasıdır.

Bu yöntem, gerçek bir enfeksiyondan alınan çok küçük miktardaki dokularda patojen gen ekspresyonunun kantifikasyonunu mümkün kılar. Reaktiflerin hazırlanmasına başlamak için, RLT tamponuna 2-Mercaptoethanol ekleyin ve iyice karıştırın. Fenol-kloroform izoamil alkol çözeltisinden 25:24:1 oranında bir karışım hazırlayın.

M-tipi homojenizasyon tüplerini etiketleyin ve buz üzerinde soğutun. İki mililitrelik vidalı kapaklı tüpleri etiketleyin ve her bir tüpe yaklaşık 300 microliter zirkonya boncuğu ekleyin. Doku ayrıştırıcı, boncuk kırıcı (bead beater), 50 milliliter tüpler ve 96 kuyucuklu plakalar için adaptörleri olan bir masaüstü santrifüj ve bir fotometre dahil olmak üzere aşağıdaki cihazları kullanıma hazır hale getirin.

C.albicans ile enfekte edilmiş farelerden izole edilen ve daha önce dondurulmuş böbrekleri 80 derece celsius dondurucudan çıkarın ve buz üzerine koyun. Her bir böbreğe 1,2 milliliters RLT tamponu ekleyin. Ardından, tampon içeren her böbreği M-tipi bir homojenizasyon tüpüne aktarın.

Kullanılan RLT tamponu miktarı deneysel olarak belirlenir. Çok fazla RLT tamponu numune konsantrasyonunu seyreltecek, çok azı ise homojenatı çok viskoz hale getirerek işlemesini son derece zorlaştıracaktır. Ardından, önceden yüklenmiş RNA 2.01 ayarına sahip bir doku parçalayıcı kullanarak böbrekleri homojenize edin.

Ardından, 1000 x G hızında bir dakika boyunca santrifüjleyin. Her bir homojenattan 600 microliters miktarını zirkonya boncuklar içeren vidalı kapaklı bir tüpe aktarın ve geri kalan homojenatı buz üzerinde saklayın. Her tüpe 600 microliters fenol-kloroform izoamil alkol ekleyin, kapakları sıkıca kapatın ve boncuklu parçalayıcıda dört degrees celsius sıcaklıkta üç dakika boyunca vorteksleyin.

4 °C'de beş dakika boyunca 15,000 G'de santrifüj edin. Sulu fazı dikkatlice yeni bir 1,5 mL mikrofüj tüpüne aktarın ve eşit hacimde %70 etanol ekleyin. Ardından spin kolona yükleyin ve 8,000 x G'de santrifüj edin. Her bir spin kolonu, 700 µL tampon RW ile bir kez, ardından 500 µL tampon RPE ile iki kez yıkayın.

Kolonları kuru toplama tüplerine aktarın ve kalan tüm sıvıyı uzaklaştırmak için bir dakika daha santrifüjleyin. Son olarak, RNA'yı elüe etmek için 50 µL su kullanın. Ardından, RNA konsantrasyonunu ölçmek için OD 260 nanometre değerinde bir spektrofotometre kullanın.

Dijital barkodlama kullanarak gen ekspresyon profillemesi gerçekleştirmek için, öncelikle raporlayıcı kod setini ve yakalama kod setini buz üzerinde çözerek başlayın. Raporlayıcı kod setine 130 µL hibridizasyon tamponu ekleyin. Karıştırmak için ters çevirin ve santrifüjle çöktürün.

Ardından, 12 reaksiyon tüpünün her birine karışımdan 20 µL ekleyin. Daha sonra, her tüpe 10 µg toplam doku RNA'sı ekleyin ve pipetleyerek karıştırın. Enfeksiyon modeline, inokülasyon boyutuna ve kullanılan patojen suşuna bağlı olarak, toplam RNA içindeki patojen RNA yüzdesi %0 ile %2 arasında değişmektedir. Bu nedenle, her biri için eklenmesi gereken toplam RNA miktarı ampirik olarak optimize edilmelidir.

Şimdi her tüpe beş µL yakalama kodu seti ekleyin. Tüpleri altüst ederek karıştırın ve hızlıca santrifüjleyin. Ardından reaksiyonları, ısıtmalı kapaklı bir termal döngüleyici cihazda yaklaşık 18 saat boyunca 65 °C'de inkübe edin.

20 °C'den bir numune kartuşu çıkarın ve oda sıcaklığına gelmesini bekleyin. 4 °C'den iki reaktif plakası çıkarın ve bir masaüstü santrifüjde 670 x G hızında iki dakika boyunca döndürün. Ardından, ekrandaki adım adım talimatları izleyerek yüksek hassasiyet seçeneğini belirleyin ve hazırlık istasyonunu kurun.

Ardından reaksiyonları termal döngüleyiciden çıkarın ve hemen hazırlık istasyonuna yükleyin. Üç saatlik yüksek hassasiyetli program çalıştırıldıktan sonra kartuşu çıkarın ve şeritleri mühürlemek için şeffaf bant kullanın. Gerekiyorsa kartuşun altına mineral yağ uygulayın.

Ardından kartuşu dijital analizöre yerleştirin. Ekrandaki adım adım talimatları izleyerek ve yüksek çözünürlüklü tarama seçeneğini belirleyerek dijital analizörü kurun. Tarama programını çalıştırdıktan sonra sonuçları indirin veya e-posta ile almayı seçin ve ham verileri üreticinin yazılımına aktarın.

Verileri metin protokolüne göre analiz edin. Bu videoda gösterilen protokolün, özgünlüğü artırmak ve konakçı RNA'sından kaynaklanan gürültüyü azaltmak için hem bir yakalama probu hem de bir rapor probu kullanması şeklinde benzersiz bir avantajı vardır. Burada gösterildiği gibi, enfekte olmamış bir doku örneğinden elde edilen arka plan ham sayımlarının tamamı 10'un altındayken, iki enfekte doku örneğinden elde edilen ham sayımların tamamı 10'un üzerindeydi.

İki biyolojik örnekten elde edilen ham sayımlar, 0,945'lik bir R kare değeri ile çok iyi korelasyon göstermiştir. Platform, doğal biyolojik ekspresyon seviyelerini kapsayacak yeterli dinamik aralığı da sağlamaktadır. 248 çevresel yanıt genini belirleyen bir prob seti kullanılarak, patojen gen ekspresyonunun iki fazı belirlenmiştir.

Erken gen ekspresyon yanıtı, inokülum ile enfeksiyon sonrası 12. saat örnekleri arasında RNA seviyeleri anlamlı derecede farklı olan genleri içerir. Ayrıca, 12. saat noktası ile enfeksiyon sonrası 48. saat örnekleri arasında RNA seviyeleri anlamlı derecede farklı olan genleri içeren geç bir gen ekspresyon yanıtı da tespit edilmiştir. Bu sonuçlar, C.albicans gen ekspresyonunun bir memeli konakçısının invaziv enfeksiyonu sırasında dinamik olarak düzenlendiğini göstermektedir.

Bu yöntem kolay ve hızlıdır. Doku toplamadan verilerin ifade edilmesine kadar olan tüm prosedür 48 saatten kısa sürer. 12 örnek için uygulama süresi yaklaşık dört saattir.

Bu yöntem in vivo patojen gen ekspresyonunu yakalamak için geliştirilmiş olsa da, aynı yöntem konakçı gen ekspresyonunu belirlemek için de kullanılabilir. Bu sayede araştırmacılar, bir enfeksiyonun her iki tarafı hakkında aynı anda faydalı bilgiler edinebilirler.