Name: Dijital Çizgi-kodlama Platformu kullanarak bulaşmasını Mikroplar Gen İfadesi profil (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-01-13T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 13 s
Description: Öğrenin, dijital çizgi-kodlama platformu kullanarak C. albicans enfeksiyonlarında patojen gen ifadesini hassas ve tekrarlanabilir şekilde profillemeyi. Bu yöntem, küçük doku örneklerinden in vivo gen dinamiklerini nicelendirmeyi mümkün kılar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Bu çalışma NIH hibe R21 DE023311 (APM), R56 AI111836 (APM &amp; SGF), R01 AI054928 (SGF) ve R01 DE017088 (SGF) tarafından kısmen desteklenmiştir.

Bütün hayvan prosedürleri Los Angeles Biyomedikal Araştırma Enstitüsü Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu tarafından (protokol 011000) onaylı ve hayvanların etik tedavisi için Sağlık (NIH) kurallar National Institutes göre gerçekleştirilmiştir. Fareler Harbor-UCLA Araştırma ve Eğitim Enstitüsü kampüsünde bulunan bir AAALAC akredite tesis kafesli bulundu. Laboratuar hayvanları hekimliği konusunda uzmanlaşmış bir tam zamanlı veteriner onların bakımını yönetti. Kafes ve hayvancılık ABD Kamu Sağlığı Hizmetleri yayın &quot;Laboratuvar Hayvanları Bakım ve Kullanım Kılavuzu&quot; kurallarına göre sağlandı. Her girişimi insanca fareler tedavi etmek için yapılmıştır. Farelerin hayatta kalışı, sağlık günde üç kez izlenmiştir. Açıkçası hasta, uyuşuk fare grubundan ayrılmış ve acı en aza indirmek için ötenazi uygulandı. Euthanas Panel tarafından tavsiye edilen fareler doz aşımı pentobarbital (210 mg / kg) ile ötenazi uygulandıAmerikan Veteriner Hekimleri Birliği ia. Dokular, Reaktifler ve Araçların 1. Hazırlık <ol><li> Tüm çalışmalar için 20-22 g ağırlığındaki erkek Balb / c fareleri kullanın. Damar içine 1 x 10 6 maya faz C deney grubu başına üç fare inoküle albicans hücreleri. Belirli zaman noktalarında sonrası enfeksiyon hayvanların ve hasat böbrekleri Kurban. Vidalı kapaklı bir tüp içine her bir böbrek yerleştirin daha sonra RNA ekstraksiyonu 6 -80 ° C &#39;de sıvı azot içinde dondurulması ve bir mağaza ek. Not: Xu ve ark detaylı olarak tarif edildiği gibi hayvan deneyleri gerçekleştirilmiştir 6.. </li><li> -80 ° C derin dondurucuda böbreklerin çıkarmadan önce aşağıdaki reaktifler ve araçları hazırlayın: <ol><li> Toplam RNA ekstraksiyon kiti açın. 2-merkaptoetanol ekleme (% 1 v / v) RLT tamponu ve (her bir örnek için 2 ml hazırlama) iyice karıştırın. </li><li> Fenol hazırlayın: kloroform: izoamil alkol 25: 24: 1 (her bir örnek için 600 ul gerekir). </li><li> Etiket M-tipi homojenizasyon tüpleri (M-tüp) ve buz üzerinde soğuk. </li><li> Etiket 2 mi kap tüpleri vida ve her tüpe yaklaşık 300 ul zirkonyum boncukları ekleyin. </li><li> Ara cihazları mevcuttur: Doku ayıracı, beadbeater, 50 ml tüpler ve 96 gözlü levhalar, fotometre adaptörleri ile masa santrifüj. </li></ol></li></ol> Enfekte Dokular 2. RNA Ekstraksiyon <ol><li> -80 ° C derin dondurucuda böbreklerin içeren tüpleri çıkarın ve buz koymak. Her böbrekte 2-mercaptoethanol ile rlt tampon ml 1.2 ekleyin. M-tipi homojenizasyon tüpleri içine tampon ile böbrek Durusu. </li><li> Önceden yüklenmiş ayarı RNA_02.01 bir doku aynştıncı kullanarak böbrek homojenize. </li><li> Oda sıcaklığında, bir masa üstü santrifüjü içinde 1 dakika boyunca 1000 x g&#39;de santrifüjleyin. </li><li> Zirkonyum boncuklar içeren vidalı kapaklı tüpe 600 ul Homojenat aktarın. Buz üzerinde kalan Homojenat kaydedin. </li><li> 600 ul fenol ekleyin: kloroform: izoamil alkol 25: 24: 1 ilaÖnceki aşamada elde edilen borular. </li><li> 4 ° C soğuk odada 3 dakika süreyle beadbeater sıkıca kapaklarını kapatın ve vorteks. </li><li> 4 ° C soğuk oda 5 dakika boyunca 15.000 x g&#39;de santrifüjleyin tüpler. </li><li> Dikkatle, yeni bir 1.5 ml mikrofüj tüpe sulu faz transferi% 70 etanol içinde eşit hacimde iyice karıştırın, daha sonra (iki kez yük) sıkma kolonu üzerine yüklenir. </li><li> Iki kez 500 ul tampon RPE ardından 700 ul tampon RW ile bir kez spin kolon yıkayın. Kuru toplama tüpüne Santrifüj bir ekstra dakika spin kolon kalan sıvıyı çıkarmak için. 8000 x g&#39;de santrifüj tüm adımları uygulayın. </li><li> 50 ul H2O ile Zehir RNA Bir spektrofotometre kullanılarak OD 260 RNA konsantrasyonu ölçün. </li></ol> 3. Gen İfadesi Dijital Çizgi-kodlama kullanarak profilleme <ol><li> Çözülme raportör karakterkümesi (yeşil kapak tüp) ve buz üzerinde yakalama karakterkümesi (gri kapak tüp). </li><li> Yeniden 130 ul hibridizasyon tamponu ekleyinporter karakterkümesi, mix ve aşağı dönmeye ters çevirin. </li><li> 12, reaksiyon tüplerinin her karışımın 20 ul ekle. </li><li> Her tüpe (5 ul bir hacim içinde) toplam doku RNA 10 ug ekleyin. Pipetleme karıştırın. </li><li> Her tüpe 5 ul yakalama karakterkümesi ekleyin. Hızlı bir dönüş aşağı ardından tüp çevirerek karıştırın. </li><li> Isıtılmış kapak O / N (~ 18 saat) ile birlikte, bir termal döngü 65 ° C &#39;de reaksiyonlar inkübe edin. </li><li> -20 ° C den bir numune kartuşunu çıkarın ve oda sıcaklığına sıcak olsun. </li><li> Bir masaüstü santrifüj 2 dakika boyunca 670 x g&#39;de 4 ° C ve santrifüj, iki reaktif plakaları çıkarın. </li><li> Ekranda adım adım yönergeleri izleyerek hazırlık istasyonu kurmak yüksek hassasiyet seçeneği seçin. </li><li> Termal döngü gelen tepkileri çıkarın ve hemen hazırlık istasyonunda yükleyin. Yüksek hassasiyet programı (3 saat) çalıştırmak için seçin. </li><li> Hazırlık istasyonu programı tamamlandığında, kartuşu çıkarın ve net bir bant ile şerit mühür. Apkatlı kartuşun altına mineral yağ (nesil biri için nCounter sadece nesiller bu adımı gerekmez sonrası), daha sonra dijital analizörü üzerine kartuşu yükleyin. </li><li> Yüksek çözünürlüklü tarama seçeneğini ekrandaki adım adım talimatları takip ederek dijital analizörü ayarlayın. </li><li> Tarama programı (~ 4.5 saat), yüksek çözünürlük (600 alanlar) seçeneği seçin çalıştırın. </li><li> Tarama programı tamamlandığında, sonuçlar indirmek (veya e-posta yoluyla sonuçlar almayı tercih) ve üreticinin yazılımı içine ham veri aktarmak. Yazılım otomatik olarak veri kalitesini kontrol etmek ve verilerin kalitesi normal aralığın dışında kalırsa bayrakları çıkaracağız. Daha sonra bir excel dosyası olarak veri ihracat, (yazılım yönergeleri izleyin opsiyonel) Dahili fonksiyonunu kullanarak teknik ayarlama yapın. </li><li> Aşağıdaki yöntemlerden birini kullanarak verileri normalleştirmek: codeset tüm genlerden toplam sayıları; Bir ya da birkaç iç kontrol genleri; geometrik ortalamayüksek ölçüde eksprese edilen genler (tartışmaya bakınız). </li><li> Daha sonra farklı deney grupları arasında ifade düzeylerinin oranını hesaplamak, her genin (deney çoğaltır veya üç kez yapıldı ise) için ortalama ifade değerlerini hesaplayın. </li><li> (isteğe bağlı) analiz ve MultiExperiment Görüntüleyici 10 olarak nSolver yazılım veya bir kümelenme programında yerleşik işlevleri tarafından profilleme sonuçları görselleştirmek. </li></ol>

<ol><li>Cairns, T., Minuzzi, F., Bignell, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+host-infecting+fungal+transcriptome%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiol+Lett%22%5BJournal%5D)">The host-infecting fungal transcriptome.</a> FEMS Microbiol Lett. 307 (1), 1-11 (2010).</li>
<li>Westermann, A. J., Gorski, S. A., Vogel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual+RNA-seq+of+pathogen+and+host%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Dual RNA-seq of pathogen and host.</a> Nat Rev Microbiol. 10 (9), 618-630 (2012).</li>
<li>Creecy, J. P., Conway, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+bacterial+transcriptomics+with+RNA-seq%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Quantitative bacterial transcriptomics with RNA-seq.</a> Curr Opin Microbiol. 23C, 133-140 (2015).</li>
<li>Geiss, G. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+multiplexed+measurement+of+gene+expression+with+color-coded+probe+pairs%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Direct multiplexed measurement of gene expression with color-coded probe pairs.</a> Nat Biotechnol. 26 (3), 317-325 (2008).</li>
<li>Malkov, V. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplexed+measurements+of+gene+signatures+in+different+analytes+using+the+Nanostring+nCounter+Assay+System%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Res+Notes%22%5BJournal%5D)">Multiplexed measurements of gene signatures in different analytes using the Nanostring nCounter Assay System.</a> BMC Res Notes. 2, 80(2009).</li>
<li>Xu, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+and+Alliance+of+Regulatory+Pathways+in+C.+albicans+during+Mammalian+Infection%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biology%22%5BJournal%5D)">Activation and Alliance of Regulatory Pathways in C. albicans during Mammalian Infection.</a> PLoS Biology. 13, e1002076(2015).</li>
<li>O'Meara, T. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Cryptococcus+neoformans+Rim101+Transcription+Factor+Directly+Regulates+Genes+Required+for+Adaptation+to+the+Host%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The Cryptococcus neoformans Rim101 Transcription Factor Directly Regulates Genes Required for Adaptation to the Host.</a> Mol Cell Biol. 34 (4), 673-684 (2014).</li>
<li>Cheng, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Profiling+of+Candida+albicans+Gene+Expression+During+Intra-Abdominal+Candidiasis+Identifies+Biologic+Processes+Involved+in+Pathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">Profiling of Candida albicans Gene Expression During Intra-Abdominal Candidiasis Identifies Biologic Processes Involved in Pathogenesis.</a> J Infect Dis. 208 (9), 1529-1537 (2013).</li>
<li>Fanning, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Divergent+Targets+of+Candida+albicans+Biofilm+Regulator+Bcr1+in+Vitro+and+In+Vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Eukaryot+Cell%22%5BJournal%5D)">Divergent Targets of Candida albicans Biofilm Regulator Bcr1 in Vitro and In Vivo.</a> Eukaryot Cell. 11 (7), 896-904 (2012).</li>
<li>Saeed, A. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TM4%3A+a+free%2C+open-source+system+for+microarray+data+management+and+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">TM4: a free, open-source system for microarray data management and analysis.</a> Biotechniques. 34 (2), 374-378 (2003).</li>
</ol>

Bu protokol, Carnegie Mellon Üniversitesi'ndeki Dr. Aaron P. Mitchell'in laboratuvarında geliştirilmiştir. Bu makalenin yayınlanması NanoString Technologies tarafından desteklenmektedir.

Bu protokol nanoString nCounter platformu kullanarak mikropların bulaşmasını kopyalanma profilleme optimize etmek için geliştirilmiştir. Bütün prosedür, ifade verileri doku toplama, en az 48 saat gerektirir. Hands-on defa 12 örnek için yaklaşık 4 saat olduğunu. Bu protokolde Bir anahtar değişken ilk aşamada dokuya eklenen tampon RLT miktarıdır. Çok az bir tampon fenol kloroform ile ekstraksiyon adımından sonra, viskoz jellerin oluşmasına yol açabilir ve RNA geri kazanımı için herhangi bir sulu faz bırakabilir ise çok fazla tampon, Homojenat seyreltilmiş ve RNA konsantrasyonunu düşürmek için yol açacaktır. (Tipik boyutları varsayarak) fare dokuları için tampon RLT arasında deneysel olarak tespit uygun hacimleri: böbrek (1.2 mi), dil (1.0 mi) ve akciğer (2.0 mi). Özellikle bu ipliksi formda yetişen mikrobiyal patojenler için, boncuk yenerek adım tamamen hücresel içeriği serbest bırakmak için açık kalın hücre duvarını kırmaya yardımcı olur. Elüsyon adımında, sırayla nihai RNA artırmak içinkonsantrasyon, ilk turu eluatı sütuna geri eklenir ve ikinci kez Zehir olabilir. Yaklaşık 100 ug toplam doku RNA için tek bir RNeasy spin kolon (~ 2 mg / ml x 50 ul) elde edilebilir. RNA daha fazla miktarda gerekli ise, ikinci bir preparatif kalan doku homojenatı yapılabilir. RNA konsantrasyonu ölçülmüştür kadar sadece durumda, kalan homojenatın atmayın. Enfeksiyon modeline bağlı olarak, inokulum büyüklüğü ve patojen suş, toplam doku RNA patojen RNA yüzdesi% 0 -2% arasında değişir ve genellikle% 0.05% -0.5 aralığında düşüyor. C arasında toplam doku RNA Örneğin, 10 ug albicans ile enfekte saf C 10 ng eşit ham sayıları yaratabilir böbrek bir in vitro kültüründen albicans RNA (10 ng / 10 ug =% 0.1). Toplam doku RNA patojen RNA yüzdesi geniş bir aralıkta değişir, çünkü bu pathoge miktarını bilmek zor olduğuToplam RNA&#39;nın belirli bir miktarda n RNA. Israf karakterkümesi önlemek için tespit seviyesinin altında patojen RNA ile numuneler üzerinde (250 x 192 genleri reaksiyonları için, reaksiyon başına maliyeti yaklaşık 200 $), bir RNA kalite kontrol adımı, her numune içindeki patojen RNA seviyesini belirlemek için gerçekleştirilebilir. Bu S-RTPCR ya da birkaç temizlik genleri ihtiva eden küçük bir karakterkümesi biri ile yapılabilir. Patojen genler kullanılarak Normalleştirme, farklı örnekleri arasında mukayese edilebilir ifade profillerinin önce kritik bir adımdır. Normalleştirilmesi için üç yaygın olarak kullanılan yöntem vardır. Karakterkümesi tüm genlerden 1. Kullanım toplam sayar. 2. Bir veya birkaç &#39;temizlik&#39; genler. 3. geometrik ortalama (N, N sayının ürünün kök th) yüksek ölçüde sentezlenen genlerin. Büyük bir karakterkümesi (&gt; 100 gen), iyi bir seçim olabilir normalleşmesi için toplam sayıları kullanarak, rastgele seçilen sondalar içeren için çünkü ilgisiz genlerin olabilir inanç çok sayıda toplam sayılarıTam RNA girdi miktarı yansıtmaktadır. Küçük bir karakterkümesi (hifal büyüme genleri birlikte düzenlenir eğiliminde olduğu göz önüne alındığında bu tür hifal büyümesi gibi) belirli bir süreç odaklı sondalar içeren (&lt;100 genler), birini seçerek ya da birkaç temizlik genler için normalleşmesi için kontrol şarttır olarak. TDH3, bir sağlam ifade metabolik gen, birçok deneyler için bir kontrol de hizmet vermiştir. Üçüncü yöntem son derece ifade genlerden eşit katkılarından dolayı bir vurgu ile, yöntem 1 ve 2 bir melez. NCounter platformu genom çapında olmamasına rağmen, bu, tek bir deneyde 800 genlerin için ifade seviyesi ölçümü sağlar. Bu nedenle, analiz etmek en bilgilendirici genlerin seçme profilleme başarısı için kritik öneme sahiptir. Prob seçmek için iki yaklaşım kullanılmaktadır. İlk yaklaşım &quot;temelli bilgi&quot; dir. Yayımlanmış ifade ve işlevsel verilerden Bilgi akımına potansiyel ilgi genleri için ekrana derlenmişBu çevresel tepki genlerinin 6-9 olarak çalışma. Bu yaklaşım, in vivo dolayısıyla veri yorumlama bağlamı sağlayan birçok mevcut veri setleri veri profilleme kolay karşılaştırılmasını sağlar. İkinci yaklaşım &quot;tabanlı keşif&quot; dir. Gibi transkripsiyon faktörlerini, kinaz veya hücre duvarı proteinlerinin belirten tüm genler gibi mikrop genomundaki genleri, kategorisi sondaları seçilmiştir. Bu yaklaşım, in vivo verileri 6 profilleme dayalı yeni virülans faktörleri ve yeni düzenleyici ilişkilerin keşif belirlenmesini sağlar.

Gen ifadesi dinamikleri, bir hücre çevresel değişikliklere nasıl tepki hakkında önemli bilgiler tutar. Bir enfekte mikrop durumunda, gen ekspresyon verileri, patojen enfeksiyon ortama uyum sağlar ve konakçıya zarar ilgili klinik açıdan önemli bakış açıları sağlayacaktır. Son yirmi yılda, in vitro ve in vivo hem de gen ekspresyon çalışmaları veri büyük miktarda üretilen ve enfeksiyon biyoloji 1-3 anlamak için bir temel atılmıştır. Bununla birlikte, mikrodizi, RNAseq dahil olmak üzere mevcut profil teknolojileri, enfeksiyon sırasında patojen gen ekspresyonunun profil için optimal değildir. RNA, enfeksiyon oluşmuş doku örneklerinden izole edilmiş toplam RNA&#39;nın ezici kısmı (genellikle&gt;% 99) oluşturmaktadır barındırır. Konak RNA mikrodizinlerinde yüksek arka katkıda bulunur ve dizi RNAseq okur hakimdir. Enfekte dokudan Patojen hücre izolasyonu, teorik olarak patojen RNA için zenginleştirmek için yardımcı olabilir, ancak ek olarak teşkilal problemleri: enfekte doku büyük miktarlarda gerektirir; prosedür sıkıcı olabilir; ve daha da önemlisi, bu uzun bir süreç boyunca yerel durum ya da RNA&#39;nın bütünlüğü muhafaza etmek zordur. Gerçek enfeksiyonları sırasında patojen gen ifadesi üzerinde daha kapsamlı ve doğru veri elde etmek amacıyla, biz karışık RNA nüfusta azınlık RNA türlerinin güvenilir ve uygun maliyetli kantifizasyonunu bir protokol geliştirmek için yola çıktı. NanoString nCounter 4, 5. Bu platform QRT-PCR ile karşılaştırılabilir bir hassasiyet seviyesine sahip enzimatik amplifikasyonu gerektirmez dijital bar kodlu prob çiftleri kullanılarak gen ekspresyonunun doğrudan multiplekslenmiş ölçümü yapar yeni geliştirilmiş bir platformdur. Teknoloji genom çapında değil, her deneyde kadar 800 farklı genlerin saptanmasını sağlar. Bu nedenle, bu profil için problar olarak bilgilendirme genleri seçmek için çok önemlidir. Burada büyük bir uğultu çalışma profilleme gen ifadesini kullanmakÖrnek olarak invaziv enfeksiyon sırasında patojen, Candida albicans, göstermek için: 1) deneysel prosedürleri (protokol) Teknik ayrıntılar, 2) Bu yöntemin duyarlılığı, tekrarlanabilirlik ve dinamik aralık (temsilcisi sonuçları) ve 3) Önemli Bu protokol (tartışma) dayalı deney tasarlama ve gerçekleştirmek için dikkat edilmesi gereken noktalar. Bu protokol, kolayca çeşitli patojenler için adapte edilebilir ve başarılı bir şekilde enfeksiyon modellerinde 6-9 bir dizi tatbik edilmiştir.

<table><tbody><tr><td>gentleMACS Ayrıştırıcı</td><td>Miltenyl Biotec</td><td>130-093-235</td><td></td></tr><tr><td>gentelMACS M tüpü</td><td>Miltenyl Biotec</td><td>130-093-236</td><td></td></tr><tr><td>RNeasy Mini Kit</td><td>QIAGEN</td><td>74104</td><td></td></tr><tr><td>2-merkaptoetanol</td><td>Sigma</td><td>M-3148</td><td></td></tr><tr><td>Fenol: CHCl3: IAA</td><td>Sigma</td><td>P-2069</td><td></td></tr><tr><td>Zirkonya boncuklar</td><td>Biospec Ürünleri</td><td>11079110zx</td><td></td></tr><tr><td>Mini-Beadbeater-16</td><td>Biospec Ürünleri</td><td>607</td><td></td></tr><tr><td>nCounter Analiz sistemi</td><td>nanoString Teknolojileri</td><td></td><td></td></tr><tr><td>nCounter Gen İfade Kod Setleri</td><td>nanoString Teknolojileri</td><td></td><td></td></tr><tr><td>nSolver Analiz aracı</td><td>nanoString Teknolojileri</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

dijital Çizgi-kodlama platform&#39;u kullanarak bulaşmasını mikroplar gen İfadesi profil

Gene Expression Profiling of Infecting Microbes Using a Digital Bar-coding Platform

En memeli patojenler için, çalışmalar profilleme gen ifadesi doğru enfekte dokulardan patojen gen transkript ölçmek için teknik zorluklar ile sınırlı kalmıştır. Patojen RNA enfekte doku örneklerinden izole edilen total RNA küçük bir bölümünü oluşturmaktadır. Mikroarray ve RNAseq teknolojileri Hem güvenilir zayıf dile patojen genlerin okur üreten zorluklar var. In vivo çoğalması azalmış olan mutant suşlar patojen daha büyük bir sorun teşkil etmektedir. Burada, çok hızlı son derece hassas ve son derece tekrarlanabilir bir in vivo gen ekspresyon profili protokol açıklar. Biz hematojen yaygın kandidiyazis bir fare modelinde mantar patojen Candida albicans bizim soruşturma sırasında bu protokolü geliştirdi. Bu protokolü kullanarak, dinamik düzenlenmiş C. zaman derslerini belgeledi albicans gen böbrek enfeksiyonu sırasında ifade ve keşfedilen beklenmedik özelliklerigen ekspresyon tepkileri vivo ilaç tedavisi antifungal.

Patojen gen ifadesi in vivo profilleme için bir temel zorluk yeterli patojen RNA okur elde etmektir. Toplam RNA, toplam RNA, büyük miktarda patojen transkript düşük yüzdeli verilen (&gt; 10 ug), her bir reaksiyon için kullanılacak sahiptir. Platform bu açıdan benzersiz bir avantaja sahiptir: bir yakalama probu ve ev sahibi RNA ezici bir miktar gürültü önemli bir seviyeye neden olmaz, böylece özgüllüğünü artırmak için bir rapor prob hem kullanır. İki enfekte doku örnekleri (mavi nokta) ham sayıları oluşturulan her şeyden 10. İfade veri iken Şekil 1&#39;de gösterildiği gibi, (Ref uyarlanmıştır. 6), bir bulaşmamış doku örneğinden arka plan ham sayımları (kırmızı noktalar), tüm 10 altında olduğu Bu protokolü kullanarak son derece tekrarlanabilir. Şekil 1&#39;de gösterildiği gibi, (Ref uyarlanmıştır. 6), ham sayıları iki biyolojik çoğaltır (mavi noktalar, 48 saat sonrası enfeksiyon böbrek örnekleri) çok goo vardıR-kare değeri d korelasyon, 0.945 eşittir. Platform ayrıca doğal biyolojik ifade seviyelerini kapsayacak şekilde yeterli dinamik aralığı sağlar (Şekil 1, ham sayıları 6 1 10 ila 10 arasında değişmektedir). Bir erken gen ifadesi tepki aşı ile 12 saat arasında anlamlı farklılık RNA düzeyleri genleri içerir: 248 çevre yanıt genleri belirten bir prob seti kullanarak, patojen geni (. Ref uyarlanan Şekil 2&#39;de, 6) ifade iki aşamadan ayırt başardık Enfeksiyondan örnekleri (p &lt;0.05 ve&gt; ifadede 2 kat değişiklik), ve geç gen ifade yanıtı 48 saat sonrası enfeksiyon örneklerinde (P 12 saat zaman noktasında arasında anlamlı farklılık olduğu RNA düzeyleri ile genleri &lt;0.05 içermektedir ve&gt; 2 kat ifadesinde değişiklik). Bu sonuçlar göstermektedir C albicans gen ekspresyonu dinamik invaziv infectio sırasında düzenlenirbir memeli konakçının n. <img alt="figür 1" src="/files/ftp_upload/53460/53460fig1.jpg" /> Şekil Ham enfekte olan ve olmayan böbrek dokulardan sayar 1.. (. Ref 6 uyarlanmıştır) Sonda böbrek örnekleri dağılım olarak sunulmuştur iki enfekte (48 saat sonrası enfeksiyon, mavi veri noktaları) ve bir bulaşmamış (kırmızı veri noktaları) için sayar arsa. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53460/53460fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 2," src="/files/ftp_upload/53460/53460fig2.jpg" /> C Şekil 2. İfade albicans çevre duyarlı genlerin invaziv enfeksiyon sırasında (Ref uyarlanan. 6). ekspresyon düzeylerinde değişiklikler 248 C için fare böbrek işgali sırasında albicans genleri bir ısı m sunulmuşturap biçimi. Biyolojik kopyalardaki ortalama değerleri up-regülasyonu (sarı) için gösterilen ve 12, 24. genlerin (mavi), ve 48 saat sonrası enfeksiyon göreli düzenleme aşağı inokulum seviyeleri (0 saat) anlamına. Renk doygunluğu yukarı katlayın veya aşağı-regülasyon 10 tam doygunluk ile ifade değişimin boyutunu temsil eder. Isı haritası bölümleri temsilcisine kadar erken düzenlenen genlerin (üstte), geç genlerin (orta) ve erken aşağı düzenlenen genlerin (alt) göstermek için genişletilir. Bu porsiyonlar halinde, bireysel örnekler tekrarlanabilir göstermek için ayrı ayrı sunulmuştur. Biz aşı ve 12 saat örnekler arasında önemli farklılıklar gibi erken ifade değişiklikleri tanımlar. Biz 12 ve 48 saat örnekler arasında önemli farklılıklar gibi geç ifade değişiklikleri tanımlar. Önemi&gt; 2 kat ve bir p-değeri &lt;0.05 değişiklikler anlamına gelir. Ortalama değerler hesaplandı önce her bir numune için veri, kontrol geni TDH3 RNA düzeylerine normalleştirildi. Bizim atama kriterleri bazı Dynamica izinLly düzenlenen genler erken ve geç ifade sınıfları hem içine düşmek. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53460/53460fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a>

Bir enfeksiyon sırasında patojen gen ekspresyon profili oluşturmak için hızlı, hassas ve tekrarlanabilir bir protokol geliştirdik.

Dijital Çizgi-kodlama Platform&#39;u kullanarak bulaşmasını Mikroplar Gen İfadesi profil

For most mammalian pathogens, gene expression profiling studies have been limited by technical difficulties to accurately quantify pathogen gene ...

Bu deneyin genel amacı, bir patojenin enfeksiyöz ortama nasıl adapte olduğunu ve konakçısına nasıl zarar verdiğini aydınlatmak için in vivo patojen gen ekspresyonunu doğru bir şekilde ölçmektir. Bu teknik, enfeksiyöz hastalıklar alanındaki araştırmacıların, gerçek bir enfeksiyon sırasında çeşitli doku tiplerinde ve birden fazla zaman noktasında patojen gen ekspresyon dinamiklerini incelemelerinin önünü açmıştır. Bu yöntemin temel avantajı, yüksek hassasiyete sahip ve son derece tekrarlanabilir olmasıdır.Bu yöntem, gerçek bir enfeksiyondan alınan çok küçük miktardaki dokularda patojen gen ekspresyonunun kantifikasyonunu mümkün kılar. Reaktiflerin hazırlanmasına başlamak için, RLT tamponuna 2-Mercaptoethanol ekleyin ve iyice karıştırın. Fenol-kloroform izoamil alkol çözeltisinden 25:24:1 oranında bir karışım hazırlayın.M-tipi homojenizasyon tüplerini etiketleyin ve buz üzerinde soğutun. İki mililitrelik vidalı kapaklı tüpleri etiketleyin ve her bir tüpe yaklaşık 300 microliter zirkonya boncuğu ekleyin. Doku ayrıştırıcı, boncuk kırıcı (bead beater), 50 milliliter tüpler ve 96 kuyucuklu plakalar için adaptörleri olan bir masaüstü santrifüj ve bir fotometre dahil olmak üzere aşağıdaki cihazları kullanıma hazır hale getirin.C.albicans ile enfekte edilmiş farelerden izole edilen ve daha önce dondurulmuş böbrekleri 80 derece celsius dondurucudan çıkarın ve buz üzerine koyun. Her bir böbreğe 1,2 milliliters RLT tamponu ekleyin. Ardından, tampon içeren her böbreği M-tipi bir homojenizasyon tüpüne aktarın.Kullanılan RLT tamponu miktarı deneysel olarak belirlenir. Çok fazla RLT tamponu numune konsantrasyonunu seyreltecek, çok azı ise homojenatı çok viskoz hale getirerek işlemesini son derece zorlaştıracaktır. Ardından, önceden yüklenmiş RNA 2.01 ayarına sahip bir doku parçalayıcı kullanarak böbrekleri homojenize edin.Ardından, 1000 x G hızında bir dakika boyunca santrifüjleyin. Her bir homojenattan 600 microliters miktarını zirkonya boncuklar içeren vidalı kapaklı bir tüpe aktarın ve geri kalan homojenatı buz üzerinde saklayın. Her tüpe 600 microliters fenol-kloroform izoamil alkol ekleyin, kapakları sıkıca kapatın ve boncuklu parçalayıcıda dört degrees celsius sıcaklıkta üç dakika boyunca vorteksleyin.4 °C'de beş dakika boyunca 15,000 G'de santrifüj edin. Sulu fazı dikkatlice yeni bir 1,5 mL mikrofüj tüpüne aktarın ve eşit hacimde %70 etanol ekleyin. Ardından spin kolona yükleyin ve 8,000 x G'de santrifüj edin. Her bir spin kolonu, 700 µL tampon RW ile bir kez, ardından 500 µL tampon RPE ile iki kez yıkayın.Kolonları kuru toplama tüplerine aktarın ve kalan tüm sıvıyı uzaklaştırmak için bir dakika daha santrifüjleyin. Son olarak, RNA'yı elüe etmek için 50 µL su kullanın. Ardından, RNA konsantrasyonunu ölçmek için OD 260 nanometre değerinde bir spektrofotometre kullanın.Dijital barkodlama kullanarak gen ekspresyon profillemesi gerçekleştirmek için, öncelikle raporlayıcı kod setini ve yakalama kod setini buz üzerinde çözerek başlayın. Raporlayıcı kod setine 130 µL hibridizasyon tamponu ekleyin. Karıştırmak için ters çevirin ve santrifüjle çöktürün.Ardından, 12 reaksiyon tüpünün her birine karışımdan 20 µL ekleyin. Daha sonra, her tüpe 10 µg toplam doku RNA'sı ekleyin ve pipetleyerek karıştırın. Enfeksiyon modeline, inokülasyon boyutuna ve kullanılan patojen suşuna bağlı olarak, toplam RNA içindeki patojen RNA yüzdesi %0 ile %2 arasında değişmektedir. Bu nedenle, her biri için eklenmesi gereken toplam RNA miktarı ampirik olarak optimize edilmelidir.Şimdi her tüpe beş µL yakalama kodu seti ekleyin. Tüpleri altüst ederek karıştırın ve hızlıca santrifüjleyin. Ardından reaksiyonları, ısıtmalı kapaklı bir termal döngüleyici cihazda yaklaşık 18 saat boyunca 65 °C'de inkübe edin.20 °C'den bir numune kartuşu çıkarın ve oda sıcaklığına gelmesini bekleyin. 4 °C'den iki reaktif plakası çıkarın ve bir masaüstü santrifüjde 670 x G hızında iki dakika boyunca döndürün. Ardından, ekrandaki adım adım talimatları izleyerek yüksek hassasiyet seçeneğini belirleyin ve hazırlık istasyonunu kurun.Ardından reaksiyonları termal döngüleyiciden çıkarın ve hemen hazırlık istasyonuna yükleyin. Üç saatlik yüksek hassasiyetli program çalıştırıldıktan sonra kartuşu çıkarın ve şeritleri mühürlemek için şeffaf bant kullanın. Gerekiyorsa kartuşun altına mineral yağ uygulayın.Ardından kartuşu dijital analizöre yerleştirin. Ekrandaki adım adım talimatları izleyerek ve yüksek çözünürlüklü tarama seçeneğini belirleyerek dijital analizörü kurun. Tarama programını çalıştırdıktan sonra sonuçları indirin veya e-posta ile almayı seçin ve ham verileri üreticinin yazılımına aktarın.Verileri metin protokolüne göre analiz edin. Bu videoda gösterilen protokolün, özgünlüğü artırmak ve konakçı RNA'sından kaynaklanan gürültüyü azaltmak için hem bir yakalama probu hem de bir rapor probu kullanması şeklinde benzersiz bir avantajı vardır. Burada gösterildiği gibi, enfekte olmamış bir doku örneğinden elde edilen arka plan ham sayımlarının tamamı 10'un altındayken, iki enfekte doku örneğinden elde edilen ham sayımların tamamı 10'un üzerindeydi.İki biyolojik örnekten elde edilen ham sayımlar, 0,945'lik bir R kare değeri ile çok iyi korelasyon göstermiştir. Platform, doğal biyolojik ekspresyon seviyelerini kapsayacak yeterli dinamik aralığı da sağlamaktadır. 248 çevresel yanıt genini belirleyen bir prob seti kullanılarak, patojen gen ekspresyonunun iki fazı belirlenmiştir.Erken gen ekspresyon yanıtı, inokülum ile enfeksiyon sonrası 12. saat örnekleri arasında RNA seviyeleri anlamlı derecede farklı olan genleri içerir. Ayrıca, 12. saat noktası ile enfeksiyon sonrası 48. saat örnekleri arasında RNA seviyeleri anlamlı derecede farklı olan genleri içeren geç bir gen ekspresyon yanıtı da tespit edilmiştir. Bu sonuçlar, C.albicans gen ekspresyonunun bir memeli konakçısının invaziv enfeksiyonu sırasında dinamik olarak düzenlendiğini göstermektedir.Bu yöntem kolay ve hızlıdır. Doku toplamadan verilerin ifade edilmesine kadar olan tüm prosedür 48 saatten kısa sürer. 12 örnek için uygulama süresi yaklaşık dört saattir.Bu yöntem in vivo patojen gen ekspresyonunu yakalamak için geliştirilmiş olsa da, aynı yöntem konakçı gen ekspresyonunu belirlemek için de kullanılabilir. Bu sayede araştırmacılar, bir enfeksiyonun her iki tarafı hakkında aynı anda faydalı bilgiler edinebilirler.

gene-expression-profiling-infecting-microbes-using-digital-bar-coding

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Biz gen-ilaç ve gen-çevre etkileşimleri anlamak için kapsamlı, tarafsız genom ekranlar geliştirdik. Bu mutant koleksiyonlarını tarama yöntemleri sunulmaktadır.

Barkodlu Maya Kütüphaneler Rekabet Genomik Ekranlar

Oligonükleotid çiftli florasan boncuklar kullanarak bir örnek içinde mikroorganizmaların tespiti için çoklama yöntemi açıklar. Bir örnek içindeki tüm organizmalar Amplikon bir panel prob-çiftli boncuk melezleşmiştir. LUMINEX veya Bio-Plex enstrüman, boncuk, boncuk türü ve hibridizasyon sinyali için her bir sorgu için kullanılır.

Oligonükleotid çiftli Floresan Mikroküreler kullanarak Kompleksi Klinik ve Çevre Örneklerinde Bakterilerin Multiplex Algılama

Mikrobiyal topluluğu karakterize etmek, çevresel mikrobiyolojide uzun süredir devam eden bir hedef olmuştur. Yeni nesil dizileme yöntemleri artık mikrobiyal toplulukların minimum maliyet ve iş gücü ile benzeri görülmemiş bir derinlikte karakterizasyonuna izin veriyor. Burada, bir tezgah üstü dizileyici kullanarak bakteriyel 16S ribozomal RNA genlerini dizileme yaklaşımımızı detaylandırıyoruz.

16S Ribozomal RNA Gen amplikonlarının nesil Sıralama

Yeşil floresan protein geninin keşfinden bu yana, floresan proteinler moleküler hücre biyolojisini etkilemiştir. Bu protokol, genetik mühendisliği yoluyla farklı floresan proteinlerin ekspresyonunun, tek tek hücreleri barkodlamak için nasıl kullanıldığını açıklar. Prosedür, çoğullanmış uygulamalar için ideal olan bir hücre karışımındaki farklı popülasyonların izlenmesini sağlar.

Multiplexed Uygulamaları için Floresan Proteinleri ile Genetik Barkodlama

Bu el yazması, DNA mikrodizileri tarafından sağlanan en son teknolojinin kullanımını açıklamaktadır. Mikrodiziler, belirli bir koşul altında bakterilerde meydana gelen transkriptomik değişikliklere genel bir bakış sağlar. Ayrıca, şirket içinde geliştirilen uygun yazılım paketleri kullanılarak büyük miktarda verinin analiz edilebilmesinin kolaylığını vurguluyoruz.

Bakteriyel Transkriptom Analizi Vaka çalışması için A Hızlı ve Güvenilir Boru Hattı: Serin bağımlı Gen Yönetmelik<em&gt; Streptococcus pneumoniae</em

Amplifikasyona ihtiyaç duymadan biyolojik substratlardaki molekülleri barkodlayarak ve sayarak gen ekspresyonunu ölçen çoğullanmış yüksek verimli bir gen ekspresyon platformunun kullanımını açıklıyoruz. Platformu, irritabl bağırsak sendromu olan ve olmayan kişilerde tam kandaki mikroRNA (miRNA) ekspresyonunu ölçmek için kullandık.

İrritabl Bağırsak Sendromu içinde miRNA&#39;lar Sirkülasyon tedirginlikler bir Çoklanmış Yüksek verim Gen İfadesi Platformu Kullanma Algılanan

Tek hücreli sıralama genotypic heterojenlik biyolojik sistemlerde ortaya çıkarır, ama daha fazla işlem hacmi derin topluluk kompozisyon ve işlev profil oluşturma için gerekli güncel teknolojileri eksikliği. Burada, biz bir mikrosıvısal iş akışı sıralama için tarif &gt; 50.000 tek hücreli genleri farklı popülasyonlar hücre.

Tek hücreli genom sıralama için bir üretilen iş Ultrahigh mikrosıvısal Platform

Bakteriyel Fitness belirlenmesi için bu moleküler tabanlı yaklaşım dijital PCR üzerinden nicelik benzersiz genomik DNA barkodları kullanarak mikroorganizmaların kesin ve doğru algılanmasını kolaylaştırır. Protokol, Salmonella suşları için rekabetçi dizinin hesaplanmasında açıklanmaktadır; Ancak, teknoloji, herhangi bir genetiği değiştirilmiş organizmanın mutlak ölçümlerini gerektiren protokollere kolayca adapte olmaktadır.

Salmonella Fitness yüksek verimlilik analizi için dijital PCR tabanlı rekabetçi endeksi

Burada fare embriyonik dokularında gen ekspresyonunu profillemek için çok katlı tek hücreli mRNA dizileme yöntemi ni sunduk. Damlacık tabanlı tek hücreli mRNA dizileme (scRNA-Seq) yöntem çoklama stratejileri ile birlikte aynı anda birden fazla örnekten tek hücre profili olabilir, hangi önemli ölçüde reaktif maliyetlerini azaltır ve deneysel toplu etkileri en aza indirir.

Fare Embriyonik Hücrelerinin Çok katlı Tek Hücreli mRNA Sıralama Analizi

Burada sunulan protokol, RNA dizilimi transkriptom verilerini ham okumalardan fonksiyonel analize analiz etmek için kalite kontrolü ve gelişmiş istatistiksel analitik yaklaşımlara yönelik ön işleme adımları da dahil olmak üzere eksiksiz bir işlem hattını açıklar.

Konak-Patojen Etkileşimlerini Araştırmak için Yüksek Verimli Transkriptom Analizi

Çok katlı barkodlama görüntü analizi son zamanlarda tümör mikroçevresinin karakterizasyonunu geliştirmiş ve hücre kompozisyonu, fonksiyonel durum ve hücre-hücre etkileşimleri hakkında kapsamlı çalışmalara izin vermiştir. Burada, oligonükleotid konjuge antikorların barkodlamasını ve siklus görüntülemeyi kullanarak, yüksek boyutlu bir görüntü analiz tekniğinin kullanılmasına izin veren bir boyama ve görüntüleme protokolünü tanımlıyoruz.

Parafin doku örneklerinin tek hücreli analizinde immünoprofilleme ve mekansal haritalama karakterizasyonu için çoklanmış barkodlama görüntü analizi

Öğrenin, dijital çizgi-kodlama platformu kullanarak C. albicans enfeksiyonlarında patojen gen ifadesini hassas ve tekrarlanabilir şekilde profillemeyi. Bu yöntem, küçük doku örneklerinden in vivo gen dinamiklerini nicelendirmeyi mümkün kılar.

Dijital Çizgi-kodlama Platform'u kullanarak bulaşmasını Mikroplar Gen İfadesi profil

Daha fazla video keşfet