Oligonükleotid çiftli Floresan Mikroküreler kullanarak Kompleksi Klinik ve Çevre Örneklerinde Bakterilerin Multiplex Algılama

Merhaba, ben Tarım ve AgriFood Canada'dan Tim Duso. Bu videoda, bir bioplex cihazı kullanarak karmaşık bir klinik veya çevresel numunede belirli mikroorganizmaların varlığını ve bolluğunu belirlemek için bir protokol göstereceğiz. Bu protokol, türe özgü bir oligonükleotid probuna kimyasal olarak bağlanmış floresan polistiren boncuklar kullanır.

Üniversal PCR primerleri kullanılarak numuneden bir amplikon üretilir ve amplikon, proba bağlı boncuklara hibritlenir. Bio plex cihazı ile iki sinyal üretilir. Biri boncuğu tanımlar ve diğeri hibridizasyon sinyalini ölçer.

Prosedürün genel amacı, ilgilenilen mikrobiyotanın profilini hızlı ve yarı kantitatif bir şekilde belirlemektir. Bu tekniği vajinal sürüntülerdeki bakteri profillerini belirlemek için uyguladık ve elde edilen verileri, laktobasil organizmalarının daha az yaygın hale geldiği ve Gardnerella, vais ve apoian vae gibi diğer organizmaların vajinal sürüntülerde tespit edilebilir hale geldiği mikrobiyotada bir değişiklik ile karakterize edilen klinik bir durum olan bakteriyel vajinozu teşhis etmek için kullandık. Bununla birlikte, bu tekniğin, hızlı bir multipleks testinin arzu edildiği diğer herhangi bir mikrobiyotaya uygulanabileceğini akılda tutmak önemlidir.

Prosedürün nasıl çalıştığını açıklayarak başlayalım. Bir mikrobiyal profil, swabın DNA ekstraktında bulunan tüm organizmalardan 60'ta bir protein ve kaplama geni şaperonunun amplifiye edilmesiyle oluşturulur. Üniversal amplifikasyon primerlerinden biri, biotin ilavesinin yanı sıra fosfoat modifiye edilmiş bazların dahil edilmesiyle modifiye edilir.

Beş asal uçta, amplikon, yalnızca antisens ipliği bozan T yedi ekzon nükleaz kullanılarak tek sarmallı hale getirilir. Duyu ipliği, fosfoat modifiye edilmiş bir PCR primeri ile korunduğundan, kalan ipliği tamamlayan oligonükleotid probları, floresan polistiren boncuklara kovalent olarak bağlanır. Farklı bir organizmayı tespit eden bir prob içeren her benzersiz boncuk rengiyle, tek bir numune için yüze kadar farklı boncuk kullanılabilir.

Vajinal sürüntüden elde edilen tek sarmallı PCR ürünü, ilgilenilen tüm organizmalar için problar içeren bir prob bağlantılı boncuk karışımına hibritlenir. Bir strep din konjugatı yoluyla biyotinile problara bağlanan bir floresan raportör FICO ethin eklenir. Son olarak, hibridizasyon karışımı, her bir boncuğu kimlik ve hibridizasyon sinyali için ayrı ayrı inceleyen bir luminex veya bio plex cihazı üzerinde analiz edilir.

Bu analizin sonuçları, belirli mikroorganizmaların varlığını gösterir ve hibridizasyon sinyalinin yoğunluğu, o organizmanın bolluğu ile ilişkilidir. Numunede, BV ile ilişkili organizmaların varlığı BV'yi teşhis etmek için kullanılabilir. Bu tekniğin büyük boyama gibi mevcut yöntemlere göre en büyük avantajı, belirli mikroorganizmaların varlığı ve bolluğu hakkında bilgi üretilmesidir.

Prosedürü gösteren bir araştırma görevlisi olan Jennifer Town olacak Laboratuvarımızda, yaklaşık 20 saniye boyunca girdap yaparak mikro küreleri yeniden askıya alın. 400 mikrolitre mikroküreyi bir dakika boyunca 14.000 kez G'de bir einor tüp santrifüjüne aktarın, snat Resus'u çıkarın ve atın. Mikroküreleri 50 mikrolitre 0.1 molar MES pH 4.5'te askıya alın.

Mikrokürelere bir adet yakalama oligo animosu ekleyin ve girdap oluşturarak karıştırın. Mikroküreciklere 2,5 mikrolitre taze EDC çözeltisi ekleyin. Reaksiyonu oda sıcaklığında karanlıkta 30 dakika inkübe edin.

Daha önce hazırlanan EDC çözeltisini atın ve suda mililitre EDC başına 10 miligramlık taze bir numune hazırlayın. Yukarıdaki gibi, mikro küreciklere 2,5 mikrolitre daha taze EDC çözeltisi ekleyin ve beş saniye boyunca girdap yapın. Karanlıkta 30 dakika oda sıcaklığında tekrar inkübe edin.

Boncuk santrifüjünü 14.000 kez G'de yeniden askıya almak için bir mililitre% 0.02 Tween 20 vorteks ekleyerek boncukları yıkayın. Bir mililitre% 0.1 SDS Resus ekleyerek boncukları tekrar yıkayın. Boncukları 100 mikrolitre te tamponunda askıya alın.

Stok konsantrasyonunu belirlemek için bir hemo sitometredeki boncukları numaralandırın. Her bir boncuğu mikrolitre başına 100 boncukluk bir nihai konsantrasyona seyrelterek bir mikroküre ana karışımı hazırlayın, birleştirilmiş boncukları tahlilin istenen pleksine göre bir araya getirin Mikroküre ana karışımını karanlıkta dört derecede saklayın. Bu karışım, bu koşullar altında tutulursa aylarca saklanabilir, her numune için PCR ürünü oluşturur.

PCR tamamlandıktan hemen sonra fosfolat ve biyotin modifiye edilmiş beş ana primer setini dahil edin. Her bir PCR tüpüne iki mikrolitre T yedi eksonükleaz ekleyin, oda sıcaklığında 40 dakika inkübe edin. Bu inkübasyonun sonunda, karışıma 12.5 mikrolitre 0.5 molar E-D-T-A-P-H 8.0 ekleyin.

Bu, toplamda yaklaşık 64,5 mikrolitre tek sarmallı PCR ürünü verir. Resus Bend Microsphere ana karışımını bir pipet ile karıştırın. Uygun bir miktarı bir einor tüpüne dağıtın.

Tüpü kapatın ve iki dakika boyunca bir su banyosu sonica'da sonikat yapın. 17 mikrolitre tek sarmallı PCR ürününü düşük profilli 96'nın uygun kuyucuklarına dağıtın. Kuyu plakası, her birine 33 mikrolitre Yeniden Askıya Alınmış Sonicated boncuk karışımı ekleyin.

Plakayı silikon bir kapakla örtün ve hafifçe vurun. Plakayı beş dakika boyunca 95 derece, 10 dakika boyunca 60 derece, 60 derece beş dakika boyunca 60 derece tutma veya duraklatma programıyla yavaşça termodöngüleyiciye koyun. Bitir, programı başlatın.

Taze strep Aden FICO Ethin çözeltisi yapın. Kuyu başına 25 mikrolitreye ihtiyacınız olacak. Sapı mililitre başına bir miligram seyrelterek strep ve FICO ethin yapın.

Bir kez tmac tamponu ile mililitrede 50 ila 20 mikrogramda bir. Thermocycler 60 derece tutma adımına ulaştığında, kapağı açın, silikon kapağı çıkarın ve her birine doğrudan strep din FICO ethin solüsyonu ekleyin. Silikon kapağı yerine takın, termosikleyici kapağını kapatın ve programa devam edin.

Program tamamlandığında, plakayı çıkarın ve okumak için hızlı bir şekilde bio plex makinesine aktarın. Plaka 10 dakika içinde okunmalıdır. Plakayı 60 derecede okuyun.

Bio plex'in bu sıcaklığa kadar önceden ısıtıldığından emin olun. Bu, sıfır zamanında tek bir bireyden alınan uzunlamasına numunelerin karşılık gelen gram lekelerinin ve luminex profillerinin sonuçlarını gösterir. Gram boyası, bv'nin klinik tanısı ile tutarlıdır ve bu, Gardner Relic, vais ve Apoian Vae dahil olmak üzere BV ile ilişkili organizmalar için pozitif hibridizasyon sinyalleri gösteren bir Fiveplex Luminex testi ile doğrulanır.

Lactobacillus Iners zaman ilerledikçe düşük seviyelerde de tespit edilir. Bu birey, gram lekelerle gösterildiği gibi bir BV mikrobiyotasından normal bir mikrobiyotaya geçiş yapar. Aynı örneklerin Luminex analizi, Gardnerella Vaginalis bolluğunun zirve yaptığını ve azaldığını, lactobacillus iners'ın ise son zaman noktasında baskın organizma haline gelmek için arttığını göstermektedir.

Mikrobiyotanın profilini çıkarmak için bu yöntem kullanılarak, belirli organizmaların varlığı ve bolluğu hakkında bilgi üretilir. Yöntem dizi tabanlı olduğundan, prob tasarımı derin dizileme analizi ile bilgilendirilebilir ve yeni nesil Dizileme yöntemleri ile tanımlanan mikroorganizmalar numunelerde hızlı, nispeten düşük maliyetli bir şekilde izlenebilir. Bu videoyu izlemek, Luminex veya Bio Plex cihazı kullanılarak bir numuneden mikrobiyal profilin nasıl oluşturulacağını iyi bir şekilde anlamanızı sağlamış olmalıdır.

Oligonükleotid problarını floresan boncuklara nasıl bağlayacağınızı, klinik veya çevresel bir numuneden tek sarmallı alicon nasıl üreteceğinizi, hibridizasyonun nasıl gerçekleştirileceğini ve sonuçların Luminex veya Bio Plex cihazında nasıl belirleneceğini gösterdik. Deneylerinizde iyi şanslar.