Eşzamanlı İki foton İn Vivo Fare Retrosplenial kortekste sinaptik Girişlerin Görüntüleme ve postsinaptik Hedefler
March 13th, 2016
Bu video, Thy1-GFP transgenik hattında in vivo iki foton mikroskobu kullanılarak fare retrosplenial korteksindeki nöronların kronik olarak görüntülenmesine izin veren kraniyotomi prosedürünü göstermektedir. Bu yaklaşım, mCherry eksprese eden adeno ilişkili virüsün dorsal hipokampusa enjeksiyonu ile birleştirilir. Bu teknikler, RSC'de deneyime bağlı yapısal plastisitenin uzun süreli izlenmesine izin verir.
Aşağıda açıklanan tüm deneysel prosedürler, Polonya Bilimler Akademisi, Nenscki Deneysel Biyoloji Enstitüsü'ndeki Yerel Etik Komite tarafından onaylanmıştır. Bu video, fare retrosplenial korteksindeki nöronların kronik olarak görüntülenmesine izin veren kraniyotomi prosedürünü göstermektedir in vivo iki foton mikroskobu kullanarak ayak transgenik çizgisinin bir G'sinde . Bu yaklaşım, dorsal hipokampusta adeno ile ilişkili virüs olan AAV'yi eksprese eden mCherry enjeksiyonu ile birleştirilir.
Bir araya getirildiğinde, bu teknikler retrosplenial kortekste yaşanan bağımlılığın, yapısal plastisitenin uzun süreli izlenmesine izin verir. Bu yazıda, iki fotonlu in vivo mikroskopi için olası bir ilgi alanı olmadığından, retrosplenial korteks üzerine kraniyal pencerenin implantasyonunu öneriyoruz. Nöronal yapılardaki morfolojik değişiklikleri görselleştirmek için, beyindeki nöronların yaklaşık yüzde 10'unda floresan GFP proteini ekspresyonu ile B farelerinin bu bir-G'sini kullanıyoruz.
Önerdiğimiz bir diğer yenilik, yapının retrosplenial kortekse izdüşümlerini görselleştirmek için nörona özgü bir promotör altında bir floresan proteini mCherry'nin nörona özgü bir promotör altında beyindeki daha derin yapılara ekspresyonu olan bir AAV'nin enjekte edilmesidir. Otoklavdaki tüm aletleri, sıvılar için cam kapları ve pamuklu çubukları sterilize edin. Sen vazgeçilebilir eldivenler.
Ameliyat masasını, stereotaktik çerçeveyi ve çevresindeki tüm alanı %70 etanol ile temizleyin. Tüm sterilize edilmiş ekipman için steril bir alan oluşturmak için steril bir cerrahi ped kullanın. Jel köpüğü küçük parçalar halinde kesin ve steril tuzlu suya batırın.
Hayvanı indüksiyon odasına koyun ve izofluran seviyesini% 5'e ve oksijen akışını dakikada iki litreye ayarlayın. Bu prosedür yaklaşık üç dakika sürmelidir. Hayvanı indüksiyon odasından çıkarın.
Hayvanın tamamen sakinleştiğinden emin olmak için kuyruk veya ayak parmağı tutamları kullanın. Hassas düzelticiler kullanarak saçları başın arkasından, kulakların arasından gözlere kadar tıraş edin. Hayvanı stereotaktik çerçeveye yerleştirin ve kafayı kulak çubuklarıyla sabitleyin.
Anestezi seviyelerini% 1.5 ila 2 izofluran ve dakikada üç litre oksijene sıfır nokta olarak ayarlayın. Göz merhemini uygulayın. Enflamasyon, ağrı ve enfeksiyonu önlemek için hayvana deri altına tolfedin, kilogram başına dört miligram, butomidor, kilogram başına iki miligram ve Baytril, kilogram başına beş miligram enjekte edin.
Beyin şişmesini önlemek için hayvana kas içine deksametazon, kilogram başına sıfır nokta iki miligram enjekte edin. Cildi betadin ve ardından %70 etanol içeren steril pamuklu çubuklar kullanarak temizleyin. Eldivenleri değiştirin ve üzerlerine %70 etanol püskürtün.
Cildi forseps ile kaldırın ve mikromakas kullanarak cildi başın tabanı boyunca yatay olarak kesin ve ardından gözler arasındaki ön noktaya eğik olarak kesin. Cilt kapağını çıkarın. Aşırı kanama ve ağrıyı önlemek için periost üzerine steril çubukla lidokain merhem sürün.
Periosteumu çıkarmak için steril pamuklu çubuklar veya neşter kullanın. Kafatasını steril çubuklarla kurulayın. Steril iğne kullanarak, cilt kenarlarını hareketsiz hale getirmek ve diş çimentosu ile daha fazla temas etmesini önlemek için cilt kenarlarına yoğun siyanoakrilat yapıştırıcı uygulayın.
Tutkalın kurumasını bekleyin. Lambdoid sütürün ön tarafında kafatasının üzerine üç milimetrelik steril bir kapak camı yerleştirin. Kapak kaymasını retrosplenial koordinatlarda, ön, posterior bregma eksi iki nokta sekiz, medial lateral bregma sıfırda ortalayın.
Steril bir iğne ile kafatası yüzeyini çizerek kapak kayma kenarlarını işaretleyin. Kapak camını %70 etanol içeren steril kaba geri koyun. Üç milimetre çapında bir dairenin ana hatlarını çizmek için küçük çaplı frezli yüksek hızlı bir diş matkabı kullanın.
Delme bölgesini steril tuzlu uçlu swablarla kemik tozundan temizleyin. Ara sıra kanamayı durdurmak ve kemiği temizlemek için jel köpüğü ve swabları kullanın. Delme arasında, kemik çemberine hafifçe dokunarak ve hareketliliğini kontrol ederek kemik kalınlığını ince forseps ile kontrol edin.
Dikiş bölgesinde kemiğin daha kalın olduğunu unutmayın. Kemik çemberi hareketli olduğunda ve çevrede sadece eşit ince bir kemik tabakası kaldığında delmeyi durdurun. Kalan tüm kemik tozunun çalışma alanını tuzlu uçlu çubuklarla temizleyin.
Steril salini, delinmiş daireyi kaplayacak şekilde delme alanına bırakın. Kemik çemberini ince bir forseps ile dikkatlice kaldırın ve ardından kemiği yukarı doğru kaldırarak nazikçe ama sıkıca çıkarın. Dura'nın olası hasarını önlemek için kaldırırken kemik çemberini eğmemeye dikkat edin.
Kanamayı tamamlamaya yardımcı olmak için steril tuzlu suya batırılmış jel köpüğü dura üzerine nazikçe uygulayın. Tüm kanama tamamen durana kadar bekleyin. Pıhtılaşma sürecini bozmamak için jel köpüğü dikkatlice çıkarın.
Sütür alanının yüksek vaskülarize olduğunu unutmayın, bu nedenle bu noktada kanama derin olabilir. Kanamanın durması için yeterli süreyi beklemek şarttır. İnfüzyon pompasını stereotaktik kuleye takın ve kontrolörü bağlayın.
35 guage iğneyi doldurma şırıngasına yerleştirin. Şırıngayı sterilize etmek için 10 kez etanol ile ve etanol izlerini gidermek için 10 kez steril tuzlu su ile yıkayın. Şırıngadaki hava kabarcıklarını çıkarın.
Şırıngayı pompaya yerleştirin. Tek bir doz AV preparatı doldurun ve buz üzerinde tutun. Şırıngayı virüs çözeltisi ile doldurun.
İğneyi bregma üzerinde ortalayın ve ardından aşağıdaki koordinatları kullanarak nazikçe hipokampusa yerleştirin: Ön, arka eksi iki, medial lateral artı eksi bir, dorsal ventral eksi bir. Bu koordinatlar, kraniyal alanın kenarına yakın bir yerde bulunacaktır. Dokunun stabilize olması için beş dakika bekleyin.
Dakikada 50 nanolitre oranında sıfır noktası yedi mikrolitre AV çözeltisi enjekte edin. Virüsün tamamen emilmesi için 10 dakika bekleyin. İğneyi yavaşça çıkarın.
Kanama olursa jel köpük ile kurulayın. Kontralateral tarafla tekrarlayın. Steril kuru kapak camını, delinmiş daire çerçevesindeki duranın üstüne yerleştirin.
Durayı nazikçe düzleştirmek ve kapak camı kenarlarını kafatası yüzeyine yaklaştırmak için kapak camını ön pazı ile tutun. Steril bir iğne kullanarak, yoğun siyanoakrilat yapıştırıcıyı kafatasına yapıştırmak için kapak camı kenarlarına uygulayın. Tutkalın kurumasını bekleyin.
Kafatasının ön kısmına bir sabitleme çubuğu, anton somunu veya özel yapım bir tasarım yerleştirin. Sabitleme çubuğunun, görüntüleme seansı sırasında kraniyal pencerenin yatay olarak konumlandırılmasını sağlayacak bir konuma yerleştirilmesi gerektiğini unutmayın. Yapıştırıcıyı çubuğun kenarlarına sürün.
Tutkalın kurumasını bekleyin. Sabitleme çubuğunun pencereden mümkün olduğunca uzağa yerleştirilmesi gerektiğini unutmayın. Pencereye çok yakın yerleştirilirse, çubuk ve onu özel yapım tutucuya bağlayan vida, görüntüleme işlemi sırasında objektif için bir engel teşkil edebilir.
Diş akriliğini hazırlayın ve camın etrafındaki kafatası yüzeyine uygulayın. Pencerenin etrafında krater benzeri bir şekil oluşturmak faydalıdır. Daha sonra su objektifi ile görüntüleme için uygulanan su için bir boşluk oluşturacaktır.
Dental akrilik ile bir kapak oluşturun, işlem alanının geri kalanını kaplayın, cilt kenarları, sabitleme çubuğu, krateri kraniyal pencerenin etrafında yeniden güçlendirin. Diş çimentosunun sertleşmesini bekleyin. Hayvanı stereotaktik çerçeveden çıkarın ve kurtarma odasına koyun.
Fizyolojik fonksiyonları gözlemlerken hayvanın ameliyattan sonra iyileşmesini bekleyin. Ameliyat sonrası anestezi siroproferrin, kilogram başına 10 miligram ve antibiyotik tedavisi baytril, kilogram başına beş miligram 48 saat boyunca uygulayın. Ti safir lazeri başlatın, mikroskobu çalıştırın.
Bu deneyde kullanılan sistem, iki fotonlu bir lazer, OPO sistemi ve çift galyumlu arsenit tahrif edilmiş PMT ile donatılmıştır. Hayvanı indüksiyon odasına koyun ve anestezi uygulayın. Hayvanı indüksiyon odasından çıkarın ve mikroskop altında gaz anestezi maskesine yerleştirin.
Oksijen akışını dakikada üç litre sıfır noktasına ve izofluran konsantrasyonunu% 1.52'ye düşürün. Hayvanı bir MT vidası veya başka bir özel sistemle özel mikroskop çerçevesine sabitleyin. Kraniyal pencereyi düzleştirin. Mikroskop üreticisinin kafa sabitleme sistemini kullanmak mümkündür, ancak belirli özel çerçeve daha iyi sonuçlar, gelişmiş kafa stabilitesi, kronik bir deney sırasında birden fazla oturumda sabit konumlandırma sağlar.
Düşük büyütmeli bir objektif olan geniş alan mikroskobu ayarlarını kullanarak, görünümü retrosplenial korteksin kenarlarından birinde ortalayın ve kapak kayma yüzeyine odaklayın. Krater benzeri akrilik kuyuya bir damla su damlatın. Uzun mesafeli suya daldırma hedefine geçin.
Su menisküsü numuneyi ve objektifi birbirine bağlayana kadar objektifi kraniyal pencereye doğru hareket ettirin. İki foton ayarlarına geçin ve en düşük yakınlaştırmayı kullanarak örneği yukarıdan aşağıya taramaya başlayın. Dura maddesinin geçişi, yüksek spesifik olmayan sinyalin parlaması olarak görünür olacaktır.
Tüm dinamik aralığı kapsamak için her iki kanalda, GFP ve mCherry'de mikroskop toplama ayarlarını floresan hücrelerden gelen sinyal gücüne göre ayarlayın. Dendritik ağacın diğer hücrelerden ayrıldığı uygun bir nöron bulduktan sonra, yalnızca en düşük yakınlaştırma ve beş mikronluk Z mesafesi ile ayarlanmış GFP filtrelerini kullanarak bir ilk tarama yapın. Tarama yığınının maksimum projeksiyonunu elde edin ve ters çevrilmiş renkler kullanarak ek açıklamalar için yazdırın.
Yakınlaştırmayı, istenen morfolojik ayrıntıları görüntülemeye izin verecek bir değere ayarlayın. Maksimum projeksiyonu kılavuz olarak kullanarak tüm dendritik ağacı GFP ve mCherry kanalında görüntüleyin. Bu protokolü kullanarak, retrosplenial korteksteki hem pre hem de post-sinaptik yapıları tekrar tekrar izlemek mümkün olacaktır.
Bu yaklaşım, dendritlerin, sinaptik dikenlerin veya pre-sinaptik nötronların morfolojisindeki değişiklikler olduğunda davranışsal manipülasyonların korelasyon göstermesi beklenen kronik bir deneyle kullanılabilir. Görüntüleme seansları herhangi bir sıklıkta yapılabilir, ancak hayvanın düzgün bir şekilde iyileşmesini sağlamak ve anestezinin etkisini en aza indirmek için 24 saatlik zaman aralığı tercih edilir. Düzgün uygulanırsa, bu teknik birkaç ay boyunca birden fazla görüntüleme seansı yapılmasına izin verir.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Genel Bakış
Bu video, fare retrosplenial korteksindeki nöronların kronik görüntüleme için kraniyotomi prosedürünü in vivo iki-foton mikroskopi kullanarak gösterir. Yöntem, dorsal hipokampusa mCherry eksprese eden adeno-ilişkili virüs enjeksiyonu içerir ve yapısal plastisitenin uzun süreli izlenmesini sağlar.
Çalışmanın Önemli Bileşenleri
Bilim Alanı
- Nörobilim
- Görüntüleme Teknikleri
- Yapısal Plastisite
Arka Plan
- Kronik görüntüleme teknikleri, zamanla nöronal değişiklikleri incelemek için gereklidir.
- Retrosplenial korteks, uzamsal navigasyon ve hafızayı anlamak için kritik bir alandır.
- İki-foton mikroskopi, nöronal yapıların yüksek çözünürlüklü görüntülemesine olanak tanır.
- Adeno-ilişkili virüsler, nörobilim araştırmalarında yaygın olarak gen teslimi için kullanılır.
Çalışmanın Amacı
- Zamanla nöronal yapıların morfolojik değişikliklerini görselleştirmek.
- Deneyime bağlı plastisitede retrosplenial korteksin rolünü araştırmak.
- Canlı hayvanlarda kronik görüntüleme için güvenilir bir yöntem kurmak.
Kullanılan Yöntemler
- Retrosplenial kortekse erişim için kraniyotomi prosedürü.
- Nöronal aktiviteyi görüntülemek için in vivo iki-foton mikroskopi.
- Dorsal hipokampusa mCherry eksprese eden adeno-ilişkili virüs enjeksiyonu.
- Spesifik nöronların görselleştirilmesi için Thy1-GFP transgenik farelerin kullanımı.
Ana Sonuçlar
- Görüntüleme için kraniyal pencere implantasyonunun başarılı olması.
- Retrosplenial korteksteki yapısal değişikliklerin uzun süreli izlenmesi.
- Nöronal yapılarda deneyime bağlı plastisitenin gösterimi.
- Yöntemin canlı hayvan modelleri üzerinde gelecekteki çalışmalar için doğrulanması.
Sonuçlar
- Kraniyotomi ve görüntüleme teknikleri, nöronal plastisite hakkında değerli bilgiler sağlar.
- Bu yaklaşım, retrosplenial korteks ile ilgili çeşitli çalışmalara uygulanabilir.
- Gelecekteki araştırmalar bu yöntemler üzerine inşa ederek diğer beyin bölgelerini keşfedebilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
Simultaneous two-photon in vivo imaging of synaptic inputs and postsynaptic targets in the mouse retrosplenial cortex enables direct, longitudinal assessment of structural plasticity in a brain region critical for spatial memory. This capability supports mechanistic de-risking and predictive confidence in early CNS target validation, especially for pathways involving hippocampal-cortical connectivity. The method's chronic imaging design positions it as a reusable platform for experience-dependent plasticity studies across discovery and preclinical research.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct visualization of synaptic and dendritic structural changes in response to behavioral or pharmacological manipulations.
- Supports functional target validation by correlating morphological plasticity with specific interventions.
- Facilitates mechanistic de-risking for CNS targets by providing high-resolution, longitudinal data in a disease-relevant brain region.
Screening & Assay Development
- Establishes a validated in vivo imaging system for quantifying synaptic and dendritic changes over time.
- Provides reproducible, quantitative outputs suitable for screening compounds that modulate structural plasticity.
- Enables assay standardization and platform reuse for multiple CNS research programs.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with translational biomarker strategies by enabling monitoring of experience-dependent plasticity in a region implicated in memory and cognition.
- Supports continuity from discovery through preclinical validation by allowing repeated, non-terminal measurements in the same animal.
- Reduces biological risk by providing predictive, longitudinal data on synaptic remodeling relevant to disease models.
Pipeline & Workflow Integration
This imaging platform integrates into the CNS discovery continuum from early mechanistic studies through preclinical validation, supporting both hypothesis testing and translational continuity.
- Discovery Biology: Enables hypothesis-driven interrogation of synaptic and dendritic remodeling in response to defined manipulations.
- Screening: Provides quantitative, reproducible imaging outputs for compound or genetic screening in vivo.
- Analytics: Delivers high-content morphological measurements for statistical comparison across experimental conditions.
- Translational Research: Bridges discovery and preclinical phases by supporting longitudinal studies in a memory-relevant brain region.
- Enterprise Reuse: Offers a standardized, chronic imaging workflow adaptable to diverse CNS research programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in CNS target validation.
- Operational Value: Standardizes chronic imaging procedures for reproducibility and scalability across studies.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision-making by providing longitudinal, quantitative data on synaptic plasticity.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of CNS targets and interventions based on in vivo structural outcomes.
Implementation Considerations
- Requires expertise in stereotactic surgery, in vivo imaging, and viral vector delivery.
- Demands access to two-photon microscopy and advanced image analysis infrastructure.
- Necessitates rigorous cross-team standardization of surgical and imaging protocols.
- Adaptation to other brain regions or disease models may require protocol optimization.
- High vascularization of the retrosplenial cortex presents practical challenges for window implantation and imaging stability.
