Name: Eşzamanlı İki foton İn Vivo Fare Retrosplenial kortekste sinaptik Girişlerin Görüntüleme ve postsinaptik Hedefler (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-03-13T14:00:00.000+00:00
Duration: 16 min 45 s
Description: Öğrenin fare retrosplenial korteksinde eşzamanlı iki foton in vivo mikroskopi ile sinaptik girişlerin görüntülenmesi ve postsinaptik hedeflerin izlenmesi. Kronik kraniyotomi ve AAV enjeksiyonu ile uzun süreli yapısal plastisite çalışmaları yapın.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Yazarlar filme yardım için ses kayıtları, çizimler M. Borczyk, virüs üretimi A. Trąbczyńska, genotipleme M. Ziókowska ve A. Mirgos M. Steczkowski teşekkür etmek istiyorum. KR K. Deisseroth gelen CAMK promoterinin kontrolü altında floresan protein mCherry rekombinant adeno-ilişkili virüs (AAV) tür hediye kabul eder. Bu proje Avrupa Birliği tarafından finanse edilen CEPT altyapısı kullanılarak, Doku Yapısı ve İşlevi, Nörobiyoloji, Deneysel Biyoloji Nencki Enstitüsü Merkezi&#39;nin Hayvan Modelleri ve Laboratuvar Laboratuvarı çekirdek tesislerinde gerçekleştirildi - Avrupa Bölgesel Kalkınma Fonu içinde 2007-2013 Operasyonel Programı &quot;Yenilikçi Ekonomi&quot;. Bu çalışma, Ulusal Bilim Merkezi&#39;ne hibe ile desteklenmiştir: Sonata Bis 2012/05 / E / NZ4 / 02996, Harmonia 2013/08 / M / NZ3 / 00861, Symfonia 2013/08 / G / KR ve Sonata Bis 2014 NZ24 / 00691 / 14 / E / NZ4 / 00172 RC

Aşağıda açıklanan tüm deneysel prosedürleri Deneysel Biyoloji Nencki Enstitüsü, Polonya Bilimler Akademisi Yerel Etik Kurulu tarafından kabul edildi. Not: ilişkili videoda bazı sahneler hızlanır. Hız faktörü bu sahneler gösterilir. 1. Cerrahi Hazırlık <ol><li> otoklav sıvıların ve pamuklu için tüm araçları, cam kapları sterilize. vazgeçilebilir eldiven kullanın. Cerrahi tablo, stereotaksik çerçeve ve% 70 etanol ile tüm çevresi temizleyin. tüm sterilize ekipmanlar için steril bir alan yaratmak için steril cerrahi takımını kullanın. Küçük parçalar halinde gelfoam kesin ve steril tuzlu su içinde bekletin. Not: Laboratuvar Hayvanları Bakım ve Kullanım Kılavuzu göre, etanol sterilant ne de üst düzey dezenfektan ne olduğunu. Sadece daha önceden sterilize edilmiş yüzeyler üzerinde bir temizleme / yağ ayırma maddesi olarak kullanılır. </li><li> th hayvan koymake indüksiyon odası ve / dk 2 L% 5 izofluran seviyesini ve oksijen akışını ayarlayın. Bu işlem yaklaşık 3 dakika sürer. </li><li> indüksiyon odasının dışında hayvan alın. Hayvan tamamen uyuşturulmuş sağlamak amacıyla kuyruk ya da ayak Kıstırmaları kullanın. </li><li> kesin bir düzeltici gözlerine kadar (kulak arası) başın arka saç tıraş kullanma. </li><li> stereotaksik çerçeve hayvan koyun ve kulak çubukları ile baş stabilize. </li><li> % 1.5-2 izofluran ve 0.3 L / dk oksijen anestezi seviyelerini ayarlayın. </li><li> göz merhemi sürün. </li><li> sırasıyla, iltihap, ağrı ve enfeksiyonu önlemek için Tolfedine (4 mg / kg), Butomidor (2 mg / kg) ve Baytril (5 mg / kg) ile, hayvan deri altına enjekte edilir. </li><li> Beyin şişmesini önlemek Deksametason hayvan intramüsküler (0.2 mg / kg) enjekte edilir. Not: Deksametazon deri altından enjekte ya da periton boşluğu içine, kas hasarını önlemek mümkündür. </li><li> s kullanarak cilt temizlemekBetadine ile terile pamuklu% 70 etanol ile izledi. </li><li> eldiven değiştirin ve% 70 etanol ile sprey. Not: Steril alan dokunmayın atılabilir eldivenler kullanırken. Sadece steril cerrahi aletler ve steril bezlerden uçları ile hayvan dokunun. </li></ol> 2. Kafa Pencere Cerrahisi <ol><li> forseps ile cilt kaldırın ve mikro makas gözler arasında ön noktaya eğik sonra kafa tabanı boyunca yatay olarak cilt insizyon ve kullanma. flep çıkarın. </li><li> aşırı kanama ve ağrıyı önlemek için periost üzerinde steril bir bez ile lidokain merhem sürün. </li><li> periost kaldırmak için steril pamuklu çubuklarla veya bir neşter kullanın. Steril bezlerden ile kafatası kurulayın. </li><li> Steril bir iğne kullanarak onları hareketsiz ve diş çimento ile temas önlemek için deri kenarlarında yoğun siyanoakrilat yapıştırıcı uygulayın. tutkal kurumasını bekleyin. </li><li> t üzerinde steril, 3 mm coverglass Laylambdoidea&#39;nın sütür ile öne o kafatası. RSC de lamel merkezi koordinatları: AP, Bregma -2.8; ML, steril bir iğne ile kafatası yüzeyi çizilmeye tarafından 0. Mark lamel kenarları bregma. % 70 etanol ile, steril kap içine geri coverglass koyun. </li><li> 3 mm çaplı daire anahat küçük çaplı çapak ile yüksek hızlı diş matkap kullanın. steril tuzlu batırılmış çubuklar ile kemik tozundan sondaj sahasını temizleyin. zaman zaman kanamayı durdurmak ve kemik temizlemek için gelfoam ve bezlerden kullanın. </li><li> sondaj arasında hafifçe kemik daire dokunmadan ve hareketliliğini kontrol ederek ince forseps ile kemik kalınlığı kontrol edin. Kemik sütür alanının üzerinde kalın olduğunu unutmayın. Kemik daire mobil ve kemik sadece bir hatta ince tabaka çevresi üzerinde bırakıldığında sondaj durdurun. tuzlu batırılmış çubuklar ile kalan tüm kemik tozu operasyonel alanını temizleyin. </li><li> delinmiş CIR kapsayan, delme alanına steril tuz bırakındöngü. Dikkatlice sonra yavaşça ince forseps ve kemik daire gözetlemek ama sıkıca yukarıya doğru kaldırarak kemiği kaldırmak. dura olası hasarları önlemek için kaldırarak kemik daire çarpık için dikkatli olun. </li><li> Yavaşça kanamayı durdurmaya yardımcı olmak için dura üzerine steril serum fizyolojik ile ıslatılmış gelfoam uygulayın. Tüm kanama tamamen durana kadar bekleyin. Dikkatle pıhtılaşma sürecini rahatsız etmeyecek gelfoam kaldırın. Not: Bu noktada kanama derin olarak kanıtlamak olabilir bu yüzden dikiş alanı, çok kanlanan olduğunu. Kanama tamamen durdurmak için yeterli bir süre beklemek gereklidir. Buz üzerine yerleştirerek soğutulan tuzlu batırılmış gelfoam tutmak için yararlıdır. </li></ol> 3. Virüs enjeksiyonundan <ol><li> stereotaktik kuleye infüzyon pompası takın ve denetleyici bağlayın. </li><li> şırınga içine 35G iğne takın. sterilize etanol şırıngayı 10 kez yıkayın ve steril tuzlu su ile 10 kat e izlerini silmek için-metanol. şırınga hava kabarcıklarını çıkarın. pompası içine şırınga yerleştirin. Not: diğer dezenfektanların kullanmayı düşünün. </li><li> (10 12 pfu tavsiye edilir) RAAV2 / 1 MCherry hazırlanması tek doz çözülme ve buz üzerinde tutmak. virüs çözümü ile şırınga doldurun. </li><li> Bregma üzerinde iğne ortalamak ve sonra yavaşça aşağıdaki koordinatları kullanarak hipokampus takın: AP -2, ML +/- 1.0, DV -1. Bu koordinatlar Kraniotomi kenarına yakın yer alacaktır. Doku stabilize etmek için 5 dakika bekleyin. </li><li> 50 nl / dak oranında rAAV2 / 1 MCherry çözeltisi 0.7 ul enjekte edilir. Virüs tamamen adsorbe için 10 dakika bekleyin. Yavaşça iğneyi çıkartın. Kanama oluşursa gelfoam ile kurulayın. kontralateral site ile tekrarlayın. </li></ol> 4. Kafa Pencere İmplantasyonu <ol><li> delinmiş daire çerçeve içinde dura üstüne steril, kuru coverglass yatıyordu. Forc ile coverglass tutuneps hafifçe dura düzleştirmek ve coverglass getirmek için &#39;kafatası yüzeye yakın kenarları. Not: coverglass pıhtı ve kanama devam eder bozan mümkündür. Bu durumda ise, coverglass asansör alkol, kuru yerleştirin ve 2.9 adıma geri dönün. </li><li> steril bir iğne coverglass kenarlarında yoğun siyanoakrilat yapıştırıcı uygulamak kullanılarak kafatası onları takmak için. tutkal kurumasını bekleyin. </li><li> Kafatasının ön kısmında bir sabitleme çubuğu (M2 somunu veya ısmarlama tasarım) yerleştirin. bar kenarlar üzerinden siyanoakrilat tutkal sürün. tutkal kurumasını bekleyin. <ol><li> oturumu görüntüleme sırasında kafatası pencerenin yatay konumlandırma sağlayacak bir konuma tespit çubuğunu yerleştirin. penceresinden mümkün olduğunca uzak yerleştirin. o pencereye çok yakın yerleştirilirse, ısmarlama tutucu ile bağlayan çubuk ve vida görüntüleme işlemi sırasında hedefi için bir engel olarak poz olabilir. </li></ol></li><li&gt; diş akrilik hazırlayın ve camın etrafında kafatası yüzeyinde uygulayın. Pencere etrafında bir krater benzeri şeklini yararlıdır. Su amacı ile görüntüleme için daha sonra uygulanacak su için bir oyuk oluşturur. </li><li> kranial pencerenin etrafında krater takviye operasyonel alanda, deri kenarları, tespit çubuğunun geri kalanını kapsayan diş akrilik bir kap oluşturun. Diş çimento sertleşmesine bekleyin. </li><li> stereotaksik çerçeve hayvan çıkarın ve kurtarma odasına koydu. </li><li> fizyolojik fonksiyonlarını izlerken hayvan ameliyatın bekleyin. </li><li> 48 saat boyunca post-operatif analjezi (karprofen, 10 mg / kg) ve antibiyotik tedavisi (Baytril, 5 mg / kg) uygulanır. </li></ol> 5. Görüntüleme <ol><li> kadar güç mikroskobu, Sapphire lazer: Ti başlatın. Bu deneyde kullanılan sistem bir iki-fotonlu lazer, OPO sistemi ve çift GaAsP PMT ile donatılmıştır. </li><li> induc hayvan koyunyon odası ve anestezi neden. </li><li> mikroskop altında gaz anestezi maskesi indüksiyon odası ve yerden hayvan çıkarın. 0.3 L / dak oksijen akışını ve% 1.5-2 izofluran konsantrasyonu azaltır. </li><li> M2 vida (veya başka bir özel sistemi) ile özel mikroskop çerçeveye hayvan sabitleyin. kranial pencereyi dengeleyin. Not: Belirli özel kare daha iyi sonuçlar (geliştirilmiş kafa istikrar, kronik deney sırasında birden oturumlarda sabit konumlandırma) verir rağmen, mikroskop üreticinin baş sabitleme sistemini kullanmak mümkündür. </li><li> retrosplenial korteksin kenarlarından birinde widefield mikroskop ayarları ve düşük büyütme objektif merkezi görünümü kullanarak ve lamel yüzey üzerine odaklanır. </li><li> krater benzeri akrilik kuyuya bir su damlasının uygulanır. Bir uzun mesafe suya daldırma hedefi geçin. Su menisküs con kadar kafatası pencereye doğru hedefe taşımaknumune ve objektif nects. </li><li> iki foton ayarlarına geçin ve en düşük zum kullanarak alt numune üst taramaya başlar. dura mater geçiş yüksek spesifik olmayan sinyalin bir parlama olarak görünür olacaktır. </li><li> tüm dinamik aralığını karşılamak için floresan hücrelerden sinyal gücüne göre her iki kanal (GFP ve mCherry) mikroskop satın alma ayarlarını yapın. </li><li> (Diğer hücrelerden ayrılmıştır dendritik ağaç ile) uygun bir nöron bulduktan sonra düşük zum ve 5 mikron z mesafe sadece GFP filterset kullanarak bir ilk tarama yapar. </li><li> Taranan yığınının maksimum projeksiyon elde etmek ve (ters renkleri kullanarak) ek açıklamalar için yazdırabilirsiniz. </li><li> İstenilen morfolojik ayrıntıları görüntüye sağlayacak bir değere zum ayarlayın. Görüntü rehber olarak maksimum projeksiyon kullanılarak GFP ve mCherry kanallarında tüm dendritik ağaç. </li></ol>

<ol><li>Grutzendler, J., Gan, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+imaging+of+synaptic+plasticity+and+pathology+in+the+living+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22NeuroRx%22%5BJournal%5D)">Two-photon imaging of synaptic plasticity and pathology in the living mouse brain.</a> NeuroRx. 3, 489-496 (2006).</li>
<li>Svoboda, K., Yasuda, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Principles+of+two-photon+excitation+microscopy+and+its+applications+to+neuroscience%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Principles of two-photon excitation microscopy and its applications to neuroscience.</a> Neuron. 50, 823-839 (2006).</li>
<li>Trachtenberg, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+in+vivo+imaging+of+experience-dependent+synaptic+plasticity+in+adult+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Long-term in vivo imaging of experience-dependent synaptic plasticity in adult cortex.</a> Nature. 420, 788-794 (2002).</li>
<li>Holtmaat, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+neocortical+neurons+through+a+chronic+cranial+window%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Protoc%22%5BJournal%5D)">Imaging neocortical neurons through a chronic cranial window.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2012, 694-701 (2012).</li>
<li>Chow, D. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laminar+and+compartmental+regulation+of+dendritic+growth+in+mature+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Laminar and compartmental regulation of dendritic growth in mature cortex.</a> Nat Neurosci. 12, 116-118 (2009).</li>
<li>Czajkowski, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Encoding+and+storage+of+spatial+information+in+the+retrosplenial+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Encoding and storage of spatial information in the retrosplenial cortex.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 111, 8661-8666 (2014).</li>
<li>Czajkowski, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Superficially+projecting+principal+neurons+in+layer+V+of+medial+entorhinal+cortex+in+the+rat+receive+excitatory+retrosplenial+input%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Superficially projecting principal neurons in layer V of medial entorhinal cortex in the rat receive excitatory retrosplenial input.</a> J Neurosci. 33, 15779-15792 (2013).</li>
<li>Feng, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+neuronal+subsets+in+transgenic+mice+expressing+multiple+spectral+variants+of+GFP%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP.</a> Neuron. 28, 41-51 (2000).</li>
<li>Couey, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recurrent+inhibitory+circuitry+as+a+mechanism+for+grid+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Recurrent inhibitory circuitry as a mechanism for grid formation.</a> Nat Neurosci. 16, 318-324 (2013).</li>
<li>Miyashita, T., Rockland, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GABAergic+projections+from+the+hippocampus+to+the+retrosplenial+cortex+in+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">GABAergic projections from the hippocampus to the retrosplenial cortex in the rat.</a> European Journal of Neuroscience. 26, 1193-1204 (2007).</li>
</ol>

Yazarlar (KL, MR, KR) patent haklarını Bu maddede kullanılan Tutucu çerçeve için (PL410001) bekleyen var.

Geçerli yazıda kranial pencereden RSC sinaptik giriş ve postsinaptik hedeflerin in vivo görüntüleme eş zamanlı iki foton için bir protokol mevcut. implantasyon prosedürü birkaç anahtar aşamadan oluşmaktadır. İlk olarak, hayvan derin anestezi ve stereotaktik çerçeve sabittir, daha sonra RSC üzerinde kafatası belirgin bir dairesel çizgiler boyunca matkap ve dairesel kemik kaldırılır ile inceltilir. Kanama durdurulduktan sonra, RAAV2 / 1 MCherry hipokampus enjekte edilir ve kapak cam delinmiş alana kafa...

İki foton mikroskopi yaşayan ve hayvanları davrandığını beyin aktivitesinin gözlem devrim. 1990 yılında piyasaya sunulmasından bu yana hızla popülerlik kazanmıştır ve şimdi in vivo 1,2 beyin aktivitesinin birçok yönleriyle incelenmesi yönünde en ilginç ve yenilikçi yaklaşımlarından biri olarak uygulanır. Bu uygulamalar ve nöronal hücrelerin morfolojisi (kalsiyum seviyesi göstergeleri veya erken genler ifade kullanarak, örneğin) kan akım ölçümleri, nöronal aktivasyon dahildir. Laboratuvarların sayısı giderek artıyor in vivo beyin görüntüleme için yeni bir standart olarak bilimsel dünyada tekniği uygulayan, iki foton mikroskopları kullanın. Standart yaklaşım kafatası pencere implantasyon varil ya da fare beyninin 3 görsel korteks üzerinde (bir kapak camı ile kapatılmış kafatasına bir yuvarlak delik) içerir. Daha sonra, deney protokolüne göre, MMse zaman 4,5 üzerinde beyin aktivitesi ve nöronal morfoloji değişiklikleri izlemek için izin, görselleştirme ve davranışsal eğitim oturumları bir dizi uğrar. Her iki durumda da kraniyotomi sadece sütürler geçmeden, parietal kemik etkiler. Büyük ölçüde tekniğin başlıca dezavantajı, bu tür hazne ya da görsel korteksin kolayca erişilebilir korteks için sınırlı bir uygulama olduğuna inanılmaktadır. diğer bölgelere göre kraniyal pencere implantasyonu nedeniyle aşırı kanama ve / veya uzaysal engel için, zorluklar bir çok oluşturmaktadır. Bu yazıda in vivo mikroskopi 6 iki-foton ilgi başka bir olası bölge olarak retrosplenial korteks (RSC) Yukarıdaki kraniyal pencere implantasyonu öneriyoruz. RSC uzaysal oluşumundan sorumlu beyin devresinin önemli bir unsurdur. Anatomik, RSC kortikal, hipokampal ve talamik bölgeleri 7 bağlayan bir nöronal ağın bir parçasıdır. Buağır gibi uzamsal öğrenme ve nesli yanı sıra mekansal navigasyon 6 gibi davranışların, bir dizi çıkıyor. Nöronların morfolojik değişikliklerini görselleştirmek için biz Thy1 promoteri altında yeşil floresan protein (GFP) eksprese eden bir transgenik fare hattı kullanır. Bu farelerde, GFP iki foton mikroskopi 8 kullanarak kortikal akson ve dendritler net görüntülenmesi için izin beyindeki nöronların yaklaşık% 10 olarak ifade edilir. Biz teklif Başka bir yenilik RSC projelendirme beynin derin yapılara bir nöron spesifik CaMKII promotör 9 altında kırmızı floresan proteini (mCherry) kodlama bir rekombinant adeno-ilişkili virüs serotipi 2/1 (/ 1 RAAV2) enjekte edilmesidir hipokamp gibi. Thy1-GFP fare hipokampusunda rAAV2 / 1 mCherry sentezleme Hippocampo-cortica öncesi ve postsinaptik elemanlarının aynı anda görüntülenmesi sağlarl 10 sinapsların. Protein aksonal terminallerde yeterli düzeyde ulaşmasını mCherry rAAV güdümlü ifade iki ila üç hafta gerektirir. Bu süre Kraniotomi kurtarma için gerekli her zamanki saatinde ile tutarlıdır.

<table><tbody><tr><td><güçlü > İlaç< / güçlü ></td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>İzofluran</td><td>Baxter</td><td>AErrane 8DG9623</td><td>Ameliyat öncesi% 5-2</td></tr><tr><td>İzofluran</td><td>Baxter</td><td>AErrane 8DG9623</td><td>Ameliyat sırasında% 1.5-2</td></tr><tr><td>Deksametazon</td><td>Taraması Veteriner</td><td>Deksazon: 2mg / ml</td><td>0.2 mg / kg kas içi</td></tr><tr><td>Baytril</td><td>Bayer</td><td>2.50%</td> <td>5 mg / kg deri altından</td></tr><tr><td>Tolfedin</td><td>Vetokinol</td><td>%</td><td>4 4 mg/kg deri altından</td></tr><tr><td>Butomidor</td><td>Richter Pharma</td><td>10 mg/ml</td><td>2 mg/kg deri altından</td></tr><tr><td>Carprofen</td><td>KRKA-Polska</td><td>Rycarfa 50mg/ml</td><td>10 mg/kg deri altından</td></tr><tr><td>Lidokain</td><td>Jelfa</td><td>Lignocainum</td><td>topikal</td></tr><tr><td>olarak</td><td></td><td></td><td></td> Lidokain Jelfa 20 mg/g</tr><tr><td><güçlü > Cerrahi< / güçlü ></td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Gelfoam</td><td>Ethicon</td><td>Spongostan dental; REF MS0005</td><td></td></tr><tr><td>Göz merhemi</td><td>Dedra</td><td>Lubrithal</td><td>topikal CA</td></tr><tr><td>yapıştırıcı</td><td>Pelikan Daniel</td><td>20G Huste</td><td></td></tr><tr><td>Dental akrilik</td><td>SpofaDental</td><td>Duracryl Plus</td><td></td></tr><tr><td>Stereotaksik çerçeve</td><td>Çalma</td><td>51500D</td><td></td></tr> <tr><td>< güçlü > Alet < / güçlü ></td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Coverglass</td><td>Harvard Aparat</td><td>HSE-64-0720</td><td>3 mm çap</td></tr><tr><td>Diş matkabı</td><td>Sigmed</td><td>Keystone KVet</td><td></td></tr><tr><td>Sabitleme çubuğu</td><td>Özel yapım</td><td>N/A</td><td>M2 veya M3 vida somunları kullanılabilir</td></tr><tr><td>Forseps</td><td>Renex</td><td>PN-7B-SA</td><td></td></tr><tr><td>Mikro makas</td><td>Falcon</td><td>BM.183.180</td><td></td></tr><tr><td>Diseksiyon mikroskobu</td><td>KOZO</td><td>XTL6445T</td><td></td></tr><tr><td>< güçlü > Görüntüleme< / güçlü ></td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Tutucu çerçeve</td><td>Özel yapım</td><td>N / A</td><td></td></tr><tr><td>İki fotonlu mikroskop</td><td>Zeiss</td><td>Dik Axio Examiner Z1</td><td>Lazer ünitesi: Optik Parametrik Osilatör 1050-1300nm ile Tutarlı Bukalemun 690-1040nm. Hedefler: EC-PLAN-NEUFLUAR 10x/0.1 ve LD Plan-APOCHROMAT 20x/1.0. Algılama: Zeiss bant geçiren filtreler BP 500-550 (GFP) ve BP 570-610 (mCherry), 560nm'de ışın ayırıcı ile ayrılmış ve iki GaAsP fotodetektöre bağlanmıştır.</td></tr><tr><td><güçlü > Reaktif< / güçlü ></td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td></td><td>K. Deisseroth'tan</td><td></td><td>CaMK promotörü kontrolü altında floresan protein mCherry eksprese eden rekombinant adeno-ilişkili virüs (rAAV)</td> hediyesi</tr></tbody></table>

eşzamanlı İki foton<em&gt; İn vivo</em&gt; fare retrosplenial kortekste sinaptik girişlerin görüntüleme ve postsinaptik hedefler

Simultaneous Two-photon In Vivo Imaging of Synaptic Inputs and Postsynaptic Targets in the Mouse Retrosplenial Cortex

Bu video, Thy1-GFP transgenik fare hattında in vivo iki foton mikroskobu kullanılarak fare retrosplenial korteksindeki (RSC) nöronların kronik olarak görüntülenmesine izin veren kraniyotomi prosedürünü göstermektedir. Bu yaklaşım, davranışsal manipülasyonların in vivo olarak nöronal morfolojideki değişikliklerle korelasyonunu araştırmak için bir olasılık yaratır.
Kraniyal pencere implantasyon işleminin sadece namlu alanı gibi kolay erişilebilir korteks bölgeleriyle sınırlı olduğu düşünülüyordu. Yaklaşımımız, yüksek derecede vaskülarize RSC'deki nöronların görselleştirilmesine izin verir. RSC, daha önce in vivo iki fotonlu görüntüleme için sorunlu olduğu düşünülen, uzamsal hafızadan sorumlu beyin devresinin önemli bir unsurudur.
RSC üzerindeki kraniyal pencere implantasyonu, dorsal hipokampusa mCherry eksprese eden rekombinant adeno-ilişkili virüs (rAAVmCherry) enjeksiyonu ile birleştirilir. İfade edilen mCherry, hipokampustan RSC'ye aksonal projeksiyonlara yayılır ve korteksteki hem presinaptik aksonal boutonlardaki hem de postsinaptik dendritik dikenlerdeki değişikliklerin görselleştirilmesini sağlar. 
Bu teknik, RSC'de deneyime bağlı yapısal plastisitenin uzun süreli izlenmesine izin verir.

Thy1-GFP raportör fare nöronların bir alt GFP tanımı kortikal dendrit ve RSC lokal akson çıkıntıların in vivo görüntüleme karşılaştırın. Şekil 1A görebilir birden GFP pozitif dendritler ile görüntülerin bir yığının en projeksiyon gösterir. Hücre gövdesi bir arter altında kalmıştır. Şekil 1B 1A belirtilen dendritik şube tek bir düzlem uzaklaştırdınız görüntü (dijital zoom 3x) gösterir. dendritik morfoloji (dikenler, filopodia) Detayları açıkça gö...

Bu video, Thy1-GFP transgenik hattında in vivo iki foton mikroskobu kullanılarak fare retrosplenial korteksindeki nöronların kronik olarak görüntülenmesine izin veren kraniyotomi prosedürünü göstermektedir. Bu yaklaşım, mCherry eksprese eden adeno ilişkili virüsün dorsal hipokampusa enjeksiyonu ile birleştirilir. Bu teknikler, RSC'de deneyime bağlı yapısal plastisitenin uzun süreli izlenmesine izin verir.

Eşzamanlı İki foton<em&gt; İn Vivo</em&gt; Fare Retrosplenial kortekste sinaptik Girişlerin Görüntüleme ve postsinaptik Hedefler

This video shows the craniotomy procedure that allows chronic imaging of neurons in the mouse retrosplenial cortex (RSC) using in vivo two-photon ...

Aşağıda açıklanan tüm deneysel prosedürler, Polonya Bilimler Akademisi Nenscki Deneysel Biyoloji Enstitüsü Yerel Etik Kurulu tarafından onaylanmıştır. Bu video, thi one-G of feet transgenik hattındaki farelerin retrosplenial korteksindeki nöronların in vivo iki foton mikroskopi kullanılarak kronik görüntülenmesine olanak tanıyan kraniyotomi prosedürünü göstermektedir. Bu yaklaşım, dorsal hipokampusa mCherry eksprese eden adeno-ilişkili virüs, AAV, enjeksiyonu ile birleştirilmiştir.Bu tekniklerin birleşimi, retrosplenial korteksteki yapısal plastisitenin ve deneyimlenen bağımlılığın uzun süreli izlenmesine olanak tanır. Bu makalede, iki fotonlu in vivo mikroskopi için retrosplenial korteks üzerindeki kraniyal pencere implantasyonunu olası bir ilgi bölgesi olarak öneriyoruz. Nöronal yapılardaki morfolojik değişiklikleri görüntülemek için, beyindeki nöronların yaklaşık yüzde 10'unda floresan GFP proteini ekspresyonu olan thi one-G B farelerini kullanıyoruz.Önerdiğimiz bir diğer yenilik ise, yapının retrosplenial kortekse olan projeksiyonlarını görselleştirmek amacıyla, hipokampus gibi beynin daha derin yapılarına, nöron-spesifik bir promotör altında floresan protein mCherry ekspresyonu sağlayan bir AAV enjekte edilmesidir. Tüm aletleri, sıvılar için kullanılan cam kapları ve pamuklu çubukları otoklavda sterilize edin. Tek kullanımlık eldivenlerinizi takın.Cerrahi masayı, stereotaktik çerçeveyi ve tüm çevre alanı %70 etanol ile temizleyin. Sterilize edilmiş tüm ekipmanlar için steril bir alan oluşturmak amacıyla steril bir cerrahi ped kullanın. Jel süngeri küçük parçalara bölün ve bunları steril salin içinde bekletin.Hayvanı indüksiyon odasına yerleştirin; isofluran seviyesini %5'e, oksijen akışını ise dakikada iki litreye ayarlayın. Bu işlem yaklaşık üç dakika sürmelidir. Hayvanı indüksiyon odasından çıkarın.Hayvanın tamamen sedatize olduğundan emin olmak için kuyruk veya ayak parmağı sıkıştırmaları uygulayın. Hassas tıraş makineleri kullanarak başın arkasındaki, kulakların arasındaki ve gözlere kadar olan bölgedeki tüyleri tıraş edin. Hayvanı stereotaktik çerçeveye yerleştirin ve başı kulak barlarıyla sabitleyin.Anestezi seviyelerini %1,5 ila %2 isoflurane ve dakikada 0,3 litre oksijen olarak ayarlayın. Göz merhemini uygulayın. İnflamasyonu, ağrıyı ve enfeksiyonu sırasıyla önlemek için hayvana deri altına 4 mg/kg tolfedine, 2 mg/kg butomidor ve 5 mg/kg Baytril enjekte edin.Beyin şişmesini önlemek için hayvana kilogram başına 0,2 mg dekzametazon intramüsküler olarak enjekte edin. Cildi, betadinli steril pamuklu çubuklar ve ardından %70 etanol kullanarak temizleyin. Eldivenleri değiştirin ve üzerlerine %70 etanol püskürtün.Cildi pensle kaldırın ve mikro makas kullanarak başın tabanı boyunca yatay olarak, ardından iki göz arasındaki ön noktaya doğru eğik bir şekilde cildi kesin. Cilt flebini kaldırın. Aşırı kanamayı ve ağrıyı önlemek için periost üzerine steril bir pamuklu çubukla lidokain pomad uygulayın.Periostu temizlemek için steril pamuklu çubuklar veya skalpel kullanın. Kafatasını steril çubuklarla kurulayın. Steril bir iğne kullanarak, deri kenarlarını sabitlemek ve dental simanla daha fazla temas etmesini önlemek için yoğun siyanoakrilat yapıştırıcı uygulayın.Yapıştırıcının kurumasını bekleyin. Steril üç milimetrelik bir lamel camı, lambdoid sütürün ön kısmına gelecek şekilde kafatası üzerine yerleştirin. Lameli retrosplenial koordinatlarda; bregmanın anterior-posterior ekseninde -2.8, medial-lateral ekseninde 0 olacak şekilde ortalayın.Steril bir iğne ile kafatası yüzeyini çizerek lamel kenarlarını işaretleyin. Lameli %70 ethanol içeren steril kaba geri koyun. Üç milimetre çapında bir daire oluşturmak için küçük çaplı freze ucuna sahip yüksek hızlı bir diş hekimi matkabı kullanın.Delme bölgesini steril serum fizyolojikle ıslatılmış pamuklu çubuklarla kemik tozundan arındırın. Ara sıra meydana gelen kanamaları durdurmak ve kemiği temizlemek için jel köpük ve pamuklu çubuklar kullanın. Delme işlemleri arasında, kemik dairesine hafifçe dokunarak ve hareketliliğini kontrol ederek ince penset yardımıyla kemik kalınlığını kontrol edin.Sütür bölgesinde kemiğin daha kalın olduğu unutulmamalıdır. Kemik daire hareketlendiğinde ve çevresinde yalnızca eşit, ince bir kemik tabakası kaldığında delme işlemini durdurun. Operasyon alanındaki tüm kalan kemik tozlarını serum fizyolojik ile nemlendirilmiş pamuklu çubuklarla temizleyin.Steril salini solüsyonunu, delinmiş daireyi kaplayacak şekilde delme bölgesine damlatın. Kemik daireyi ince bir pensle dikkatlice kanırtın ve ardından kemiği yukarı doğru kaldırarak nazikçe ama sıkıca çıkarın. Duraya gelebilecek olası hasarları önlemek için kemik daireyi kaldırırken eğmemeye dikkat edin.Kanamayı durdurmaya yardımcı olmak için steril salin ile ıslatılmış jel süngeri dura üzerine nazikçe uygulayın. Tüm kanamalar tamamen durana kadar bekleyin. Pıhtılaşma sürecini bozmamak için jel süngeri dikkatlice çıkarın.Sütur bölgesinin yüksek derecede vaskülerize olduğunu, bu nedenle bu noktadaki kanamanın şiddetli olabileceğini unutmayın. Kanamanın durması için yeterli süre beklenmesi esastır. İnfüzyon pompasını stereotaktik kuleye sabitleyin ve kontrol cihazını bağlayın.35-gauge iğneyi doldurma şırıngasına yerleştirin. Şırıngayı sterilize etmek için 10 kez etanolle, etanol kalıntılarını gidermek için ise 10 kez steril salinle yıkayın. Şırıngadaki hava kabarcıklarını giderin.Şırıngayı pompaya yerleştirin. Tek doz AV hazırlığı doldurun ve buz üzerinde tutun. Şırıngayı virüs solüsyonu ile doldurun.İğneyi bregma üzerine ortalayın ve ardından şu koordinatları kullanarak dikkatlice hipokampusa yerleştirin: Anterior, posterior -2, medial lateral ±1, dorsal ventral -1. Bu koordinatlar kranial alanın kenarına yakın konumlanacaktır. Dokunun stabilize olması için beş dakika bekleyin.0.7 µL AV solüsyonunu dakikada 50 nL hızla enjekte edin. Virüsün tamamen emilmesi için 10 dakika bekleyin. İğneyi nazikçe çıkarın.Kanama meydana gelirse jel süngerle tampon yapın. İşlemi karşı tarafta tekrarlayın. Steril kuru lamel camı, delinmiş daire çerçevesindeki duranın üzerine yerleştirin.Kapağı pensle tutarak durayı nazikçe düzleştirin ve lamel kenarlarını kafatası yüzeyine yaklaştırın. Steril bir iğne kullanarak, lameli kafatasına sabitlemek için lamel kenarlarına yoğun siyanoakrilat yapıştırıcı uygulayın. Yapıştırıcının kurumasını bekleyin.Kafatasının ön kısmına bir tespit çubuğu, anton somunu veya özel yapım bir tasarım yerleştirin. Tespit çubuğunun, görüntüleme oturumu sırasında kranial pencerenin yatay olarak konumlandırılmasına olanak sağlayacak bir konuma yerleştirilmesi gerektiğini unutmayın. Tutkalı çubuğun kenarlarına uygulayın.Yapıştırıcının kurumasını bekleyin. Sabitleme çubuğunun pencereden mümkün olduğunca uzak yerleştirilmesi gerektiğini unutmayın. Pencereye çok yakın yerleştirilirse, çubuk ve onu özel yapım tutucuya bağlayan vida, görüntüleme işlemi sırasında objektif için bir engel teşkil edebilir.Dental akriliği hazırlayın ve camın etrafındaki kafatası yüzeyine uygulayın. Pencerenin etrafında krater benzeri bir şekil oluşturmak faydalı olacaktır. Bu, daha sonra su objektifi ile görüntüleme için uygulanacak su için bir boşluk oluşturacaktır.Dental akrilik ile, operasyon alanı deri kenarlarının geri kalanını kapatan ve kraniyal pencere etrafındaki krateri güçlendiren bir kapak oluşturun. Dental çimentonun sertleşmesini bekleyin. Hayvanı stereotaktik çerçeveden çıkarın ve iyileşme odasına yerleştirin.Fizyolojik fonksiyonları gözlemlerken hayvanın cerrahi işlemden sonra iyileşmesini bekleyin. 48 saat boyunca postoperatif anestezi için 10 mg/kg cyroproferrin ve antibiyotik tedavisi için 5 mg/kg baytril uygulayın. Ti safir lazeri başlatın ve mikroskoba güç verin.Bu deneyde kullanılan sistem, iki fotonlu bir lazer, OPO sistemi ve çift galyum arsenür falsifiye PMT ile donatılmıştır. Hayvanı indüksiyon kamarasına yerleştirin ve anesteziyi indükleyin. Hayvanı indüksiyon kamarasından çıkarın ve mikroskop altındaki gaz anestezi maskesine yerleştirin.Oksijen akışını dakikada sıfır virgül üç litreye ve izofluran konsantrasyonunu %1,52'ye düşürün. Hayvanı, bir MT vidası veya başka bir özel sistem kullanarak özel mikroskop çerçevesine sabitleyin. Kranyal pencereyi düzleyin. Not: mikroskop üreticisinin kafa sabitleme sistemi de kullanılabilir, ancak özel çerçeve daha iyi sonuçlar, artırılmış kafa stabilitesi ve kronik bir deney sırasındaki birden fazla seansta sabit konumlandırma sağlar.Geniş alan mikroskop ayarlarını ve düşük büyütmeli bir objektifi kullanarak, görüntüyü retrosplenial korteksin kenarlarından birine ortalayın ve lamel yüzeyine odaklayın. Krater benzeri akrilik kuyuya bir damla su ekleyin. Uzun çalışma mesafeli su daldırma objektifine geçiş yapın.Su menisküsü numune ile objektifi birbirine bağlayana kadar objektifi kranial pencereye doğru hareket ettirin. İki foton ayarlarına geçin ve en düşük yakınlaştırmayı kullanarak numuneyi yukarıdan aşağıya doğru taramaya başlayın. Dura materin geçişi, yüksek spesifik olmayan sinyalin parlaması şeklinde görülecektir.Tüm dinamik aralığı kapsamak amacıyla, floresan hücrelerden gelen sinyal gücüne göre hem GFP hem de mCherry kanallarındaki mikroskop görüntüleme ayarlarını düzenleyin. Dendritik ağacı diğer hücrelerden ayrılmış uygun bir nöron bulduktan sonra, en düşük yakınlaştırma ve beş mikron Z mesafesine ayarlanmış yalnızca GFP filtrelerini kullanarak bir ön tarama gerçekleştirin. Tarama yığınının bir maksimum projeksiyonunu elde edin ve ters renkler kullanarak açıklamalar eklemek üzere çıktısını alın.İstenen morfolojik detayların görüntülenebilmesine olanak sağlayacak bir yakınlaştırma değerine ayarlayın. Maksimum projeksiyonu kılavuz olarak kullanarak tüm dendritik ağacı GFP ve mCherry kanallarında görüntüleyin. Bu protokolü kullanarak, retrosplenial korteksteki hem pre- hem de post-sinaptik yapıların tekrar tekrar izlenmesi mümkün olacaktır.Bu yaklaşım, davranışsal manipülasyonların dendrit morfolojisi, sinaptik dikenler veya pre-sinaptik nöronlardaki değişikliklerle korele olmasının beklendiği kronik bir deneyde kullanılabilir. Görüntüleme oturumları herhangi bir frekansta gerçekleştirilebilir, ancak hayvanın uygun şekilde toparlanmasına izin vermek ve anestezinin etkisini en aza indirmek için 24 saatlik zaman aralığı tercih edilir. Doğru uygulandığında bu teknik, birkaç ay boyunca birden fazla görüntüleme oturumu gerçekleştirilmesine olanak tanır.

simultaneous-two-photon-vivo-imaging-synaptic-inputs-postsynaptic

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Sinirbilim

Kaynak: Wang, Z.,  et al. Transpupiller İki Fotonlu Fare Retinasının İn Vivo Görüntülemesi.  J. Vis. Uzm. (2021). Bu video, iki foton mikroskobu kullanılarak in vivo retinal görüntüleme için bir tekniği göstermektedir. Anestezi uygulanmış fareler, başlarını sabitleyerek, göz kayganlaştırıcı uygulayarak ve gözün üzerine bir lamel yerleştirerek görüntülemeye hazırlanır. Floresan proteinleri eksprese eden retinal ganglion hücreleri (RGC'ler) ilk olarak hizalama için epifloresan kullanılarak...

Fare Retinasının İki Fotonlu İn Vivo Görüntülemesi

Source: Maruoka, H., et. al. uyanık farelerde mikroglial dinamiklerin ve nöronal aktivitenin eşzamanlı görüntülenmesi. J. Vis. Exp. (2022) Bu video, görsel stimülasyon sırasında uyanık bir farede nöronal aktiviteyi ve mikroglial dinamikleri görüntülemek için iki fotonlu bir mikroskopi prosedürünü göstermektedir. kalsiyum geçişleri ve hücresel etkileşimler.

Uyanık Bir Farede Mikroglial Dinamiklerin ve Nöronal Aktivitenin Eş Zamanlı Görüntülenmesi

Kaynak: Kamei, R., et. al., Fare Hipokampüsündeki Mikroglia'nın İn Vivo Kronik İki Foton Görüntülemesi. J. Vis. Uzm. (2022)Video, hipokampal CA1 (Cornu ammonis 1) ve dentat girustaki mikroglial dinamiklerin in vivo iki foton mikroskobu için kurulum ve görüntüleme sürecini göstererek optimum optik hizalama ve yapısal bütünlük değerlendirmesi sağlar.

Fare hipokampüsünde mikroglial dinamiklerin in vivo iki fotonlu görüntülenmesi

Bir yöntem olup, önceden belirlenmiş neokorteks fonksiyonel mikro etki floresan boyalar ile nöronlar etiketleme için açıklanmıştır. İlk olarak, iç sinyal optik görüntüleme fonksiyonel bir harita elde etmek için kullanılır. Sonra iki foton mikroskopi haritanın bir mikro-etki alanı içindeki etiket ve resim nöronlar için kullanılır.

Belirli Fonksiyonel İçsel Sinyal birleştiren tarafından neokorteks Mikro-etki ve İki foton Görüntüleme nöronlar Hedefli Etiketleme

Nöronlarda deneyim-bağımlı moleküler değişiklikler davranışsal sorunlara yanıt olarak adapte beyin yeteneği için gereklidir.

Kortikal Nöronlar In Vivo İki foton Of Görüntüleme Deneyimi bağımlı Moleküler Değişiklikler

Canlı hayvanda hızlandırılmış görüntüleme, sağlam beyindeki yapısal yeniden yapılanma hakkında değerli bilgiler sağlar. Burada, canlı fare korteksindeki floresan etiketli sinaptik yapıların iki foton mikroskobu ile transkraniyal görüntülenmesine izin veren inceltilmiş bir kafatası preparatını tanıtıyoruz.

İki-Foton<em&gt; In vivo</em&gt; Bir inceltilmiş-kafatası Hazırlık kullanarak Fare Cortex dendritik dikenler Görüntüleme

Biz yukarıda ikili birincil somatosensor corticies (S1) Thy1içinde çift optik pencerelerden nöronal aktivite ölçmek için deneysel bir işlem tarif-GCaMP6s transgenik fareler 2-foton (2 P) mikroskopi vivo içindekullanma.

Sinirsel aktivite Thy1kullanarak birincil somatosensor kortekste Imaging-GCaMP6s transgenik fareler

Bu yöntem, yaşayan farelerin Hippocampus optik erişim sağlayan kronik bir hazırlık açıklar. Bu hazırlık, birkaç hafta boyunca nöronal yapısal plastisite ve aktivite-uyarılmış hücresel plastisite uzunlamasına optik görüntüleme gerçekleştirmek için kullanılabilir.

Canlı fareler içinde dorsal hipokampal CA1 uzunlamasına Iki foton görüntüleme

İn vivo görüntüleme, sağlık ve hastalıkta biyoloji çalışmaları için güçlü bir araçtır. Bu protokol, standart iki foton mikroskobu ile fare retinasının transpupiller görüntülemesini tanımlar. Ayrıca, retinanın birden fazla hücresel kohortunu floresan olarak etiketlemek için farklı in vivoimaging yöntemleri göstermektedir.

Transpupiller İki Foton Fare Retinasının In vivo Görüntülenmesi

Burada, uyanık farelerde mikroglial dinamiklerin ve nöronal aktivitenin eşzamanlı görüntülenmesi için adeno ilişkili virüs enjeksiyonunu kraniyal pencere implantasyonu ile birleştiren bir protokolü tanımladık.

Uyanık Farelerde Mikroglial Dinamiğin ve Nöronal Aktivitenin Eşzamanlı Görüntülenmesi

Öğrenin fare retrosplenial korteksinde eşzamanlı iki foton in vivo mikroskopi ile sinaptik girişlerin görüntülenmesi ve postsinaptik hedeflerin izlenmesi. Kronik kraniyotomi ve AAV enjeksiyonu ile uzun süreli yapısal plastisite çalışmaları yapın.

Eşzamanlı İki foton

Daha fazla video keşfet