Eşzamanlı İki foton

Aşağıda açıklanan tüm deneysel prosedürler, Polonya Bilimler Akademisi Nenscki Deneysel Biyoloji Enstitüsü Yerel Etik Kurulu tarafından onaylanmıştır. Bu video, thi one-G of feet transgenik hattındaki farelerin retrosplenial korteksindeki nöronların in vivo iki foton mikroskopi kullanılarak kronik görüntülenmesine olanak tanıyan kraniyotomi prosedürünü göstermektedir. Bu yaklaşım, dorsal hipokampusa mCherry eksprese eden adeno-ilişkili virüs, AAV, enjeksiyonu ile birleştirilmiştir.

Bu tekniklerin birleşimi, retrosplenial korteksteki yapısal plastisitenin ve deneyimlenen bağımlılığın uzun süreli izlenmesine olanak tanır. Bu makalede, iki fotonlu in vivo mikroskopi için retrosplenial korteks üzerindeki kraniyal pencere implantasyonunu olası bir ilgi bölgesi olarak öneriyoruz. Nöronal yapılardaki morfolojik değişiklikleri görüntülemek için, beyindeki nöronların yaklaşık yüzde 10'unda floresan GFP proteini ekspresyonu olan thi one-G B farelerini kullanıyoruz.

Önerdiğimiz bir diğer yenilik ise, yapının retrosplenial kortekse olan projeksiyonlarını görselleştirmek amacıyla, hipokampus gibi beynin daha derin yapılarına, nöron-spesifik bir promotör altında floresan protein mCherry ekspresyonu sağlayan bir AAV enjekte edilmesidir. Tüm aletleri, sıvılar için kullanılan cam kapları ve pamuklu çubukları otoklavda sterilize edin. Tek kullanımlık eldivenlerinizi takın.

Cerrahi masayı, stereotaktik çerçeveyi ve tüm çevre alanı %70 etanol ile temizleyin. Sterilize edilmiş tüm ekipmanlar için steril bir alan oluşturmak amacıyla steril bir cerrahi ped kullanın. Jel süngeri küçük parçalara bölün ve bunları steril salin içinde bekletin.

Hayvanı indüksiyon odasına yerleştirin; isofluran seviyesini %5'e, oksijen akışını ise dakikada iki litreye ayarlayın. Bu işlem yaklaşık üç dakika sürmelidir. Hayvanı indüksiyon odasından çıkarın.

Hayvanın tamamen sedatize olduğundan emin olmak için kuyruk veya ayak parmağı sıkıştırmaları uygulayın. Hassas tıraş makineleri kullanarak başın arkasındaki, kulakların arasındaki ve gözlere kadar olan bölgedeki tüyleri tıraş edin. Hayvanı stereotaktik çerçeveye yerleştirin ve başı kulak barlarıyla sabitleyin.

Anestezi seviyelerini %1,5 ila %2 isoflurane ve dakikada 0,3 litre oksijen olarak ayarlayın. Göz merhemini uygulayın. İnflamasyonu, ağrıyı ve enfeksiyonu sırasıyla önlemek için hayvana deri altına 4 mg/kg tolfedine, 2 mg/kg butomidor ve 5 mg/kg Baytril enjekte edin.

Beyin şişmesini önlemek için hayvana kilogram başına 0,2 mg dekzametazon intramüsküler olarak enjekte edin. Cildi, betadinli steril pamuklu çubuklar ve ardından %70 etanol kullanarak temizleyin. Eldivenleri değiştirin ve üzerlerine %70 etanol püskürtün.

Cildi pensle kaldırın ve mikro makas kullanarak başın tabanı boyunca yatay olarak, ardından iki göz arasındaki ön noktaya doğru eğik bir şekilde cildi kesin. Cilt flebini kaldırın. Aşırı kanamayı ve ağrıyı önlemek için periost üzerine steril bir pamuklu çubukla lidokain pomad uygulayın.

Periostu temizlemek için steril pamuklu çubuklar veya skalpel kullanın. Kafatasını steril çubuklarla kurulayın. Steril bir iğne kullanarak, deri kenarlarını sabitlemek ve dental simanla daha fazla temas etmesini önlemek için yoğun siyanoakrilat yapıştırıcı uygulayın.

Yapıştırıcının kurumasını bekleyin. Steril üç milimetrelik bir lamel camı, lambdoid sütürün ön kısmına gelecek şekilde kafatası üzerine yerleştirin. Lameli retrosplenial koordinatlarda; bregmanın anterior-posterior ekseninde -2.8, medial-lateral ekseninde 0 olacak şekilde ortalayın.

Steril bir iğne ile kafatası yüzeyini çizerek lamel kenarlarını işaretleyin. Lameli %70 ethanol içeren steril kaba geri koyun. Üç milimetre çapında bir daire oluşturmak için küçük çaplı freze ucuna sahip yüksek hızlı bir diş hekimi matkabı kullanın.

Delme bölgesini steril serum fizyolojikle ıslatılmış pamuklu çubuklarla kemik tozundan arındırın. Ara sıra meydana gelen kanamaları durdurmak ve kemiği temizlemek için jel köpük ve pamuklu çubuklar kullanın. Delme işlemleri arasında, kemik dairesine hafifçe dokunarak ve hareketliliğini kontrol ederek ince penset yardımıyla kemik kalınlığını kontrol edin.

Sütür bölgesinde kemiğin daha kalın olduğu unutulmamalıdır. Kemik daire hareketlendiğinde ve çevresinde yalnızca eşit, ince bir kemik tabakası kaldığında delme işlemini durdurun. Operasyon alanındaki tüm kalan kemik tozlarını serum fizyolojik ile nemlendirilmiş pamuklu çubuklarla temizleyin.

Steril salini solüsyonunu, delinmiş daireyi kaplayacak şekilde delme bölgesine damlatın. Kemik daireyi ince bir pensle dikkatlice kanırtın ve ardından kemiği yukarı doğru kaldırarak nazikçe ama sıkıca çıkarın. Duraya gelebilecek olası hasarları önlemek için kemik daireyi kaldırırken eğmemeye dikkat edin.

Kanamayı durdurmaya yardımcı olmak için steril salin ile ıslatılmış jel süngeri dura üzerine nazikçe uygulayın. Tüm kanamalar tamamen durana kadar bekleyin. Pıhtılaşma sürecini bozmamak için jel süngeri dikkatlice çıkarın.

Sütur bölgesinin yüksek derecede vaskülerize olduğunu, bu nedenle bu noktadaki kanamanın şiddetli olabileceğini unutmayın. Kanamanın durması için yeterli süre beklenmesi esastır. İnfüzyon pompasını stereotaktik kuleye sabitleyin ve kontrol cihazını bağlayın.

35-gauge iğneyi doldurma şırıngasına yerleştirin. Şırıngayı sterilize etmek için 10 kez etanolle, etanol kalıntılarını gidermek için ise 10 kez steril salinle yıkayın. Şırıngadaki hava kabarcıklarını giderin.

Şırıngayı pompaya yerleştirin. Tek doz AV hazırlığı doldurun ve buz üzerinde tutun. Şırıngayı virüs solüsyonu ile doldurun.

İğneyi bregma üzerine ortalayın ve ardından şu koordinatları kullanarak dikkatlice hipokampusa yerleştirin: Anterior, posterior -2, medial lateral ±1, dorsal ventral -1. Bu koordinatlar kranial alanın kenarına yakın konumlanacaktır. Dokunun stabilize olması için beş dakika bekleyin.

0.7 µL AV solüsyonunu dakikada 50 nL hızla enjekte edin. Virüsün tamamen emilmesi için 10 dakika bekleyin. İğneyi nazikçe çıkarın.

Kanama meydana gelirse jel süngerle tampon yapın. İşlemi karşı tarafta tekrarlayın. Steril kuru lamel camı, delinmiş daire çerçevesindeki duranın üzerine yerleştirin.

Kapağı pensle tutarak durayı nazikçe düzleştirin ve lamel kenarlarını kafatası yüzeyine yaklaştırın. Steril bir iğne kullanarak, lameli kafatasına sabitlemek için lamel kenarlarına yoğun siyanoakrilat yapıştırıcı uygulayın. Yapıştırıcının kurumasını bekleyin.

Kafatasının ön kısmına bir tespit çubuğu, anton somunu veya özel yapım bir tasarım yerleştirin. Tespit çubuğunun, görüntüleme oturumu sırasında kranial pencerenin yatay olarak konumlandırılmasına olanak sağlayacak bir konuma yerleştirilmesi gerektiğini unutmayın. Tutkalı çubuğun kenarlarına uygulayın.

Yapıştırıcının kurumasını bekleyin. Sabitleme çubuğunun pencereden mümkün olduğunca uzak yerleştirilmesi gerektiğini unutmayın. Pencereye çok yakın yerleştirilirse, çubuk ve onu özel yapım tutucuya bağlayan vida, görüntüleme işlemi sırasında objektif için bir engel teşkil edebilir.

Dental akriliği hazırlayın ve camın etrafındaki kafatası yüzeyine uygulayın. Pencerenin etrafında krater benzeri bir şekil oluşturmak faydalı olacaktır. Bu, daha sonra su objektifi ile görüntüleme için uygulanacak su için bir boşluk oluşturacaktır.

Dental akrilik ile, operasyon alanı deri kenarlarının geri kalanını kapatan ve kraniyal pencere etrafındaki krateri güçlendiren bir kapak oluşturun. Dental çimentonun sertleşmesini bekleyin. Hayvanı stereotaktik çerçeveden çıkarın ve iyileşme odasına yerleştirin.

Fizyolojik fonksiyonları gözlemlerken hayvanın cerrahi işlemden sonra iyileşmesini bekleyin. 48 saat boyunca postoperatif anestezi için 10 mg/kg cyroproferrin ve antibiyotik tedavisi için 5 mg/kg baytril uygulayın. Ti safir lazeri başlatın ve mikroskoba güç verin.

Bu deneyde kullanılan sistem, iki fotonlu bir lazer, OPO sistemi ve çift galyum arsenür falsifiye PMT ile donatılmıştır. Hayvanı indüksiyon kamarasına yerleştirin ve anesteziyi indükleyin. Hayvanı indüksiyon kamarasından çıkarın ve mikroskop altındaki gaz anestezi maskesine yerleştirin.

Oksijen akışını dakikada sıfır virgül üç litreye ve izofluran konsantrasyonunu %1,52'ye düşürün. Hayvanı, bir MT vidası veya başka bir özel sistem kullanarak özel mikroskop çerçevesine sabitleyin. Kranyal pencereyi düzleyin. Not: mikroskop üreticisinin kafa sabitleme sistemi de kullanılabilir, ancak özel çerçeve daha iyi sonuçlar, artırılmış kafa stabilitesi ve kronik bir deney sırasındaki birden fazla seansta sabit konumlandırma sağlar.

Geniş alan mikroskop ayarlarını ve düşük büyütmeli bir objektifi kullanarak, görüntüyü retrosplenial korteksin kenarlarından birine ortalayın ve lamel yüzeyine odaklayın. Krater benzeri akrilik kuyuya bir damla su ekleyin. Uzun çalışma mesafeli su daldırma objektifine geçiş yapın.

Su menisküsü numune ile objektifi birbirine bağlayana kadar objektifi kranial pencereye doğru hareket ettirin. İki foton ayarlarına geçin ve en düşük yakınlaştırmayı kullanarak numuneyi yukarıdan aşağıya doğru taramaya başlayın. Dura materin geçişi, yüksek spesifik olmayan sinyalin parlaması şeklinde görülecektir.

Tüm dinamik aralığı kapsamak amacıyla, floresan hücrelerden gelen sinyal gücüne göre hem GFP hem de mCherry kanallarındaki mikroskop görüntüleme ayarlarını düzenleyin. Dendritik ağacı diğer hücrelerden ayrılmış uygun bir nöron bulduktan sonra, en düşük yakınlaştırma ve beş mikron Z mesafesine ayarlanmış yalnızca GFP filtrelerini kullanarak bir ön tarama gerçekleştirin. Tarama yığınının bir maksimum projeksiyonunu elde edin ve ters renkler kullanarak açıklamalar eklemek üzere çıktısını alın.

İstenen morfolojik detayların görüntülenebilmesine olanak sağlayacak bir yakınlaştırma değerine ayarlayın. Maksimum projeksiyonu kılavuz olarak kullanarak tüm dendritik ağacı GFP ve mCherry kanallarında görüntüleyin. Bu protokolü kullanarak, retrosplenial korteksteki hem pre- hem de post-sinaptik yapıların tekrar tekrar izlenmesi mümkün olacaktır.

Bu yaklaşım, davranışsal manipülasyonların dendrit morfolojisi, sinaptik dikenler veya pre-sinaptik nöronlardaki değişikliklerle korele olmasının beklendiği kronik bir deneyde kullanılabilir. Görüntüleme oturumları herhangi bir frekansta gerçekleştirilebilir, ancak hayvanın uygun şekilde toparlanmasına izin vermek ve anestezinin etkisini en aza indirmek için 24 saatlik zaman aralığı tercih edilir. Doğru uygulandığında bu teknik, birkaç ay boyunca birden fazla görüntüleme oturumu gerçekleştirilmesine olanak tanır.