Uyanık Farelerde Mikroglial Dinamiğin ve Nöronal Aktivitenin Eşzamanlı Görüntülenmesi
23 Ağustos 2022
Burada, uyanık farelerde mikroglial dinamiklerin ve nöronal aktivitenin eşzamanlı görüntülenmesi için adeno ilişkili virüs enjeksiyonunu kraniyal pencere implantasyonu ile birleştiren bir protokolü tanımladık.
Protokolümüz, uyanık farelerde mikroglia dinamiklerinin ve nöronal aktivitenin eşzamanlı görüntülenmesini sağlar. Mikroglia'nın sürveyans davranışını veya nöronlarla etkileşimini araştırmak için yaygın olarak uygulanabilir. Bu yöntemin avantajı, hareket artefaktının sağlam kafa fiksasyonu nedeniyle görüntüleme verilerini kolayca kirletmemesidir.
Ayrıca, yüksek kare hızında görüntülemeden sonra restorasyon, verilerden hareket artefaktını ortadan kaldırmamızı sağlar. Bu yöntemde AAV enjeksiyonu ve kraniyal pencere implantasyonunun cerrahisi teknik olarak zordur. Başarısızlık başlangıçta yaygındır, bu yüzden lütfen hayal kırıklığına uğramayın ve daha fazla pratik yapın.
Enjeksiyon aparatını hazırlamak için, stereotaksik bir aletin pipet tutucusuna bir tüp içinden 26 gauge Hamilton şırıngasına bağlı bir cam pipet yerleştirin. Ardından, pipet tutucuyu dikey eksenden 60 derece öne doğru eğin. Cam pipeti, şırıngayı ve bağlantı borusunu sıvı parafin ile doldurun ve şırıngayı bir mikroenjektöre yerleştirin.
Anestezi uygulanan fareye analjezi uygulayın ve yardımcı kulak çubuklarını takın. Ardından, hayvanı sırt tarafı yukarı bakacak şekilde stereotaksik alete sabitleyin. Saçları cerrahi bölgeden çıkardıktan ve cerrahi alanı dezenfekte ettikten sonra, kafa derisinde orta hat boyunca iki santimetre uzunluğunda bir kesi yapın ve kafatasının sağ birincil görsel korteksin üzerinde iyi bir şekilde pozlanmasını sağlayın.
Açıkta kalan kafatasındaki periosteumu çıkarmak için forseps kullanın. Yaklaşık 0,5 milimetre çapında küçük bir delik oluşturmak için kafatasını stereotaksik koordinatlarda orta hatta üç milimetre yanal ve lambda hattının 5 mililitre önünde delin. Ardından, farenin açıkta kalan kafatasına yaklaşık iki santimetre x iki santimetre arasında bir şeffaf film parçası yerleştirin.
Bir pipetleyici kullanarak film üzerindeki bir mikrolitre AAV çözelti damlacığını dışarı atın. Şırıngayı ilerletin. Ve film üzerindeki AAV çözeltisinin damlacığına bir cam pipet ucu yerleştirin ve AAV çözeltisini aspire etmek için şırıngayı yavaşça çekin.
Ardından, cam pipeti kafatasında oluşturulan delikten beyin yüzeyinden 500 mikrometre derinliğe yerleştirin. Daha sonra, mikroenjektörü kullanarak saatte iki mikrolitrelik bir enjeksiyon hacmi akış hızında 0,5 mikrolitre AAV çözeltisi enjekte edin. İğneyi geri çekin ve beyin yüzeyini salinle durulayın.
Delerek kafatası üzerindeki işaret boyunca dairesel bir oluk oluşturun. Kafatasının görünürlüğünü sağlamak için kalıntıları temizleyin ve delme sırasında ısınmayı önlemek için tuzlu su uygulayın. Merkezi kafatasına forseps ile hafifçe bastırın.
Delme derinliği, çok az dirençle dikey olarak hareket ederse yeterlidir. Oluk yeterli derinliğe ulaştığında, forsepsin ucunu merkezi kafatası parçasının dibine yerleştirin. Beyin yüzeyini açığa çıkarmak için yavaşça kaldırın ve çıkarın.
27 gauge'lik bir iğne kullanarak, açıkta kalan beyin yüzeyinin kenarındaki durayı delin ve yırtın. Forsepsin ucunu duranın kenarında yapılan delikten geçirin ve beyin yüzeyini açığa çıkarmak için soyun. Hemostatik lifleri tuzlu su içinde birer birer dağıttıktan sonra, hemostatik lifleri transekte duranın bulunduğu deliğin kenarları boyunca yerleştirin.
Kraniyal pencereyi açıkta kalan beyin yüzeyine yerleştirin ve ardından pencereye hafifçe bastırırken anında yapıştırıcı ile kafatasına yapıştırın. Daha sonra, tüm açıkta kalan kafatasına anında yapıştırıcı uygulayın. Ardından, kafatası penceresini kafa plakasının kare deliğinin ortasına yerleştirmek için kafatasına dikkatlice bir kafa plakası takın.
Tutkal yeterince sertleştikten sonra, kafa ve kafa bıçağı arasındaki bağlantıyı güçlendirmek için açıkta kalan kafatasına diş çimentosu uygulayın. Özel yapım gölgelendirme cihazını ve görsel stimülasyon için bir LCD monitörü kurmak için, önce lensi beyin yüzeyine odaklanacak şekilde konumlandırın ve ardından bu lens konumunu orijinal Z konumu olarak ayarlayın. XY koordinatlarını sabit tutun ve objektif lensi yükseltin.
Fareyi ve stereotaksik aleti objektif lensten çıkarın. Silikon kullanarak kafa plakasının üstüne bir gölgelendirme cihazı takın ve kafa plakası ile gölgelendirme cihazı arasındaki boşluğun iyi kapatıldığından emin olun. Gölgelendirme cihazını damıtılmış suyla doldurun.
Ardından, fareyi objektif lensin altındaki stereotaksik çerçeveyle sabitleyin. Objektif lensin derinliğini kontrol ederek beyin yüzeyindeki odak düzlemini dikkatlice sıfırlayın. LCD monitörden kaynaklanan ışık kirliliğini önlemek için objektif lensi siyah alüminyum folyo ile örtün.
Görsel uyaranları sunmak için farenin gözlerinin önünde 12,5 santimetre değerinde 10 inçlik bir LCD monitör ayarlayın. EGFP ve R-CaMP için floresan gönderme toplama filtrelerini ve uyarma dalga boyunu 1.000 nanometre olarak yapılandırın. Piksel başına 0,25 mikron uzamsal çözünürlüğe sahip görüntüler elde edin.
R-CaMP pozitif nöronların ve EGFP-pozitif mikroglia'nın aynı anda görüntülenebileceği görüntüleme bölgesini bulun. Katman 2, 3'te. 30 hertz kare hızında görüntüler elde edin.
Görüntü yakalama ile eşzamanlı olarak, fareye altı yönde 12 yönde, 30 derecelik adımlarla sıfırdan 150 dereceye kadar sürüklenen ızgara görsel uyaranları sunun. Görüntü alımından sonra, fareyi mikroskop aşamasından çıkarın. Gölgelendirme cihazını ve stereotaksik cihazı fareden ayırın ve fareyi ev kafesine geri getirin.
Bu protokol kullanılarak, sekiz haftalık transgenik bir farenin birincil görsel korteksinde AAV enjeksiyonu ve kraniyal pencere implantasyonu, ardından katman 2, 3'te R-CaMP tabanlı nöral aktivite ve mikroglial dinamiklerin iki foton görüntülemesi yapıldı. Izgara görsel uyaranları fareye sunuldu ve adendritik omurgadaki görsel yanıtlar kalsiyum izleri kullanılarak analiz edildi. Mikroglial süreçler hızlı dinamikler gösterdi ve morfolojilerini 10 saniye içinde değiştirdi.
12 haftalık transgenik bir farede birincil görsel korteksin 3. katman 2'sinde iki fotonlu görüntüleme kullanılarak, R-CaMP, burada macentada görülen nöronlarda gözlendi. Yeşil renkte görülen mikrogliada bir EGFP gözlendi. EGFP ve R-CaMP için bireysel sinyaller de gözlendi.
Başarılı AAV enjeksiyonu bu yöntem için kritik öneme sahiptir. AAV enjeksiyonunun başarısız olmasının başlıca nedenleri saat camı pipetleri ve doku hasarıdır. Mikroglia üzerindeki sürveyans davranışı ve SNAP'in mikroglia etkileşiminin, Alzheimer hastalığı gibi çeşitli patojenik mekanizmalarda yaygın olduğu tespit edilmiştir.
Yöntemimiz bu alana odaklanan araştırmalara faydalıdır.
Genel Bakış
Bu çalışma, uyanık farelerde mikroglial dinamiklerin ve nöronal aktivitenin eş zamanlı görüntülenmesini sağlamak amacıyla adeno-ilişkili virüs (AAV) enjeksiyonunu kranyal pencere implantasyonu ile birleştiren bir protokol sunmaktadır. Bu yöntem, görüntüleme sırasında hareket artefaktlarını en aza indirirken araştırmacıların mikrogliaların gözetim davranışlarını ve nöronlarla olan etkileşimlerini incelemelerine olanak tanır.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Bilim Alanı
- Nörobilim
- Nörogörüntüleme
- Nörobiyoloji
Arka Plan
- Mikroglia, beyin sağlığı ve hastalıklarında temel bir rol oynar.
- Mikroglial dinamiklerin gerçek zamanlı görüntülenmesi, bu hücrelerin işlevlerinin anlaşılması için kritik öneme sahiptir.
- AAV, nörobilim uygulamalarında genetik materyalin iletilmesi için yaygın olarak kullanılır.
- Uyanık farelerde baş sabitleme, görüntüleme sırasında hareket artefaktlarını azaltır.
Çalışmanın Amacı
- Mikroglia ve nöron etkileşimini görüntülemek için güvenilir bir yöntem geliştirmek.
- Fizyolojik koşullar altında mikroglial dinamikler ve nöronal aktiviteye dair anlayışı artırmak.
- Görüntüleme sırasında hareket artefaktlarından kaynaklanan veri kontaminasyonunu minimize etmek.
Kullanılan Yöntemler
- Protokol, uyanık farelerin primer görsel korteksine AAV enjeksiyonu ve kranyal pencere implantasyonunu içermektedir.
- Biyolojik model, floresan proteinler eksprese eden transgenik farelerden oluşmaktadır.
- Temel adımlar arasında enjeksiyon için hassas stereotaksik koordinatlar ve kranyal pencere yerleşimi için cerrahi prosedürler yer almaktadır.
- Görüntüleme, iki fotonlu mikroskopi kullanılarak 30 Hz kare hızında gerçekleştirilmiştir.
- Görsel uyarılara yanıt olarak nöronlar ve mikroglialardan elde edilen kalsiyum izleri analiz edilmiştir.
Temel Sonuçlar
- 10 saniye içinde morfoloji değiştiren mikroglial uzantılarda hızlı dinamikler gözlemlenmiştir.
- Eş zamanlı görüntüleme, görsel uyaranlara yanıt olarak nöronal aktiviteyi ve mikroglial dinamikleri ortaya koymuştur.
- Protokol, yüksek kaliteli görüntüleme için AAV ve kraniyal pencerelerin etkinliğini doğrulamıştır.
Sonuçlar
- Bu yöntem, beyin dinamikleri hakkında bilgiler sağlayarak mikroglia ve nöronal etkileşimlerin gerçek zamanlı gözlemlenmesine olanak tanır.
- Bu çalışma, mikrogliaların nöronal mekanizmalardaki rollerinin anlaşılması için değerli araçlar sunmaktadır.
- Gelecekteki uygulamalar, çeşitli müdahalelerin mikroglial ve nöronal aktivite üzerindeki etkilerinin araştırılmasını kapsayabilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Yönetici Özeti: Endüstriyel İlgililik
Uyanık farelerde mikroglial dinamiklerin ve nöronal aktivitenin eş zamanlı görüntülenmesi, nöroimmün etkileşimlerin tek hücre çözünürlüğünde doğrudan sorgulanmasına olanak tanır. Bu yetkinlik, özellikle nöroinflamatuar ve nörodejeneratif hastalık modellerinde, erken evre MSS hedef doğrulamasında mekanistik risklerin azaltılmasını ve öngörü güvenini destekler. Gerçek zamanlı glial-nöronal okumaların entegrasyonu, translasyonel açıdan ilgili sistemlerde yolak etkileşimini ve fonksiyonel sonuçları netleştirerek portföy kararlarını geliştirir.
Biyofarma Ar-Ge'de Stratejik Uygulamalar
Erken Keşif ve Hedef Doğrulama
- Fizyolojik ve stimüle edilmiş koşullar altında mikroglia-nöron etkileşimlerinin doğrudan görselleştirilmesini sağlar.
- İmmün hücre dinamiklerini in vivo nöronal aktiviteyle ilişkilendirerek fonksiyonel hedef doğrulamayı destekler.
- Nöroinflamatuar ve sinaptik plastisite hipotezleri için mekanistik risk azaltmayı kolaylaştırır.
- MSS hedef etkileşimi ve yolak modülasyonu için öngörü güvenilirliğini artırır.
Tarama ve Analiz Geliştirme
- Nöronal ve mikroglial yanıtların kantitatif değerlendirmesi için valide edilmiş in vivo görüntüleme sistemleri kurar.
- Ardıl analizler ve taramalar için tekrarlanabilir, hareket artefaktı minimize edilmiş veri setleri sağlar.
- Deney geliştirme süreçleri için görsel stimulus protokollerinin ve görüntüleme parametrelerinin standardizasyonuna olanak tanır.
- Bileşiklerin nöroimmün etkileşimler üzerindeki etkilerinin güvenilir şekilde değerlendirilmesini destekler.
Translasyonel ve Preklinik Araştırmalar
- Preklinik modelleri, insan MSS bozukluklarında gözlemlenen hastalıkla ilgili nöroimmün mekanizmalarla uyumlu hale getirir.
- Dinamik hücresel yanıtların takibi yoluyla, keşif aşamasından preklinik doğrulamaya kadar süreklilik sağlar.
- Nöroinflamasyon ve sinaptik modülasyon programlarının risk ayarlı ilerlemesini destekler.
- Gerçek zamanlı hücresel aktivite paternlerine dayalı translasyonel biyobelirteç adayları sağlar.
Boru Hattı ve İş Akışı Entegrasyonu
Bu görüntüleme protokolü, uyanık ve davranış sergileyen farelerde nöroimmün etkileşimlerin hipotez odaklı test edilmesini sağlayarak, erken keşif ile preklinik araştırma arasında bir köprü kurmaktadır.
- Keşif Biyolojisi: Periferik ve merkezi uyaranlara yanıt olarak mikroglial gözetim ve nöron-glia sinyallemesi üzerine hipotez testlerini destekler.
- Tarama: Bileşik veya genetik perturbasyon çalışmaları için uygun, kantitatif ve tekrarlanabilir görüntüleme çıktıları sağlar.
- Analizler: Karşılaştırmalı durum analizleri için yüksek çözünürlüklü kalsiyum izleri ve morfolojik veriler sunar.
- Translasyonel Araştırma: Hastalıkla ilgili mekanizmalarla uyumu ve biyobelirteç geliştirmeyi kolaylaştırır.
- Kurumsal Yeniden Kullanım: Çeşitli MSS hedeflerine ve müdahalelerine uyarlanabilen, yeniden kullanılabilir bir in vivo görüntüleme platformu sunar.
Operasyonel ve Kurumsal Etki
- Bilimsel Değer: MSS hedef doğrulamasında öngörü güvenini artırır ve mekanistik belirsizliği azaltır.
- Operasyonel Değer: In vivo görüntüleme iş akışlarını standartlaştırır ve tekrarlanabilir veriler için hareket artefaktlarını en aza indirir.
- Stratejik Değer: Bilgiye dayalı devam/durdur kararlarını ve nöroimmün programların sermaye açısından verimli ilerlemesini sağlar.
- Portföy Etkisi: Fonksiyonel in vivo kanıtlara dayalı olarak MSS varlıklarının riske göre ayarlanmış önceliklendirmesini destekler.
Uygulama Hususları
- Stereotaktik cerrahi, AAV iletimi ve kraniyal pencere implantasyonu konularında teknik uzmanlık gerektirir.
- İki fotonlu mikroskopi ve gelişmiş görüntüleme altyapısına erişim gerektirir.
- Görüntüleme protokollerinin ve veri analizinin ekipler arasında titiz bir şekilde standartlaştırılmasını gerektirir.
- Protokol optimizasyonu ile çeşitli beyin bölgelerine ve transgenik modellere uyarlanabilir.
- Başlangıçtaki teknik başarısızlık oranları yüksek olabilir; yetkinlik pratik ve deneyimle artar.
