Uyanık Farelerde Mikroglial Dinamiğin ve Nöronal Aktivitenin Eşzamanlı Görüntülenmesi
August 23rd, 2022
Burada, uyanık farelerde mikroglial dinamiklerin ve nöronal aktivitenin eşzamanlı görüntülenmesi için adeno ilişkili virüs enjeksiyonunu kraniyal pencere implantasyonu ile birleştiren bir protokolü tanımladık.
Protokolümüz, uyanık farelerde mikroglia dinamiklerinin ve nöronal aktivitenin eşzamanlı görüntülenmesini sağlar. Mikroglia'nın sürveyans davranışını veya nöronlarla etkileşimini araştırmak için yaygın olarak uygulanabilir. Bu yöntemin avantajı, hareket artefaktının sağlam kafa fiksasyonu nedeniyle görüntüleme verilerini kolayca kirletmemesidir.
Ayrıca, yüksek kare hızında görüntülemeden sonra restorasyon, verilerden hareket artefaktını ortadan kaldırmamızı sağlar. Bu yöntemde AAV enjeksiyonu ve kraniyal pencere implantasyonunun cerrahisi teknik olarak zordur. Başarısızlık başlangıçta yaygındır, bu yüzden lütfen hayal kırıklığına uğramayın ve daha fazla pratik yapın.
Enjeksiyon aparatını hazırlamak için, stereotaksik bir aletin pipet tutucusuna bir tüp içinden 26 gauge Hamilton şırıngasına bağlı bir cam pipet yerleştirin. Ardından, pipet tutucuyu dikey eksenden 60 derece öne doğru eğin. Cam pipeti, şırıngayı ve bağlantı borusunu sıvı parafin ile doldurun ve şırıngayı bir mikroenjektöre yerleştirin.
Anestezi uygulanan fareye analjezi uygulayın ve yardımcı kulak çubuklarını takın. Ardından, hayvanı sırt tarafı yukarı bakacak şekilde stereotaksik alete sabitleyin. Saçları cerrahi bölgeden çıkardıktan ve cerrahi alanı dezenfekte ettikten sonra, kafa derisinde orta hat boyunca iki santimetre uzunluğunda bir kesi yapın ve kafatasının sağ birincil görsel korteksin üzerinde iyi bir şekilde pozlanmasını sağlayın.
Açıkta kalan kafatasındaki periosteumu çıkarmak için forseps kullanın. Yaklaşık 0,5 milimetre çapında küçük bir delik oluşturmak için kafatasını stereotaksik koordinatlarda orta hatta üç milimetre yanal ve lambda hattının 5 mililitre önünde delin. Ardından, farenin açıkta kalan kafatasına yaklaşık iki santimetre x iki santimetre arasında bir şeffaf film parçası yerleştirin.
Bir pipetleyici kullanarak film üzerindeki bir mikrolitre AAV çözelti damlacığını dışarı atın. Şırıngayı ilerletin. Ve film üzerindeki AAV çözeltisinin damlacığına bir cam pipet ucu yerleştirin ve AAV çözeltisini aspire etmek için şırıngayı yavaşça çekin.
Ardından, cam pipeti kafatasında oluşturulan delikten beyin yüzeyinden 500 mikrometre derinliğe yerleştirin. Daha sonra, mikroenjektörü kullanarak saatte iki mikrolitrelik bir enjeksiyon hacmi akış hızında 0,5 mikrolitre AAV çözeltisi enjekte edin. İğneyi geri çekin ve beyin yüzeyini salinle durulayın.
Delerek kafatası üzerindeki işaret boyunca dairesel bir oluk oluşturun. Kafatasının görünürlüğünü sağlamak için kalıntıları temizleyin ve delme sırasında ısınmayı önlemek için tuzlu su uygulayın. Merkezi kafatasına forseps ile hafifçe bastırın.
Delme derinliği, çok az dirençle dikey olarak hareket ederse yeterlidir. Oluk yeterli derinliğe ulaştığında, forsepsin ucunu merkezi kafatası parçasının dibine yerleştirin. Beyin yüzeyini açığa çıkarmak için yavaşça kaldırın ve çıkarın.
27 gauge'lik bir iğne kullanarak, açıkta kalan beyin yüzeyinin kenarındaki durayı delin ve yırtın. Forsepsin ucunu duranın kenarında yapılan delikten geçirin ve beyin yüzeyini açığa çıkarmak için soyun. Hemostatik lifleri tuzlu su içinde birer birer dağıttıktan sonra, hemostatik lifleri transekte duranın bulunduğu deliğin kenarları boyunca yerleştirin.
Kraniyal pencereyi açıkta kalan beyin yüzeyine yerleştirin ve ardından pencereye hafifçe bastırırken anında yapıştırıcı ile kafatasına yapıştırın. Daha sonra, tüm açıkta kalan kafatasına anında yapıştırıcı uygulayın. Ardından, kafatası penceresini kafa plakasının kare deliğinin ortasına yerleştirmek için kafatasına dikkatlice bir kafa plakası takın.
Tutkal yeterince sertleştikten sonra, kafa ve kafa bıçağı arasındaki bağlantıyı güçlendirmek için açıkta kalan kafatasına diş çimentosu uygulayın. Özel yapım gölgelendirme cihazını ve görsel stimülasyon için bir LCD monitörü kurmak için, önce lensi beyin yüzeyine odaklanacak şekilde konumlandırın ve ardından bu lens konumunu orijinal Z konumu olarak ayarlayın. XY koordinatlarını sabit tutun ve objektif lensi yükseltin.
Fareyi ve stereotaksik aleti objektif lensten çıkarın. Silikon kullanarak kafa plakasının üstüne bir gölgelendirme cihazı takın ve kafa plakası ile gölgelendirme cihazı arasındaki boşluğun iyi kapatıldığından emin olun. Gölgelendirme cihazını damıtılmış suyla doldurun.
Ardından, fareyi objektif lensin altındaki stereotaksik çerçeveyle sabitleyin. Objektif lensin derinliğini kontrol ederek beyin yüzeyindeki odak düzlemini dikkatlice sıfırlayın. LCD monitörden kaynaklanan ışık kirliliğini önlemek için objektif lensi siyah alüminyum folyo ile örtün.
Görsel uyaranları sunmak için farenin gözlerinin önünde 12,5 santimetre değerinde 10 inçlik bir LCD monitör ayarlayın. EGFP ve R-CaMP için floresan gönderme toplama filtrelerini ve uyarma dalga boyunu 1.000 nanometre olarak yapılandırın. Piksel başına 0,25 mikron uzamsal çözünürlüğe sahip görüntüler elde edin.
R-CaMP pozitif nöronların ve EGFP-pozitif mikroglia'nın aynı anda görüntülenebileceği görüntüleme bölgesini bulun. Katman 2, 3'te. 30 hertz kare hızında görüntüler elde edin.
Görüntü yakalama ile eşzamanlı olarak, fareye altı yönde 12 yönde, 30 derecelik adımlarla sıfırdan 150 dereceye kadar sürüklenen ızgara görsel uyaranları sunun. Görüntü alımından sonra, fareyi mikroskop aşamasından çıkarın. Gölgelendirme cihazını ve stereotaksik cihazı fareden ayırın ve fareyi ev kafesine geri getirin.
Bu protokol kullanılarak, sekiz haftalık transgenik bir farenin birincil görsel korteksinde AAV enjeksiyonu ve kraniyal pencere implantasyonu, ardından katman 2, 3'te R-CaMP tabanlı nöral aktivite ve mikroglial dinamiklerin iki foton görüntülemesi yapıldı. Izgara görsel uyaranları fareye sunuldu ve adendritik omurgadaki görsel yanıtlar kalsiyum izleri kullanılarak analiz edildi. Mikroglial süreçler hızlı dinamikler gösterdi ve morfolojilerini 10 saniye içinde değiştirdi.
12 haftalık transgenik bir farede birincil görsel korteksin 3. katman 2'sinde iki fotonlu görüntüleme kullanılarak, R-CaMP, burada macentada görülen nöronlarda gözlendi. Yeşil renkte görülen mikrogliada bir EGFP gözlendi. EGFP ve R-CaMP için bireysel sinyaller de gözlendi.
Başarılı AAV enjeksiyonu bu yöntem için kritik öneme sahiptir. AAV enjeksiyonunun başarısız olmasının başlıca nedenleri saat camı pipetleri ve doku hasarıdır. Mikroglia üzerindeki sürveyans davranışı ve SNAP'in mikroglia etkileşiminin, Alzheimer hastalığı gibi çeşitli patojenik mekanizmalarda yaygın olduğu tespit edilmiştir.
Yöntemimiz bu alana odaklanan araştırmalara faydalıdır.
Genel Bakış
Bu çalışma, uyanık farelerde mikroglial dinamiklerin ve nöronal aktivitenin eşzamanlı görüntülemesini sağlamak için adeno-ilişkili virüs (AAV) enjeksiyonu ile kraniyal pencere implantasyonunu birleştiren bir protokolü özetlemektedir. Bu yöntem, araştırmacıların görüntüleme sırasında hareket artefaktlarını en aza indirerek mikrogliaların gözetim davranışını ve nöronlarla etkileşimlerini araştırmalarına olanak tanır.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Bilim Alanı
- Sinirbilim
- Nörogörüntüleme
- Nörobiyoloji
Arka Plan
- Mikroglia, beyin sağlığı ve hastalığında esas rol oynar.
- Mikroglial dinamiklerin gerçek zamanlı görüntülemes, işlevlerini anlamak için kritik öneme sahiptir.
- AAV, nörobilim uygulamalarında genetik materyal teslimatı için yaygın olarak kullanılır.
- Uyanık farelerde baş fiksasyonu, görüntüleme sırasında hareket artefaktlarını azaltır.
Çalışmanın Amacı
- Mikroglia ve nöron etkileşimi görüntüleme için güvenilir bir yöntem geliştirmek.
- Fizyolojik koşullar altında mikroglial dinamiklerin ve nöronal aktivitenin anlaşılmasını artırmak.
- Görüntüleme sırasında hareket artefaktlarından kaynaklanan veri kirlenmesini en aza indirmek.
Kullanılan Yöntemler
- Protokol, uyanık farelerin primer görsel korteksine AAV enjeksiyonu ve kraniyal pencere implantasyonunu içerir.
- Biyolojik model, floresan proteinler eksprese eden transgenik farelerden oluşur.
- Önemli adımlar, enjeksiyon için hassas stereotaktik koordinatlar ve kraniyal pencere yerleşimi için cerrahi prosedürleri içerir.
- Görüntüleme, 30 Hz kare hızında iki-foton mikroskobu kullanılarak yapılmıştır.
- Nöronlar ve mikrogliadan kaynaklanan kalsiyum izleri, görsel uyaranlara yanıt olarak analiz edilmiştir.
Ana Sonuçlar
- Mikroglial süreçlerde 10 saniye içinde morfoloji değiştiren hızlı dinamikler gözlemlenmiştir.
- Eşzamanlı görüntüleme, görsel uyaranlara yanıt olarak nöronal aktivite ve mikroglial dinamikleri ortaya koymuştur.
- Protokol, yüksek kaliteli görüntüleme için AAV ve kraniyal pencerelerin etkinliğini doğrulamıştır.
Sonuçlar
- Bu yöntem, beyin dinamiklerine dair içgörüler sağlayarak, mikroglia ve nöronal etkileşimlerin gerçek zamanlı gözlemlenmesini mümkün kılar.
- Çalışma, mikrogliaların nöronal mekanizmalardaki rollerini anlamak için değerli araçlar sağlar.
- Gelecekteki uygulamalar, mikroglial ve nöronal aktiviteye çeşitli müdahalelerin etkilerini araştırmayı içerebilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
Simultaneous imaging of microglial dynamics and neuronal activity in awake mice enables direct interrogation of neuroimmune interactions at single-cell resolution. This capability supports mechanistic de-risking and predictive confidence in early CNS target validation, especially for neuroinflammatory and neurodegenerative disease models. Integrating real-time glial-neuronal readouts advances portfolio decisions by clarifying pathway engagement and functional outcomes in translationally relevant systems.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct visualization of microglia-neuron interactions under physiological and stimulated conditions.
- Supports functional target validation by linking immune cell dynamics to neuronal activity in vivo.
- Facilitates mechanistic de-risking for neuroinflammatory and synaptic plasticity hypotheses.
- Improves predictive confidence for CNS target engagement and pathway modulation.
Screening & Assay Development
- Establishes validated in vivo imaging systems for quantitative assessment of neuronal and microglial responses.
- Provides reproducible, motion-artifact-minimized datasets for downstream analysis and screening.
- Enables standardization of visual stimulus protocols and imaging parameters for assay development.
- Supports reliable evaluation of compound effects on neuroimmune interactions.
Translational & Preclinical Research
- Aligns preclinical models with disease-relevant neuroimmune mechanisms observed in human CNS disorders.
- Enables continuity from discovery through preclinical validation by tracking dynamic cellular responses.
- Supports risk-adjusted advancement of neuroinflammation and synaptic modulation programs.
- Provides translational biomarker candidates based on real-time cellular activity patterns.
Pipeline & Workflow Integration
This imaging protocol bridges early discovery and preclinical research by enabling hypothesis-driven testing of neuroimmune interactions in awake, behaving mice.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing on microglial surveillance and neuron-glia signaling in response to peripheral and central stimuli.
- Screening: Delivers quantitative, reproducible imaging outputs suitable for compound or genetic perturbation studies.
- Analytics: Provides high-resolution calcium traces and morphological data for comparative condition analysis.
- Translational Research: Facilitates alignment with disease-relevant mechanisms and biomarker development.
- Enterprise Reuse: Offers a reusable in vivo imaging platform adaptable to diverse CNS targets and interventions.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in CNS target validation.
- Operational Value: Standardizes in vivo imaging workflows and minimizes motion artifacts for reproducible data.
- Strategic Value: Enables informed go/no-go decisions and capital-efficient advancement of neuroimmune programs.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of CNS assets based on functional in vivo evidence.
Implementation Considerations
- Requires technical expertise in stereotaxic surgery, AAV delivery, and cranial window implantation.
- Demands access to two-photon microscopy and advanced imaging infrastructure.
- Necessitates rigorous cross-team standardization of imaging protocols and data analysis.
- Adaptable to various brain regions and transgenic models with protocol optimization.
- Initial technical failure rates may be high; proficiency improves with practice and experience.
