Name: Fonksiyonel tamamlama Analizi (FCA): Tasarım ve Biyokimyasal Yolların Öğretim Ek için Uygulanan A Laboratory Egzersiz (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-06-24T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 27 s
Description: Öğrenin, fonksiyonel tamamlama analizi yöntemiyle mutant bakteri hücrelerinde enzim aktivitelerini nasıl doğrulayacağınızı. Bu teknik, amino asit metabolizması ve bakteri stringent yanıtı gibi biyokimyasal yolları in vivo koşullarda çalışmanıza olanak tanır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

AOH ve MAS Bilim Koleji ve destek için Rochester Teknoloji Enstitüsü&#39;nde Yaşam Bilimleri Thomas H. Gosnell Okulu kabul eder. Bu çalışma Amerika Birleşik Devletleri Ulusal Bilim Vakfı (NSF) AOH MCB-1120541 için ödül tarafından kısmen desteklenmiştir.

NOT: Yazarlar ilgilenen bireyler için öğretim amaçlı fonksiyonel tamamlama analizi birleşmesini kolaylaştırmak için bakteri suşları ve rekombinant plazmidler sağlamak için hazırız. Fonksiyonel tamamlama deneyleri kolaylaştırmak için kullanılmıştır plasmidler Tablo 1 &#39;de listelenmiştir. Fonksiyonel tamamlama için Plazmidler 1. İnşaat <ol><li> Fonksiyonel olarak tamamlanması diaminopimelat Aminotransferaz (dapL) klonlanması. <ol><li> V arasında dapL açık okuma çerçevesi (ORF) büyütmek A. spinosum ve cDNA&#39;ların thaliana ve C PCR ile reinhardtiiye. 15 saniye için 94 ° C&#39;de 30 döngü, 30 saniye için 60 ° C ve 2 dakika 72 ° C&#39;de, ardından 2 dk süreyle 94 ° C &#39;de 1 döngü, kullanın. Her bir primerden 12 pmol dahil, 1 mM MgSO 4, 0.5 ila 4 mm deoksinükleotid trifosfatın her birinden ve DNA şablonu, 0.5 ng ve pFX 1 üniteDNA polimerazı. NOT: Bitki A. üç dapL ortologlarda rekombinant klonlama ile ilgili tam açıklaması thaliana (-dapL &#39;de), bakteri Verrucomicrobium spinosum (Vs -dapL) ve deniz yosunu Chlamydomonas reinhardtii (Cr -dapL) daha önce yayınlanmıştır. 2,18-20 NOT: aşağıda dapL ortologlar klonlanması için kullanılan primerler şunlardır: DapL F vs 5&#39;-CCCCGAATTCATGGCCCTCATCAACGAAAACTTCCTCAAG-3 &#39; DapL R vs 5&#39;CCCCGTCGACCTACTTCAGCGCGGCGATACGGCGGCAGAC-3 &#39; DapL F &#39;de 5&#39;-GGGGCATTGGAAGGAGATATAACCATGGCAGTCAATACTTGCAAATGT-3&#39; En dapL R-5&#39;-GGGGGTCGACTCATTTGTAAAGCTGCTTGAATCTTCG-3 &#39; Cr dapL F-5&#39;-CCCCCGAATTCATGCAGCTCAACGTGCGGTCCACCGCCAGC- 3 &#39; Cr dapL R -5&#39; CCCCCAAGCTTCTAGTTACGCTTGCCGTAGGCCTCCTTAAA-3 &#39; </li><li> t içine PCR fragmanlarını klonlamakO pET30a yeniden birleştirici plazmidleri üretilmesi için plazmid, pET30a :: Vs dapL, pET30a :: dapL ve primerler, kısıtlama enzimleri ve T4 DNA ligaz kullanılarak pET30a :: Cr dapL &#39;de. <ol><li> Kısaca, ucun 50 ng ve 1 x ligaz tampon maddesi içinde vektörün 20 ng&#39;si ile ve bir gece boyunca 17 ° C&#39;de T4 DNA ligazı 1 birim inkübe edilir. E. içine ligasyonu Dönüşümü LB levhaları üzerinde koloniler için E. coli Dh5α hücreleri ve ekran 24 saat boyunca 37 ° C&#39;de inkübe edilerek 50 mg / ml kanamisin ile takviye edilmiş -1. 18-20 </li></ol></li><li> Kısıtlama pET30a :: Cr dapL için Xbal ve SalI ve Xbal ve HindIII enzimleri ile fonksiyonel tamamlama için plazmid oluşturmak için, dapL plazmidler At pET30a :: Vs dapL ve pET30a :: sindiremez. Plazmidleri pBAD33 :: Vs dapL üretmek üzere T4 DNA ligazı kullanılarak plazmid pBAD33 halinde eklentilerini bağlamak; pBAD33 :: dapL ve pBAD33 :: Cr dapL At. <ol><li> geçmenin 50 ng ve 20 ng inkübe1x ligaz tamponu vektörün ve gece boyunca 17 ° C&#39;de T4 DNA ligazı, 1 birim. E. içine ligasyonu Dönüşümü LB levhaları üzerinde koloniler için E. coli Dh5α hücreleri ve ekran 24 saat boyunca 37 ° C inkübe edilerek 34 | ig / ml kanamisin ile takviye edilmiş -1. 20 </li></ol></li></ol></li><li> A. tirosin aminotransferaz (tyrB) klonlanması fonksiyonel tamamlama için thaliana. NOT: A. cDNA klonlama ile ilgili tam ayrıntılar At5g36160 daha önce tarif edilmiştir lokus etiketlerinin açıklamalı thaliana. 4 <ol><li> PCR ile cDNA yükseltmek. 15 saniye için 94 ° C&#39;de 30 döngü, 30 saniye için 60 ° C ve 2 dakika 72 ° C&#39;de, ardından 2 dk süreyle 94 ° C &#39;de 1 döngü, kullanın. Her bir primerden 12 pmol, dahil 1 mM MgSO 4, 0.5 mM, dört deoksinükleotid trifosfatın her birinden ve DNA şablonu, 0.5 ng ve pFX DNA polimeraz 1 ölçü. Not: cl için kullanılan primerlerşöyle At5g36160 bölgesinin oning gibidir: TyrB F &#39;de 5&#39;-CCCCGAATTCATGGGAGAAAACGGAGCCAAGCGAT-3&#39; AttyrB R 5&#39;CCCCGAATTCATGGGAGAAAACGGAGCCAAGCGAT-3 &#39; </li><li> EcoR1 ve Sal1 PCR fragmanının sindirilmesi ile yeniden birleştirici plazmidleri pET30a :: At5g36160 üretilmesi için plazmid pET30a içine parçası, klon; Aşağıda tarif edildiği gibi T4 DNA ligazı kullanılarak pET30a içine fragmanı ligate. 4 </li><li> Fonksiyonel tamamlama plazmid yaratmak restriksiyon Xbal ve Hindin enzimleri ile pET30a :: At5g36160 sindirmek, T4 DNA ligazı kullanılarak, rekombinant plazmid pBAD33 :: At5g3160 üretmek için aynı kısıtlayıcı enzim sitelerinin kullanılması ile pBAD33 içine ekleme ligate etmek. <ol><li> geçmenin 50 ng ve 1 x ligaz tampon maddesi içinde vektörün 20 ng&#39;si ile ve bir gece boyunca 17 ° C&#39;de T4 DNA ligazı 1 birim inkübe edin. E. içine ligasyonu Dönüşümü LB plakaları üzerinde koloniler için coli Dh5α hücreleri ve ekran 34 ug / ml -1 Chlo ile desteklenmiş24 saat boyunca 37 ° C inkübe edilerek ramphenicol. 4 </li></ol></li></ol></li><li> Klonlanması UDP- K V den -acetylmuramoyl-L-alanil-D-glutamat mezo -2,6-diaminopimelat Ligaz (MURE) fonksiyonel tamamlama için spinosum. Not: V. gelen MURE ORF klonlanması spinosum daha önce tarif edilmiştir. 18 <ol><li> PCR ile açık okuma çerçevesi yükseltin. 15 saniye için 94 ° C&#39;de 30 döngü, 30 saniye için 60 ° C ve 2 dakika 72 ° C&#39;de, ardından 2 dk süreyle 94 ° C &#39;de 1 döngü, kullanın. Her bir primerden 12 pmol, dahil 1 mM MgSO 4, 0.5 mM, dört deoksinükleotid trifosfatın her birinden, şablon DNA, 0.5 ng ve pFX DNA polimeraz 1 ölçü. Daha sonra plazmid pET100D :: Vs MURE üretilmesi için plazmid pET100D klonlanması. NOT: aşağıda Vs MURE klonlanması için kullanılan primerler şunlardır: MURE f- 5&#39;CACCATGACCATTTTGCGCGATCTTATCGAGGGT vs -3 &#39; VsMURE R 5&#39;GTCGACTCACTGACGGTCATCCCTCCTTTGGCGTGC-3 &#39; </li><li> Fonksiyonel olarak tamamlanması plazmid üretmek pET100D sindirimi için :: Vs MURE Sınırlama ile Xbal ve Sal1 enzimler ve bunların rekombinant plazmid pBAD33 :: Vs MURE T4 DNA ligazı kullanılarak üretilmesi için pBAD33 içine ekleme ligate. <ol><li> gece boyunca 17 ° C&#39;de T4 DNA ligazı 1 birim ile birlikte ekin 50 ng ve 1 x ligaz tampon maddesi içinde vektörün 20 ng&#39;si, inkübe edilir. E. içine ligasyonu Dönüşümü 24 saat boyunca 37 ° C inkübe edilerek 34 ug / ml kloramfenikol -1 ile desteklenmiş LB plakaları üzerinde koloniler için E. coli Dh5α hücreleri ve ekran. 8 </li></ol></li></ol></li><li> Fonksiyonel tamamlama için Novosphingobium sp Relà / s Pot (rsh) klonlanması. Not:. Novosphingobium sp rsh klonlanması daha önce tarif edilmiş 17. <ol><li> 599 nükleotid upst ilave olarak rsh ORF yükseltinPCR ile sonlandırma yerinde aşağı başlatma başlangıç ​​site ve 46 nükleotidin delmek. 15 saniye için 94 ° C&#39;de 30 döngü, 30 saniye için 60 ° C ve 2 dakika 72 ° C&#39;de, ardından 2 dk süreyle 94 ° C &#39;de 1 döngü, kullanın. Her bir primerden 12 pmol, dahil 1 mM MgSO 4, 0.5 mM, dört deoksinükleotid trifosfatın her birinden, şablon DNA, 0.5 ng ve Taq DNA polimerazın 1 ölçü. Daha sonra pCR2.1 :: Nsp rsh üretilmesi için plazmid pCR2.1 klonlamak. <ol><li> amplifiye edilen PCR fragmanı 1 ul, pCR2.1 vektörü 1 ul, tuz çözeltisi 1 ul su 1 ul inkübe edin. 5 dakika ve ligasyon 2 ul E. içine 25 ° C de inkübe LB levhaları üzerinde koloniler için E. coli hücreleri, ve ekran 37 inkübe edilerek 50 mg / ml kanamisin ile takviye edilmiş -1 24 saat ° C. NOT: aşağıda rsh klonlanması için kullanılan primerler şunlardır: rsh F 5&#39;- GTTGAAAAACGCCGAATAGC 3 &#39; rsh R 5&#39;- GAGACCTGTGCGTAGGTGGT 3 &#39; </li><li> Fonksiyonel tamamlama için plazmid pCR2.1 :: Nsp EcoR1 ile rsh sindirmek ve T4 DNA ligaz kullanılarak rsh rekombinant plazmid pRK290 :: Nsp üretmek için geniş konakçı aralığına pRK290 içine insert Arter. <ol><li> geçmenin 50 ng ve 1 x ligaz tampon maddesi içinde vektörün 20 ng&#39;si ile ve bir gece boyunca 17 ° C&#39;de T4 DNA ligazı 1 birim inkübe edin. E. içine ligasyonu Dönüşümü LB levhaları üzerinde koloniler için E. coli Dh5α hücreleri ve ekran 37 inkübe edilerek 10 ug / ml tetrasiklin ile desteklenen -1 24 saat ° C. 17 </li></ol></li></ol></li></ol></li></ol> Dönüşüm kolaylaştırılması için Elektro-yetkili Bakteriyel Hücre 2. Hazırlık Not: elektro-kompetan hücrelerin hazırlanması daha küçük bir hacimde (örneğin, 250 mi) aşağı ölçeklendirilebilir kültür 1.0 L için protokol 26 dayanır. Bu protokol b unutmayıne FCA kolaylaştırmak için bu yazıda anlatılan yetkili tüm suşları yapmak için kullanılır. 22 <ol><li> Bir şişe içine tek bir koloni ile sıvı ortam 50 ml inoküle ve bu adımı (Tablo 2) başlamadan önce mutant genotipini kontrol emin, gece boyunca büyümektedir. </li><li> Günde iki, gece boyunca kültürün 50 ml&#39;si ile uygun bir ortamda (LB, E. coli mutantlarının ve PD Novosphingobium sp) 1.0 L inoküle ve 30 ° &#39;de (log fazına) 0.4-0.6 bir OD 600 büyüyebilir C. </li><li> 4 ° C&#39;de 15 dakika boyunca 5000 x g&#39;de santrifüjleme ile hasat hücreler supernatant süzün ve steril, buz gibi soğuk saf H2O 500 ml pelet </li><li> Santrifüj hücreler, 4 ° C&#39;de 20 dakika boyunca 5000 x g&#39;de, süpernatant süzün ve steril, buz gibi soğuk% 10 gliserol, 250 ml pelet. </li><li> 4 ° C&#39;de 20 dakika boyunca 5000 x g&#39;de santrifüj hücreleri ° C, süper süzünyüzen, ve% 10 gliserol, 2.0 ml pelet tekrar süspansiyon. </li><li> Bir kuru buz-etanol banyosu içinde tüpler koyarak dondurularak hemen mikro santrifüj tüplerine 50 ul transfer hücreleri eş-payı ve. Elektroporasyon için -80 ° C &#39;de, yetkili hücreleri saklayın. </li></ol> Tamamlama plazmid ile bakteriyel hücrelerin 3. elektroporasyonu <ol><li> Elektroporasyon için, yetkili hücrelerin bir tümböleni (50 ul) rekombinant plazmidin 1.0 ul (10-50 ng) ekleyin ve 5 dakika buz üzerine yerleştirin. </li><li> Bir elektroporasyon küvetine pipetleme yoluyla karışımı aktarın ve aşağıdaki ayarı elektroporasyon aparatı ayarlayın: 25 jxF kapasitansı, 2.5 kV ve 200 Ohm direnci ve darbe teslim. </li><li> 15 ml konik tüp bir pipet kullanarak kurtarma elektroporasyon küvetine medya (LB) ve transfer 1,0 ml ekleyin. bir çalkalama inkübatöründe 60 dakika boyunca hafif bir döndürme ile yeniden elde. </li><li> reco kültür 100 ul Plateagar plakaları üzerine çok adım pipetleme transformantların ve steril bir dağıtıcısı kullanarak yaymak için seçin. NOT: Uygun agar plakaları yapmak için antibiyotik ve genotipleri kontrol etmek için bu adımı başlamadan önce Tablo 1 ve Tablo 2 kontrol ettiğinizden emin olun. </li></ol> AOH1 4. Dönüşüm kullanarak fonksiyonel tamamlama kolaylaştırılması L, L-diaminopimelat Aminotransferaz (dapL) <ol><li> Tamamlama analizi için, boş vektör (pBAD33) ile AOH1 dönüşümü ve bölüm 3.0 özetlenen elektroporasyon protokolü kullanılarak ayrı dönüşüm olaylarda DapL ifade vektörleri ile. </li><li> 50 ug / ml -1 DAP ve 34 ug / ml kloramfenikol -1 ve 50 | ig / ml kanamisin ile takviye edilmiş -1 LB agar ortamı üzerinde kaplama ile transformantların seçin. </li><li> LB beni üzerine çizgiler ile çoğaltma kaplama koloniler fonksiyonel tamamlama için test% 0.2 ile 50 ug / ml -1 DAP ve 34 ug / ml kanamisin -1 olmayan (ağırlık / hacim) arabinoz ile dium. </li><li> 24 saat 30 ° C&#39;de inkübe ve sonuçları gözlemleyin. NOT: Sonuç vektörü sadece kontrol ile karşılaştırıldığında mutant sadece dapL gen mutant arka planda ifade edilir sadece DAP serbest medyada büyümek mümkün olduğunu göstermek gerekir. </li></ol> TKL-11 5. Dönüşüm UDP- N -acetylmuramoylalanyl-D-glutamil-2,6-mezo kullanarak fonksiyonel tamamlama kolaylaştırılması için -diaminopimelate Ligaz (MURE) <ol><li> Boş vektör (pBAD33) ve bölüm 3.0 özetlenen protokolü kullanılarak MURE ifade vektörü (pBAD33 :: VsmurE) ile mutant Transform. </li><li> LB agar ortamı üzerinde plaka seçin transformantlar / ml -1 kloramfenikol 50 ug / ml -1 timin ve 34 ug ile takviye edilmiş ve 24 saat boyunca 30 ° C&#39;de inkübe edin. </li><li> Kontrol ve iki LB ortamı artı% 0.2 (ağ / hac) arabinoz ve 50 ug / ml -1 timin üzerine deney dönüşümler hem koloniler, çizgi ya da kaplama ile tamamlanması için test. </li><li> görsel olarak büyüme fenotipi değerlendirmek için tek bir 30 ° C &#39;de plaka ve 24 saat boyunca 42 ° C&#39;de, diğer inkübe edin. NOT: Bu sonuçlar, mutant MURE gen vektörü sadece kontrole kıyasla mutant arka ifade yalnızca 42 ° C&#39;de büyüyebilir göstermelidir. </li></ol> DL39 6. Dönüşüm tirosin aminotransferaz kullanarak fonksiyonel tamamlama kolaylaştırılması için (tyrB) <ol><li> LB agar plakaları üzerinde pBAD33 ya pBAD33 :: At5g36160 ile ya DL39 Transform ve Seçenek transformantlar bölümünde belirtilen 50 ug / ml -1 tirosin, 50 ug / ml -1 fenilalanin ve protokol kullanılarak 34 ug / ml kloramfenikol ile takviye -1 3.0. </li><li> kopya50 ug / ml -1 fenilalanin ve 50 | ig / ml -1 tirosin, 50 ug / ml -1, aspartat, 50 ug / ml -1 leusin, 50 ug / ml -1 valin ile minimum (M9) ortama -plate koloni / ml -1 izolösin 50 ug, 10 ug / ml -1 urasil% 0.5 gliserol (ağ / hac),% 0.2 (ağırlık / hacim) arabinoz. Her iki plakaların aynı koloni çizgiler ile fenilalanin ve tirozin eksik plakalar üzerinde de çoğaltma plaka koloniler. </li><li> büyüme fenotipi gözlemlemek için 48 saat boyunca 30 ° C&#39;de inkübe edin. Not: Sonuç vektörü, yalnızca kontrol ile karşılaştırıldığında, mutant yalnızca mutant arka tyrB geninin ifade yalnızca, fenilalanin ve tirosin serbest bir ortam üzerinde yetişebilir mümkün olduğunu göstermesi gerekir. </li></ol> Hx699 7. Dönüşüm Hypomucoid Fenotip Novosphingobium ve sp fonksiyonel tamamlama kolaylaştırılması için. Gerilme Hx699 </p&gt; <ol><li> Bölüm 3.0 özetlenen dönüşüm protokolü kullanılarak 2 ayrı transformasyon olaylar yabani tip suşu Novosphingobium sp Transform. (Rr2-17) ve pRK290 mutant Hx699 ve pRK290 :: rsh Nsp. </li><li> Patates dekstroz dönüşümleri plakası (PD) agar 10 ug / ml tetrasiklin ile desteklenen -1, ve en az 24 saat boyunca ya da transformantlar görünene kadar inkübe edilir. </li><li> Çizgi, her iki dönüşümler taze PD agar plakaları üzerinde &quot;X&quot; desen ve 30 inkübe en az 4 gün süreyle ° C. görsel olarak, her iki levha büyüme fenotipi inceleyerek sadece vektör, ve deney fenotipleri dikkate alınmalıdır. NOT: Sonuç rsh vektörü sadece kontrol ile karşılaştırıldığında mutant arka planda ifade edildiğinde hipo-sümüksü fenotip tamamlanmaktadır olduğunu göstermelidir. </li></ol>

<ol><li>Gillum, A. M., Tsay, E. Y., Kirsch, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+the+Candida+albicans+gene+for+orotidine-5%27-phosphate+decarboxylase+by+complementation+of+S.+cerevisiae+ura3+and+E.+coli+pyrF+mutations%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Gen+Genet%22%5BJournal%5D)">Isolation of the Candida albicans gene for orotidine-5'-phosphate decarboxylase by complementation of S. cerevisiae ura3 and E. coli pyrF mutations.</a> Mol Gen Genet. 198, 179-182 (1984).</li>
<li>Hudson, A. O., Singh, B. K., Leustek, T., Gilvarg, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+L%2CL-diaminopimelate+aminotransferase+defines+a+novel+variant+of+the+lysine+biosynthesis+pathway+in+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">An L,L-diaminopimelate aminotransferase defines a novel variant of the lysine biosynthesis pathway in plants.</a> Plant Physiol. 140, 292-301 (2006).</li>
<li>Jander, G., Joshi, V. Aspartate-derived amino acid biosynthesis in Arabidopsis thaliana. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aJander%2C+G+%22The+Arabidopsis+Book%22">The Arabidopsis Book</a>. Last, R. L. , American Society for Plant Biologists. Rockville, MD. (2009).</li>
<li>Prabhu, P., Hudson, A. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+partial+characterization+of+an+L-Tyrosine+aminotransferase+from+Arabidopsis+thaliana%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry+Research+International%22%5BJournal%5D)">Identification and partial characterization of an L-Tyrosine aminotransferase from Arabidopsis thaliana.</a> Biochemistry Research International. , 549572(2010).</li>
<li>Mansfield, J., Genin, S., Magori, S., Citovsky, V., Sriariyanum, M., Ronald, P., Dow, M., Verdier, V., Beer, S. V., Machado , M. A., Toth, I., Salmond, G., Foster, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Top+10+pathogenic+bacteria+in+molecular+pathology%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Plant+Pathology%22%5BJournal%5D)">Top 10 pathogenic bacteria in molecular pathology.</a> Molecular Plant Pathology. 13, 614-629 (2012).</li>
<li>McGroty, S. E., Pattaniyil, D. T., Patin, D., Blanot, D., Ravichandran, A. C., Suzuki, H., Dobson, R. C., Savka, M. A., Hudson, A. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biochemical+Characterization+of+UDP-N-acetylmuramoyl-L-alanyl-D-glutamate%3A+meso-2%2C6-diaminopimelate+ligase+%28MurE%29+from+Verrucomicrobium+spinosum+DSM+4136T%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Biochemical Characterization of UDP-N-acetylmuramoyl-L-alanyl-D-glutamate: meso-2,6-diaminopimelate ligase (MurE) from Verrucomicrobium spinosum DSM 4136T.</a> PLoS ONE. 8 (6), e66458(2013).</li>
<li>Hutton, C. A., Perugini, M. A., Gerrard, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+lysine+biosynthesis%3A+an+evolving+antibiotic+strategy%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biosyst%22%5BJournal%5D)">Inhibition of lysine biosynthesis: an evolving antibiotic strategy.</a> Mol Biosyst. 3, 458-465 (2007).</li>
<li>Potrykus, K., Cashel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%28p%29ppGpp%3A+still+magical%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Microbiol%22%5BJournal%5D)">(p)ppGpp: still magical.</a> Annu Rev Microbiol. 62, 35-51 (2008).</li>
<li>Dalebroux, Z. D., Svensson, S. L., Gaynor, E. C., Swanson, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ppGpp+Conjures+Bacterial+Virulence%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiology+and+Molecular+Biology+Reviews%22%5BJournal%5D)">ppGpp Conjures Bacterial Virulence.</a> Microbiology and Molecular Biology Reviews. 74, 171-199 (2010).</li>
<li>Cashel, M., Gentry, D. J., Hernandez, V. J., Vinella, D. The stringent response. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCashel%2C+M+%22Escherichia+coli+and+Salmonella+typhimurium%3A+cellular+and+molecular+biology%22">Escherichia coli and Salmonella typhimurium: cellular and molecular biology</a>. Neidhardt, F. C., Curtiss, R. III, Ingraham, J. L., Lin, E. C. C., Low, K. B., Magasanik, B., Reznikoff, W. S., Riley, M., Schaechter, M., Umbarger, H. E. , 2nd, ASM Press. Washington, DC. 1458-1496 (1996).</li>
<li>Chatterji, D., Ojha, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Revisiting+the+stringent+response%2C+ppGpp+and+starvation+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Revisiting the stringent response, ppGpp and starvation signaling.</a> Curr. Opin. Microbiol. 4, 160-165 (2001).</li>
<li>Jain, V., Kumar, M., Chatterji, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ppGpp%3A+stringent+response+and+survival%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">ppGpp: stringent response and survival.</a> J. Microbiol. 44, 1-10 (2006).</li>
<li>Kramer, G. F., Baker, J. C., Ames, B. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Near-UV+stress+in+Salmonella+typhimurium%3A+4-thiouridine+in+tRNA%2C+ppGpp%2C+and+pppGpp+as+components+of+an+adaptive+response%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Near-UV stress in Salmonella typhimurium: 4-thiouridine in tRNA, ppGpp, and pppGpp as components of an adaptive response.</a> J. Bacteriol. 170, 2344-2351 (1988).</li>
<li>Braeken, K., Moris, M., Daniels, R., Vanderleyden, J., Michiels, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+horizons+for+%28p%29ppGpp+in+bacterial+and+plant+physiology%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Microbiol%22%5BJournal%5D)">New horizons for (p)ppGpp in bacterial and plant physiology.</a> Trends Microbiol. 14, 45-54 (2006).</li>
<li>Joseleau-Petit, D., Vinella, D., D'Ari, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+alarms+and+cell+division+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Metabolic alarms and cell division in Escherichia coli.</a> J. Bacteriol. 181, 9-14 (1999).</li>
<li>Mittenhuber, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+genomics+and+evolution+of+genes+encoding+bacterial+%28p%29+ppGpp+synthetases%2Fhydrolases+%28the+Rel%2C+RelA%2C+and+SpoT+proteins%29%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Microbiol.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Comparative genomics and evolution of genes encoding bacterial (p) ppGpp synthetases/hydrolases (the Rel, RelA, and SpoT proteins).</a> J. Mol. Microbiol. Biotechnol. 3, 585-600 (2001).</li>
<li>Gan, H. M., Buckley, L., Szegedi, E., Hudson, A. O., Savka, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+an+rsh+Gene+from+a+Novosphingobium+sp.+Necessary+for+Quorum-Sensing+Signal+Accumulation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Identification of an rsh Gene from a Novosphingobium sp. Necessary for Quorum-Sensing Signal Accumulation.</a> J. Bacteriol. 191, 2551-2560 (2009).</li>
<li>Nachar, V. R., Savka, F. C., McGroty, S. E., Donovan, K. A., North, R. A., Dobson, R. C., Buckley, L. J., Hudson, A. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomic+and+biochemical+analysis+of+the+diaminopimelate+and+lysine+biosynthesis+pathway+in+Verrucomicrobium+spinosum%3A+Identification+and+partial+characterization+of+L%2CL-diaminopimelate+aminotransferase+and+UDP-N-acetylmuramoylalanyl-D-glutamyl-2%2C6-meso-diaminopimelate+ligase%5BTitle%5D)+AND+%22Front.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Genomic and biochemical analysis of the diaminopimelate and lysine biosynthesis pathway in Verrucomicrobium spinosum: Identification and partial characterization of L,L-diaminopimelate aminotransferase and UDP-N-acetylmuramoylalanyl-D-glutamyl-2,6-meso-diaminopimelate ligase.</a> Front. Microbiol. 3, 183(2012).</li>
<li>Hudson, A. O., Giròn, I., Dobson, R. C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystallization+and+preliminary+X-ray+diffraction+analysis+of+L%2CL-diaminopimelate+aminotransferase+%28DapL%29+from+Chlamydomonas+reinhardtii%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Cryst%22%5BJournal%5D)">Crystallization and preliminary X-ray diffraction analysis of L,L-diaminopimelate aminotransferase (DapL) from Chlamydomonas reinhardtii.</a> Acta Cryst. 67, 140-143 (2011).</li>
<li>Dobson, R. C. J., Gir òn, I., Hudson, A. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((L%2CL-Diaminopimelate+Aminotransferase+from+Chlamydomonas+reinhardtii%3A+A+Target+for+Algaecide+Development%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">L,L-Diaminopimelate Aminotransferase from Chlamydomonas reinhardtii: A Target for Algaecide Development.</a> PLoS ONE. 6 (5), e20439(2011).</li>
<li>Guzman, L. M., Belin, D., Carson, M. J., Beckwith, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tight+regulation%2C+modulation%2C+and+high-level+expression+by+vectors+containing+the+arabinose+pBAD+promoter%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Tight regulation, modulation, and high-level expression by vectors containing the arabinose pBAD promoter.</a> J. Bacteriol. 177, 4121-4130 (1995).</li>
<li>Sambrook, J., Russell, D. W. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSambrook%2C+J+%22Molecular+Cloning%3A+A+laboratory+manual%22">Molecular Cloning: A laboratory manual</a>. , 3rd, Cold Spring Harbor Laboratory Press. New York. (2001).</li>
<li>Lugtenberg, E. J., van Schijndel-van Dam, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temperature-sensitive+mutants+of+Escherichia+coli+K-12+with+low+activity+of+the+diaminopimelic+acid+adding+enzyme%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Temperature-sensitive mutants of Escherichia coli K-12 with low activity of the diaminopimelic acid adding enzyme.</a> J. Bacteriol. 110, 41-46 (1972).</li>
<li>Mavrides, C., Orr, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multispecific+aspartate+and+aromatic+amino+acid+aminotransferases+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Multispecific aspartate and aromatic amino acid aminotransferases in Escherichia coli.</a> J. Biol Chem. 250, 4128-4133 (1975).</li>
<li>Gelfand, D. H., Steinberg, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Escherichia+coli+mutants+deficient+in+the+aspartate+and+aromatic+amino+acid+aminotransferases%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Escherichia coli mutants deficient in the aspartate and aromatic amino acid aminotransferases.</a> J. Bacteriol. 130, 429-440 (1977).</li>
<li>Whitaker, R. J., Gaines, C. G., Jensen, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+multispecific+quintet+of+aromatic+aminotransferases+that+overlap+different+biochemical+pathways+in+Pseudomonas+aeruginosa%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">A multispecific quintet of aromatic aminotransferases that overlap different biochemical pathways in Pseudomonas aeruginosa.</a> J. Biol Chem. 257, 13550-13556 (1982).</li>
<li>Raskin, D. M., Judson, N., Mekalanos, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+the+stringent+response+in+the+essential+function+if+the+conserved+bacterial+G+protein+CgtA+in+Vibrio+cholera%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci%2C+USA%22%5BJournal%5D)">Regulation of the stringent response in the essential function if the conserved bacterial G protein CgtA in Vibrio cholera.</a> Proc Natl Acad Sci, USA. 104, 4636-4641 (2007).</li>
<li>Ditta, G., Stanfield, S., Corbin, D., Helinski, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Broad+host+range+DNA+cloning+system+for+Gram-negative+bacteria%3A+construction+of+a+gene+bank+of+Rhizobium+meliloti%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci%2C+USA%22%5BJournal%5D)">Broad host range DNA cloning system for Gram-negative bacteria: construction of a gene bank of Rhizobium meliloti.</a> Proc Natl Acad Sci, USA. 77, 7347-7351 (1980).</li>
<li>Watanabe, A., Suzuki, M., Ujiie, S., Gomi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+and+enzymatic+characterization+of+a+novel+%CE%B2-1%2C6-glucosidase+from+Aspergillus+oryzae%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biosci+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Purification and enzymatic characterization of a novel β-1,6-glucosidase from Aspergillus oryzae.</a> J Biosci Bioeng. , (2015).</li>
<li>Song, J. T., Lu, H., McDowell, J. M., Greenberg, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+key+role+for+ALD1+in+activation+of+local+and+systemic+defenses+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">A key role for ALD1 in activation of local and systemic defenses in Arabidopsis.</a> Plant J. 40, 200-212 (2004).</li>
<li>Rost, B., Liu, J., Nair, R., Wrzeszczynski, K. P., Ofran, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automatic+prediction+of+protein+function%5BTitle%5D)+AND+%22Celuular+and+Molecular+Life+Sciences%22%5BJournal%5D)">Automatic prediction of protein function.</a> Celuular and Molecular Life Sciences. 60, 2637-2650 (2003).</li>
<li>Norris, S. R., Shen, X., Penna, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complementation+of+the+Arabidopsis+pds1+mutation+with+the+gene+encoding+p-Hyrdoxyphenylpyruvate+dioxygenase%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Complementation of the Arabidopsis pds1 mutation with the gene encoding p-Hyrdoxyphenylpyruvate dioxygenase.</a> Plant Physiol. 117, 1317-1323 (1998).</li>
<li>Mohler, W. A., Blau, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+expression+and+cell+fusion+analyzed+by+lacZ+complementation+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci%2C+USA%22%5BJournal%5D)">Gene expression and cell fusion analyzed by lacZ complementation in mammalian cells.</a> Proc Natl Acad Sci, USA. 93, 12423-12427 (1996).</li>
</ol>

Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarları olduğunu beyan ederim.

Rochester Teknoloji Enstitüsü&#39;nde Biyoteknoloji ve Moleküler Bioscience müfredat ayrılmaz bir parçası olan derslerin çoğu dersin ders kısmına ek olarak laboratuvar bileşeni var. akademik yıl 2014-2015 için müfredat yaklaşık% 60&#39;ını temsil eden bir laboratuvar bileşeni içeren 29 olan 48 ders, toplam içerir. İlkeleri ve Uygulamaları (BPP), bir laboratuvar bazlı ders: Böyle bir ders Bitki Biyokimya ve Patoloji (FPBP), bir harmanlanmış ders / laboratuvar ders ve Biyoseparasyonlara temelleri olduğunu. <p class="j...

Bir genin işlev (ler) açıklık / rol (ler) bağlamında fonksiyonel tamamlama homolog doğal tipte durumuna gözlemlenebilir fenotip ile belirli bir mutant geri belirli bir homolog ya da ortolog genin yeteneği olarak tanımlanır veya orthologous gen mutant arka plana cis veya trans tanıtıldı. Bu teknik yaygın izole ve işlev (ler) birçok genin / rolü (ler) tanımlamak için kullanılır olmuştur. Bir özel örnek olarak S. URA3 kullanılarak Candida albicans arasından orotidin-5-fosfat dekarboksilaz izolasyon ve tanımlanmasıdır S. cerevisiae ve E. pyrF mutant E. coli. 1 Yazarlar amino asitler, peptidoglikan ve araştırma programlarına sıkı yanıtın metabolizmasında rol alır ve B öğretim programlarına bu tekniği dahil olan genlerin işlevini aydınlatmak için bu tekniği kullandıkiotechnology ve Moleküler Bioscience (BMB) Rochester Institute of Technology (RIT) program. İlkeleri ve Uygulamaları (BPP) (Hudson / Savka), RIT BMB Programı iki üst bölümü seçmeli laboratuar tabanlı dersler: Yazarlar Bitki Biyokimyası / Patoloji (FPBP) (Hudson) ve Biyoseparasyonlara temelleri öğretmek. derslerde ele alınmaktadır konuların bazıları araştırma alanları ile bağlı olduğundan, yazarlar bu iki laboratuar tabanlı derslerin içine kendi araştırma programlarında kullanılan teknikler ve deneysel araçları birçok dahil etmişlerdir. Böyle bir örnek bitkiler, peptidoglikan ve bakterilerden sıkı yanıt metabolizma asit metabolizmasını amino ilgili ders materyallerini güçlendirmek için bir laboratuvar egzersiz fonksiyonel tamamlama olduğunu. FPBB ders açıklanan bitkilerden amino asit yollarının üç olduğu lisin (Lys) arasında, tirosin(Tyr) ve fenilalanin (Phe). Hayvanlar lys de novo sentez genetik makine yoksun beri lys yolu nedeniyle tüm hayvanlar, özellikle insanlarda için temel bir amino asit gibi amino asitin önemi sırasında vurgulanır. Buna ek olarak, son zamanlarda bitkilerin bakteri önemli ölçüde farklı olan Lys sentezi için bir yol kullanılması olduğu keşfedilmiştir. Bu buluş, kısmen, E. fonksiyonel komplemantasyon ile kolaylaştırıldı E. coli diaminopimelat (DAP) model bitki Arabidopsis thaliana enzim L L-diaminopimelat aminotransferaz (DapL) kodlayan bir gen kullanılarak mutantlar. Ara madde 2 diaminopimelat, Lys sentezi için varyant yolları, Şekil 1 &#39;de gösterilmiştir. Buna ek olarak , lys sentezi çok düzenlenir amino asitler aspartat türetilmiş ailesi aracılığıyla kolaylaştırır. 3 protein synt önemleri ek olaraknüklerde, Tyr ve Phe&#39;den için yollar fenilpropanoid bileşiklerin anabolizmasında öncül bileşikler olarak hizmet veren önemlerini gibi bitki savunma bileşiklerin sentezi dahil verilen vurgulanmış almaktadır. alkaloidler, lignin, flavonoidler, isoflavonoitlerin, diğerleri arasında hidroksisinnamik asit 4 tyr ve phe yolları da bitki ve bakteriyel anabolik yollar arasındaki farkı göstermek için vurgulanır. Bitkilerde, enzim, Tyr ve Phe&#39;den katabolizması esas olarak dahil olup, bu amino asitler anabolizma dahil değildir ise bakteriler, enzim tirosin aminotransferaz (TyrB), her iki amino asit anabolizma yer almaktadır. (Şekil 2). 4 Gram pozitif ve Gram peptidoglikan (PG) yapısına ilişkin negatif bakteriler arasındaki farklar FPBP ders vurgulanır. Gram negatif bakterilerin PG aslında dayalı bitki patolojisi ile ilgili ilgi çoğu obitki patojenleri Gram negatif bulunmaktadır. ilk 10 bakteriyel bitki patojenleri ile ilgili yeni bir yorum tüm Gram negatif olduğunu ortaya koymuştur. Bakteri cinslerden edildi. Pseudomonas, Ralstonia, Agrobacterium, Xanthomonas, Erwinia, Xylella, Dickeya ve Pectobacterium kimyasal farklılıkları 5 bir Gram negatif ve Gram pozitif bakterilere PG kök karşılaştırırken çapraz bağlama amino arasındaki farktır Her iki tip asitlerdir. PG farklı çapraz-bağlanması için, ilk aşama PG anabolizma sitoplazmik aşamada gerçekleşir ve enzim UDP- N -acetylmuramoyl-L-alanil-D-glutamat mezo -2,6-diaminopimelat ligaz ile kolaylaştırılır (MURE) (Şekil 3A). MURE çok Gram negatif bakteriler peptit sapının üçüncü konum. 6 da, belirli bir diamin bileşiğinin eklenmesini katalize sondan bir önceki Lys (, mezo -diaminopimelate öncülü <em&gt; m -DAP) olarak görev yapan çapraz bağlama amino asidi ve Lys çoğu Gram pozitif bakterilerin PG (Şekil 3B) aynı rol oynar. 7, bu m -DAP ve Lys her iki amin sahip olmasından kaynaklanmaktadır gruplar ve peptit, kök çapraz bağlanma için iki peptid bağlar oluşturabilirler. Biyoseparasyonlara in: Principles and Practices (BPP) kursu nedeniyle çevresel değişikliklere bakteri ekimi ve nasıl besin düzeyleri her iki sistemde de önemli ölçüde değişecek açık ve kapalı sistemler arasındaki farklar tartışılır. Bu olaylar bir &quot;aşağı kayması&quot; veya &quot;shift&quot; olarak adlandırılan düzenleyici değişiklikler ile bağlantılı açlık ya da amino asitler ya da enerji yeterli kaynağı tarafından tetiklenen. Bir bakteri kültürü, tek bir karbon kaynağı ile kimyasal olarak tanımlanmış orta zengin ve karmaşık ortamından transfer edildiğinde &quot;vites&quot; yanıtı oluşabilir. ortamda bu değişiklik hızlı Cessa yol açartRNA ve rRNA sentezi yon. amino asit biyosentezi upregüle halde ribozomlar, protein ve DNA sentezinin eksikliği Bu bırakma sonuçları. &quot;Vites&quot; yanıtın ardından, mevcut ribozomlar orta ya da çevrede artık mevcut amino asitleri sentezlemek için yeni enzimler üretmek için kullanılır. Bir süre sonra, rRNA sentezi ve yeni ribozom monte edilir ve bakteriyel hücre popülasyonu daha az bir oranda olmakla birlikte büyümeye başlar. Olayların ders &quot;sıkı tepki&quot; ya da &quot;sıkı denetim&quot; olarak adlandırılan ve küresel hücresel düzenlemenin bir örneğidir ve gerekli yüzeylerde ve enerji ihtiyacının durumu telafi etmek için hücrenin biyosentetik makine ayarlamak için bir mekanizma olarak düşünülebilir edilir . 8 sıkı tepkisi dolayısıyla çevrede besin akıları hızla yanıt bakteri sağlayan ve katkıda bulunur ve enhbesin ve veya substrat kullanılabilirliği açısından hızla değiştirebilirsiniz ortamlarda rekabet bakterilerin yeteneğini MANOTOP&#39;la. 8-9 Katı yanıtı amino asitler, karbon, azot, fosfat ve yağlı asitlerin mevcudiyeti sınırlıdır gen ekspresyonunda bir rol vardır. 8,10-14 Bu katı tepkisi iki nükleotid guanosin tetrafosfat (ppGpp) ve guanosin tarafından koordine edilir pentafosfat (pppGpp) genellikle alarmone (p) ppGpp olarak birlikte anılacaktır. Örneğin, amino asitler sınırlı olan zaman, guanosin 3-difosfat 5-trifosfatın anabolizma türetilen guanosin 3,5- (bis) pirofosfat (ppGpp), (pppGpp) biriken protein sentezini-alarmone bir darboğaz yol açabilir hücresinde. (P) ppGpp seviyesindeki değişiklik, doğrudan hücre büyümesi ve developmen katılan ortamında alt-tabakaların eksikliğinin üstesinden gelmek üzere yanıt düzenleyen genlerin ifadesi ile ilgilidirt. Bu süreçte yer alan genlerin ikisi rela ve spoT denir. RelA amino asit sınırlama sonucudur yüksüz tRNA&#39;ların birikimine cevap olarak dahil olan bir ribozom ile ilişkili (p) ppGpp sentetaz olup. bir iki fonksiyonlu (p) ppGpp sentetaz ve hidrolaz spot çalışır. Spot sentetaz aktivitesi karbon ve yağ asidi açlık eksikliği yanıt yer almaktadır. RelA / Spot homologları bitkilerde ve bakterilerde yaygın ve R ELA / S Pot h omologs için RSH olarak adlandırılır 8. 8,10 -12,16 yeni bir el yazması bir bakteri Novosphingobium sp Rr 2-17 bu alarmones sentezinde yer alan belirli bir Rsh proteini olduğunu göstermiştir. 17 Burada fonksiyonel tamamlama deneyleri gergin dört biyokimyasal yollar sunuyoruz. Bu yazıda belirtilen tamamlama deneyleri expl bir yol sağlarcevher bilinmeyen / varsayılan işlev (ler) ya da eğitim araçları biyokimyasal yolların öğretilmesini tamamlamak için sahip olduğu tahmin edilir enzimleri belirlenmesi ve ya karakterize bir araç olarak bu in vivo deney istihdam.

<table><tbody><tr><td>E. coli mutantlar</td><td>Hudson/Savka laboratuvarı veya CGSC (http://cgsc.biology.yale.edu/)</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Elektroporatör</td><td>Biorad-USA</td><td>1652100</td><td></td></tr><tr><td>Elektroporasyon Küvetleri</td><td>Biorad-USA</td><td>1652082</td><td></td></tr><tr><td>Sıcaklık kontrollü inkübatör</td><td>Jenerik Mikrosantrifüj Jenerik</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Luria Agar</td><td>Thermofisher Bilimsel</td><td>22700025</td><td></td></tr><tr><td>Luria Et Suyu</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>12795084</td><td></td></tr><tr><td>M9 Orta</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>63011</td><td></td></tr><tr><td>Patates Dekstroz Orta</td><td>Fisher Scientfic&nbsp;</td><td>DF0013-15-8</td><td></td></tr><tr><td>Kanamisin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>K1377</td><td></td></tr><tr><td>Diaminopimelat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>92591</td><td></td></tr><tr><td>Timin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T0376</td><td></td></tr><tr><td>Kloramfenikol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C0378</td><td></td></tr><tr><td>Tirozin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T3754</td><td></td></tr><tr><td>Fenilalanin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2126</td><td></td></tr><tr><td>Aspartat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9256</td><td></td></tr><tr><td>Valin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>V0500</td><td></td></tr><tr><td>Lösin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L8000</td><td></td></tr><tr><td>İzolösin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I2752</td><td></td></tr><tr><td>Urasil</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>U0750</td><td></td></tr><tr><td>Gylcerol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5516</td><td></td></tr><tr><td>Arabinoz</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3256</td><td></td></tr><tr><td>Tetrasilin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>87128</td><td></td></tr><tr><td>Taq DNA polimeraz</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>10342-020</td><td></td></tr><tr><td>Platin pfx DNA polimeraz</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>11708-013</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA ligaz</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>15224-041</td><td></td></tr><tr><td>E. coli Dh5-alfa</td><td>Thermofisher Bilimsel</td><td>18258012</td><td></td></tr><tr><td>E. coli Top10</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>C4040-03</td><td></td></tr><tr><td>pET100D/topo vektör</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>K100-01</td><td></td></tr><tr><td>pCR2.1 Vektör</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>K2030-01</td><td></td></tr></tbody></table>

fonksiyonel tamamlama analizi (fca): tasarım ve biyokimyasal yolların Öğretim ek için uygulanan a laboratory egzersiz

Functional Complementation Analysis (FCA): A Laboratory Exercise Designed and Implemented to Supplement the Teaching of Biochemical Pathways

Fonksiyonel tamamlama deneyi (FCA), yaygın olarak genler / enzimlerin fonksiyonu / rolünü açıklamak için kullanılan bir in vivo deneydir. Bu teknik biyokimya, genetik ve diğer birçok bilim dallarında çok yaygındır. tekniğin kapsamlı bir bakış peptidoglikan ve bakteriyel sıkı yanıt Bu yazıda bildirilen asitleri, amino ilgili biyokimyasal yolların öğretilmesini tamamlamak için. Lisin (D, L-diaminopimelat aminotransferaz (dapL) ve tirosin ve fenilalanin metabolizmasına katılan tirosin aminotransferaz (tyrB) metabolizmasında rol oynayan modeli bitki organizma Arabidopsis thaliana iki cDNA&#39;lar vurgulanır. Buna ek olarak, bakteriyel peptidoglikan anabolik yolu ortada yer alan bir bakteri Verrucomicrobium spinosum gelen UDP- N -acetylmuramoyl-L-alanil-D-glutamat mezo -2,6-diaminopimelat ligaz (MURE) geninin analizi ile vurgulanırpeptidoglikan -linking. Bakteriyel sıkı yanıt da. Rsh (r ela / s Pot h omolog) bakteri Novosphingobium sp bir hiper-sümüksü fenotip sorumlu çift işlevli gen analizi ile bildirilen FCA dört örnekleri sunulmaktadır. Video yani lisin, peptidoglikan ve sıkı tepki, üçü üzerinde durulacak.

Çeşitli fonksiyonel tamamlama analizlerde kullanılan bakteriyel suşlar, Tablo 2&#39;de sıralanmıştır. Fonksiyonel tamamlama analizi: L, L-diaminopimelat aminotransferaz (dapL) E. E. coli çift mutant AOH1 (Δ DAPD :: Kan2, dapE6) Dape geninde bir mutasyon ve DAPD geninin tam silme (Şekil 1) barındırır. Bu ne...

biyokimyasal yollarla ilgili enzimatik faaliyetlerin doğrulama fonksiyonel tamamlama analizi (FCA) kullanılarak aydınlatılmıştır edilebilir. amino asitler, bakteriyel katı cevabı ve bakteriyel peptidoglikan biyosentezinin metabolizmasında rol oynayan enzimlerin enzimatik aktivitesi gösteren FCA deneyi Bu yazıda tarif edilmektedir.

Fonksiyonel tamamlama Analizi (FCA): Tasarım ve Biyokimyasal Yolların Öğretim Ek için Uygulanan A Laboratory Egzersiz

Functional complementation assay (FCA) is an in vivo assay that is widely used to elucidate the function/role of genes/enzymes. This technique is very ...

İşlevsel Tamamlama Denemesinin genel amacı, mutant arka planda vahşi tip bir fenotipi geri yükleyip yüklemediğini görmek için karşılık gelen genin işlevsel bir kopyasını mutant bir hücreye sokarak bir enzimin aktivitesini açıklamaktır. Bu yöntem, biyokimya, mikrobiyoloji, genetik, bitki biyolojisi, evrim ve diğerleri gibi çeşitli alanlardaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, normalde doğası gereği yapay olan in vitro koşulların aksine, normalde fizyolojik olan in vivo koşullar altında bir enzimin işlevini, aktivitesini ve/veya rolünü değerlendirmesidir.Bu tekniğin etkileri, karakterize edilmemiş enzimlerin ve hala varsayılan veya tahmin edilen işlevlere sahip olanların tanımlanması ve/veya işlevinin açıklanmasına kadar uzanır. Bu fonksiyonel tamamlama prosedürünü gösteren, laboratuvarımda bir öğrenci olan biyoteknoloji ve moleküler biyoloji uzmanı Taylor Harkness'tir. DapL, TarB, MurE ve RSH genlerinin metin protokolüne göre klonlanmasından sonra, 50 mililitre sıvı ortamı, ilgilenilen bir gen ile dönüştürülecek ve bir gecede büyüyecek tek bir mutant bakteri hücresi kolonisi ile aşılayın.İkinci günde, uygun ortamın 1 litresini aşılamak içi

functional-complementation-analysis-fca-laboratory-exercise-designed

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Biz geçerlidir etiket kinetik karakterizasyonu ile papain birkaç sistatin B mutantlar bağlayıcı yapı-işlev analizi için ücretsiz Biacore X100 kullanarak protein etkileşim analizi. Kalibrasyon konsantrasyon analizi (CFCA) standart eğri gerek kalmadan muhafaza bağlayıcı aktivite ile protein konsantrasyonu ölçer. Biz CFCA kinetik analiz güvenilirliğini artırır ve bu kinetik sabitler güvenilir bir rekombinant proteinin aktivitesi azalır bile tespit edilebilir kullanarak bu onay konsantrasyonlarının...

Kinetik ve Yapı-fonksiyon Analiz Affinity belirlenmesi Doğru Protein Konsantrasyonu Önemi

Proteinlerin hücre içi lokalizasyonu hücre sinyal uzay-zamansal düzenleme belirlenmesinde önemlidir. Burada, iki moleküllü floresan proteinlerin hücre mekansal etkileşimleri izlenmesi için basit bir yöntem olarak tamamlama (BiFC) açıklar.

Bimoleküler Floresan tamamlama

Biz bitki protein-protein etkileşimleri test etmek için bir teknik geliştirdik. Sarı floresan protein (YFP) örtüşmeyen iki parça halinde bölünmüş durumda. Her parçası füzyon proteinleri ifade sağlayan, Gateway sistemi üzerinden ilgi bir gen-frame klonlanmış. YFP sinyal Sulandırma sadece tahkikat proteinler etkileşime girdiğinde oluşur.

Ağ Geçidi Uyumlu Bimoleküler Floresan tamamlama (BiFC) kullanarak Bitki Protein Etkileşimleri Tespiti

13 C-izotop etiketleme çeşitli türleri için mikroorganizmaların hücre merkezi metabolizma belirlenmesi için yararlı bir tekniktir. Hücreleri belirli bir substrat ile etiketli kültüre edildikten sonra, GC-MS ölçüm aminoasittir benzersiz etiketleme desen dayalı işlevsel metabolik yollar ortaya çıkarabilir.

Sayesinde Metabolik Pathway Onay ve Keşif 13</supAminoasittir> C-etiketleme

Kantitatif Spor Analizi (QFA) mikrobiyal kültür uyumu tahmin etmek için deneysel ve hesaplamalı yöntemleri tamamlayıcı bir dizi. QFA genetik mutasyonlar, uyuşturucu ya da mikrop büyümesi üzerine uygulanan diğer tedavilerin etkisi tahmin ediyor. Tek kültür odaklı analiz paralel kültürlerin binlerce deneyler ölçekleme dizayn edilebilir.

Kantitatif Spor Analizi İş Akışı

Sistematik, büyük ölçekli sentetik gen (bir gen ya da gen-epistasis) etkileşim ekranlar genetik ve fazlalık yolu çapraz konuşma keşfetmek için kullanılabilir. Burada, yüksek-throughput kantitatif sentetik genetik dizi tarama teknolojisi tarif eSGA biz epistatik ilişkileri durulaştırmada ve genetik etkileşim ağları keşfetmek için geliştirilen...

Bakteriyel Fonksiyonel Ağlar ve tanımında Haritalama<em&gt; Escherichia Coli</em&gt; Sentetik Genetik Diziler kullanarak

Bimoleküler Floresan tamamlama akış sitometrik analizi protein-protein etkileşimleri incelemek için bir yüksek kapasiteli nicel yöntem sağlar. Bu metodoloji, eşleme protein bağlama siteleri ve protein-protein etkileşimleri düzenleyen faktörler taranması için uygulanabilir.

Bimoleküler Floresan tamamlama akışı Sitometrik Analizi: Protein-protein etkileşim Eğitim Bir Yüksek Verimli Kantitatif Yöntemi

Proteinler birbirleri ile etkileşim halindedir ve bu etkileşimler fonksiyonlarını büyük ölçüde belirler. Protein etkileşim ortakları, dihidrofolat redüktaz protein fragmanı tamamlama testine (DHFR-PCA) dayalı bir maya uygunluk testi kullanılarak in vivo olarak yüksek verimli olarak tanımlanabilir.

Yaşayan Hücrelerde Protein-fragmanı tamamlama Assay (PCA) ile genom Protein-protein etkileşimi Eleme

Fumarilasetoasetik hidrolaz etki alanı içeren proteinlerin ifade ve arıtma örnekleri ( E. coli, FPLC ifadesi) ile açıklanmıştır. Arıtılmış proteinler kristalizasyon ve antikor üretimi için kullanılır ve enzim asdında istihdam edilir. Seçilen fotometrik asdalar, oxaloasetat dekarboksilaz ve acylpyruvate hydrolase olarak FAHD1 Multi-functionality görüntülemek için sunulmaktadır.

Fumarylacetoasetat Hydrolase etki alanı Içeren proteinleri ifade, arıtma, kristalizasyon ve enzim Asdimleri

Moleküler biyoloji laboratuvarı ders öğrencileri için ders tabanlı bir lisans araştırma deneyimi (CURE) formatında uyarlanabilir bir Gibson Assembly moleküler klonlama modülü kullanılmıştır. Öğrenci öğrenme çıktılarının değerlendirilmesi, CURE'nin tamamlanmasından sonra moleküler klonlamada daha iyi bir anlayış ve güven gösterdi ve doğal ürün biyosentez araştırmaları için yeni plazmitler klonlandı.

Uyarlanabilir Bir Moleküler Klonlama Ders Tabanlı Lisans Araştırma Deneyimi ile Öğrenci Sonuçlarının İyileştirilmesi

Burada, kemik iliği, dalak ve enfarktüslü kalpten makrofajların çıkarılması ve ardından canlı hücrelerdeki metabolik akışın değerlendirilmesi için yöntemleri ayrıntılı olarak açıklıyoruz.

Dalak ve Kardiyak Makrofajlarda ve Kemik İliği Monositlerinde Ex Vivo Metabolik Akının Analizi

Öğrenin, fonksiyonel tamamlama analizi yöntemiyle mutant bakteri hücrelerinde enzim aktivitelerini nasıl doğrulayacağınızı. Bu teknik, amino asit metabolizması ve bakteri stringent yanıtı gibi biyokimyasal yolları in vivo koşullarda çalışmanıza olanak tanır.

Fonksiyonel tamamlama Analizi (FCA): Tasarım ve Biyokimyasal Yolların Öğretim Ek için Uygulanan A Laboratory Egzersiz

Daha fazla video keşfet