Fonksiyonel tamamlama Analizi (FCA): Tasarım ve Biyokimyasal Yolların Öğretim Ek için Uygulanan A Laboratory Egzersiz

İşlevsel Tamamlama Denemesinin genel amacı, mutant arka planda vahşi tip bir fenotipi geri yükleyip yüklemediğini görmek için karşılık gelen genin işlevsel bir kopyasını mutant bir hücreye sokarak bir enzimin aktivitesini açıklamaktır. Bu yöntem, biyokimya, mikrobiyoloji, genetik, bitki biyolojisi, evrim ve diğerleri gibi çeşitli alanlardaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, normalde doğası gereği yapay olan in vitro koşulların aksine, normalde fizyolojik olan in vivo koşullar altında bir enzimin işlevini, aktivitesini ve/veya rolünü değerlendirmesidir.

Bu tekniğin etkileri, karakterize edilmemiş enzimlerin ve hala varsayılan veya tahmin edilen işlevlere sahip olanların tanımlanması ve/veya işlevinin açıklanmasına kadar uzanır. Bu fonksiyonel tamamlama prosedürünü gösteren, laboratuvarımda bir öğrenci olan biyoteknoloji ve moleküler biyoloji uzmanı Taylor Harkness'tir. DapL, TarB, MurE ve RSH genlerinin metin protokolüne göre klonlanmasından sonra, 50 mililitre sıvı ortamı, ilgilenilen bir gen ile dönüştürülecek ve bir gecede büyüyecek tek bir mutant bakteri hücresi kolonisi ile aşılayın.

İkinci günde, uygun ortamın 1 litresini aşılamak için 50 mililitrelik gece kültürünü kullanın ve 30 santigrat derecede kilitlenme fazına veya 0,4 ila 0,6 arasında bir OD600'e kadar büyütün. Hücreleri 15 dakika boyunca 5.000 kez G ve dört santigrat derecede santrifüjleme ile hasat edin. Daha sonra süpernatanı boşaltın ve peleti yeniden süspanse etmek için 500 mililitre steril, buz gibi, damıtılmış su kullanın.

Hücreleri tekrar santrifüjleyin ve süpernatanı boşalttıktan sonra, peleti yeniden süspanse etmek için 250 mililitre steril, buz gibi soğuk %10 gliserol kullanın. Hücreleri son bir kez döndürdükten sonra, hücreleri yeniden süspanse etmek için iki mililitre% 10 gliserol kullanın. 50 mikrolitrelik alikotları mikrosantrifüj tüplerine aktarın ve tüpleri kuru bir buz etanol banyosuna yerleştirerek hemen dondurun.

Elektroporasyon için hücreleri eksi 80 santigrat derecede saklayın. Elektroporasyonu gerçekleştirmek için, 50 mikrolitrelik bir yetkin hücre alikotuna 1 mikrolitre rekombinant plazmit ekleyin ve beş dakika boyunca buzun üzerine koyun. Hücreleri bir elektroporasyon küvetine aktarın ve elektroporasyon aparatını aşağıdaki ayarlara ayarlayın: 25 derece Fahrenheit kapasitansı, 2,5 kilovolt ve 200 ohm direnç.

Ardından küvet cihazdayken, bir nabız verin. Küvete 1 mililitre geri kazanım ortamı ekleyin ve hücreleri 15 mililitrelik konik bir tüpe aktarın. Kültürü, mutantın ihtiyaç duyduğu uygun sıcaklıkta 60 dakika boyunca hafif rotasyonla çalkalayan bir inkübatörde inkübe ederek hücrelerin iyileşmesine izin verin.

Transformatörleri seçmek için, 100 mikrolitre kültürü agar plakaları ile ortama pipetleyin ve çözeltiyi yaymak için steril bir yayıcı kullanın. Ardından, gece boyunca uygun sıcaklıkta inkübe edin. Daha fazla ayrıntı için metin protokolüne bakın.

Tamamlama analizi yapmak için, AOH1'i boş vektör pBAD33 ile veya az önce gösterildiği gibi elektroporasyon kullanarak dapL ekspresyon vektörleri ile dönüştürün. Dönüşüm karışımını, mililitre Dap başına 50 mikrogram, mililitre kloramfenikol başına 34 mikrogram ve mililitre kanamisin başına 50 mikrogram ile takviye edilmiş LB agar ortamı üzerine yerleştirin. Sonuçları gözlemlemeden önce plakaları 24 saat boyunca 30 santigrat derecede inkübe edin.

Boş pBAD33 vektörü veya murE ifade vektörü ile, bu videoda daha önce gösterildiği gibi elektroporasyon kullanarak TKL-11 mutantını dönüştürün. Transformatörleri, mililitre tiamin başına 50 mikrogram ve mililitre kloramfenikol başına 34 mikrogram ile takviye edilmiş LB agar üzerine yerleştirin ve dönüştürücüleri kontrol etmeden önce plakaları 24 saat boyunca 30 santigrat derecede inkübe edin. Hem kontrol hem de deneysel dönüşümlerden kolonileri iki LB ortamı plakasına, artı% 0.2 arabinoz ve mililitre tiamin başına 50 mikrogram üzerine çizgileyerek veya kaplayarak tamamlamayı test edin.

Büyüme fenotipini değerlendirmeden önce bir plakayı 30 santigrat derecede ve diğerini 42 santigrat derecede 24 saat inkübe edin. Bu videoda daha önce gösterildiği gibi, mutant Hx699 suşunu ve novosphingobium türlerinin vahşi tip Rr217 suşunu, pRK290 boş vektörü veya yerel rshNsp genini içeren bir vektör ile her biri iki ayrı dönüşüm olayında dönüştürün. Transformatörleri, mililitre tetrasiklin başına 10 mikrogram ile takviye edilmiş patates dekstroz veya PD agar üzerine yerleştirin ve en az 72 saat veya dönüştürücüler görünene kadar inkübe edin.

Ardından, transformatörleri tetrasiklin içeren taze PD agar plakaları üzerinde X şeklinde çizin. En az dört gün boyunca 30 santigrat derecede inkübe ettikten sonra, her iki plakanın büyüme fenotipini görsel olarak inceleyin. E.coli çift mutant AOH1, DapE geninde bir mutasyon ve DapD geninin bir delesyonunu barındırır ve Dap sağlanmadıkça büyümez.

Burada görüldüğü gibi, DapL'leri eksprese eden AOH1 mutantı, Dap lyse yolunda THDP'yi LLDap'e dönüştürerek LLDap içermeyen ortamda büyüyebilir. MurE enzimi, gram negatif bakterilerin peptidoglikanına m-DAP eklenmesini kolaylaştırır. E.coli MurE mutantı, TKL-11, 42 santigrat derecede büyüyemez.

Bu deneyde, sadece MurE ile dönüştürülen TKL-11 hücreleri 42 santigrat derecede büyür. TyrB genindeki bir mutasyon, tirozin ve fenilalanin sentezini engeller. Bununla birlikte, burada gösterildiği gibi, TyrB mutant DL39 suşu, A.thaliana At5g36160 genini eksprese ettiğinde, tirozin ve fenilalanin içermeyen M9 ortamında büyür ve enzimin tirozin sentezleyebileceğini gösterir.

Novosphingobium türündeki Hx699 mutantı, işlevsel olmayan bir RSH proteini barındırır ve hipomukoidal fenotip üretir. Bununla birlikte, doğal RSH geni ile transformasyon, hipermukoidal olan çok hücreli X çizgisinde daha çözünür hücre dışı polisakkaritler üretir. Buna karşılık, Hx699 mutantı boş bir vektörle dönüştürüldüğünde, hipomukoidal bir fenotip üretir.

Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik yaklaşık 24 ila 48 saat içinde yapılabilir. Düzgün bir şekilde gerçekleştirildiği takdirde, kullanılan model organizmanın büyümesine bağlı olarak, klonlama hariç, hazırlama ve dönüştürme adımlarının yetkinliğidir. Bu prosedürü denerken, fonksiyonel tamamlama analizinde kullanılan mutantların büyüme koşulu gereksinimlerini hatırlamak önemlidir.

Bu prosedürü takiben, substrat özgüllüğü, sıcaklık ve pH optimumu ve somatik hız oranları vb. gibi ek soruları yanıtlamak için geleneksel in vitro aksiyomatik karakterizasyonlar gibi diğer yöntemler gerçekleştirilebilir. Geliştirildikten sonra, bu teknik, biyoloji alanındaki ve mikrobiyoloji gibi birçok alt bölüm alanındaki araştırmacıların, çeşitli organizmalardan elde edilen enzimlerin in vivo işlevini veya rolünü aydınlatmanın yolunu açmaktadır. Bu videoyu izledikten sonra, elektrokompetan bakteri hücrelerinin nasıl yapılacağını, elektroporasyon kullanılarak bakterilerin nasıl dönüştürüleceğini ve fonksiyonel tamamlama kullanılarak genlerin/enzimlerin işlevinin nasıl değerlendirileceğini iyi anlamış olmalısınız.

Patojen organizmalarla çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini ve gerekli önlemlerin alınması gerektiğini unutmayın.