Bimoleküler Floresan tamamlama

Bu deney, iki proteinin hücrelerde etkileşime girip girmediğini tanımlamayı ve bu etkileşim bölgelerinin yönlerini tanımlamayı amaçlamaktadır. İlk hücreler, biri parçalanmış bir floresan proteinin uç terminaline ve diğeri parçalanmış floresan proteinin tamamlayıcı C terminaline kaynaşmış olan iki ilgili proteini kodlayan ekspresyon yapıları ile transfekte edilir. Transfekte edilmiş hücrelerin kültürde floresan sinyal geliştirmesine izin verdikten sonra, protein kompleksleri görüntüleme ve immünoblotlama ile görselleştirilir.

Daha sonra, toplanan görüntüler Image J gibi görüntüleme yazılımlarına aktarılır Kontrollü bir deneyde hücre başına ortalama floresan yoğunluğunu ölçmek için, BIFC sonuçları, protein protein etkileşimlerini ve bu komplekslerin lokalizasyonunu gösterebilir, örneğin iskele proteininin SH üç alanı kesişen ve PI üç KC iki beta'nın pro zengin alanı. Bu tekniğin kolokalizasyon, immünopresipitasyon ve fret gibi mevcut yöntemlere göre ana avantajı, BFC'nin hücredeki daha zayıf geçici etkileşimlerin uzamsallaştırılmış lokalizasyonuna izin vermesidir. Ve bu yöntem, fret'te görüldüğü gibi kapsamlı işlem sonrası görüntüler gerektirmez.

Bu yöntem, DO proteinleri X ve Y'nin etkileşimi gibi sinyal iletimi alanındaki temel soruları ele alabilir ve eğer öyleyse, bu komplekslerin hücrede lokalize olduğu spesifik bölmeler nelerdir? Genel olarak, bu yönteme yeni başlayanlar mücadele edeceklerdir çünkü biyopsilerini ifade etmek için uygun konfigürasyonu seçmemişlerdir. İlgilenilen etiketli proteinler BIFC füzyon proteinleri için çoklu floroforlardan birini seçerek başlayın.

Venüs'ün amino ve karboksi terminal uçlarının 37 santigrat derecede bir kompleks oluşturabildiğini, Y-F-P-B-I-F-C parçalarının ise 30 santigrat derecede bir ön inkübasyon gerektirdiğini düşünün. BIFC fragmanlarının bağlanmasının ilgilenilen proteinlerin işlevini nasıl etkileyebileceğini göz önünde bulundurarak, ilgilenilen proteinlere etiket eklenmesi için ifade vektörleri tasarlayın. Örneğin, RA ailesi, GTP a'lar karboksi terminalinde lipid ile modifiye edilmiştir ve bu modifikasyonu bozmadan bu uçta etiketlenemez.

Transfeksiyon koşullarını belirlemek için her zaman pilot deneyler yapın. Ayrıca, sinyal gelişimi için en uygun zamanı belirlemek için hücreleri floresan mikroskobu ile izleyin. Ardından, yapıların eşit ifadesini doğrulamak için batı çiçeği analizi yapın.

Daha da önemlisi, BIFC fragmanlarının eklenmesinin, her bir numune plakası için ilgilenilen proteinlerin hücresel lokalizasyonunu değiştirmediğini doğrulamak için HA veya bayrak etiketi için immüno boyama. 1.3 kez, beş hücrenin 10'u, her biri bir cam alt madde plakasına ve altı kuyulu bir plakanın iki kuyusuna hücre oluşturur ve hücrelerin ertesi gün 37 derecelik bir inkübatörde gece boyunca yerleşmesine izin verir. DNA'ları lipektomi veya tercih edilen başka bir yöntemle transfeksiyon için hazırlayın.

İlk olarak, DNA'yı transfeksiyon kontrolü olarak 250 mikrolitre serum serbest DMEM içinde seyreltin. CFP'yi toplam BIFC DNA'larınızın miktarı olan 50'ye ekleyin. Şimdi dudağı bir mikrogram DNA başına 10 mikrolitre dudak kullanarak 250 mikrolitre serumsuz DMEM ile seyreltin.

DNA'yı karıştırın ve dudak seyreltmelerini oda sıcaklığında 20 dakika inkübe edin. Hücreleri ılık serum içermeyen DMEM ile iki kez durulayın. Her bir cam alt plakaya veya altı kuyulu bir tabağın kuyusuna iki mililitre serumsuz DMEM ekleyin.

Daha sonra her bir transfeksiyon karışımını bir cam alt tabak ve altılı iki kuyu arasında eşit olarak bölün. Kuyu plakası, hücreleri beş saat boyunca 37 santigrat derecede inkübe eder. Son olarak, transfeksiyon ortamını çıkarın ve tam DMEM artı %10 FBS ortamı ile değiştirin.

İlgilenilen proteinlerin gerekli ekspresyon seviyelerini elde etmek için hücreleri pilot deneylerde belirlenen süre boyunca inkübe edin. Pozitif kontrolün floresan olduğundan emin olmak için transfekte edilmiş hücreleri bir epi floresan mikroskobu altında inceleyin. Canlı hücre görüntüleme için hücreleri PBS ile üç kez durulayın.

Hücreleri eksik gösterge kalıplarına yerleştirin. Sabit hücreleri görüntülemek için. %2 para formaldehit ekleyin ve 10 dakika buzun üzerine koyun.

Daha sonra hücreleri üç kez durulayın, şimdi bir mililitre PBS ile kaplayın ve karanlıkta dört santigrat derecede saklayın, hücreleri hemen altı kuyulu tabakta tutun. Western blot analizleri için, lys hücrelerinin görüntü hücrelerini temsil etmesi için tüm hücrelerin aynı anda hazırlanması önemlidir. Etiket proteinlerinin eşdeğer seviyelerde ifade edildiğinden emin olmak için bir western blot yapın.

Hücreleri konfokal mikroskopla görüntülerken, floresansın numuneler arasında karşılaştırılabilir olması için deney boyunca ayarların sabit tutulması önemlidir. Piksellerin doygun olmadığı hücreleri tek tek görüntülediğinizden emin olun. CFP bir transfeksiyon kontrolü olarak dahil edildiğinden, BIFC sinyallerinin analizi için yalnızca CFP pozitif hücreleri seçin.

Görüntü J gibi görüntüleme yazılımlarını kullanarak floresan miktarını belirleyin.Ayarlanan ölçümleri analiz etmek için görüntü dosyalarını Görüntü J.Go'da açın. Ölçümler kutusundaki alan ve ortalama gri değer kutularını işaretleyin. Bu örnekte, venöz görüntülerin yalancı renkli yeşil ve CFP görüntüleri, yalancı renkli kırmızı olduğunu unutmayın.

Serbest seçim aracını kullanarak, CFP kanalındaki tüm hücrenin kenarına bir anahat çizin ve bu anahattı yerinde bırakın. YFP kanalına geçin. Analize gidin, ortalama gri değeri ölçün, her görüntü için hücre başına ortalama floresan yoğunluğunu yansıtır.

YFP kanalında hücre içermeyen bir alana bir daire çizin. Bu alan için arka plan olarak bir ölçüm yapın. Her görüntüden arka planı çıkarın.

Son olarak, bir hücre popülasyonu için ortalama floresan yoğunluğunu hesaplamak için, bir örnekte görüntülenen tüm hücreler için ortalama derece değeri eksi arka planın ortalamasını alın. İdeal olarak, üç deneyde 60 hücreyi ölçün. Kesişen çok alanlı iskele proteini, yeni bir sınıf iki PI üç kinaz, PI üç KC iki beta kesişen SH üç alanın düzenlenmesi yoluyla nöronal sağkalımı düzenler, PI üç KC iki beta ile kesişen VN'nin iki beta transfeksiyonu, VC etiketli PI üç KC iki beta, YFP kanalında bir floresan sinyali ile sonuçlanır, Bu, karmaşık oluşumu gösteren yalancı renkli yeşildir.

Burada kırmızı renkli CFP yalancı, kesişen PI üç KC iki beta'nın prolin açısından zengin alanındaki transfekte hücre mutasyonlarını işaretlemek için bir kontrol olarak kullanılır ve PI üç KC iki beta BIFC sinyalini azaltır. BIFC sinyalindeki bu fark, vahşi tip ve PA PI üç K proteinlerinin ekspresyonundaki farklılıklardan kaynaklanmaz. Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik uygun şekilde yapılırsa üç gün içinde gerçekleştirilebilir. Bu prosedürü gerçekleştirirken, BC sinyalindeki farklılıkların bu prosedürü takip eden ifadeden değil, karmaşık oluşumdaki farklılıklardan kaynaklandığından emin olmak için uygun kontrolleri çalıştırmayı ve protein ekspresyonunu kontrol etmeyi hatırlamanız gerekir.

Bu komplekslerin birbirlerine olan farklı afiniteleri nelerdir gibi soruları cevaplamak için sakinler üzerinde yüzey plazması gibi başka teknikler de uygulanabilir.