Name: Bimoleküler Floresan tamamlama (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-04-15T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 54 s
Description: Öğrenin, bimoleküler floresan tamamlama yöntemiyle canlı hücrelerde protein-protein etkileşimlerini ve hücre içi lokalizasyonlarını görselleştirin. Bu teknik, zayıf veya geçici etkileşimleri uzamsal çözünürlükle tespit eder.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

ITSN PI3K C2β, ve bu protokolde kullanılan kontrol vektörlerinin sadece ticari olmayan amaçlar için, talep üzerine yazarlar mevcuttur. Yazarlar, lütfen tavsiye ve O&#39;Bryan laboratuar BiFC protokolü oluşturulmasında kullanılan reaktifler sağlamak için Dr. Chang-Deng Hu kabul etmek istiyoruz. KAW Vakfı Jerome Lejeune fon tarafından desteklenmiştir. O&#39;Bryan laboratuvar İş Ulusal Sağlık Enstitüsü, (HL090651), DOD (PR080428), St. Baldrick Vakfı ve Vakıf Jerome Lejeune hibe tarafından desteklenmektedir.

A. BiFC Kalibrasyon <ol><li> Fluorofor seçin. BiFC füzyon ortakları (Tablo 1) yanı sıra, YFP ve Venüs gibi, birden fazla fluorophores vardır. Venüs Amino-ve karboksi-terminal uçları YFP BiFC parçaları fluorofor oluşumu 2 kolaylaştırmak için 30 ° C'de bir ön inkübasyon gerektiren, karmaşık bir form için 37 ° C'de mümkün. Bu düşük bir ısıda inkübasyon bazı hücresel süreçleri değiştirmek ve parçaları seçerken dikkate alınmalıdır. Eritme proteinlerin karboksi-terminus Venüs vektörler Addgene ( <a href="http://www.addgene.org/pgvec1">http://www.addgene.org/pgvec1</a> kontrolleri olarak kullanmak için ek yapıları, örneğin birlikte; seepBiFC-VN173 ve pBiFC-VC155) <a href="http://www.addgene.org/pgvec1?f=c&amp;identifier=22012&amp;atqx=BiFC&amp;cmd=findpl">pBiFC-bJunVN173</a> ve pBiFC-bFosVC155 2. Amino-terminal Venüs vektörler (pFLAG VN173 ve PHA-VC155) dahil olmak üzere daha fazla vektörler, aşağıdaki web sitesini de mevcuttur: <a href="http://people.pnhs.purdue.edu/%7Ehu1/">http://people.pnhs.purdue.edu/ ~ hu1 /</a> . </li><li> Ilgi protein Etiketi BiFC parçaları aday proteinler, amino ve karboksi-terminal uçlarında kaynaşmıştır . Bazı proteinler, protein fonksiyonunun bozulması nedeniyle her iki ucunda, etiketleme için izin vermeyebilir. Örneğin, Ras GTPases süperailesinin birçok üyeleri o sonunda BiFC parçalarının karboksi-terminus böylece engelleyen eklenti değiştirilmiş lipit. Böylece, BiFC parçalarının eki ilgi proteinlerin fonksiyonu nasıl etkileyebileceği bazı fikir sahibi olmak önemlidir. Bir protein nasıl etiketleme etkileyecek belirsiz ise işlevi birden fazla kombinasyon test edilmelidir. BiFC parçası ek olarak, bir peptid ilintileyici parçalanmış fluorofor ve aday proteinleri arasındaki esnekliği artırmak dahil edilebilir. BiFC vektörler çoklu klonlama siteleri (MCS) yeterli esneklik, RSIAT, KQKVMNH ve RPACKIPNDLKQKVMNH linkers sağlayabilir kısa amino asit uzanır kodlamak BiFC deneyler 3,9 iken başarıyla kullanılmaktadır </li><li> Transfeksiyon koşulları belirleyin. Birden fazla mutantlar test önce, birkaç kontrol deneyleri yapılmalıdır. Denenmelidir ilk iki BiFC kombinasyonları, iki yabani türü proteinler etkileşime girdiği bilinmektedir ve bir yabani tip ve mutant bir etkileşim yok. Bu iki kombinasyonları kullanarak, farklı miktarlarda DNA ve transfeksiyon kez aday proteinler için bir BiFC sinyal tespit için en uygun koşulların belirlenmesi için test edilmelidir. Biz 6 kuyu çanağı tek bir için her BiFC inşa 0.25ug, 0.5ug 1.0ug test öneririz. Sinyal gelişimi için en uygun zamanı belirlemek için floresan mikroskopi transfeksiyon monitör hücreleri bir gün sonra. <a href="http://www.addgene.org/pgvec1?f=c&amp;identifier=22012&amp;atqx=BiFC&amp;cmd=findpl">PBiFC bJunVN173</a> ve pBiFC-bFosVC155 2 yapıları BiFC için yararlı pozitif kontrol ve Addgene (yukarıya bakınız) mevcuttur. Buna ek olarak, Western blot analizi yapıları eşit ifade onaylamak için yapılmalıdır. Koşullar floresan sinyal iki yabani türü proteinler ama hiç sinyal arasında gözlenen bu tür yabani tip ve mutant proteinler arasında görülmektedir tercih edilmelidir. Sonuç olarak, protein ekspresyonu herhangi bir non-spesifik etkileşimleri önlemek için mümkün olduğunca düşük tutmak için en iyisidir. </li><li> BiFC parçalarının yanı sıra, ilgi proteinlerin yerelleştirme değiştirir olmadığını belirlemek Her BiFC inşa HA veya BAYRAK epitop etiketi içerir . Immunostain HA veya BAYRAK epitop etiketi yanı sıra BiFC etiketi ilgi proteinlerin lokalizasyonu etkiler olmadığını belirlemek için de endojen protein (mümkünse) hücreler transefected. </li></ol> B. Hücre Kaplama ve Transfeksiyon <ol><li> COS hücreleri (1.3x10 5), her bir cam alt Matek örnek başına 6-plaka levha ve iki kuyu üzerine kaplanmıştır . Hücreler 37 ° C geceleme yerleşmek için izin verin Faiz aday proteinleri daha uygun olan alternatif hücre tipleri de kullanılıyor olabilir. </li><li> DNA'lar transfeksiyon için hazırlayın. Biz genellikle COS transfections Lipofectamine (Invitrogen) kullanmaktadır. Ancak, diğer reaktifler ilgi hücre hattı için daha uygun olabilir. Transfeksiyon karışımı bir cam alt çanağı ve 6-plaka iki kuyu arasında bölünmüş olacağından, bu bölünme için hesap DNA uygun miktarda kullanın. Serum serbest (SF) DMEM 250uL DNA seyreltilir. 1 / 5 'transfeksiyon kontrol olarak toplam BiFC DNA'lar miktarı CFP ekleyin. BiFC ölçümü için, sadece hücreleri CFP için olumlu bir BiFC sinyal varlığı için analiz edilecektir. Bu nedenle alternatif bir transfeksiyon kontrolü; CFP spektrumları Tablo 1'de bazı BiFC çiftleri ile üst üste olacağını edinbelki de gerekli. 250uL SF DMEM (DNA 10uL Lipofectamine/1ug) Lipofectamine sulandırınız. DNA ve Lipofectamine dilüsyonları karıştırın. 20dk oda sıcaklığında inkübe edin. Not: Lipofectamine: DNA oranı hücre tipine bağlı olarak değişebilir. Ilgi hücre hattı için uygun Transfeksiyonu yöntemi kullanın. </li><li> 2x hücrelerin sıcak SF DMEM ile durulayın. 6-iyi bir yemeğin her cam taban plakası veya SF DMEM 2mL ekleyin. </li><li> Transfeksiyon karışımı bir cam alt çanağı ve 6-iyi bir yemeğin iki kuyu arasında eşit olarak her bir bölme. </li><li> 5 saate hücreleri 37 ° C'de inkübe edin. </li><li> Transfeksiyon ortamı çıkarın ve eksiksiz bir medya (% DMEM 10 FBS) ile değiştirin. </li><li> Gecede inkübe hücreleri 37 ° C Inkübasyon aşağıdaki transfeksiyon uzunluğu ilgi proteinlerin ekspresyon düzeyleri bağlı olarak değişecektir. Bu adımı ampirik olarak tespit edilmesi gerekmektedir, böylece uzun süreli inkübasyon spesifik olmayan etkileşim meydana gelebilir. </li></ol> Görüntüleme için C. Hücre Hazırlık <ol><li> Hücreler, başlangıçta pozitif kontrol floresan olduğundan emin olmak için bir epifluorescent mikroskop altında incelenir. Eğer doğru değilse, 37 ° C ye kadar sinyal görülmektedir hücreleri ek süre izin için gerekli olabilir. </li><li> 3x hücreler PBS (pH 7.4) ile durulayın. Cam tabak içinde alt hücreleri için% 2 paraformaldehid (pH 7.4) ekleyin. 10 dakika süreyle buz üzerinde hücrelerin düzeltildi. 3x hücreler PBS (pH 7.4) ile durulayın. 4 Mağaza hücreleri ° C 1 ml PBS (pH 7.4) ile kaplanmıştır. Hücreler görüntüleme için sabit olmak zorunda değilsiniz, ancak bir kez BiFC parçaları sağlam bir fluorofor dinamik etkileşimleri 3 geri dönüşümsüz böylece önlenmesi analiz reform. Ayrıca, Sabitlenmemiş hücreleri sinyal geliştirmeye devam edeceğini unutmayın. 6-iyi çanak hücrelerin Lyse ve Western Blot analizi için lizatları hazırlamak. Parçalanmış hücreleri görüntülü hücrelerin temsilcisi böylece tüm hücreleri aynı zamanda hazır olduklarını önemlidir. </li></ol> D. Görüntüleme Hücreler <ol><li> Floresan yoğunluğu, hücre başına hesaplanacaktır. Görüntü bireysel hücrelere emin olun. </li><li> CFP bir tranfection kontrol olarak dahil oldu ve sadece CFP pozitif hücrelerin BiFC sinyalleri analiz için seçilir. Biz hücre CFP ile transfekte ise, aynı zamanda BiFC yapıları ile transfekte olduğunu varsayıyor. Bu yaklaşım BiFC bir sinyal eksikliği görüntülü hücreler ilgi proteinleri ve birinin yokluğu nedeniyle ya da o hücrenin hem de BiFC ifade yapıları arasında bir etkileşim eksikliği nedeniyle olumsuz olduğunu garanti eder. </li><li> Biz Zeiss LSM 510 konfokal mikroskop hücre görüntüleme için kullanın. Bu mikroskop kullanarak zum, iğne deliği, dedektör kazanç, amplifikatör ofset, çerçeve boyutu, tarama hızı, tarama ortalama ve lazer güç tutarlı tutmak için önemlidir. Herhangi bir görüntüleme sistemi kullanılarak floresan örnekleri arasında karşılaştırılabilir şekilde ayarlar sabit tutmak için önemlidir. Ayrıca, floresan niceleme zaman piksel doymuş olması önemlidir. </li></ol> E. Floresan miktarının <ol><li> Floresan herhangi bir görüntüleme yazılımı kullanarak sayısal olabilir. Biz NIH (http://rsb.info.nih.gov/ij/) serbestçe kullanılabilir. ImageJ kullanmaktadır. ImageJ görüntü dosyaları açın. AnalyzeSet ​​Ölçümler git. Alan için onay kutularını ve Ölçümler kutusunda ortalama Gri Değer. </li><li> 'Serbest el seçimi' aracını kullanarak, tüm hücre CFP kanal kenarında bir taslak çizin. </li><li> Bu anahat yerinde bırakarak, YFP kanala geçiş. AnalyzeMeasure için gidin. Ortalama Gri Değeri piksel sayısını (yani hücrenin alan başına ortalama floresan yoğunluğu) bölünmesiyle seçiminde tüm piksellerin gri değerlerin toplamıdır. </li><li> Her resim için bir hücre içermeyen bir alanda YFP kanal bir daire çizin. Arka plan olarak bu alan için bir ölçüm alın. Her görüntünün arka planı çıkarma. </li><li> Bir örnek görüntülü tüm hücreler için ortalama Gri Değer eksi arka plan ortalama. Bu hücrelerden oluşan bir nüfus için ortalama floresan yoğunluğu olacak. Biz üç deney içinde yaklaşık 60 hücreleri sayısal olarak öneriyorum. </li></ol> F. Temsilcisi Sonuçlar: Bizim laboratuvar çok etki alanı iskele protein, birden fazla biyokimyasal ve sinyal yolları 10,11,12,13,14 düzenlemek için sayısız proteini ile etkileşime intersectin (ITSN) odaklanır. ITSN iki Eps15 homoloji (EH) etki, bir sarmal sarmal bölge ve beş Src homoloji 3 (SH3) etki içerir. ITSN, uzun izoformu Dbl homoloji (DH) ve Cdc42 15 guanin nükleotid değişim faktörü olarak konser pleckstrin homoloji (PH) alan bu hareket içerir. Bu modüler yapısı protein destekler:, protein etkileşimleri ve BiFC deneyler için ideal bir aday ITSN yapar. ITSN, hücre içi lokalizasyonu bağlayıcı ortakları değiştirmek ve bu nedenle ITSN (unpublis tarafından düzenlenen yollar değiştirebilirhed veri). Son zamanlarda, bizim laboratuvar ITSN bir roman sınıf II PI3K, PI3K-C2β 11 düzenlenmesi yoluyla nöronal hayatta kalma düzenleyen göstermiştir . PI3K-C2β amino-terminal Pro-zengin bir etki ITSN SH3 etki alanı için iki bağlanma yerleri içerir. ITSN ve PI3K-C2β kesilmesi mutantlar ile birlikte immunoprecipitation kullanarak ITSN SH3A ve SH3C etki alanı PI3K-C2β amino-terminal bölge ile etkileşim içinde olduğunu gösterdi. Sonra, bu karmaşık hücre içi lokalizasyonu görselleştirmek için BiFC kullandı. ITSN Venüs (PHA-VC155) karboksi-terminus erimiş Venüs (pFLAG VN173) ve PI3K C2β yapıları amino terminus erimiş oldu. Başka bir negatif kontrol olarak, non-spesifik peptid PHA-VC155 erimiş oldu. VN-ITSN ve VC-PI3K-C2β bir noktasal dağılımı (Şekil 2A, üst panelleri) ile bir BiFC kompleksi kurdu. PI3K-co-yağış ITSN ve PI3K-C2β bozabilir C2β Pro zengin etki Mutasyonlar BiFC sinyal (Şekil 2A, alt paneller) 11 azalmıştır. ITSN ve iki PI3K C2β proteinler arasında BiFC sinyal Bu fark, protein ekspresyonu (Şekil 2B) farklılıklar nedeniyle değildi. <img src="/files/ftp_upload/2643/2643fig1.jpg" alt="Şekil 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 1"> Şekil 1 BiFC, fluorofor (Bu durumda Venüs) amino (VN) ikiye bölünmüş durumda ve karboksi-terminal (VC) sona erer. Bu ilgi iki proteinlerine biter kaynaşmıştır. Iki protein etkileşim, VN ve VC parçaları yeniden ilişkilendirmek etkileşim siteleri fluorofor ve floresan sulandırıldıktan. Protein etkileşimleri 5: BiFC protein ölçmek için kullanılan protein parçası tamamlama yöntemi (PCA) belirli bir örnek. <img src="/files/ftp_upload/2643/2643fig2.jpg" alt="Şekil 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 2"> Şekil 2 ITSN ve PI3K C2β formu BiFC kompleksi. A. VN etiketli ITSN VC-etiketli PI3K C3β WT veya prolin zengin bir etki ile birlikte-tranfected mutant (PI3K-C2β-PA). ITSN ve WT PI3K C2β formu bir kompleks (yeşil). CFP Western Blot yapıları eşit ifade göstermek için yapıldı transfeksiyon kontrolü B. (kırmızı) olarak kullanılmıştır. VC-etiketli yapıları HA etiketlenir. <img src="/files/ftp_upload/2643/2643table1.jpg" alt="Tablo 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Tablo 1"> Tablo 1 BiFC uyumlu birden çok vektörleri vardır. YN155: YFP 1-155aa; YC155: YFP 155-238aa; YN173: YFP 1-172aa; YFP YC173, 173-238aa; VN155: 1-Venüs 154aa; VC155: 155-238 Venüs; VN173: Venüs 1-172aa; VC173: 173-238aa Venüs; CN155 CFP 1-154aa; CC155 CFP 155-238aa, GN173: GFP 1-172aa CitN155: Sitrin 1-155aa CitC155: 155-238aa Sitrin CitN173: Sitrin 1-172aa, CitC173: Sitrin 173-238aa CerN173: 1-172aa Cerulean 2,3,9.

<ol><li>Kerppola, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+molecular+interactions+by+fluorescence+complementation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Visualization of molecular interactions by fluorescence complementation.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 7, 449-456 (2006).</li>
<li>Shyu, Y. J., Liu, H., Deng, X., Hu, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+new+fluorescent+protein+fragments+for+bimolecular+fluorescence+complementation+analysis+under+physiological+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Identification of new fluorescent protein fragments for bimolecular fluorescence complementation analysis under physiological conditions.</a> Biotechniques. 40, 61-66 (2006).</li>
<li>Hu, C. D., Chinenov, Y., Kerppola, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+interactions+among+bZIP+and+Rel+family+proteins+in+living+cells+using+bimolecular+fluorescence+complementation%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Visualization of interactions among bZIP and Rel family proteins in living cells using bimolecular fluorescence complementation.</a> Mol Cell. 9, 789-798 (2002).</li>
<li>Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+green+fluorescent+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Biochem%22%5BJournal%5D)">The green fluorescent protein.</a> Annu Rev Biochem. 67, 509-544 (1998).</li>
<li>Michnick, S. W., Remy, I., Campbell-Valois, F. X., Vallee-Belisle, A., Pelletier, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+protein-protein+interactions+by+protein+fragment+complementation+strategies%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Detection of protein-protein interactions by protein fragment complementation strategies.</a> Methods Enzymol. S328, 208-230 (2000).</li>
<li>Michnick, S. W., MacDonald, M. L., Westwick, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+genetic+strategies+to+delineate+MAP+kinase+signaling+pathways+using+protein-fragment+complementation+assays+%28PCA%29%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Chemical genetic strategies to delineate MAP kinase signaling pathways using protein-fragment complementation assays (PCA).</a> Methods. 40, 287-293 (2006).</li>
<li>Piston, D. W., Kremers, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+protein+FRET%3A+the+good%2C+the+bad+and+the+ugly%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Biochem+Sci%22%5BJournal%5D)">Fluorescent protein FRET: the good, the bad and the ugly.</a> Trends Biochem Sci. 32, 407-414 (2007).</li>
<li>Ciruela, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence-based+methods+in+the+study+of+protein-protein+interactions+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Fluorescence-based methods in the study of protein-protein interactions in living cells.</a> Curr Opin Biotechnol. 19, 338-343 (2008).</li>
<li>Hu, C. D., Kerppola, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+visualization+of+multiple+protein+interactions+in+living+cells+using+multicolor+fluorescence+complementation+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Simultaneous visualization of multiple protein interactions in living cells using multicolor fluorescence complementation analysis.</a> Nat Biotechnol. 21, 539-545 (2003).</li>
<li>Martin, N. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intersectin+regulates+epidermal+growth+factor+receptor+endocytosis%2C+ubiquitylation%2C+and+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Intersectin regulates epidermal growth factor receptor endocytosis, ubiquitylation, and signaling.</a> Mol Pharmacol. 70, 1643-1653 (2006).</li>
<li>Das, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+neuron+survival+through+an+intersectin-phosphoinositide+3%27-kinase+C2beta-AKT+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Regulation of neuron survival through an intersectin-phosphoinositide 3'-kinase C2beta-AKT pathway.</a> Mol Cell Biol. 27, 7906-7917 (2007).</li>
<li>Mohney, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intersectin+activates+Ras+but+stimulates+transcription+through+an+independent+pathway+involving%5BTitle%5D)+AND+%22JNK.+J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Intersectin activates Ras but stimulates transcription through an independent pathway involving.</a> JNK. J Biol Chem. 278, 47038-47045 (2003).</li>
<li>Tong, X. K., Hussain, N. K., Adams, A. G., O'Bryan, J. P., McPherson, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intersectin+can+regulate+the+Ras%2FMAP+kinase+pathway+independent+of+its+role+in+endocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Intersectin can regulate the Ras/MAP kinase pathway independent of its role in endocytosis.</a> J Biol Chem. 275, 29894-29899 (2000).</li>
<li>Adams, A., Thorn, J. M., Yamabhai, M., Kay, B. K., O'Bryan, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intersectin+an+adaptor+protein+involved+in+clathrin-mediated+endocytosis%2C+activates+mitogenic+signaling+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Intersectin an adaptor protein involved in clathrin-mediated endocytosis, activates mitogenic signaling pathways.</a> J Biol Chem. 275, 27414-27420 (2000).</li>
<li>O'Bryan, J. P., Mohney, R. P., Oldham, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitogenesis+and+endocytosis%3A+What%27s+at+the+INTERSECTIoN%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Mitogenesis and endocytosis: What's at the INTERSECTIoN?</a> Oncogene. 20, 6300-6308 (2001).</li>
<li>Shyu, Y. J., Suarez, C. D., Hu, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+AP-1+NF-kappaB+ternary+complexes+in+living+cells+by+using+a+BiFC-based+FRET%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Visualization of AP-1 NF-kappaB ternary complexes in living cells by using a BiFC-based FRET.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 151-156 (2008).</li>
</ol>

Bütün hücrelerde protein etkileşimleri ve bu kompleksleri hücre içi lokalizasyonu belirlenmesi: BiFC protein görselleştirmek için mükemmel bir yöntemdir. BiFC, avantajları sadece etkileşen proteinler floresan olduğunu, geçici etkileşimler stabilize ve görüntüleme verileri post-processing az. Bu yöntemin dezavantajları fluorofor ve fluorofor kompleks tersinmezlik için olgunlaşma zamanı. Bazı uygulamalar altında bu tersinmezlik bir avantaj olarak kullanılabilir. Örneğin, bir kurucu aktivasyon BiFC karmaşık bir enzimdir ve...

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>Cellgro</td><td>10-013</td><td></td></tr><tr><td>Fetal bovine serum</td><td>Cellgro</td><td>35-011-CV</td><td></td></tr><tr><td>Cam tabanlı mikro kuyu plakaları</td><td>Matek</td><td>P35G-1.5-14C</td><td></td></tr><tr><td>6 kuyucuklu plakalar</td><td>Falcon BD</td><td>35-3846</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine</td><td>Invitrogen</td><td>18324020</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Cellgro</td><td>21-031-CV</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehit</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>Konfokal Mikroskop</td><td>Carl Zeiss, Inc.</td><td>LSM510 META</td><td></td></tr></tbody></table>

bimoleküler floresan tamamlama

Bimolecular Fluorescence Complementation

Sinyalizasyon komplekslerinin hücre içi dağıtım tanımlama karmaşık çıkış anlamak için şarttır. , Immunoprecipitation konvansiyonel yöntemlerle komplekslerin uzamsal lokalizasyonu hakkında bilgi vermemektedir. BiFC aksine, etkileşim ve protein kompleksleri sar compartmentalization izler. Bu yöntemde, bir fluororescent protein, amino ve karboksi-terminal sonra iki protein ilgi erimiş olmayan floresan parçalarının içine ikiye bölünmüş durumda. Fluorofor sulandırma (Şekil 1) 1,2 proteinlerin etkileşimi. BiFC bir sınırlaması parçalanmış fluorofor sulandırılmış bir kez karmaşık 3 geri dönüşümsüz olmasıdır. Bu sınırlama, geçici ya da zayıf etkileşimleri tespit avantajlı, ama karmaşık dinamiklerin bir kinetik analizi engellemektedir. Ek bir uyarı sulandırılmış flourophore yine gerçek zamanlı etkileşimler 4 gözlem engelleyen, olgun ve floresan için 30 dakika gerektirir. Protein etkileşimleri 5,6: BiFC,, yeşil floresan protein çeşitleri olarak muhabir proteinleri (BiFC), dihidrofolat redüktaz, b-laktamaz ve protein ölçmek için lusiferaz istihdam protein parçası tamamlama yöntemi (PCA) belirli bir örnek . Protein çalışmak için alternatif yöntemler: hücrelerinde protein etkileşimleri floresan co-yerelleştirme ve Förster rezonans enerji transferi (FRET) 7 içerir. Eş-lokalizasyonu için, iki protein ayrı ayrı, doğrudan fluorofor veya dolaylı immünofloresan ya etiketlenir. Ancak, bu yaklaşım, co-lokalizasyon verileri yorumlamak zor olmayan etkileşim proteinlerin yüksek arka yol açar. Buna ek olarak, konfokal mikroskobi çözünürlük sınırları nedeniyle, iki proteinin mutlaka etkileşim olmadan co-lokalize görünebilir. BiFC ile ilgi iki proteinin etkileşime girdiğinde, floresan sadece görülmektedir. FRET protein çalışmak için başka bir mükemmel bir yöntemdir: protein etkileşimleri, ama teknik olarak zor olabilir. FRET deneyler, donör ve alıcı hücrede benzer bir parlaklık ve stokiyometri olması gerekir. Buna ek olarak, bir donör yoluyla alıcısı kanal ve tersi içine kanama için hesaba katmalısınız. FRET aksine, BiFC, küçük bir arka plan görüntü verilerini floresan, küçük işleme sonrası yüksek aşırı ekspresyonu gerektirmez ve zayıf veya geçici etkileşimler algılayabilir. Biyoparlaklık rezonans enerji transferi (Bret), donör, böylece heyecan verici bir alıcı bioluminescent olmak için bir substrat katalize bir enzim (örneğin lusiferaz) dışında FRET benzer bir yöntem. Bret teknik sorunlar, kanama ve yüksek arka plan floresan yoksun ama özel bölmeleri 8 substrat lokalizasyonu eksikliği nedeniyle mekansal bilgi sağlama yeteneğine yoksundur . Genel olarak, BiFC bölümlere sinyalizasyon içgörü kazanmak için protein kompleksleri hücre içi lokalizasyonu görselleştirmek için mükemmel bir yöntemdir.

Proteinlerin hücre içi lokalizasyonu hücre sinyal uzay-zamansal düzenleme belirlenmesinde önemlidir. Burada, iki moleküllü floresan proteinlerin hücre mekansal etkileşimleri izlenmesi için basit bir yöntem olarak tamamlama (BiFC) açıklar.

Bimoleküler Floresan tamamlama

Sinyal komplekslerinin hücre altı dağılımının belirlenmesi, bu komplekslerden elde edilen çıktının anlaşılması için zorunludur. ... gibi geleneksel yöntemler

Bu deney, iki proteinin hücrelerde etkileşime girip girmediğini belirlemeyi ve bu etkileşim bölgelerinin özelliklerini tanımlamayı amaçlamaktadır. İlk olarak hücreler, ilgilenilen iki proteini kodlayan ekspresyon konstrüktları ile transfekte edilir; bu proteinlerden biri parçalanmış bir floresan proteinin N terminusuna, diğeri ise parçalanmış floresan proteinin tamamlayıcı C terminusuna füzyonlanmıştır. Transfekte edilen hücrelerin kültürde floresan sinyal geliştirmesi beklendikten sonra, protein kompleksleri görüntüleme ve immünoblotlama yöntemleriyle görselleştirilir.Ardından, toplanan görüntüler Image J gibi görüntüleme yazılımlarına aktarılır. Kontrollü bir deneyde hücre başına ortalama floresan yoğunluğunu nicelleştirmek için BIFC sonuçları, iskele proteininin SH3 domenlerinin kesişmesi ve PI3KC2β'nin prolin bakımından zengin domeni gibi protein-protein etkileşimlerini ve bu komplekslerin lokalizasyonunu gösterebilir. Bu tekniğin kolokalizasyon, immünopresipitasyon ve FRET gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajı, BiFC'nin hücredeki daha zayıf ve geçici etkileşimlerin mekansal lokalizasyonuna olanak tanımasıdır. Ayrıca bu yöntem, FRET'te görüldüğü gibi kapsamlı görüntü son işlemleme süreçleri gerektirmez.Bu yöntem, sinyal iletimi alanındaki temel soruları yanıtlayabilir; örneğin, X ve Y proteinleri etkileşime giriyor mu ve eğer giriyorsa, bu kompleksler hücrede hangi spesifik kompartmanlara yerleşiyor? Genel olarak, bu yönteme yeni başlayanlar, biyopsilerini eksprese etmek için uygun konfigürasyonu seçmedikleri için zorluk yaşayacaklardır. İlgilenilen etiketli proteinler için, BIFC füzyon proteinleri için mevcut çok sayıda florofordan birini seçerek başlayın.Venus'un amino ve karboksi uçlarının 37 °C'de bir kompleks oluşturabildiğini, buna karşın Y-F-P-B-I-F-C fragmanlarının 30 °C'de ön inkübasyon gerektirdiğini göz önünde bulundurun. BIFC fragmanlarının eklenmesinin ilgilenilen proteinlerin fonksiyonunu nasıl etkileyebileceğini değerlendirerek, bu proteinlere etiket eklenmesi için ekspresyon vektörleri tasarlayın. Örneğin, RA ailesi ve GTP α'lar karboksi ucundan lipid modifikasyonuna uğrarlar ve bu modifikasyonu bozmadan bu uçtan etiketlenemezler.Transfeksiyon koşullarını belirlemek için her zaman pilot deneyler gerçekleştirin. Ayrıca, sinyal gelişimi için optimal zamanı belirlemek amacıyla hücreleri floresan mikroskobu ile izleyin. Ardından, konstrüktların eşit ifadesini doğrulamak için western blot analizi yapın.Önemli bir nokta olarak, her örnek plakası için BIFC fragmanlarının eklenmesinin, ilgilenilen proteinlerin hücresel lokalizasyonunu değiştirmediğini doğrulamak amacıyla HA veya flag etiketi için immün boyama yapın. Beş hücre hattının her birinden 1,3 × 10⁴ hücreyi bir cam tabanlı kültür plakasına ve altı kuyucuklu bir plakanın iki kuyucuğuna ekleyin ve hücrelerin gece boyunca 37 °C'lik bir inkübatörde çökelmesini bekleyin. Ertesi gün, lipofeksiyon veya tercih edilen başka bir yöntemle transfeksiyon için DNA'ları hazırlayın.Öncelikle, bir transfeksiyon kontrolü olarak DNA'yı 250 µL serumsuz DMEM içinde seyreltin. Toplam BIFC DNA miktarınızın 50'de biri oranında CFP ekleyin. Şimdi, her 1 µg DNA için 10 µL lipofektamin kullanacak şekilde, lipofektamini 250 µL serumsuz DMEM içinde seyreltin.DNA ve lipozom dilüsyonlarını karıştırın ve oda sıcaklığında 20 dakika inkübe edin. Hücreleri ılık, serumsuz DMEM ile iki kez yıkayın. Her bir cam tabanlı plakaya veya altı kuyucuklu plağın her bir kuyucuğuna iki mililitre serumsuz DMEM ekleyin.Ardından, her bir transfeksiyon karışımını bir cam tabanlı kap ile altılı kuyucuklu plakadaki iki kuyucuğa eşit olarak paylaştırın ve hücreleri 37 °C'de beş saat boyunca inkübe edin. Son olarak, transfeksiyon medyumunu uzaklaştırın ve yerine %10 FBS içeren tam DMEM medyumu ekleyin.İlgilenilen proteinlerin gerekli ekspresyon seviyelerini elde etmek için hücreleri, pilot deneylerde belirlenen süre boyunca inkübe edin. Pozitif kontrolün floresan olduğunu doğrulamak için transfekte edilen hücreleri epi floresan mikroskop altında inceleyin. Canlı hücre görüntüleme için hücreleri PBS ile üç kez durulayın.Hücreleri indikatör boya içermeyen medyumla besleyin. Sabitlenmiş hücrelerin görüntülenmesi için %2 paraformaldehit ekleyin ve 10 dakika boyunca buz üzerinde bekletin.Ardından, hücreleri üç kez PBS ile durulayın, üzerlerini 1 mL PBS ile kapatın ve 4 °C'de karanlıkta saklayın, ardından altı kuyucuklu plakadaki hücreleri hemen lize edin. Western blot analizleri için, lize edilen hücrelerin görüntüleme yapılan hücreleri temsil etmesi amacıyla tüm hücrelerin aynı anda hazırlanması önemlidir. Tag proteinlerinin eşdeğer düzeylerde eksprese edildiğinden emin olmak için western blot gerçekleştirin.Konfokal mikroskop ile hücre görüntüleme yapılırken, örnekler arasındaki floresansın karşılaştırılabilir olması için deney boyunca ayarların sabit tutulması önemlidir. Piksellerin doyuma ulaşmadığı tekil hücrelerin görüntülendiğinden emin olun. CFP transfeksiyon kontrolü olarak eklendiğinden, BIFC sinyallerinin analizi için yalnızca CFP pozitif hücreleri seçin.Image J gibi bir görüntüleme yazılımı kullanarak floresan miktarını belirleyin. Görüntü dosyalarını Image J'de açın. Analyze set measurements sekmesine gidin. Ölçümler kutusundaki area ve mean gray value seçeneklerini işaretleyin. Bu örnekte, venöz görüntülerin yeşile ve CFP görüntülerinin kırmızıya pseudo-renklendirildiğini unutmayın.Serbest seçim aracını kullanarak, CFP kanalında hücrenin tamamının kenarları boyunca bir taslak çizin ve bu taslağı yerinde bırakın. YFP kanalına geçin. Analiz sekmesine giderek, her görüntü için hücre başına ortalama floresan yoğunluğunu yansıtan ortalama gri değerini ölçün.Hücre içermeyen bir alanda YFP kanalında bir daire çizin. Bu alanı arka plan olarak ölçün. Arka planı her bir görüntüden çıkarın.Son olarak, bir hücre popülasyonu için ortalama floresan yoğunluğunu hesaplamak için, tek bir örnekte görüntülenen tüm hücrelerin ortalama derece değerinden arka plan değerini çıkararak ortalamasını alın. İdeal olarak, üç deney boyunca 60 hücreyi nicelendirin. Kesişen çok alanlı iskele proteini, yeni bir sınıf iki PI 3 kinaz olan PI3KC2β'nin düzenlenmesi yoluyla nöronal sağkalımı düzenler; intersecting SH3 domenleri, PI3KC2β'nin amino terminalindeki prolin açısından zengin bölge ile etkileşime girer. VN etiketli intersecting ile VC etiketli PI3KC2β'nin transfeksiyona tabi tutulması, YFP kanalında, kompleks oluşumunu belirten ve yalancı renk olarak yeşil boyanan floresan bir sinyalle sonuçlanır.Burada kırmızıyla yalancı renklendirilmiş CFP, transfekte hücreleri işaretlemek için kontrol olarak kullanılmıştır; PI3K2beta'nın prolin açısından zengin alanındaki mutasyonlar, intersectin ve PI3K2beta'nın birlikte çöktürülmesini bozarak BIFC sinyalini azaltır. BIFC sinyalindeki bu fark, yabanıl tip ve PA PI3K proteinlerinin ekspresyon farklarından kaynaklanmamaktadır. Uzmanlaşıldığında, bu teknik uygun şekilde yürütüldüğü takdirde üç gün içinde tamamlanabilir. Bu prosedürü gerçekleştirirken, BIFC sinyalindeki farklılıkların ekspresyon farklarından değil, kompleks oluşumundaki farklılıklardan kaynaklandığından emin olmak için uygun kontrolleri çalıştırmayı ve protein ekspresyonunu kontrol etmeyi unutmamalısınız.Bu komplekslerin birbirlerine karşı farklı afiniteleri nelerdir gibi soruları yanıtlamak için, örnekler üzerinde yüzey plazmon rezonansı gibi diğer teknikler uygulanabilir.

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Bu makale BioRad düzgün soğan epidermal hücrelerin içine plazmid DNA tanıtmak için Helios Gen Tabancası ve nasıl Bimoleküler Floresan tamamlama (BiFC) ilkesine dayalı soğan hücreleri protein-protein etkileşimleri test etmek için nasıl kullanılacağını...

Helios Gen Tabancası kullanarak Soğan Hücrelerde Protein-Protein Etkileşimi Bimoleküler Floresan tamamlama (BiFC) Testi

Biz bitki protein-protein etkileşimleri test etmek için bir teknik geliştirdik. Sarı floresan protein (YFP) örtüşmeyen iki parça halinde bölünmüş durumda. Her parçası füzyon proteinleri ifade sağlayan, Gateway sistemi üzerinden ilgi bir gen-frame klonlanmış. YFP sinyal Sulandırma sadece tahkikat proteinler etkileşime girdiğinde oluşur.

Ağ Geçidi Uyumlu Bimoleküler Floresan tamamlama (BiFC) kullanarak Bitki Protein Etkileşimleri Tespiti

Bu videoda, protein-protein etkileşimlerini değerlendirmek için fotoaktif lokalizasyon mikroskobu ve bimoleküler floresan tamamlamasının bir kombinasyonu olan BiFC-PALM açıklanmaktadır. BiFC, iki floresan protein fragmanının, ilgilenilen iki etkileşimli protein ile füzyonunu içerir. İki protein etkileşime girdiğinde, parçalar yakınlaştırılır, bu da iki parçanın bir araya gelmesine ve işlevsel bir floresan proteini yeniden oluşturmasına izin verir. Tek bir floroforun floresansı, PALM tarafından...

Bimoleküler Floresan Tamamlama-Birleştirilmiş Fotoaktif Lokalizasyon Mikroskobu

Bu videoda, konformasyona özgü tek alanlı antikorlar kullanarak spesifik protein dimerlerini tespit etmek ve izole etmek için bimoleküler tamamlama afinite saflaştırmasını, BiCAP'i gösterdik.

Etkileşen İki Proteini İzole Etmek için Bimoleküler Tamamlama Afinite Saflaştırması

Bimoleküler Floresan tamamlama akış sitometrik analizi protein-protein etkileşimleri incelemek için bir yüksek kapasiteli nicel yöntem sağlar. Bu metodoloji, eşleme protein bağlama siteleri ve protein-protein etkileşimleri düzenleyen faktörler taranması için uygulanabilir.

Bimoleküler Floresan tamamlama akışı Sitometrik Analizi: Protein-protein etkileşim Eğitim Bir Yüksek Verimli Kantitatif Yöntemi

In vivo protein komplekslerinin oluşumu bimoleküler floresan tamamlanmasıyla görselleştirilebilir. Etkileşim ortakları floresan etiketler tamamlayıcı bölümlerine bağlı ve geçici olarak tütün yaprakları olarak ifade edilen iki protein arasında yakın üzerine yeniden flüoresan sinyal elde edilir.

Tütün protoplastlarında ve Yapraklar Bimoleküler Floresan tamamlama tarafından Visualized protein-protein etkileşimleri

Protein-protein etkileşimleri, bimoleküler floresan tamamlama (BiFC) ile fotoaktif lokalizasyon mikroskobu (PALM) birleştirilerek nanometre uzamsal çözünürlüğe sahip hücrelerde görselleştirilir. Burada açıklanan, bireysel Ras-Raf komplekslerinin nano ölçekli kümelenmesini ve difüzyonunu görselleştirmek için U2OS hücrelerinde Ras-Raf etkileşimlerini görüntülemek için BiFC-PALM'in kullanılmasıdır.

Bimoleküler Floresan tamamlama ile fotoaktive Yerelleştirme Mikroskobu (BiFC-PALM)

Bu el yazması Bimolecular uluslara benzeşme arıtma (BiCAP) protokolünü açıklar. BM complexed bireysel proteinler hem de konut projeleri hariç rakip bağlama ortaklarıyla oluşan iken bu roman yöntemi belirli yalıtım ve aşağı akım proteomik karakterizasyonu herhangi bir iki etkileşen proteinlerin kolaylaştırır.

Bimolecular tamamlayıcı benzeşme arıtma (BiCAP) tarafından parçalanmış çok protein sinyal kompleksleri

Bu iletişim kuralı açıklar caspase Bimolecular floresan uluslara (BiFC); Başlatan caspases, indüklenen yakınlığı hangi onların harekete geçirmek için ilk adımdır görselleştirmek için kullanılan bir görüntüleme tabanlı yöntemi.

Caspase harekete geçirmek Bimolecular floresan uluslara kullanarak yolları kadar aydınlatma

Bu protokol, C. elegans germline yerinde protein-protein etkileşimleri için prob yakınlık ligasyon test kullanımını göstermektedir.

Yakınlık Ligasyon Tayini kullanılarak C. elegans Germline Ribonükleoprotein Kompleksi Montaj Yerinde Algılama

Burada, BiFC tabanlı FRET-FLIM test tarafından floresan etiketli proteinler kullanarak üç protein ortağı arasındaki üçlü kompleks oluşumunu görselleştirmek için bir yöntem sunuyoruz. Bu yöntem, protein-proteinetkileşim komplekslerini vivo olarak incelemek için değerlidir.

BiFC-FRET-FLIM Tahlilinde MADS Kutusu Transkripsiyon Faktörünün İki Monomeri ile Kalsiyum Sensör Proteini Arasındaki Üçlü Etkileşimin Belirlenmesi

Öğrenin, bimoleküler floresan tamamlama yöntemiyle canlı hücrelerde protein-protein etkileşimlerini ve hücre içi lokalizasyonlarını görselleştirin. Bu teknik, zayıf veya geçici etkileşimleri uzamsal çözünürlükle tespit eder.

Bimoleküler Floresan tamamlama

Daha fazla video keşfet