Bimoleküler Floresan tamamlama akışı Sitometrik Analizi: Protein-protein etkileşim Eğitim Bir Yüksek Verimli Kantitatif Yöntemi

Bu prosedürün genel amacı, PDE dört D üç ile ACAP LBC etkileşim alanlarını haritalamaktır. Akış sitometrisi kullanarak biyomoleküler, floresan, kompleman veya BC'nin ortalama floresan yoğunluğunu ölçerek. Bunu yapmak için, hücreler, floresan raportör proteinin N veya C terminal kısmına kaynaşmış ACAP LBC ve PDE dört D üç fragman ile transfekte edilir.

Venüs Flow sitometrisi daha sonra protein parçalarının etkileşime girip girmediğini değerlendirmek için floresanı değerlendirmek için yapılır Venüs tamamlandı ve floresan oldu. Protein parçaları etkileşime girmezse, floresan tespit edilmez. Bağıl protein ekspresyon seviyelerini belirlemek için ücretsiz batı kan analizi yapılır.

Protein protein etkileşimlerinin gücü daha sonra YFP ortalama floresan yoğunluğunun protein ekspresyon seviyeleri ile normalleştirilmesiyle hesaplanır. Elde edilen veriler, PDE 43'ün ACAP LBC'ye bağlanmasına, PDE 43 içinde, esas olarak yukarı akış korunmuş bölge bir veya UCR bir aracılığıyla birden fazla bölgenin aracılık ettiğini göstermektedir. Bu tekniğin mikroskop kullanılarak birlikte immünopresipitasyon ve BP C gibi mevcut yöntemlere göre başlıca avantajları veya nispeten basit olması, hassas olması ve çok sayıda hücrenin hızlı bir şekilde taranmasını kolaylaştırmasıdır.

Bu yöntem protein-protein etkileşimleri hakkında bilgi sağlayabilse de, ilaç keşfi için protein-protein etkileşimlerini düzenleyen faktörleri taramak için de kullanılabilir. Genel olarak, bu yönteme yeni olan bireyler mücadele edecektir çünkü doğrusal bir B yanıtının belirlenmesi gerekir. Bir yapı ifadesi benzer olmalıdır, böylece sonuç kullanımı farklı protein parçaları birbiriyle karşılaştırılabilir.

Burada açıklanan deneylerde, hücreler, YFP türevinin N terminal fragmanı, Venüs tam uzunlukta ACAP LBC'ye ve Venüs'ün C terminal fragmanı aşağıdakilerden birine, tam uzunlukta PDE E 43'e kaynaştırılmış, yukarı akış korunmuş bölge bir UCR PDE E 43 veya yukarı akış korunmuş bölge iki artı katalitik bölge UCR R iki artı PDE 43'ün CAT'i ile transfeksiyondan bir gün önce transfekte edilmiştir. Altı. Peki, doku kültürü plakaları, iki mililitre tam büyümede kuyu başına 1.2 kez 10 ila beşinci HEC 2 9 3 T hücresi tohumlar. Orta boy tohum, üç kontrol kuyusu artı her test için üç kuyu.

Cotran gece boyunca 37 santigrat derecede% 5 karbondioksitte inkübe edilir. Ertesi gün, BC plazma DNA yapılarının ve bir belirteç olarak BS C yapıları ile transfekte edilen CFP vektörünün transfeksiyonu için hazırlanın. Her koşul için, 250 mikrolitre Optum M1 serum içermeyen ortama uygun miktarda DNA ekleyin.

Steril bir tüpte, üç kuyuyu kesmek için bir tüp yeterlidir. Daha sonra seyreltilmiş DNA karışımına her mikrogram için bir reaktif olmak üzere üç mikrolitre transit LT ekleyin ve karıştırmak için hafifçe pipetleyin, oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin. 250 mikrolitre transfeksiyon karışımında inkübasyonun ardından hücrelere damla damla inkübe edin, ardından 24 saat 37 santigrat derecede% 5 karbondioksitte inkübe edin.

Bir epi floresan mikroskobu altında transfeksiyon kontrolü floresan sonrası, hücreler transfeksiyon verimliliğini raporlamak için BC sinyali için sarı floresan ve CFP floresan ifade etmelidir. Hücreleri akış sitometrik analizine hazırlamak için, önce iki mililitre buz gibi soğuk PBS ile yıkayın, ardından 250 mikrolitre% 0.05 Tripsin ekleyerek hücreleri ayırın, 37 santigrat derecede iki ila beş dakika inkübe edin. Daha sonra bir mikroskop kullanarak hücre dekolmanı olup olmadığını kontrol edin.

Hücreler ayrıldıktan sonra, tripsini bir mililitre DMEM ile nötralize edin. Daha sonra, bir mililitre hücreyi bir mikro santrifüj tüpüne aktarın, ardından 0.25 mililitre hücreyi ikinci bir mikro santrifüj tüpüne aktarın. Tüpleri 500 peynirde beş dakika döndürün.

250 mikrolitrelik numune, akış sitometrisi için daha fazla işlenecektir. Bir mililitrelik numuneyi, Resus'un dönüşünü takiben paralel olarak yapılması gereken batı kan analizi için buz üzerinde bir kenara koyun. Hücreleri 250 mikrolitre faks tamponunda askıya alın ve buz üzerine yerleştirin Hücreler ayrıca PBS'de% 1 Paraform aldehit içinde sabitlenebilir Akış sitometrisi analizi burada hemen olmayacaksa, akış sitometrisi bir Beckman Coulter camgöbeği kullanılarak gerçekleştirilir 488 nanometre, 405 nanometre ve 642 nanometre katı hal lazerleri ile donatılmış bir DP, standart boncuklar kullanılarak akış sitometresini kalibre ettikten sonra elde etmek ve analiz etmek için zirve yazılımı kullanılır, doğrusal bir ölçekte ileri saçılma veya FSC'ye karşı yana doğru saçılma SSC'yi çizin ve canlı hücre popülasyonu üzerinde yürüyün.

Bir sonraki çizim: SSC'ye karşı voltaj, darbe, genişlik ve toplanmamış canlı hücre popülasyonundaki yürüyüş. Daha sonra, FSC'yi doğrusal bir ölçekte ve bu alette 405 FL altıda CFP floresansına karşı bir log ölçeğinde çizin ve toplanmamış canlı CFP pozitif hücreler üzerinde yürüyün. Son olarak, BC yoğunluğunu görselleştirmek için FSC'yi bu cihazda 488 nanometre FL'de YFP floresansına karşı doğrusal bir ölçekte çizin.

Ardından, Y-F-P-C-F-P çift negatif örneğini çalıştırın ve her sinyalin eşiğini ayarlamak için F-S-C-S-S-C FL bir ve FL altı foto çarpan tüpünü veya PMT voltajını ayarlayın. Ardından, gelecekteki çevrimdışı telafi için hem YFP hem de CFP tek pozitif örneklerini çalıştırın. En az 10.000 kapılı etkinlik edindiğinizden emin olun.

Son olarak, veri toplamayı takiben deneysel örnekler için veri toplayın. Canlı hücreler için FS CSC nokta grafiğinde birinci geçit ile yayma ile edinime göre analiz protokolünü ayarlayın. Agrege edilmemiş canlı hücreler için birinci kapının nokta grafiği ve agrega edilmemiş ccfp pozitif canlı hücreler için ikinci kapının ccfp FSC nokta grafiği ile FSC darbesindeki ikinci kapı

YFP ve CFP tek pozitif hücreleri kullanarak Y fp CFP nokta grafiğinde YFP ve CCFP sinyalini telafi ettikten sonra, CFP ve YFP pozitif hücreler için kesme çizgilerini belirleriz. CFP pozitif hücrelerin YFP ortalama floresan yoğunluğunu veya MFI'sini veri çizimi için mükemmel hale getirin, ardından Excel'de Y-F-P-M-F-I'yi ACAP, LBC, PDE, E 43'ün ifade seviyesine normalleştirin ve YFP ortalama floresan yoğunluğunun doğrusal aralığını belirlemek için western blotting ile belirlenen gibi kontrol alfa tubulinini yükleyin. CFP, HEC 2 93 hücrelerinde VN ACAP L BBC ve değişen miktarlarda VC PDE E 43 ile koişe edildi ve etkileşim, bu videoda tarif edildiği gibi bif akış sitometrisi kullanılarak değerlendirildi, bu grafik, transfekte edilen VC PDE E 43'ün bir fonksiyonu olarak VC PDE E 43'ün ekspresyonundaki nispi kat değişimini göstermektedir.

Mavi karelerle gösterilen CFP pozitif hücrelerde Venüs'ün ortalama floresan yoğunluğu, VCDE 43 ekspresyonu ile korelasyon gösterdi ve kırmızı üçgenlerle gösterilen bir western blot'un görüntü analizi ile belirlenen ekspresyon seviyeleri ile tutarlıydı. Yeşil karelerle gösterildiği gibi numuneler arasında benzer CFP ortalama floresan yoğunluğu görüldü ve hücre varyasyonlarını sınırlamak için negatif bir kontrol olarak kullanıldı. Bu sonuçlar, BS e'nin ortalama floresan yoğunluğunu ölçerek ACAB LB C PDE 43 etkileşimini ölçmek için akış sitometrisinin kullanımını doğrularken, aynı zamanda PDE E 43 içinde ACAP LBC bağlanma bölgelerini haritalamak için tarama için kullanılan BIC yapılarının uygun miktarını belirlerken, tam uzunlukta PDE E 43 fl ile ACAP LBC etkileşiminin BIC analizi.

PDE 43'ün UCR bir bölgesi ve PDE 43'ün UCR iki ve CAT bölgeleri burada görüldüğü gibi bu yöntem kullanılarak değerlendirildi. vn, ACAP, LBC ve VC, PDE 43, UCR, iki artı CAT'in ekspresyonu, VC PDE 43, FL ve VC PDE 43 UCR ile karşılaştırıldığında daha düşük BC sinyali ile sonuçlanır, tüm akış örneklerinde benzer bir protein ekspresyonu gözlendi ve ortalama floresan, ACAP, LBC, PDE 43 ve alfa tubulinin nispi ekspresyon seviyelerine normalize edildi. Bu nedenle normalize B-C-M-F-I, ACAP LBC PDE 43 FL ve ACAP LBC PDE 43 UCR R bir arasında floresan yoğunluğunda bir fark olmadığını, ancak ACAP LBC PDE 43 UCR iki artı CAT etkileşimi için çok daha düşük sinyal olduğunu gösterir.

Bu sonuçlar, PDE 43'te ACAP LBC ile etkileşime giren birden fazla bölge olduğunu ve PDE 43 UCR R'nin ACAP LBC ile etkileşimin birincil bölgesi olduğunu göstermektedir. Bu videoyu izledikten sonra, BP C'nin akış sitometrisi analizi ile protein, protein etkileşiminin nasıl çalışılacağı konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.Bu prosedürü denerken, benzer protein ekspresyonu ve doğrusal BP C yanıtı elde etmek için kullanılan doğru BP C yapısını belirlemeyi unutmamak önemlidir. Bu prosedürü takiben, PDE 40 D üç içindeki hangi amino asitlerin sorumlu olduğunu belirlemek için peptit veya risk gibi diğer yöntemler uygulanabilir.

ACAP RBC etkileşimleri.