Name: Bimoleküler Floresan tamamlama akışı Sitometrik Analizi: Protein-protein etkileşim Eğitim Bir Yüksek Verimli Kantitatif Yöntemi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-08-15T12:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 11 s
Description: Öğrenin, BiFC ve akış sitometrisi kullanarak canlı hücrelerde AKAP-Lbc ile PDE4D3 arasındaki protein-protein etkileşimlerini nicel olarak haritalamayı. Bu yüksek verimli yöntem, etkileşim bölgelerini hızlı ve hassas bir şekilde belirlemenizi sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Biz eleştirel deneysel değerlendirme ve tartışma için UIC de O&#39;Bryan laboratuvar teşekkür ederim. Klinik ve Translasyonel Bilimler Hibe UL1TR000050 için UIC Merkezi - Bu çalışma Translational Bilim ilerlemek için GKC ve Ulusal Merkezi Amerikan Kalp Derneği Hibe 11SDG5230003 tarafından desteklenmiştir.

1. Hücre transfeksiyonu <ol><li> Transfeksiyon önce plaka hücreleri gün, immünofloresan için daha az hücre kaplama. <ol><li> Immunofloresan için: 6-plaka, kat cam kapak fişleri içinde (1 de başına) en az 4 saat süreyle 37 ° C de% 0.02 jelatin ile, orta ile bir kez yıkayın ve her bir kuyu için, plaka 1 x 10 5 HEK 293T 2 ml tam Hücreler büyüme ortamı içinde [Dulbecco&#39;nun modifiye edilmiş Eagle ortamı (DMEM) artı% 10 FBS]. </li><li> Akış sitometrik ve Western blot analizi için: levha 1,2 5 HEK 293T hücre / oyuk 6-plaka (24-çukurlu plaka başına 0,5 ml tam büyüme ortamı içinde 0.3 x 10 5 HEK 293T hücreleri içinde 2 ml tam büyüme ortamı x 10 .) </li></ol></li><li> Imalatçının protokolüne göre transfeksiyon için DNA hazırlayın: Effectene (Qiagen) immünofloresan için kullanılır. Transit-LT1 (Mirus) akım sitometrik ve Western Blot analizleri için kullanılır. Kullanılan DNA miktarı aşağıda listelenmiştir. <table border="1"><tbody><tr><td&gt; </td><td> 24 oyuklu plaka (ng) </td><td> 6-plaka (ng) </td></tr><tr><td> CFP-vektör </td><td> 10 </td><td> 50 </td></tr><tr><td> VN N-AKAP-Lbc </td><td> 200 </td><td> 1.000 </td></tr><tr><td> VC N-PDE4D3-FL (tam boy PDE4D3) </td><td> 2.5, 5, 10, 20, 40, 80 </td><td> 100 </td></tr><tr><td> VC N-PDE4D3-UCR1 (UCR1 etki alanı içeren bir PDE4D3 N-terminal parçası) </td><td></td><td> 100 </td></tr><tr><td> VC N-PDE4D3-UCR2 + CAT (UCR2 ve katalitik etki içeren bir PDE4D3 C-terminal parçası) </td><td></td><td> 100 </td></tr></tbody></table> Transfeksiyon Effectene (6-de) kullanılarak: <ol><li> Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca belirtilen plazmid DNA + miktarı 4 ul artırıcı 100 ul tampon EM için, karışım, ve inkübe ekleyin. </li><li> 10 dakika boyunca 5 ul Effectene, karışım, ve inkübe eklemeoda sıcaklığı. Ekle hücrelere bırak-bilge. </li></ol> : Transit-LT1 (6-well/24-well) kullanarak transfeksiyon <ol><li> Bir steril tüp içine Opti-MEM I serumsuz ortamda 250 μl/50 ul plasmid DNA Belirtilen miktarlarda ekleyin. </li><li> Seyreltilmiş DNA karışıma Transit-LT1 reaktif ekleyin ve karıştırmak için hafifçe pipetle. (Transit-LT1 Reaktif: DNA oranı DNA 1 mikrogram başına Transit-LT1 reaktif 3 ul). </li><li> Oda sıcaklığında 30 dakika süreyle inkübe edilir ve hücreleri damla damla ilave edin. </li></ol></li></ol> 2. Sitometrisi, Western Blot, ve İmmünofloresan için Hücre Hazırlık <ol><li> 24 saat sonrası transfeksiyon, hücreler hasat öncesi Epifloresans mikroskop altında floresan kontrol edin. </li><li> Akım sitometri analizi için hücre hazırlama: <ol><li> 24-well/6-well plakaları ile, 0.5 ml / 2 ml buz gibi soğuk PBS ile bir hücreleri yıkayın. </li><li> 50 μl/250 ul% 0.05 tripsin kullanarak hücreleri ayırmak. </li><li> 200 ul / 1 ml DMEM ortamı ile nötralize tripsin. </li><li> Co5 dakika boyunca 500 x g&#39;de santrifüj ile llect 250 ul hücreleri (her ikisi de 24 oyuklu ve 6-delikli plaka için), Western blot analizi için geriye kalan hücreler (1 mi) kullanın. </li><li> 250 ul FACS buffer içinde yeniden süspanse hücreleri [PBS +% 0.5 (w / v) BSA, 2 mM EDTA +] akış sitometri analizi için buz üzerinde depolar. Akım sitometri analizi hemen olmayacak eğer hücreler (PBS içinde)% 1 paraformaldehid sabitlenebilir. </li></ol></li><li> Western Blot analizi için hücre hazırlama: akım sitometri analizi için hücre hazırlama paralel olarak gerçekleştirdi. <ol><li> 2 ml buz gibi soğuk PBS ile yıkayın 1x hücreleri, hücre parçalama tamponu 100 ul [10 mM sodyum fosfat tamponu, pH 6.95, 150 mM NaCI, 5 mM EDTA, 5 mM EGTA,% 1 Triton X-100] eklenerek hücre parçalandığı . </li><li> 4 de 21.000 xg&#39;de 10 dakika boyunca santrifüj ile hücre lizatı toplamak ° C </li><li> , Bradford protein testi ile protein konsantrasyonu ölçmek SDS-PAGE için şerit başına protein eşit miktarda yük ve immün için nitroselüloz transfer. </li></ol&gt; </li><li> Immünofloresan için hücre hazırlama. <ol><li> 2 ml PBS ile durulayın 3x hücreler, oda sıcaklığında 10 dakika boyunca% 3.7 paraformaldehid (PBS) 1 ml hücre düzeltmek için, daha sonra 5 dakika boyunca 2 ml PBS ile 3 kez yıka. </li><li> Montaj orta kullanarak, bir cam slayt üzerinde kayma kapağı monte edin. Gerekirse oje kullanarak lamel kenarları mühür. </li><li> Muayene ° C önce 4 de slaytlar saklayın. </li></ol></li></ol> 3. Akım Sitometri ve İmmünofloresan Mikroskopi <ol><li> Flow sitometri bir Beckman Coulter Mavi 488 nm ile donatılmış ADP, 405 nm ve 642 nm katı hal lazerleri kullanılarak yapılır. Zirve yazılım satın alma ve analiz için kullanılır. <ol><li> Standart boncuklar kullanarak akış sitometresinin kalibre. </li><li> Yolluk canlı hücre popülasyonu için doğrusal bir ölçekte Arsa İleri dağılım (FSC) / yana dağılım (SSC). </li><li> Yolluk olmayan toplu canlı hücre popülasyonu için arsa gerilim / FSC darbe genişliği. </li><li> Arsa count/FL6 (OBP fluorescencyolluk olmayan toplu canlı CFP-pozitif hücreler için bir günlük ölçekte e, 405 nm). </li><li> BiFC yoğunluğu için bir günlük ölçekte Arsa count/FL1 (YFP floresan, 488 nm). </li><li> FSC, SSC, FL1 ve FL6 fotoğraf çoğaltıcı tüp (PMT) Her bir sinyal için eşik ayarlamak için voltaj ayarlamak, YFP-CFP-çift negatif örnekleri çalıştırın. </li><li> Run (hem YFP + ve CFP +) için örnekler gelecek off-line tazminat pozitif ve tek </li><li> Analiz için en azından 10,000 kapılı olayları (olmayan toplanan canlı CFP + hücreleri) elde edin. </li></ol></li><li> . İmmünofloresan mikroskobu bir Zeiss LSM 510 konfokal mikroskop Not kullanılarak yapılır: tüm ayarlar arasında tutarlı (örneğin, zum, iğne deliği, dedektör kazanç, amplifikatör ofset, çerçeve boyutu, tarama hızı, tarama ortalama ve lazer güç olarak) tutmak önemlidir tüm verilerin uygun bir karşılaştırma için örnekler. </li></ol> 4. Veri Analizi (Summit Yazılımı kullanarak Yapılan) <ol><li> Acquisit için olana benzer bir analiz protokolü ayarlamauygun yolluk ile iyon: Canlı hücreler için FSC / SSC nokta arsa Gate 1. Olmayan toplu canlı hücreler için Gate 1 FSC / darbe genişliği Kapısı 2. Olmayan toplu OBP + canlı hücreler için Gate 3 sayısı / CFP Gate 3. </li><li> YFP ve YFP + ve OBP + tek pozitif hücreleri kullanarak OBP sinyal telafi. </li><li> CFP / YFP pozitif hücreler için yeniden belirlemek kesme hatları. </li><li> İhracat YFP CFP floresan yoğunluğu (MFI) + veri komplo için Excel&#39;e hücreler anlamına gelir. </li><li> AKAP-Lbc, PDE4D3 ifade seviyelerine YFP MFI Normale ve Western blot tarafından belirlenen, α-tubulin yükleme kontrolü. </li></ol>

<ol><li>Collura, V., Boissy, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+protein-protein+complexes+to+interactomics%5BTitle%5D)+AND+%22Subcell+Biochem%22%5BJournal%5D)">From protein-protein complexes to interactomics.</a> Subcell Biochem. 43, 135-183 (2007).</li>
<li>Stumpf, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Estimating+the+size+of+the+human+interactome%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Estimating the size of the human interactome.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 6959-6964 (2008).</li>
<li>Shekhawat, S. S., Ghosh, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Split-protein+systems%3A+beyond+binary+protein-protein+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Chem.+Biol%22%5BJournal%5D)">Split-protein systems: beyond binary protein-protein interactions.</a> Curr. Opin. Chem. Biol. 15, 789-797 (2011).</li>
<li>Dwane, S., Kiely, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tools+used+to+study+how+protein+complexes+are+assembled+in+signaling+cascades%5BTitle%5D)+AND+%22Bioeng.+Bugs%22%5BJournal%5D)">Tools used to study how protein complexes are assembled in signaling cascades.</a> Bioeng. Bugs. 2, 247-259 (2011).</li>
<li>Piehler, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+methodologies+for+measuring+protein+interactions+in+vivo+and+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Struct.+Biol%22%5BJournal%5D)">New methodologies for measuring protein interactions in vivo and in vitro.</a> Curr. Opin. Struct. Biol. 15, 4-14 (2005).</li>
<li>Kerppola, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+and+implementation+of+bimolecular+fluorescence+complementation+%28BiFC%29+assays+for+the+visualization+of+protein+interactions+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Design and implementation of bimolecular fluorescence complementation (BiFC) assays for the visualization of protein interactions in living cells.</a> Nat. Protoc. 1, 1278-1286 (2006).</li>
<li>Shyu, Y. J., Suarez, C. D., Hu, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+ternary+complexes+in+living+cells+by+using+a+BiFC-based+FRET+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Visualization of ternary complexes in living cells by using a BiFC-based FRET assay.</a> Nat. Protoc. 3, 1693-1702 (2008).</li>
<li>Wong, K. A., O'Bryan, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bimolecular+fluorescence+complementation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Bimolecular fluorescence complementation.</a> J. Vis. Exp. (50), e2643(2011).</li>
<li>Sugarbaker, E. V., Thornthwaite, J. T., Temple, W. T., Ketcham, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometry%3A+general+principles+and+applications+to+selected+studies+in+tumor+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+Adv.+Surg.+Oncol%22%5BJournal%5D)">Flow cytometry: general principles and applications to selected studies in tumor biology.</a> Int. Adv. Surg. Oncol. 2, 125-153 (1979).</li>
<li>Koshy, S., Alizadeh, P., Timchenko, L. T., Beeton, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+measurement+of+GLUT4+translocation+to+the+plasma+membrane+by+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Quantitative measurement of GLUT4 translocation to the plasma membrane by flow cytometry.</a> J. Vis. Exp. (45), e2429(2010).</li>
<li>Smith, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basic+confocal+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Protoc.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Basic confocal microscopy.</a> Curr. Protoc. Mol. Biol. Chapter 14 (Unit 14), 11(2008).</li>
<li>Westwick, J. K., Lamerdin, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improving+drug+discovery+with+contextual+assays+and+cellular+systems+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Improving drug discovery with contextual assays and cellular systems analysis.</a> Methods Mol. Biol. 756, 61-73 (2011).</li>
<li>Kilpatrick, L. E., Holliday, N. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissecting+the+pharmacology+of+G+protein-coupled+receptor+signaling+complexes+using+bimolecular+fluorescence+complementation%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Dissecting the pharmacology of G protein-coupled receptor signaling complexes using bimolecular fluorescence complementation.</a> Methods Mol. Biol. 897, 109-138 (2012).</li>
</ol>

Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarlarının olmadığını beyan ederim.

BiFC protein-protein etkileşimleri incelemek için basit ve hassas bir yöntemdir. Bu yöntem, yeni bir protein-protein etkileşimleri tanımlamak için kullanılamaz, ancak, bu hücre içinde, protein-protein etkileşimi teyit etmek için ve fonksiyonel özelliklerini incelemek için özellikle uygundur, örneğin protein-protein etkileşimi siteleri eşleme protein kompleksleri hücre altı konumlanması olarak, ve protein-protein etkileşimi modüle eden küçük moleküller / peptitlerin taranması için. VN ve VC parçaları floresan olmayan old...

650.000 protein-protein etkileşimleri, normal hücre fonksiyonlarını 1,2 korunmasında kritik rol oynayan, insan interactome var olduğu tahmin edilmektedir. Ortak immunoprecipitation yanı sıra (eş-IP), altın standart (PCA) hücreleri 3 içinde protein-protein etkileşimleri tespit duyarlılığını artırmak için geliştirilmiştir, hücre lizat birkaç protein parçası tamamlama deneyleri protein-protein etkileşimleri incelemek için. Teknikleri Förster rezonans enerji transferi (FRET), Biyoparlaklık Rezonans Enerji Transferi (BRET) ve Bimoleküler Floresan tamamlama (BiFC) 4,5 içerir. Her potansiyel bir etkileşim protein ortağı (bu örnekte biz AKAP-Lbc ve PDE4D3 kullanın) sigortalarla, BiFC bir floresan protein iki parça (bir YFP varyant burada Venüs kullanın) kolaylaştırdı dernek dayanmaktadır. F tarafından görüntülenmiştir olabilir fonksiyonel floresan hücreleri sonuçları içinde ilgi iki protein, etkileşimiCanlı veya sabit hücreleri 6,7,8 kullanarak luorescence mikroskobu. Diğer PCA ile karşılaştırıldığında, BiFC canlı hücrelerde hücresel yerleşimi çalışma potansiyeli olan, duyarlı ve daha az teknik zordur. Bu tekniğin büyük bir dezavantajı, ancak bir kere oluştuktan sonra, floresan protein kompleksi geri alınamaz olmasıdır. Bu nedenle dinamik protein-protein etkileşimleri incelemek için iyi bir yöntem değildir. Bu yazıda, Venüs floresan yoğunlukları izleyerek AKAP-Lbc ile PDE4D3 etkileşimi siteleri eşleştirmek için BiFC kullanın. (Otomatik yüksek kapasiteli makineler kullanılarak gerçekleştirilmiştir değilse) zaman alıcı ve emek-yoğun floresan mikroskobu kullanarak geleneksel analizi ile karşılaştırıldığında, akım sitometri, kısa bir süre 9 üzerinde heterojen nüfus hücrelerin binlerce basit bir kantitatif analiz sağlar 10. Burada, akış sitometrik-BiFC analizi ve ortak IP geleneksel bir yan-yana karşılaştırma yaparak, biz göstermek bu iki methods karşılaştırılabilir veri sağlamak, ancak, akış sitometrik BiFC analizi zaman alıcı az ve ilgi hücreleri sınırlı zaman daha yararlı olabilir daha az malzeme kullanır.

<table><tbody><tr><td colspan="4">REAGENTS</td></tr><tr><td>Dulbecco&#8217; s modifiye Eagle&#8217; s media (DMEM)</td><td>Invitrogen</td><td>11965-092</td><td></td></tr><tr><td>Penicilin-Streptomisin (pen/strep), 100x</td><td>Invitrogen</td><td>15070-063</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Sığır Serumu (FBS)</td><td>İnvitrogen</td><td>16000-044</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Flag antikoru</td><td>Sigma</td><td>M2, F1804</td><td></td></tr><tr><td>Anti-HA antikoru</td><td>Covance</td><td>16B12, MMS-101R</td><td></td></tr><tr><td>&#945;-tubulin</td><td>Sigma</td><td>DM1A, T9026</td><td></td></tr><tr><td>Anti-GFP antikoru</td><td>Clontech</td><td>632569</td><td></td></tr><tr><td>Hücre kültürü plakaları, 6 oyuklu doku kültürü ile tedavi edilmiş</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>130184</td><td></td></tr><tr><td>HEK 293T hücreleri</td><td>ATCC</td><td>CRL-11268</td><td></td></tr><tr><td>Maxiprep plazmit saflaştırma kiti, yüksek hızlı</td><td>Qiagen</td><td>12663</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&#8217; s Fosfat tamponlu salin (DPBS), steril 1x</td><td>Invitrogen</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>Tripsin-EDTA,% 0.05 (a / h)</td> <td>Gibco</td><td>25300</td><td></td></tr><tr><td>FACS boyama için polistiren yuvarlak tabanlı tüpler</td><td>BD Biosciences</td><td>352052</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehit</td><td>Fisher Scientific</td><td>S74337MF</td><td></td></tr><tr>DAPI <td>Invitrogen</td><td>P-36931</td> <td>ile altın antifade reaktifini uzatın</td><td></td></tr><tr><td>Superfrost plus Mikroskop slaytları</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-550-15</td><td></td></tr><tr><td>Fisherfinest premium kapak camı</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-548-5P</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">EQUIPMENT</td></tr><tr><td>CO2 hava ceketli İnkübatör</td><td>NuAIR DH otomatik akışlı</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Konfokal mikroskop LSM510 META</td><td>Carl Zeiss, Inc</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Elektroforez ve transfer ünitesi</td><td>Biorad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cyan ADP Akış Sitometresi</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

bimoleküler floresan tamamlama akışı sitometrik analizi: protein-protein etkileşim eğitim bir yüksek verimli kantitatif yöntemi

Flow Cytometric Analysis of Bimolecular Fluorescence Complementation: A High Throughput Quantitative Method to Study Protein-protein Interaction

Hücrelerin içinde protein-protein etkileşimleri incelemek için yöntemler arasında, Bimoleküler Floresan tamamlama (BiFC) oldukça basit ve hassastır. BiFC bir floresan protein olmayan iki floresan parçalarının (venüs, bir sarı floresan protein varyantı, burada kullanılan) kullanılarak floresan üretimi esas alınmaktadır. Floresan olmayan Venüs parçaları (VN ve VC) bağlı VN-AKAP-Lbc-VC-PDE4D3 etkileşim ve fonksiyonel bir floresan protein oluşumu için floresan verecek şekilde iki etkileşen proteinleri (bu durumda, AKAP-Lbc ve PDE4D3) kaynaşmıştır hücrelerin içinde. BiFC protein komplekslerinin hücre altı konumlanması ve floresan yoğunluğuna dayalı protein etkileşimleri gücü hakkında bilgi sağlar. Bununla birlikte, protein-protein etkileşimi kuvvetini ölçmek için mikroskopi kullanılarak BiFC analizi zaman alıcı ve protein ekspresyonu ve etkileşim içinde heterojenite nedeniyle biraz görecelidir. Sitometrik akış kaplinBiFC metodolojisi ile analizi, floresan BiFC protein-protein etkileşimi sinyalini doğru olarak kısa bir süre içinde hücrelerin büyük bir miktar için ölçülebilir. Burada, AKAP-Lbc ile etkileşim için gerekli olan PDE4D3 bölgeleri eşleştirmek için bu metodolojinin bir uygulama göstermektedir. Bu yüksek kapasiteli yöntem, protein-protein etkileşimleri düzenleyen tarama faktörlere uygulanabilir.

AKAP-Lbc ve PDE4D3 yapıları (Şekil 1B) sırasıyla, VN ve VC parçaları erimiş edildi. AKAP-Lbc ve fonksiyonel YFP floresan (Şekil 1A) içinde PDE4D3 sonuç etkileşimi. Burada PDE4D3 içinde haritası AKAP-Lbc bağlayıcı sitelere BiFC yöntemini kullanın. Memba korunmuş bölge 1 (UCR1), yukarı korunmuş bölge 2 (UCR2) ve katalitik bölgesi (CAT) PDE4D3 bağlama sitesi tarama için kullanılan bu nedenle, tam boy (FL), UCR1 ve UCR2 artı CAT, PDE4 aile proteinler arasında korunur AKAP-Lbc için. Farklı y...

Bimoleküler Floresan tamamlama akış sitometrik analizi protein-protein etkileşimleri incelemek için bir yüksek kapasiteli nicel yöntem sağlar. Bu metodoloji, eşleme protein bağlama siteleri ve protein-protein etkileşimleri düzenleyen faktörler taranması için uygulanabilir.

Bimoleküler Floresan tamamlama akışı Sitometrik Analizi: Protein-protein etkileşim Eğitim Bir Yüksek Verimli Kantitatif Yöntemi

Among methods to study protein-protein interaction inside cells, Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) is relatively simple and sensitive. BiFC ...

Bu prosedürün genel amacı, ACAP LBC'nin PDE4D3 ile etkileşime girdiği bölgelerin haritasını çıkarmaktır. Bu işlem, biyomoleküler floresan tamamlamasının (BiFC) ortalama floresan yoğunluğu akış sitometrisi kullanılarak ölçülerek gerçekleştirilir. Bunu yapmak için hücreler, floresan rapor proteininin N veya C terminal kısmına füze edilmiş ACAP LBC ve PDE4D3 fragmanları ile transfekte edilir.Protein fragmanlarının etkileşime girip girmediğini değerlendirmek için ardından Venus akış sitometrisi gerçekleştirilir ve floresan ölçümü tamamlanır. Protein fragmanları etkileşime girmezse floresan tespit edilmez. Göreceli protein ekspresyon seviyelerini belirlemek için tamamlayıcı western blot analizi yapılır.Protein-protein etkileşimlerinin gücü, YFP ortalama floresans yoğunluğunun protein ekspresyon seviyelerine normalize edilmesiyle hesaplanır. Elde edilen veriler, PDE 43'ün ACAP LBC'ye bağlanmasının, PDE 43 içindeki birden fazla bölge, öncelikle ise upstream conserved region one veya UCR one aracılığıyla gerçekleştiğini göstermektedir. Bu tekniğin, ko-immünopresipitasyon ve mikroskop kullanılarak yapılan BPC gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajları; nispeten basit olması, hassas olması ve çok sayıda hücrenin hızlı bir şekilde taranmasına olanak tanımasıdır.Bu yöntem protein-protein etkileşimleri hakkında içgörü sağlayabilse de, ilaç keşfi için protein-protein etkileşimlerini düzenleyen faktörlerin taranmasında da kullanılabilir. Genel olarak, bu yöntemde yeni olan kişiler, lineer bir B yanıtının belirlenmesi gerektiği için zorluk yaşayabilirler. Farklı protein fragmanları kullanılarak elde edilen sonuçların birbiriyle karşılaştırılabilmesi için konstrükt ekspresyonu benzer olmalıdır.Burada açıklanan deneylerde hücreler; YFP türevi Venus'un N terminal fragmanının tam uzunluktaki ACAP LBC'ye füzyon edildiği plazmid ile Venus'un C terminal fragmanının aşağıdakilerden biriyle füzyon edildiği plazmid ile birlikte kotransfekte edilir: tam uzunluktaki PDE E 43, PDE E 43'ün yukarı akış korunumlu bölgesi bir (UCR1) veya PDE 43'ün yukarı akış korunumlu bölge iki artı katalitik bölgesi (UCR2+CAT). Transfeksiyondan bir gün önce, altılı doku kültürü plakalarının her kuyucuğuna 2 mL komple büyüme ortamında 1,2 × 10⁵ HEC 293 T hücresi ekilir. Üç kontrol kuyucuğu ile her bir test için üçer kuyucuk ekimi yapılır.Cotran'ı %5 karbondioksit altında 37 °C'de gece boyunca inkübe edin. Ertesi gün, BC plazmid DNA konstrüktlerinin ve bir belirteç olarak BS C konstrüktleri ile birlikte kotranse edilen CFP vektörünün transfeksiyonu için hazırlık yapın. Her bir koşul için, uygun miktarda DNA'yı 250 µL Optum M1 serumsuz ortama ekleyin.Steril bir tüp içerisinde, bir tüp üç kuyucuğa transfeksiyon yapmak için yeterlidir. Ardından, seyreltilmiş DNA karışımının her bir mikrogramı için üç mikrolitre transit LT one reaktifi ekleyin ve karıştırmak için nazikçe pipetleyin; oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin. İnkübasyonun ardından, 250 mikrolitre transfeksiyon karışımını hücrelerin üzerine damla damla ekleyin ve ardından %5 karbon dioksit içeren 37 degrees Celsius ortamında 24 saat inkübe edin.Transfeksiyondan sonra, bir epi floresan mikroskop altında floresansı kontrol edin; hücreler BC sinyali için sarı floresan ve transfeksiyon verimliliğini raporlamak için CFP floresanı eksprese etmelidir. Hücreleri akış sitometrik analize hazırlamak için öncelikle iki mililitre buz gibi soğuk PBS ile yıkayın, ardından 250 mikrolitre %0,05 Trypsin ekleyerek hücreleri ayırın ve 37 degrees Celsius'ta iki ila beş dakika inkübe edin. Daha sonra, hücrelerin ayrılıp ayrılmadığını bir mikroskop kullanarak kontrol edin.Hücreler ayrıldıktan sonra, trypsin'i bir mililitre DMEM ile nötralize edin. Ardından, bir mililitre hücreyi bir mikro santrifüj tüpüne, 0,25 mililitre hücreyi ise ikinci bir mikro santrifüj tüpüne aktarın. Tüpleri 500 ×g'de beş dakika boyunca santrifüjleyin.250 µL'lik örnek, akış sitometrisi için daha ileri aşamalara tabi tutulacaktır. Santrifüj sonrası resüsitasyonu takiben paralel olarak yürütülmesi gereken western kan analizi için bir mL'lik örneği buz üzerinde ayırın. Hücreleri 250 µL fax tamponu içerisinde süspande edin ve buz üzerine yerleştirin; hücreler ayrıca PBS içinde %1 paraformaldehit ile fikse edilebilir. Eğer akış sitometrisi analizi hemen yapılmayacaksa, buradaki işlem uygulanır; akış sitometrisi, 488 nm, 405 nm ve 642 nm katı hal lazerlerle donatılmış bir Beckman Coulter CytoDX ile gerçekleştirilir. Veri toplama ve analiz için Summit yazılımı kullanılır. Akış sitometresi standart boncuklar kullanılarak kalibre edildikten sonra, doğrusal bir ölçekte ileri saçılım (FSC) ile yan saçılımın (SSC) grafiğini çizin ve canlı hücre popülasyonunu kapılayın (gate).Ardından, agregasyon oluşturmamış canlı hücre popülasyonu üzerinde voltaj darbe genişliğine karşı SSC'yi grafiğe dökün ve kapıyı ayarlayın. Daha sonra, bu cihazdaki 405 FL altı kanalındaki CFP floresansı (logaritmik ölçekte) ile FSC'yi (lineer ölçekte) grafiğe dökün ve agregasyon oluşturmamış canlı CFP pozitif hücreler üzerinde kapıyı ayarlayın. Son olarak, BC yoğunluğunu görselleştirmek için, bu cihazdaki 488 nanometre FL bir kanalındaki YFP floresansı (logaritmik ölçekte) ile FSC'yi (lineer ölçekte) grafiğe dökün.Ardından, Y-F-P-C-F-P çift negatif örneğini çalıştırın ve her bir sinyal için eşik değerini ayarlamak amacıyla F-S-C-S-S-C FL bir ve FL altı fotomultiplier tüpü veya PMT voltajını ayarlayın. Daha sonra, gelecekteki çevrimdışı kompanzasyon için hem YFP hem de CFP tek pozitif örneklerini çalıştırın. En az 10.000 kapılan (gated) olay topladığınızdan emin olun.Son olarak, veri toplama işleminin ardından deneysel örnekler için verileri toplayın. Analiz protokolünü, canlı hücreler için FS CSC nokta grafiğindeki birinci kapı (gate one) ile yayılım sağlayacak şekilde veri toplama sürecine göre ayarlayın. Agregat oluşturmamış canlı hücreler için FSC darbe (pulse) grafiğinde birinci kapının nokta grafiği ile ikinci kapıyı (gate two) ve agregat oluşturmamış ccfp pozitif canlı hücreler için ccfp FSC nokta grafiğinde ikinci kapının nokta grafiği ile üçüncü kapıyı (gate three) belirleyin.YFP ve CFP tek pozitif hücrelerini kullanarak YFP ve CFP nokta grafiğindeki YFP ve CCFP sinyalleri telafi edildikten sonra, CFP ve YFP pozitif hücreleri için kesme hatlarını belirliyoruz. CFP pozitif hücrelerin YFP ortalama floresan yoğunluğunu veya MFI değerini veri çizimi için Excel'e aktarın; ardından YFP MFI değerini, YFP ortalama floresan yoğunluğunun lineer aralığını belirlemek için western blotting ile saptanan ACAP LBC PDE E 43 ekspresyon seviyesine ve yükleme kontrolü alfa tubuline göre Excel'de normalize edin. CFP, HEC 2 93 hücrelerinde VN ACAP L BBC ve değişen miktarlarda VC PDE E 43 ile birlikte transfekte edilmiş ve etkileşim, bu videoda açıklanan çift renkli akış sitometrisi kullanılarak değerlendirilmiştir; bu grafik, transfekte edilen VC PDE E 43'ün bir fonksiyonu olarak VC PDE E 43 ekspresyonundaki göreceli kat değişimini göstermektedir.Mavi karelerle belirtilen CFP pozitif hücrelerdeki Venus'ün ortalama floresan yoğunluğu, VCDE 43 ekspresyonu ile korelasyon göstermiş ve kırmızı üçgenlerle belirtilen western blot görüntü analizi ile belirlenen ekspresyon seviyeleriyle tutarlılık sergilemiştir. Yeşil karelerle belirtilen örnekler arasında benzer CFP ortalama floresan yoğunluğu gözlemlenmiş ve bu durum hücre varyasyonlarını sınırlamak için negatif kontrol olarak kullanılmıştır. Bu sonuçlar, BS e ortalama floresan yoğunluğunu ölçerek ACAB LB C PDE 43 etkileşimini nicelleştirmek için akış sitometrisi kullanımını doğrulamakta ve aynı zamanda tam uzunluktaki PDE E 43 fl ile ACAP LBC etkileşiminin BIC analizini gerçekleştirerek PDE E 43 içindeki ACAP LBC bağlanma bölgelerini haritalamak için taramada kullanılan uygun BIC konstrükt miktarının belirlenmesini sağlamaktadır.Burada görüldüğü üzere, bu yöntem kullanılarak PDE 43'ün UCR bir bölgesi ile PDE 43'ün UCR iki ve CAT bölgeleri değerlendirilmiştir. vn ACAP LBC ve VC PDE 43 UCR iki artı CAT ifadesi, VC PDE 43 FL ve VC PDE 43 UCR bir ile karşılaştırıldığında daha düşük BC sinyali ile sonuçlanmıştır; tüm akış örneklerinde benzer protein ekspresyonu gözlemlenmiş ve ortalama floresans, ACAP LBC PDE 43 ve alpha tubulin'in göreli ekspresyon seviyelerine göre normalize edilmiştir. Bu nedenle, normalize edilmiş B-C-M-F-I, ACAP LBC PDE 43 FL ile ACAP LBC PDE 43 UCR R bir arasındaki floresans yoğunluğu açısından bir fark olmadığını, ancak ACAP LBC PDE 43 UCR iki artı CAT etkileşimi için çok daha düşük bir sinyal olduğunu göstermektedir.Bu sonuçlar, PDE 43'te ACAP LBC ile etkileşime giren birden fazla bölge olduğunu ve PDE 43 UCR R one'ın, ACAP LBC ile etkileşimin birincil bölgesi olduğunu göstermektedir. Bu videoyu izledikten sonra, BP C'nin akış sitometrisi analizi ile protein-protein etkileşiminin nasıl inceleneceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız. Bu prosedürü uygularken, benzer protein ekspresyonu ve lineer BP C yanıtı elde etmek için kullanılan doğru BP C konstrükt miktarının belirlenmesini hatırlamak önemlidir. Bu prosedürün ardından, PDE 40 D three içerisindeki hangi amino asitlerin sorumlu olduğunu belirlemek için peptit veya risk gibi diğer yöntemler uygulanabilir.ACAP'nin RBC etkileşimleri.

flow-cytometric-analysis-bimolecular-fluorescence-complementation

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Proteinlerin hücre içi lokalizasyonu hücre sinyal uzay-zamansal düzenleme belirlenmesinde önemlidir. Burada, iki moleküllü floresan proteinlerin hücre mekansal etkileşimleri izlenmesi için basit bir yöntem olarak tamamlama (BiFC) açıklar.

Bimoleküler Floresan tamamlama

Biz bitki protein-protein etkileşimleri test etmek için bir teknik geliştirdik. Sarı floresan protein (YFP) örtüşmeyen iki parça halinde bölünmüş durumda. Her parçası füzyon proteinleri ifade sağlayan, Gateway sistemi üzerinden ilgi bir gen-frame klonlanmış. YFP sinyal Sulandırma sadece tahkikat proteinler etkileşime girdiğinde oluşur.

Ağ Geçidi Uyumlu Bimoleküler Floresan tamamlama (BiFC) kullanarak Bitki Protein Etkileşimleri Tespiti

Bu videoda, konformasyona özgü tek alanlı antikorlar kullanarak spesifik protein dimerlerini tespit etmek ve izole etmek için bimoleküler tamamlama afinite saflaştırmasını, BiCAP'i gösterdik.

Etkileşen İki Proteini İzole Etmek için Bimoleküler Tamamlama Afinite Saflaştırması

In vivo protein komplekslerinin oluşumu bimoleküler floresan tamamlanmasıyla görselleştirilebilir. Etkileşim ortakları floresan etiketler tamamlayıcı bölümlerine bağlı ve geçici olarak tütün yaprakları olarak ifade edilen iki protein arasında yakın üzerine yeniden flüoresan sinyal elde edilir.

Tütün protoplastlarında ve Yapraklar Bimoleküler Floresan tamamlama tarafından Visualized protein-protein etkileşimleri

Tek bir T lenfositinde kuvvet regülasyonlu tek reseptör-ligand bağlanma kinetiğini ve kalsiyum sinyalinin gerçek zamanlı görüntülemesini aynı anda ölçmek için bir teknik açıklıyoruz.

Floresan biyomembran Kuvvet Probe: Tek Hücre üzerinde Reseptör-ligand Kinetiklerinin Eşzamanlı kantitasyonu ve Bağlama kaynaklı Hücre içi Sinyal

Kalıtsal kardiyak aritmiler genellikle bir veya daha fazla iyon kanallarının yüzey teslim değiştiren mutasyonlar neden olur. Burada, TSA-201 hücrelerinde eksprese edilen rekombinant iyon kanallarının göreli ve toplam hücre yüzeyi protein ekspresyonunun bir ölçümünü sağlamak için tahliller flow sitometri uyum sağlar.

Akım Sitometri Kullanımı rekombinant İyon Kanallarının göreli Hücre Yüzey ve toplam İfade tayini

Bu el yazması Bimolecular uluslara benzeşme arıtma (BiCAP) protokolünü açıklar. BM complexed bireysel proteinler hem de konut projeleri hariç rakip bağlama ortaklarıyla oluşan iken bu roman yöntemi belirli yalıtım ve aşağı akım proteomik karakterizasyonu herhangi bir iki etkileşen proteinlerin kolaylaştırır.

Bimolecular tamamlayıcı benzeşme arıtma (BiCAP) tarafından parçalanmış çok protein sinyal kompleksleri

Bu iletişim kuralı hücre-hücre etkileşimleri, yani proteinler hücre kavşaklar, doğrudan canlı hücreler içinde lokalize arabuluculuk proteinler arasındaki etkileşimler araştırmaya floresans dalgalanma spektroskopisi temelli bir yaklaşım açıklar. Biz aleti kalibrasyon, veri toplama ve analizi, olası yapay doku kaynaklarına düzeltmeler dahil olmak üzere ayrıntılı yönergeler sağlar.

Bir floresan dalgalanma spektroskopisi tahlil Protein-Protein etkileşimlerinin hücre-hücre kişiler

Bu makalede, her iki S. cerevisiae ve HEK293T hücrelerinde protein kendinden montajı ölçmek için fret tabanlı akış sitometri Protokolü açıklanır.

Algılama ve ölçme protein Self-montaj In vivo tarafından akış sitometri

Burada, proteinlerin hücre zarları veya mikro-parçacıklarla etkileşimini karakterize etmek için bir dizi yöntem açıklıyoruz.

Floresan Etiketli Proteinlerin Yapay Fosfolipid Mikrovezikülleri ile Etkileşiminin Kantitatif Akış Sitometrisi Kullanılarak Analiz Edilmesi

Bu protokol, düşük afiniteli protein-protein etkileşimlerini araştırmak için kütle fotometrisini yeni bir mikroakışkan sistemle birleştirir. Bu yaklaşım, düşük afiniteli ölçümleri mümkün kılan ve kütle fotometrisinin uygulanabilirliğini genişleten çözelti içindeki yüksek konsantrasyonlu komplekslerin hızlı bir şekilde seyreltilmesine dayanmaktadır.

Mikroakışkanların Kütle Fotometrisi ile Birleştirilmesiyle Mikromolar Derişimlerde Protein Kompleksi Oluşumunun Analizi

Öğrenin, BiFC ve akış sitometrisi kullanarak canlı hücrelerde AKAP-Lbc ile PDE4D3 arasındaki protein-protein etkileşimlerini nicel olarak haritalamayı. Bu yüksek verimli yöntem, etkileşim bölgelerini hızlı ve hassas bir şekilde belirlemenizi sağlar.

Bimoleküler Floresan tamamlama akışı Sitometrik Analizi: Protein-protein etkileşim Eğitim Bir Yüksek Verimli Kantitatif Yöntemi

Daha fazla video keşfet