Atomik Kuvvet Mikroskobu ile Beyin Polisomlar de Peering

Bu protokolün genel amacı, beyin poliribozomlarının mika üzerinde doğru bir şekilde saflaştırılması ve biriktirilmesi için ayrıntılı bir boru hattı sağlamak ve ağır işlem sonrası veya 3D rekonstrüksiyon analizlerine ihtiyaç duymadan nano ölçekte çözünürlükte binlerce görüntü elde etmektir. Bu yöntem, gen ekspresyonunun yeniden kablolanması sırasında polizomlar içindeki ribozom organizasyonunun etkisini anlamak gibi translasyon ve translasyonel kontrol alanlarındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajları, numune fiksasyonu veya etiketlemesi gerekmemesi ve ribozomları ve çıplak RNA standlarını kolayca tanımlamak için ölçümlerin yakın fizyolojik koşullarda gerçekleştirilebilmesidir.

Bu yöntem, memeli poliribozomunun organizasyonu hakkında fikir verebilse de, maya, bakteri ve böcek gibi diğer mikroorganizmalara ve ayrıca gen ekspresyonunun translasyonel kontrollerini içeren duruma da uygulanabilir. Bu yöntemin görsel olarak gösterilmesi kritik öneme sahiptir, çünkü mika emilimi için polizomal numunenin işlenmesi ve yıkama adımları oldukça zordur ve kullanım becerileri ve deneyimi gerektirir. Prosedürü gösteren Paola Bernabo ve Lorenzo Lunelli olacak.

Başlamak için, ekteki metin protokolünde açıklandığı gibi beyin dokusunu toplayın ve dondurun. Daha sonra donmuş mendili dondurucudan çıkarın ve tezgaha getirin. Dondurulmuş beyin dokusunu ve sıvı nitrojeni önceden soğutulmuş bir havan içine koyun ve bir toz haline gelene kadar bir havan tokmağı kullanarak toz haline getirin.

Beyin tozunun yaklaşık 25 miligramını soğuk bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın ve hemen 0.8 mililitre lizis tamponu ekleyin. Hücreleri parçalamak için karışımı 25 kez hızlı bir şekilde yukarı ve aşağı pipetleyin. Daha sonra, hücresel kalıntıları peletlemek için tüpü dört santigrat derecede bir dakika boyunca 12.000 x g'da santrifüjleyin.

Süpernatanı yeni bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın ve tüpü 15 dakika boyunca buz üzerinde tutun. Ardından, çekirdekleri ve mitokondriyi peletlemek için tüpü beş dakika santrifüjleyin. Daha sonra, önceden hazırlanmış bir sükroz gradyanının üstünden bir mililitreyi dikkatlice çıkarın.

Sükrozu, sitozolik lizattan gelen süpernatan ile damla damla kaplayın. Numune şimdi gradyanın üzerine yüklendiğinde, tüpü ve bir denge borusunu dikkatlice sallanan bir kova rotorunun kovalarına indirin. Degradeyi 100 dakika santrifüjleyin.

Ultrasantrifüjlemeden sonra, gradyanın stabilize olması için tüpleri dört santigrat derecede 20 dakika kovalarında bırakın. Ardından, numune tüpünü dikkatlice çıkarın ve bir yoğunluk gradyan fraksiyonlama sisteminin toplayıcı cihazına monte edin. UV görünür ışık dedektörü ile 260 nanometrede nükleik asitlerin emilimini izlerken bir mililitrelik fraksiyonları toplayın ve bunları buzun üzerine koyun.

Daha sonra, ilgilenilen fraksiyonların 30-40 mikrolitrelik alikotlarını hazırlayın ve buz üzerinde tutun. Numuneler hemen kullanılmayacaksa, 80 santigrat derecede saklayın ve donma-çözülme döngülerinin sayısını sınırlamak için adımlar atın. AFM görüntüleme için numune hazırlamak için, önce yıkanmış bir mika tabakasını 200 mikrolitre bir milimolar nikel ii sülfat ile kaplayın ve tabakayı oda sıcaklığında üç dakika inkübe edin.

Ardından çözeltiyi çıkarın, yüzeyi basınçlı hava ile kurulayın ve petri kabını buzun üzerine yerleştirin. Ardından, mika üzerine damla damla ilgi fraksiyonundan tüm alikotu nazikçe ekleyin. 100 veya 200 mikrolitrelik bir uç kullanarak, numuneyi mika'nın tüm yüzeyine yayın ve numuneyi buz üzerinde üç dakika inkübe edin.

Ardından, mika tabakasını 200 mikrolitre soğuk tampon AFM ile damla damla örtün ve numuneyi bir saat boyunca buz üzerinde inkübe edin. Numunenin 40 derecede tutulması ve RNaz içermeyen suda hazırlanmış soğuk tampon kullanılması poliribozom organizasyonunu korumak için önemlidir. İnkübasyondan sonra, tamponu dikkatlice çıkarın ve fazla sakarozları gidermek için mika'yı 200 mikrolitre soğuk tampon AFM ile üç ila dört kez yıkayın.

Daha sonra mika'yı soğuk yıkama solüsyonu ile üç kez yıkayın ve mikadaki fazla suyu kağıt kullanarak boşaltın. Sükrozun emici örneklerden tamamen çıkarılması, polizomda hem ribozomu hem de çıplak RNA'yı kestiğiniz için çok önemlidir. Numuneyi, petri kabının üst kısmı kısmen açık olarak kimyasal başlığın altında kurumaya bırakın.

İki saat sonra petri kabını kapatın. Numune artık oda sıcaklığında saklanabilir. Hazırlanan numuneyi çift taraflı bant kullanarak AFM'nin numune tutucusuna takın.

Ardından, numune tutucuyu üreticinin talimatlarına uygun olarak AFM aşamasına yerleştirin. Kalibrasyonu takiben, konsol ucu yüzeye temas edene kadar numuneye yaklaşın. İkiye iki mikronluk bir tarama alanı, en az 512 x 512 piksel çözünürlük seçin, canlı arka plan çıkarma modunu seçin ve 20-25 nanometrelik bir Z ölçeği seçin.

Ardından, görüntü alımına başlayın. Havada görüntü alırken 10 ila 15 nanometre arasında bir yükseklik ile karakterize edilen yuvarlak nesnelerin varlığını arayarak görüntüyü inceleyin. Ardından, keskin nesneler görselleştirilene kadar ayar noktasını ve geri besleme parametrelerini ayarlayın.

Arka plan, iki ila dört nanometre yüksekliğinde nesnelere sahip iyi örneklerde nispeten düz görünmelidir. Görüntü iyi göründüğünde, farklı numune alanlarında iki ila iki mikron taramalar yapın. Mika üzerinde sakaroz alikotlarının birikmesinden sonra, AFM, sıkıca paketlenmiş ribozom kümeleri olarak görünen tek polizomların doğru boyut tanımlarını sağlar.

Enine kesit analizi kullanılarak ribozomal zirvelerden birine daha yakından bakmak, ribozomal zirvelerin yüksekliğinin yaklaşık 14 nanometre olduğunu ortaya koymaktadır. Bu, havayla kurutulduktan sonra insan ribozomları ve polizomları için daha önce gözlemlenenlerle eşleşir. Sağdaki resimde, ribozom konumunu belirlemek ve her ribozomu kırmızı bir daire ile işaretlemek için bir makro kullanılmıştır.

Bu bilgiyi kullanarak, polizom başına ribozom sayısının frekans dağılımı analiz edilebilir. Bu deneysel dağılım, polizom başına 5.8 ribozom merkezli ve standart sapması 1.3 olan bir Gauss eğrisi ile donatıldı. Bir kez ustalaştıktan sonra, beyin pulverizasyonundan poliribozom görüntülerinin alınmasına kadar bu teknik, uygun şekilde yapılırsa sekiz saatten daha kısa sürede yapılabilir.

Bu prosedürü denerken, numuneyi buz üzerinde tutmayı ve mika üzerinde numune biriktirmek için soğuk tamponlar kullanmayı unutmamak önemlidir. Bu prosedürü izleyerek ve makalenizde kullanılabilir hale getirmek için bir geliştiricinin ImageJ eklentisini kullanarak, polizom başına ribozom sayısını tam olarak sayabilirsiniz. Her gelişmeden sonra, bu teknik, polizom oluşumunun kinetiğini anlamanın ve polizom organizasyonundaki değişiklikleri ve bunların farklı hücresel veya doku koşullarını tanımlamanın yolunu açacaktır.

Bu videoyu izledikten sonra, organizasyonlarını sistematik olarak analiz etmek ve incelemek için binlerce polizom görüntüsünün nasıl elde edileceğini iyi anlamış olmalısınız.