Atomik Kuvvet Mikroskobu ile Beyin Polisomlar de Peering
16 Mart 2016
Ribozom yapısı kapsamlı bir şekilde karakterize edilmiş olsa da, polizomların organizasyonu hala yeterince çalışılmamıştır. Bu bilgi eksikliğinin üstesinden gelmek için, burada memeli polizomlarının hava ve sıvıda atomik kuvvet mikroskobu (AFM) ile doğru görüntülenmesi için ayrıntılı bir hazırlık protokolü sunuyoruz.
Bu protokolün genel amacı, beyin poliribozomlarının mika üzerinde doğru bir şekilde saflaştırılması ve biriktirilmesi için ayrıntılı bir boru hattı sağlamak ve ağır işlem sonrası veya 3D rekonstrüksiyon analizlerine ihtiyaç duymadan nano ölçekte çözünürlükte binlerce görüntü elde etmektir. Bu yöntem, gen ekspresyonunun yeniden kablolanması sırasında polizomlar içindeki ribozom organizasyonunun etkisini anlamak gibi translasyon ve translasyonel kontrol alanlarındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajları, numune fiksasyonu veya etiketlemesi gerekmemesi ve ribozomları ve çıplak RNA standlarını kolayca tanımlamak için ölçümlerin yakın fizyolojik koşullarda gerçekleştirilebilmesidir.
Bu yöntem, memeli poliribozomunun organizasyonu hakkında fikir verebilse de, maya, bakteri ve böcek gibi diğer mikroorganizmalara ve ayrıca gen ekspresyonunun translasyonel kontrollerini içeren duruma da uygulanabilir. Bu yöntemin görsel olarak gösterilmesi kritik öneme sahiptir, çünkü mika emilimi için polizomal numunenin işlenmesi ve yıkama adımları oldukça zordur ve kullanım becerileri ve deneyimi gerektirir. Prosedürü gösteren Paola Bernabo ve Lorenzo Lunelli olacak.
Başlamak için, ekteki metin protokolünde açıklandığı gibi beyin dokusunu toplayın ve dondurun. Daha sonra donmuş mendili dondurucudan çıkarın ve tezgaha getirin. Dondurulmuş beyin dokusunu ve sıvı nitrojeni önceden soğutulmuş bir havan içine koyun ve bir toz haline gelene kadar bir havan tokmağı kullanarak toz haline getirin.
Beyin tozunun yaklaşık 25 miligramını soğuk bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın ve hemen 0.8 mililitre lizis tamponu ekleyin. Hücreleri parçalamak için karışımı 25 kez hızlı bir şekilde yukarı ve aşağı pipetleyin. Daha sonra, hücresel kalıntıları peletlemek için tüpü dört santigrat derecede bir dakika boyunca 12.000 x g'da santrifüjleyin.
Süpernatanı yeni bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın ve tüpü 15 dakika boyunca buz üzerinde tutun. Ardından, çekirdekleri ve mitokondriyi peletlemek için tüpü beş dakika santrifüjleyin. Daha sonra, önceden hazırlanmış bir sükroz gradyanının üstünden bir mililitreyi dikkatlice çıkarın.
Sükrozu, sitozolik lizattan gelen süpernatan ile damla damla kaplayın. Numune şimdi gradyanın üzerine yüklendiğinde, tüpü ve bir denge borusunu dikkatlice sallanan bir kova rotorunun kovalarına indirin. Degradeyi 100 dakika santrifüjleyin.
Ultrasantrifüjlemeden sonra, gradyanın stabilize olması için tüpleri dört santigrat derecede 20 dakika kovalarında bırakın. Ardından, numune tüpünü dikkatlice çıkarın ve bir yoğunluk gradyan fraksiyonlama sisteminin toplayıcı cihazına monte edin. UV görünür ışık dedektörü ile 260 nanometrede nükleik asitlerin emilimini izlerken bir mililitrelik fraksiyonları toplayın ve bunları buzun üzerine koyun.
Daha sonra, ilgilenilen fraksiyonların 30-40 mikrolitrelik alikotlarını hazırlayın ve buz üzerinde tutun. Numuneler hemen kullanılmayacaksa, 80 santigrat derecede saklayın ve donma-çözülme döngülerinin sayısını sınırlamak için adımlar atın. AFM görüntüleme için numune hazırlamak için, önce yıkanmış bir mika tabakasını 200 mikrolitre bir milimolar nikel ii sülfat ile kaplayın ve tabakayı oda sıcaklığında üç dakika inkübe edin.
Ardından çözeltiyi çıkarın, yüzeyi basınçlı hava ile kurulayın ve petri kabını buzun üzerine yerleştirin. Ardından, mika üzerine damla damla ilgi fraksiyonundan tüm alikotu nazikçe ekleyin. 100 veya 200 mikrolitrelik bir uç kullanarak, numuneyi mika'nın tüm yüzeyine yayın ve numuneyi buz üzerinde üç dakika inkübe edin.
Ardından, mika tabakasını 200 mikrolitre soğuk tampon AFM ile damla damla örtün ve numuneyi bir saat boyunca buz üzerinde inkübe edin. Numunenin 40 derecede tutulması ve RNaz içermeyen suda hazırlanmış soğuk tampon kullanılması poliribozom organizasyonunu korumak için önemlidir. İnkübasyondan sonra, tamponu dikkatlice çıkarın ve fazla sakarozları gidermek için mika'yı 200 mikrolitre soğuk tampon AFM ile üç ila dört kez yıkayın.
Daha sonra mika'yı soğuk yıkama solüsyonu ile üç kez yıkayın ve mikadaki fazla suyu kağıt kullanarak boşaltın. Sükrozun emici örneklerden tamamen çıkarılması, polizomda hem ribozomu hem de çıplak RNA'yı kestiğiniz için çok önemlidir. Numuneyi, petri kabının üst kısmı kısmen açık olarak kimyasal başlığın altında kurumaya bırakın.
İki saat sonra petri kabını kapatın. Numune artık oda sıcaklığında saklanabilir. Hazırlanan numuneyi çift taraflı bant kullanarak AFM'nin numune tutucusuna takın.
Ardından, numune tutucuyu üreticinin talimatlarına uygun olarak AFM aşamasına yerleştirin. Kalibrasyonu takiben, konsol ucu yüzeye temas edene kadar numuneye yaklaşın. İkiye iki mikronluk bir tarama alanı, en az 512 x 512 piksel çözünürlük seçin, canlı arka plan çıkarma modunu seçin ve 20-25 nanometrelik bir Z ölçeği seçin.
Ardından, görüntü alımına başlayın. Havada görüntü alırken 10 ila 15 nanometre arasında bir yükseklik ile karakterize edilen yuvarlak nesnelerin varlığını arayarak görüntüyü inceleyin. Ardından, keskin nesneler görselleştirilene kadar ayar noktasını ve geri besleme parametrelerini ayarlayın.
Arka plan, iki ila dört nanometre yüksekliğinde nesnelere sahip iyi örneklerde nispeten düz görünmelidir. Görüntü iyi göründüğünde, farklı numune alanlarında iki ila iki mikron taramalar yapın. Mika üzerinde sakaroz alikotlarının birikmesinden sonra, AFM, sıkıca paketlenmiş ribozom kümeleri olarak görünen tek polizomların doğru boyut tanımlarını sağlar.
Enine kesit analizi kullanılarak ribozomal zirvelerden birine daha yakından bakmak, ribozomal zirvelerin yüksekliğinin yaklaşık 14 nanometre olduğunu ortaya koymaktadır. Bu, havayla kurutulduktan sonra insan ribozomları ve polizomları için daha önce gözlemlenenlerle eşleşir. Sağdaki resimde, ribozom konumunu belirlemek ve her ribozomu kırmızı bir daire ile işaretlemek için bir makro kullanılmıştır.
Bu bilgiyi kullanarak, polizom başına ribozom sayısının frekans dağılımı analiz edilebilir. Bu deneysel dağılım, polizom başına 5.8 ribozom merkezli ve standart sapması 1.3 olan bir Gauss eğrisi ile donatıldı. Bir kez ustalaştıktan sonra, beyin pulverizasyonundan poliribozom görüntülerinin alınmasına kadar bu teknik, uygun şekilde yapılırsa sekiz saatten daha kısa sürede yapılabilir.
Bu prosedürü denerken, numuneyi buz üzerinde tutmayı ve mika üzerinde numune biriktirmek için soğuk tamponlar kullanmayı unutmamak önemlidir. Bu prosedürü izleyerek ve makalenizde kullanılabilir hale getirmek için bir geliştiricinin ImageJ eklentisini kullanarak, polizom başına ribozom sayısını tam olarak sayabilirsiniz. Her gelişmeden sonra, bu teknik, polizom oluşumunun kinetiğini anlamanın ve polizom organizasyonundaki değişiklikleri ve bunların farklı hücresel veya doku koşullarını tanımlamanın yolunu açacaktır.
Bu videoyu izledikten sonra, organizasyonlarını sistematik olarak analiz etmek ve incelemek için binlerce polizom görüntüsünün nasıl elde edileceğini iyi anlamış olmalısınız.
Tam transkripti görüntüleyin ve binlerce bilimsel videoya erişin
Genel Bakış
Bu makale, atomik kuvvet mikroskobu (AFM) kullanarak memeli polizomlarını görüntülemek için ayrıntılı bir protokol sunar. Yöntem, numune sabitlemesi veya etiketleme gerektirmeden yüksek çözünürlüklü görüntüleme sağlar.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Bilim Alanı
- Sinirbilim
- Biyokimya
- Hücre Biyolojisi
Arka Plan
- Polizom organizasyonu, geniş ribozom yapı karakterizasyonuna rağmen yeterince araştırılmamıştır.
- Ribozom organizasyonunu anlamak, gen ekspresyonu düzenlemesine ilişkin anlayış için kritik öneme sahiptir.
- Bu yöntem, maya ve bakteriler de dahil olmak üzere çeşitli organizmalara uygulanabilir.
- Polizomal örneklerin işlenmesinin karmaşıklığı nedeniyle görsel gösterim esastır.
Çalışmanın Amacı
- Beyin poliribozomlarının saflaştırılması ve görüntülemesine yönelik güvenilir bir protokol sağlamak.
- Çeviri kontrolü ve gen ekspresyonunun incelenmesini kolaylaştırmak.
- Neredeyse fizyolojik koşullar altında görüntülemeyi mümkün kılmak.
Kullanılan Yöntemler
- Görüntüleme için atomik kuvvet mikroskobu (AFM).
- Mika üzerinde beyin poliribozomlarının saflaştırılması.
- Ağır son işlem veya 3D rekonstrüksiyon gerektirmeyen görüntüleme.
- Numune emilimi ve yıkama için kullanım teknikleri.
Ana Sonuçlar
- Nanoölçekli çözünürlükte poliribozomların başarılı görüntülemesini sağlar.
- Numunelerde ribozomların ve çıplak RNA ipliklerinin tanımlanması.
- Memeli polizomlarının organizasyonu hakkında görüşler.
- Farklı organizmalarda translasyonel kontrolleri incelemek için potansiyel uygulamalar.
Sonuçlar
- Protokol, polizomlarda ribozom organizasyonunu anlamayı geliştirir.
- Gen ekspresyonunu inceleyen araştırmacılar için değerli bir araç sağlar.
- Yöntemin çeşitli organizmalara uygulanabilirliği, etkisini genişletir.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
Understanding polysome organization provides mechanistic insights into translational control, a critical layer of gene expression regulation relevant to target validation in neuroscience and metabolic disease programs. The ability to image polysomes in near-physiological conditions without fixation or labeling enables reproducible, quantitative analysis of ribosome dynamics, supporting early-stage hypothesis testing and biological de-risking. This approach offers a complementary, label-free method to assess translational states in disease-relevant systems, aiding in the prioritization of targets with strong mechanistic rationale.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables direct visualization of ribosome organization to interrogate translational hypotheses and clarify pathway-level effects of genetic or pharmacological perturbations.
- Operational Value: Provides a reproducible, label-free imaging readout that reduces variability associated with fixation or staining artifacts.
- Predictive Value: Supports assessment of translational state changes as a functional biomarker for target engagement and mechanism of action.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Generates quantitative polysome imaging data suitable for high-content analysis of ribosome number and distribution.
- Reproducibility: Allows thousands of nanoscale-resolution images to be acquired under consistent conditions, enabling statistical robustness.
- Scalability: Compatible with fractionation workflows that can be adapted to multi-sample screening campaigns.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Applicable to brain tissue, enabling direct study of polysome organization in neurodegenerative and neuropsychiatric disease models.
- Translational Continuity: Bridges in vitro findings to ex vivo brain systems, supporting mechanistic de-risking before in vivo validation.
- Cross-Species Utility: Can be extended to yeast, bacteria, and insects, allowing conservation studies and target validation across model organisms.
Pipeline & Workflow Integration
This method fits within the discovery continuum from target hypothesis validation through mechanistic de-risking, providing biophysical data on translational machinery organization that complements genomic and proteomic approaches.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by linking changes in polysome structure to translational control during gene expression rewiring.
- Analytics: Enables extraction of quantitative metrics such as ribosome count per polysome and spatial distribution, facilitating comparative analysis across conditions.
- Enterprise Reuse: Represents a reusable imaging capability for studying translational dynamics in diverse disease-relevant systems without reagent-dependent labeling.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity in translational control by providing direct nanoscale observation of polysome architecture.
- Operational Value: Eliminates need for fixation, labeling, or heavy post-processing, streamlining workflow and reducing variability.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions by offering early, structure-function insights into target-mediated translational effects.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets based on validated translational mechanism in disease-relevant tissues.
Implementation Considerations
- Requires expertise in polysome purification, density gradient fractionation, and AFM operation.
- Depends on access to ultracentrifugation, AFM instrumentation, and RNase-free buffer preparation.
- Necessitates standardized sample handling to ensure consistent deposition on mica and preservation of native polysome structure.
- Must account for tissue-specific variability in polysome yield and stability, particularly in post-mortem or frozen brain samples.
- Limited by the need for specialized training in sample preparation and AFM imaging techniques, as noted in the procedural demonstration requirement.
