Atomik Kuvvet Mikroskobu ile Beyin Polisomlar de Peering

Bu protokolün genel amacı, beyin poliribozomlarının mika üzerine doğru şekilde saflaştırılması ve biriktirilmesi için ayrıntılı bir iş akışı sağlamak ve ağır son işlem veya 3D rekonstrüksiyon analizlerine ihtiyaç duymadan nan Ölçekli çözünürlükte binlerce görüntü elde etmektir. Bu yöntem, gen ekspresyonunun yeniden yapılandırılması sırasında polisomlar içindeki ribozom organizasyonunun etkisini anlamak gibi, translasyon ve translasyonel kontrol alanlarındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajları, numune fiksasyonuna veya işaretlemesine gerek olmaması ve ribozomlar ile çıplak RNA zincirlerini kolayca tanımlayabilmek için ölçümlerin fizyolojik koşullara yakın şartlarda gerçekleştirilebilmesidir.

Bu yöntem, memeli poliribozom organizasyonu hakkında bilgi sağlayabilse de, maya, bakteri ve böcek gibi diğer mikroorganizmaların yanı sıra gen ekspresyonunun translasyonel kontrollerini içeren durumlar için de uygulanabilir. Polizomal örneğin mika tarafından absorbe edilmesi için işlenmesi ve yıkama basamakları oldukça hassas olup teknik beceri ve deneyim gerektirdiğinden, bu yöntemin görsel olarak gösterilmesi kritik önem taşımaktadır. Prosedürü Paola Bernabo ve Lorenzo Lunelli uygulamalı olarak gösterecektir.

Başlamak için, beraberindeki metin protokolünde açıklandığı şekilde beyin dokusunu toplayın ve dondurun. Ardından, dondurulmuş dokuyu dondurucudan çıkarıp tezgahtaki çalışma alanına getirin. Dondurulmuş beyin dokusunu ve sıvı azotu önceden soğutulmuş bir havana yerleştirin ve bir havan eli kullanarak toz haline gelene kadar ezin.

Yaklaşık 25 mg beyin tozunu soğuk bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın ve derhal 0.8 mL liziz tamponu ekleyin. Hücreleri parçalamak için karışımı hızlıca 25 kez pipetle çekip bırakın. Ardından, hücresel kalıntıları çöktürmek için tüpü 4 °C'de bir dakika boyunca 12,000 x g'de santrifüjleyin.

Süpernatanı yeni bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın ve tüpü 15 dakika boyunca buz üzerinde tutun. Ardından, çekirdekleri ve mitokondrileri çöktürmek için tüpü beş dakika boyunca santrifüjleyin. Sonra, önceden hazırlanmış bir sakroz gradyanının üst kısmından dikkatlice bir mililitre alın.

Sükrozun üzerine, sitozolik lizattan elde edilen süpernatantı damla damla ekleyin. Örnek gradyanın üstüne yüklendikten sonra, tüpü ve bir dengeleyici tüpü dikkatlice salınımlı rotor kovalarına yerleştirin. Gradyanı 100 dakika boyunca santrifüjleyin.

Ultrasantrifüj sonrası, gradyanın stabilize olması için tüpleri 20 dakika boyunca dört santigrat derecede kovalarında bekletin. Ardından, örnek tüpünü dikkatlice çıkarın ve bir yoğunluk gradyanı fraksiyonlama sisteminin toplama cihazına yerleştirin. UV-görünür ışık dedektörü ile 260 nanometrede nükleik asit absorbansını izleyerek bir mililitrelik fraksiyonlar toplayın ve bunları buz üzerinde bekletin.

Ardından, ilgilenilen fraksiyonlardan 30-40 µL'lik alikotlar hazırlayın ve bunları buz üzerinde tutun. Numuneler hemen kullanılmayacaksa, -80 °C'de saklayın ve donma-çözülme döngüsü sayısını sınırlamaya yönelik önlemler alın. AFM görüntüleme için numuneleri hazırlamak amacıyla, önce yıkanmış bir mika levhayı 200 µL 1 mM nikel(II) sülfat ile kaplayın ve levhayı oda sıcaklığında üç dakika inkübe edin.

Ardından çözeltiyi uzaklaştırın, yüzeyi basınçlı hava ile kurulayın ve petri kabını buza yerleştirin. Sonra, ilgili fraksiyondaki alikotun tamamını mika üzerine damla damla ve nazikçe ekleyin. 100 veya 200 mikrolitrelik bir uç kullanarak örneği mikanın tüm yüzeyine yayın ve örneği buz üzerinde üç dakika boyunca inkübe edin.

Ardından, mika levhayı damla damla 200 µL soğuk AFM tamponu ile kaplayın ve örneği bir saat boyunca buz üzerinde inkübe edin. Poliribozom organizasyonunu korumak için örneğin 4 °C'de tutulması ve RNazden arındırılmış su ile hazırlanmış soğuk tampon kullanılması önemlidir. İnkübasyonun ardından, tamponu dikkatlice uzaklaştırın ve fazla sakkarozu temizlemek için mikayı 200 µL soğuk AFM tamponu ile üç ila dört kez yıkayın.

Ardından, mikayı soğuk yıkama çözeltisiyle üç kez yıkayın ve mikadaki fazla suyu kâğıt kullanarak süzün. Polizomdaki hem ribozom hem de çıplak RNA'yı ayırdığınız için, absorbant numunelerden sakkarozun tamamen uzaklaştırılması artık kritik önem taşımaktadır. Numuneyi, petri kabının kapağı kısmen açık şekilde kimyasal çeker ocak altında kurumaya bırakın.

İki saat sonra petri kabını kapatın. Örnek artık oda sıcaklığında saklanabilir. Hazırlanan örneği, çift taraflı bant kullanarak AFM'nin örnek tutucusuna sabitleyin.

Ardından, numune tutucuyu üretici talimatlarına uygun olarak AFM tablasına yerleştirin. Kalibrasyonun ardından, kantilever ucu yüzeye temas edene kadar numuneye yaklaşın. İki çarpı iki mikronluk bir tarama alanı, en az 512 x 512 piksel çözünürlük seçin, canlı arka plan çıkarma modunu belirleyin ve 20-25 nanometrelik bir Z ölçeği seçin.

Ardından, görüntü alımına başlayın. Havada görüntü alırken, yüksekliği 10 ile 15 nanometre arasında olan yuvarlak nesnelerin varlığını kontrol ederek görüntüyü inceleyin. Daha sonra, keskin nesneler görselleştirilene kadar set noktasını ve geri besleme parametrelerini ayarlayın.

İyi örneklerde arka plan, iki ila dört nanometre yüksekliğindeki bazı nesnelerle birlikte nispeten düz görünmelidir. Görüntü uygun göründüğünde, farklı örnek alanlarından birkaç adet iki çarpı iki mikronluk tarama gerçekleştirin. Mika üzerine sükroz alikotlarının biriktirilmesinden sonra AFM, sıkıca paketlenmiş ribozom kümeleri şeklinde görünen tekil polisomların doğru boyut tanımlamalarını sağlar.

Kesit analizi kullanılarak ribozomal piklerden birine daha yakından bakıldığında, ribozomal piklerin yüksekliğinin yaklaşık 14 nanometre olduğu görülmektedir. Bu durum, hava ile kurutulmuş insan ribozomları ve polizomları için daha önce gözlemlenenlerle örtüşmektedir. Sağdaki görüntüde, ribozom konumlarını belirlemek ve her bir ribozomu kırmızı bir daire ile işaretlemek için bir makro kullanılmıştır.

Bu bilgiler kullanılarak, polisom başına düşen ribozom sayısının frekans dağılımı analiz edilebilir. Bu deneysel dağılım, polisom başına 5.8 ribozom merkezli ve 1.3 standart sapmalı bir Gauss eğrisi ile uydurulmuştur. Beyin toz haline getirme işleminden poliribozom görüntülerinin elde edilmesine kadar olan bu teknik, doğru şekilde uygulandığında ve uzmanlaşıldığında sekiz saatten kısa sürede tamamlanabilir.

Bu prosedür uygulanırken, örneğin buz üzerinde tutulması ve mika üzerine örnek depozisyonu için soğuk tamponların kullanılması gerektiği unutulmamalıdır. Bu prosedür takip edilerek ve makalenizde sunulacak olan bir geliştiricinin ImageJ eklentisi kullanılarak, polisom başına düşen ribozom sayısı hassas bir şekilde sayılabilir. Her geliştirmeden sonra bu teknik, polisom oluşumunun kinetiğinin anlaşılmasının ve polisom organizasyonundaki değişikliklerin ile bunların farklı hücresel veya doku koşullarının belirlenmesinin yolunu açacaktır.

Bu videoyu izledikten sonra, organizasyonlarını sistematik olarak analiz etmek ve incelemek amacıyla binlerce polizom görüntüsünün nasıl elde edileceği konusunda iyi bir anlayış kazanmış olmalısınız.