Numune hazırlama ve analiz RNASeq tabanlı gen ifadesi verileri Zebra balığı
October 27th, 2017
Bu iletişim kuralı Zebra balığı embriyolar, larva, Bütün transcriptome analiz için bir yaklaşım sunar veya hücre sıralanır. RNA izolasyonu, RNASeq veri yolu çözümlemesi ve qRT PCR dayalı doğrulama gen ifade değişiklikleri içerir.
Zebra balığı larva örneklerinde bu RNASeq analizinin genel amacı, zebra balığı embriyoları ve larvaları için gen ekspresyon profillerini belirlemek ve numuneler arasındaki gen ekspresyonu değişiklikleri hakkında nicel karşılaştırmalı açıklamalar yapmaktır. Bu yöntem, zebra balığı embriyolarının veya larvalarının bilgilendirici olduğu herhangi bir alanda, hedeflenen bir genin baskılanmasının gen ekspresyonu değişikliklerine veya diğer koşullara göre belirli yolların bozulmasına nasıl yol açtığı gibi temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, zebra balıklarının çok sayıda hayvanın üretimine uygun olması ve tüm hayvan transkriptom verilerinin kolayca elde edilebilmesidir.
Ek olarak, transgenik hayvanların sınıflandırılması kullanılarak belirli hücre tiplerinin izolasyonu kolaylıkla sağlanabilir. Prosedürleri gösteren, bir yüksek lisans öğrencisi olan Lain Hostelley ve laboratuvarımdan bir doktora sonrası olan Jessica Nesmith olacak. Başlamak için, üreme olgunluğu olan üç aylık olana kadar kültür embriyoları.
Embriyo toplamadan önceki akşam iki yetişkin erkek ve üç dişi balığı istenen suştan taze sistem suyuyla bölünmüş çiftleşme tanklarına ayırın. Ertesi sabah, ışıklar yandıktan sonra, bölücüyü çıkarın ve tankın dibinde embriyolar görülene kadar balığın doğal olarak çiftleşmesine izin verin. İstenilen sayı toplanana kadar embriyoları 30 dakikalık aralıklarla embriyo ortamının ayrı Petri kaplarında toplayın.
Embriyoları evrelemek için, tüm embriyoların tutarlı gelişim zamanlamasını teşvik etmek için onları 10 santimetre Petri kabı başına 50 ila 75'lik gruplar halinde kültürleyin. Ardından plakaları 28,5 santigrat derecede tutun. Segmentasyondan sonra döllenmeden yaklaşık 24 saat sonrasına kadar somit sayısı veya HPF kullanarak embriyo yaşını ölçün ve embriyoları gelişim yaşına göre ayırın.
Embriyoları metin protokolüne göre istenen aşamada ötenazi yaptıktan sonra, 20 embriyodan oluşan bir havuzu etiketli 1.5 mililitrelik bir mikro santrifüj tüpüne aktarın. Ardından, mikro santrifüj tüpünden fazla embriyo ortamını çıkarın. Tüpe 200 mikrolitre lizis reaktifi ekleyin.
Ve embriyoları mekanik olarak homojenize etmek için bir havaneli kullanın. Ardından, toplam hacmi bir mililitreye getirmek için 800 mikrolitre daha lizis reaktifi ekleyin. RNA'yı çıkarmak için, toplanan örneğe lizis reaktifi ekleyin ve oda sıcaklığında 5 dakika inkübe edin.
Kullanılan her 1 mililitre lizis reaktifi için 0,2 mililitre kloroform ekleyin ve tüpleri 15 saniye boyunca elle ters çevirin. Numuneleri oda sıcaklığında iki ila üç dakika inkübe ettikten sonra, numuneleri 12.000 kez G ve 4 santigrat derecede 15 dakika santrifüjleyin. Ayrılan sulu fazı taze bir tüpe aktarın ve kullanılan her 1 mililitre lizis reaktifi için 0,5 mililitre izopropanol ekleyin.
Tüpleri oda sıcaklığında 10 dakika inkübe ettikten sonra, numuneleri 10 dakika santrifüjleyin. Daha sonra, RNA'ya% 75 etanol ekleyin ve tüpleri 5 dakika boyunca 7, 500 kez G ve 4 santigrat derecede santrifüjleyin. Süpernatanı tamamen çıkarın ve numunenin oda sıcaklığında kurumaya bırakın.
Ardından, RNA'yı 15 ila 30 mikrolitre DEPC ile arıtılmış suda yeniden süspanse edin. Peleti çıkardıktan ve numuneyi metin protokolüne göre yıkadıktan sonra yüksek kaliteli RNA'yı saflaştırmak için, ekstrakte edilen RNA'yı konsantrasyon ve saflık açısından test etmek için bir absorpsiyon spektrofotometresi kullanın. RNA örneklerini RNASeq ve sıralama okumalarının nicelleştirilmesine dayalı gen ekspresyonu değişiklik analizi için bir satıcıya veya kolorduya göndermeden önce 260 üzeri 230 değerinin yaklaşık 2.0 olduğundan emin olun.
Tek bir deneysel koşulu bir kontrolle karşılaştırmak için, diferansiyel olarak ifade edilen genlerin verilerini bir elektronik tablo yönetim yazılımında açın. Sırala düğmesinin yanındaki açılır oku seçin ve e-tablo içinde özel sıralamayı seçin. Açılan pencerede, sütunun altındaki kutuyu seçin ve LFC sütununa göre sıralamayı seçin.
Sıralama ölçütü sütununda değerlerin seçili olduğundan emin olun. Sıra sütununda, en büyükten en küçüğe sıralamayı seçin ve Tamam'ı tıklayın. İki deneysel koşulda bulunan diferansiyel olarak ifade edilen genleri belirlemek için, deneysel olana karşı kontrol elektronik tablosunda, boş bir sütundaki ilk hücreyi seçin.
Ardından, hücreye aşağıdaki denklemi yazın. Denklemi çalıştırmak için enter veya return tuşuna basın. Denklemi içeren hücreyi seçin ve hücrenin sağ alt köşesindeki kutuyu tıklayın.
Denklemi sütundaki her hücreye kopyalamak için fareyi tıklatılmış halde tutun ve son özellik kimliğini seçene kadar seçili alanı sütunun sonuna kadar sürükleyin. Özel sıralamayı tekrar seçin ve sol alt köşedeki artı simgesine tıklayarak ikinci bir sıralama düzeyi ekleyin. İlk düzeyde, sıralama ölçütü, sütunun altında çoğalt'ı seçin.
Sıralama ölçütü'nün altında değerler'i seçin ve sıra'nın altında ikinci düzeyi A.In için Z'yi seçin, ardından sütunun altında LFC'yi seçin. Sıralama ölçütü'nün altında değerler'i seçin ve sıra'nın altında en büyükten en küçüğe'yi seçin ve Tamam'ı seçin. Devam etmeden önce gen sembolleri sütunundan parantezleri kaldırmak için, gen sembollerini içeren sütunun tamamını seçin.
Düzenle'yi seçin, ardından açılır dosya menüsünde değiştirin. Değiştir penceresinin hangi çubuğunu bul kısmına açık parantez, yıldız, kapalı parantez yazın ve değiştirme çubuğunu boş olacak şekilde kiralayın. Tüm parantez örneklerini kaldırmak için tümünü değiştir'i seçin.
Zenginleştirilmiş yolları belirlemek için, istenen gen sembollerini panoya kopyalayın. ConsensusPathDB'ye gidin, ardından web sayfasının sol kenar çubuğunda gen seti analizini ve ardından aşırı temsil analizini seçin. Gen ve protein tanımlayıcılarının bir listesini yapıştır kutusuna, gen listesini yapıştırın.
Gen/protein tanımlayıcı türü kutusunda gen sembolünü seçin ve ilerle'ye tıklayın. Yol tabanlı kümeler bölümünde, yol veritabanları tarafından tanımlanan yollar'ın yanındaki kutuyu seçin. Giriş listesindeki genleri içeren yolların listesini elde etmek için zenginleştirilmiş kümeleri bul'u seçin.
Yol adlarının yanındaki her bir kutuyu seçerek veya seçim kutularının üzerindeki sütun başlığında seç'in altında tümünü tıklatarak bir yol ağında görselleştirmek için zenginleştirilmiş yolların tümünü seçin. Ardından, seçili kümeleri görselleştir'i seçin. Sayfanın üst orta kısmındaki kutulardan birini seçip istenen yüzdeyi, göreli çakışmayı veya paylaşılan aday sayısını girerek göreli çakışma ve paylaşılan aday filtrelerini ayarlayın ve ardından uygula'yı seçin.
Zenginleştirilmiş gen ontolojilerini belirlemek için, ilgili grubun gen sembollerini panoya kopyalayın. Gen Ontolojisi Konsorsiyumu'ndaki GO Zenginleştirme analiz aracına gidin. Sayfanın sol tarafında, buradaki gen kimliklerinizin altına, gen sembollerinin listesini kutuya yapıştırın.
Gen kimlikleri kutusunun altında, go terimini, biyolojik süreci seçin. Ardından, go terms kutusunun altında danio rerio'yu seçin ve gönder'i tıklayın. QRT PCR'yi gerçekleştirin ve metin protokolüne göre RNASeq ile karşılaştırın.
Morpholinos ile enjekte edilen larvalardan ekstrakte edilen RNA'nın alms1 veya bbs1'e karşı dizilenmesi, Alstrom ve BBS modellerinde benzersiz bir şekilde yukarı ve aşağı regüle edilen genlerin yanı sıra her iki modelde de önemli ölçüde değişen genleri ortaya çıkardı. Alstrom modelinin moleküler profilini daha net bir şekilde açıklamak için, diferansiyel olarak ifade edilen genlerde zenginleştirilmiş yollar ve gen ontolojileri tanımlandı. Burada gösterildiği gibi, toplam 31 yol yukarı regüle edildi.
Geniş metabolizma gruplamasının yanı sıra, en çok etkilenen yollar, sırasıyla 32 ve 20 gen ile doğuştan gelen ve adaptif bağışıklık sistemiydi. Aşağı akış B hücresi reseptör sinyal olayları da zenginleştirildi. Alstrom Sendromunun primer silyum disfonksiyonu ile ilişkisi ile tutarlı olarak, yukarı regüle edilmiş genler arasında çeşitli sinyal yolları da zenginleştirilmiştir.
Ek olarak, insülin sekresyonu ile ilişkili üç yol, GPR40'a bağlı yağ asitleri, serbest yağ asitleri ve asetilkolin olmak üzere yukarı regüle edildi. Son olarak, Alstrom modelindeki yukarı regüle genler arasında eritrosit farklılaşması, eritrosit homeostazı, miyeloid hücre homeostazı ve homeostatik süreçler dahil olmak üzere altı GO terimi zenginleştirildi. Bir kez ustalaştıktan sonra, yol ve GO terim analizi bir saatten daha kısa sürede yapılabilir.
Bu yordamı denerken, RNASeq ifadesi karşılaştırmalarının sonuçlarını yorumlarken yol parametrelerinin ve kesme değerlerinin seçiminin en önemli hususlar olduğunu hatırlamak önemlidir. Bu prosedürü takiben, hücre tiplerinin transkriptom profillemesi ve spesifik genlerin kontrolü altında gen ekspresyon değişiklikleri gibi ek soruları yanıtlamak için mutant hatlarla uygulama ve tek hücre tiplerinin transkriptom analizi gibi diğer yöntemler gerçekleştirilebilir. Bu videoyu izledikten sonra, deneysel örnekler arasındaki önemli gen ekspresyonu değişikliklerinin tanımlanması için RNASeq tarafından oluşturulan zebra balığı transkriptomik verilerinin nasıl kullanılacağını iyi anlamış olmalısınız.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Genel Bakış
Bu protokol, zebra balığı embriyolarından, larvalarından veya sıralanmış hücrelerden tüm transkriptom analizi için bir yaklaşım sunar. Yöntem, örnekler arasında gen ekspresyon profillerinin tanımlanmasını ve nicel karşılaştırmaların yapılmasını sağlar.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Bilim Alanı
- Nörobilim
- Gelişimsel Biyoloji
- Genomik
Arka Plan
- Zebra balıkları, gen ekspresyon değişikliklerini incelemek için faydalı modellerdir.
- Spesifik hücre tiplerinin izolasyonu, transgenik hayvanlar kullanılarak sağlanabilir.
- Teknik, analiz için zebra balığının büyük ölçekli üretimini destekler.
- RNASeq verileri, hedeflenen gen baskılaması nedeniyle patikalardaki bozuklukları ortaya çıkarabilir.
Çalışmanın Amacı
- Zebra balığı embriyolarında ve larvalarında gen ekspresyon profillerini tanımlamak.
- Farklı koşullar arasında gen ekspresyon değişikliklerini karşılaştırmak.
- Bulguların qRT-PCR ile doğrulanması.
Kullanılan Yöntemler
- Zebra balığı örneklerinden RNA izolasyonu.
- RNASeq verilerinin yol analizi.
- Gen ekspresyon değişikliklerin qRT-PCR tabanlı doğrulanması.
- Spesifik hücre tipi izolasyonu için transgenik hayvanların sıralanması.
Ana Sonuçlar
- Farklı gen ekspresyon profillerinin tanımlanması.
- Gen ekspresyon değişikliklerin nicel karşılaştırmaları.
- Gen baskılamasının yolları üzerindeki etkileri hakkında görüşler.
- RNASeq bulgularının qRT-PCR ile doğrulanması.
Sonuçlar
- Bu yöntem, zebra balıklarında gen ekspresyonunu anlamayı geliştirir.
- Gelişimsel süreçleri incelemek için bir çerçeve sağlar.
- Yaklaşım, biyolojideki çeşitli araştırma sorularına uygulanabilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
RNASeq-based gene expression analysis in zebrafish enables rapid, scalable identification of pathway-level disruptions following genetic perturbation, supporting early target validation and mechanistic de-risking in discovery programs. The method provides quantitative, reproducible transcriptome data that informs go/no-go decisions by linking phenotypic observations to molecular signatures, reducing ambiguity in target hypothesis testing. Its compatibility with high-throughput embryo production and cell sorting facilitates integration into phenotypic screening cascades for lead identification and portfolio triage.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by linking gene suppression to pathway enrichment, clarifying mechanism of action and off-target effects.
- Operational Value: Supports functional target validation through quantitative comparison of gene expression profiles between control and perturbed conditions.
- Predictive Value: Identifies enriched pathways and GO terms that provide mechanistic context for phenotypic observations, improving confidence in target-disease relationships.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Generates standardized, quantitative gene expression readouts suitable for compound screening and dose-response profiling in zebrafish models.
- Scalability: Leverages ease of large-scale embryo production and RNA isolation to support high-throughput screening campaigns.
- Reproducibility: Includes qRT-PCR validation step to confirm RNASeq findings, ensuring data reliability across experimental replicates.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Identifies conserved pathways (e.g., immune signaling, insulin secretion, cilia function) linked to human disease models, supporting translational biomarker alignment.
- Preclinical Continuity: Enables progression from whole-embryo transcriptome analysis to sorted cell populations, facilitating mechanistic follow-up in relevant tissue contexts.
- Risk-Adjusted Decisions: Pathway and GO enrichment outputs help prioritize targets based on biological coherence and phenotypic concordance.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from early target hypothesis testing through lead identification, providing molecular phenotyping that bridges genetic perturbation to pathway-level insights.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by quantifying gene expression changes and identifying enriched pathways following targeted gene suppression.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative transcriptome profiles that enable reliable comparison of experimental conditions in multi-well formats.
- Analytics: Generates pathway enrichment and GO term outputs that allow teams to compare mechanistic impact across compounds or genetic models.
- Translational Research: Connects zebrafish phenotypes to human-relevant biological processes (e.g., immune response, metabolic signaling) through conserved pathway analysis.
- Enterprise Reuse: Establishes a standardized RNASeq workflow applicable across projects, reducing redundant method development and enabling cross-study data integration.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence by reducing mechanistic ambiguity through pathway-level interpretation of gene expression data.
- Operational Value: Ensures reproducibility via standardized RNA extraction, library preparation, and qRT-PCR validation steps.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision-making by providing objective, quantitative molecular phenotypes linked to target modulation.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets based on pathway enrichment strength and disease relevance.
Implementation Considerations
- Requires expertise in zebrafish husbandry, developmental staging, and RNA handling to ensure sample integrity.
- Depends on access to RNASeq library preparation and sequencing infrastructure, either in-house or via vendor.
- Necessitates bioinformatics support for differential expression analysis, pathway enrichment (e.g., ConsensusPathDB), and GO term annotation.
- Requires standardization of embryo collection timing, lysis conditions, and sequencing depth to maintain cross-experiment comparability.
- Limited by the need for careful parameter selection in enrichment analysis (e.g., cutoff values, background sets) to avoid false positives, as noted in the protocol.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
1:04
Generating Embryos Through Natural Mating and Staging Embryos
2:22
Whole Embryo Dissociation, RNA Extraction and Purify High-quality RNA
4:55
Sorting Differentially Expressed Genes
7:00
Determine Enriched Pathways
7:57
Generation of Pathway Networks and Determination of Enriched GO Terms
9:12
Results: RNAseq-based Zebrafish Genome Expression Data for Alstrom and Bardet Biedl Syndromes
10:47
Conclusion
