Numune hazırlama ve analiz RNASeq tabanlı gen ifadesi verileri Zebra balığı

Zebrafish larva örneklerinde gerçekleştirilen bu RNASeq analizinin genel amacı, zebrafish embriyoları ve larvaları için gen ekspresyon profillerini belirlemek ve örnekler arasındaki gen ekspresyon değişiklikleri hakkında nicel karşılaştırmalı ifadeler oluşturmaktır. Bu yöntem, zebrafish embriyolarının veya larvalarının bilgi verici olduğu herhangi bir alandaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir; örneğin, hedeflenen bir genin baskılanmasının, diğer koşullara kıyasla gen ekspresyon değişikliklerine veya belirli yolakların bozulmasına nasıl yol açtığı gibi. Bu tekniğin temel avantajı, zebrafishlerin çok sayıda hayvan üretiminde uygun olması ve tüm hayvan transkriptom verilerinin kolayca elde edilebilmesidir.

Ek olarak, transgenik hayvanların ayıklanması kullanılarak spesifik hücre tiplerinin izolasyonu kolaylıkla gerçekleştirilebilir. Prosedürleri, laboratuvarımdan lisansüstü öğrencisi Lain Hostelley ve doktora sonrası araştırmacı Jessica Nesmith uygulamalı olarak gösterecektir. Başlamak için, embriyoları reprodüktif olgunluk dönemi olan üç aylık yaşa kadar kültüre edin.

Embriyo toplama işleminden önceki akşam, istenilen suşundan iki yetişkin erkek ve üç dişi balığı, taze sistem suyu içeren bölmeli çiftleştirme tanklarına ayırın. Ertesi sabah, ışıklar açıldıktan sonra bölücü paneli çıkarın ve tankın dibinde embriyolar gözlemlenene kadar balıkların doğal yollarla çiftleşmesine izin verin. İstenilen sayıya ulaşana kadar embriyoları, 30 dakikalık aralıklarla ayrı embriyo medyumu içeren Petri kaplarına toplayın.

Embriyoları evrelemek için, tüm embriyoların gelişim zamanlamasının tutarlı olmasını sağlamak amacıyla, 10 santimetrelik Petri kabı başına 50 ila 75'li gruplar halinde kültüre edin. Ardından, plakaları 28.5 degrees Celsius sıcaklıkta tutun. Segmentasyon sonrası somit sayısını kullanarak, döllenmeden yaklaşık 24 saat sonrasına (HPF) kadar embriyo yaşını ölçün ve embriyoları gelişimsel yaşlarına göre ayırın.

Embriyolar, metin protokolüne uygun olarak istenen evrede ötanize edildikten sonra, 20 embriyoluk bir grup etiketli 1.5 mililitrelik mikro santrifüj tüpüne aktarın. Ardından, mikro santrifüj tüpündeki fazla embriyo besiyerini uzaklaştırın. Tüpe 200 mikrolitre lizis reaktifi ekleyin.

Embriyoları mekanik olarak homojenize etmek için bir havan eli kullanın. Ardından, toplam hacmi 1 mL'ye çıkarmak için 800 µL daha lizis reaktifi ekleyin. RNA'yı ekstrakte etmek için toplanan örneğe lizis reaktifi ekleyin ve oda sıcaklığında 5 dakika inkübe edin.

Kullanılan her 1 mililitre lizis reaktifi için 0,2 mililitre kloroform ekleyin ve tüpleri elle 15 saniye boyunca altüst ederek karıştırın. Örnekleri oda sıcaklığında iki ila üç dakika inkübe ettikten sonra, örnekleri 12.000 ×g ve 4 °C'de 15 dakika boyunca santrifüjleyin. Ayrılan sulu fazı yeni bir tüpe aktarın ve kullanılan her 1 mililitre lizis reaktifi için 0,5 mililitre izopropanol ekleyin.

Tüpler oda sıcaklığında 10 dakika inkübe edildikten sonra, örnekleri 10 dakika boyunca santrifüjleyin. Ardından, RNA'ya %75 ethanol ekleyin ve tüpleri 7.500 ×g'de ve 4 °C'de 5 dakika boyunca santrifüjleyin. Süpernatantı tamamen uzaklaştırın ve örneğin oda sıcaklığında havada kurumasına izin verin.

Ardından, RNA'yı 15 ila 30 µL DEPC işlem görmüş su içerisinde yeniden süspanse edin. Metin protokolüne uygun olarak pellet ekstre edildikten ve örnek yıkandıktan sonra yüksek kaliteli RNA saflaştırmak için, ekstrakte edilen RNA'nın konsantrasyonunu ve saflığını belirlemek amacıyla bir absorbsiyon spektrofotometresi kullanın. RNA örneklerini, sekans okumalarının nicelleştirilmesine dayalı RNASeq ve gen ekspresyon değişimi analizi için bir tedarikçiye veya kuruma göndermeden önce 260/230 değerinin yaklaşık 2,0 olduğundan emin olun.

Tek bir deneysel koşulu bir kontrolle karşılaştırmak için, diferansiyel olarak eksprese edilen genlerin verilerini bir hesap tablosu yönetim yazılımında açın. Sıralama düğmesinin yanındaki açılır oka tıklayın ve hesap tablosu içindeki özel sıralama seçeneğini belirleyin. Açılan pencerede, sütun altındaki kutuyu seçin ve LFC sütununa göre sıralamayı tercih edin.

Sütuna göre sırala kısmında, değerlerin seçili olduğundan emin olun. Sıralama sütununda, büyükten küçüğe sıralamayı seçin ve tamam'a tıklayın. İki deneysel koşulda bulunan farklı şekilde eksprese edilen genleri belirlemek için, deneysel grup ile kontrol grubu karşılaştırma hesap tablosunda, boş bir sütundaki ilk hücreyi seçin.

Ardından, aşağıdaki denklemi hücreye yazın. Denklemi çalıştırmak için enter veya return tuşuna basın. Denklemi içeren hücreyi seçin ve hücrenin sağ alt köşesindeki kutucuğa tıklayın.

Fareye tıklamaya devam edin ve seçili alanı, denklemi sütundaki her bir hücreye kopyalamak için son özellik kimliğini seçene kadar sütun boyunca aşağıya sürükleyin. Tekrar özel sıralamayı seçin ve sol alt köşedeki artı simgesine tıklayarak ikinci bir sıralama düzeyi ekleyin. İlk düzeyde, sütun altındaki sıralama ölçütü olarak "duplicate" seçeneğini belirleyin.

Sıralama ölçütü (sort on) kısmından değerleri (values) ve sıralama düzeni (order) kısmından Z'den A'ya (Z to A) seçeneğini seçin. İkinci düzeyde, "ardından şuna göre" (then by) kısmındaki sütun (column) altında LFC'yi seçin. Sıralama ölçütü (sort on) kısmından değerleri (values) ve sıralama düzeni (order) kısmından en büyükten en küçüğe (largest to smallest) seçeneğini seçip tamam'a (okay) tıklayın. Devam etmeden önce gen sembolleri sütunundaki parantezleri kaldırmak için, gen sembollerini içeren sütunun tamamını seçin.

Dosya açılır menüsünden düzenle, ardından değiştir seçeneğini belirleyin. Değiştir penceresindeki "aranan" çubuğuna aç parantez, yıldız, kapat parantez yazın ve "yenisiyle değiştir" çubuğunu boş bırakın. Tüm parantez örneklerini kaldırmak için tümünü değiştir seçeneğini belirleyin.

Zenginleşmiş yolakları belirlemek için, istenen gen sembollerini panoya kopyalayın. ConsensusPathDB adresine gidin, ardından web sayfasının sol kenar çubuğundan gen seti analizini ve ardından aşırı temsil analizini seçin. Gen ve protein tanımlayıcı listesini yapıştırın kutusuna gen listesini yapıştırın.

Gen/protein tanımlayıcı tipi kutusunda gen sembolünü seçin ve devam et'e tıklayın. Yolak tabanlı setler bölümünde, yolak veri tabanları tarafından tanımlanan yolakların yanındaki kutuyu seçin. Giriş listesindeki genleri içeren yolakların listesini elde etmek için zenginleştirilmiş setleri bul seçeneğini seçin.

Yolak isimlerinin yanındaki kutucukların her birini seçerek veya seçim kutularının üzerindeki sütun başlığında bulunan select altındaki all seçeneğine tıklayarak, bir yolak ağında görselleştirilmek istenen tüm zenginleştirilmiş yolakları seçin. Ardından, visualize selected sets seçeneğini belirleyin. Sayfanın üst orta kısmındaki kutucuklardan birini seçip istenen yüzdeyi, göreceli örtüşmeyi veya paylaşılan aday sayısını girerek relative overlap ve shared candidates filtrelerini ayarlayın, ardından apply seçeneğini belirleyin.

Zenginleşmiş gen ontolojilerini belirlemek için, ilgili grubun gen sembollerini panoya kopyalayın. Gene Ontology Consortium'daki GO Enrichment analiz aracına gidin. Sayfanın sol tarafında, "your gene IDs here" başlığı altındaki kutuya gen sembolleri listesini yapıştırın.

Gen kimlikleri kutusunun altından, GO terimi olarak biyolojik süreci seçin. Ardından, GO terimleri kutusunun altından danio rerio'yu seçin ve gönder'e tıklayın. Metin protokolüne uygun olarak QRT PCR gerçekleştirin ve RNASeq ile karşılaştırın.

alms1 veya bbs1'e karşı Morpholino enjekte edilen larvalardan ekstrakte edilen RNA'nın sekanslanması, Alström ve BBS modellerinde benzersiz şekilde yukarı veya aşağı regüle edilen genlerin yanı sıra her iki modelde de anlamlı şekilde değişen genleri ortaya çıkarmıştır. Alström modelinin moleküler profilini daha net bir şekilde aydınlatmak için, diferansiyel olarak eksprese edilen genlerde zenginleşen yolaklar ve gen ontolojileri belirlenmiştir. Burada gösterildiği üzere, toplam 31 yolak yukarı regüle edilmiştir.

Metabolizmanın geniş grubunun yanı sıra, en çok etkilenen yolaklar sırasıyla 32 ve 20 genle doğal ve adaptif bağışıklık sistemi olmuştur. B hücresi reseptörünün aşağı akış sinyalizasyon olayları da zenginleşmiştir. Alström Sendromu'nun primer siliyum disfonksiyonu ile olan ilişkisiyle tutarlı olarak, yukarı regüle edilen genler arasında çeşitli sinyal yolakları da zenginleşmiştir.

Ek olarak, insülin sekresyonu ile ilişkili üç yolak; GPR40'a bağlanan yağ asitleri, serbest yağ asitleri ve asetilkolin yukarı regüle edilmiştir. Son olarak, Alstrom modelinde yukarı regüle edilen genler arasında eritrosit diferansiyasyonu, eritrosit homeostazı, miyeloid hücre homeostazı ve homeostatik süreçler dahil olmak üzere altı GO terimi zenginleşmiştir. Uzmanlaşıldığında, yolak ve GO terimi analizi bir saatten kısa sürede tamamlanabilir.

Bu prosedürü uygularken, yol parametrelerinin ve eşik değerlerinin seçiminin, RNASeq ekspresyon karşılaştırması sonuçlarını yorumlamadaki en önemli hususlar olduğunu unutmamak gerekir. Bu prosedürün ardından, hücre tiplerinin transkriptom profillemesi ve belirli genlerin kontrolü altındaki gen ekspresyon değişiklikleri gibi ek soruları yanıtlamak amacıyla mutant hatlarla uygulama ve tek hücre tiplerinin transkriptom analizi gibi diğer yöntemler gerçekleştirilebilir. Bu videoyu izledikten sonra, deneysel örnekler arasındaki anlamlı gen ekspresyon değişikliklerini belirlemek için RNASeq ile üretilen zebra balığı transkriptomik verilerinin nasıl kullanılacağı konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.